Name: Przełączana mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości akustycznej i optycznej do obrazowania naczyń krwionośnych in vivo małych zwierząt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj przełączaną mikroskopię fotoakustyczną AR-OR-PAM do obrazowania naczyń krwionośnych małych zwierząt in vivo. System umożliwia wysoką rozdzielczość przy płytkich głębokościach i niższą w głębszych tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe z grantu Tier 2 ufundowanego przez Ministerstwo Edukacji w Singapurze (ARC2/15: M4020238). Autorzy chcieliby również podziękować Panu Chow Wai Hoong Bobby'emu za pomoc w warsztacie mechanicznym.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi przepisami i wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Technologicznego Nanyang w Singapurze (Numer Protokołu Zwierzęcego ARF-SBS/NIE-A0263).
1. System AR-OR-PAM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Konfiguracja systemu: AR-PAM
	<ol>
		<li>Jako źródło promieniowania optycznego należy użyć nanosekundowego przestrajalnego systemu laserowego składającego się z pompowanego diodą, półprzewodnikowego lasera Nd-YAG (532 nm) i lasera barwnikowego o zakresie przestrajania 559-576 nm. Ustaw długość fali lasera na 570 nm za pomocą zewnętrznego sterownika, a częstotliwość powtarzania lasera na 1 kHz za pomocą oprogramowania laserowego.</li>
		<li>Umieść próbnik wiązki pod kątem 45° przed laserem, aby skierować 5% mocy lasera do fotodiody przez filtr o zmiennej gęstości neutralnej (NDF1; OD = 0-4,0).</li>
		<li>Skieruj wiązkę laserową za próbnikiem wiązki pod kątem 90° za pryzmatem kątowym (RAP1).</li>
		<li>Użyj innego pryzmatu kątowego (RAP2), aby umożliwić przejście wiązki przez filtr o zmiennej neutralnej gęstości (NDF2; OD = 0-4,0) i na światłowód wielomodowy (MMF), kierując go przez łącznik światłowodowy (FC) - kombinację obiektywów (apertura numeryczna (NA): 0,25) i translatora XY.</li>
		<li>Przymocuj światłowód do stolika skanującego za pomocą translatora XY. Umieść soczewkę płasko-wypukłą (L1) w odległości 25 mm od końca wyjściowego światłowodu, aby skolimować wiązkę z włókna.</li>
		<li>Przepuść skolimowaną wiązkę przez stożkową soczewkę o kącie wierzchołkowym 130°, aby wygenerować wiązkę w kształcie pierścienia. Słabo skoncentruj wiązkę w kształcie pierścienia na obiekcie za pomocą domowej roboty kondensora optycznego (OC) o kątach stożka 70° i 110° oraz z otworem pośrodku.</li>
		<li>Umieść przetwornik ultradźwiękowy (UST) 50 MHz z soczewką akustyczną (AL) na środku domowej roboty kondensatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja systemu: OR-PAM
	<ol>
		<li>Jako źródło promieniowania optycznego należy użyć nanosekundowego przestrajalnego systemu laserowego składającego się z pompowanego diodą, półprzewodnikowego lasera Nd-YAG (532 nm) i lasera barwnikowego o zakresie przestrajania 559 - 576 nm. Ustaw długość fali lasera na 570 nm za pomocą zewnętrznego sterownika, a częstotliwość powtarzania lasera na 5 kHz za pomocą oprogramowania laserowego.</li>
		<li>Obróć sterowany komputerowo stolik obrotowy (przytrzymując RAP1) o 90°, aby skierować wiązkę lasera na tęczówkę w celu zmiany kształtu.</li>
		<li>Osłabij wiązkę laserową, umieszczając filtr o zmiennej gęstości neutralnej (OD: 0-4,0) wzdłuż wiązki, a następnie skoncentruj wiązkę za pomocą soczewki kondensatora (CL). Przepuść go przez otwór otworkowy (PH) w odległości 75 mm od CL w celu filtracji przestrzennej.</li>
		<li>Wystrzel przestrzennie filtrowaną wiązkę na światłowód jednomodowy (SMF) za pomocą jednomodowego łącznika światłowodowego (FC) składającego się z obiektywu 0,1 NA, aby skupić wiązkę światła na SMF.</li>
		<li>Wyreguluj łącznik światłowodowy, aby osiągnąć maksymalną wydajność sprzęgania.</li>
		<li>Przymocuj światłowód do stolika skanującego za pomocą płytki ślizgowej (SP). Umieść soczewkę achromatyczną (L2) w odległości 50 mm od światłowodu SM, aby skolimować wiązkę laserową.</li>
		<li>Odwróć skolimowaną wiązkę o 90° za pomocą sterowanego kinematycznie zwierciadła eliptycznego (M), aby wypełnić tylną aperturę innej identycznej soczewki achromatycznej (L3). Umieść soczewkę achromatyczną używaną do ustawiania ostrości na mocowaniu translacyjnym (TM2) za pomocą tubusu obiektywu (LT).</li>
		<li>Przepuść wiązkę skupiającą przez domowy sumator wiązki optoakustycznej składający się z pryzmatu prostokątnego (RA) i pryzmatu romboidalnego (RP), z warstwą oleju silikonowego (SO) pomiędzy nimi. 
		UWAGA: Warstwa oleju silikonowego będzie działać jak optycznie przezroczysta i akustycznie odbijająca folię.</li>
		<li>Zamocuj soczewkę akustyczną (AL), aby zapewnić ogniskowanie akustyczne (średnica ogniskowej: ~46 μm) na dole pryzmatu romboidalnego.</li>
		<li>Umieść przetwornik ultradźwiękowy o częstotliwości środkowej 50 MHz na wierzchu romboidalnego pryzmatu; użyj warstwy epoksydowej dla skutecznego sprzężenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przełączanie i dostrajanie systemu
<ol>
	<li>Przymocuj (mocno przykręcając) domowej roboty przełączaną płytkę do 3-osiowego zmotoryzowanego stolika sterowanego przez 3-osiowy kontroler podłączony do komputera.</li>
	<li>Przymocuj system klatek AR i OR do domowej płyty za pomocą wsporników montażowych klatki, aby umożliwić łatwe przełączanie między głowicami skanującymi AR i OR. Przesuń głowicę skanującą na obszar obrazowania.</li>
	<li>Użyj stolika Z, aby zanurzyć dolną część głowicy skanera AR-OR-PAM w wypełnionym wodą akrylowym zbiorniku (13 cm x 30 cm x 3 cm) w celu sprzężenia akustycznego.</li>
	<li>Otwórz okienko obrazowania o średnicy 7 cm na dolnej płycie zbiornika i uszczelnij je membraną polietylenową do transmisji optycznej i akustycznej.</li>
	<li>Użyj wzmacniacza echa impulsowego i oscyloskopu, aby ustawić ostrość przetwornika ultradźwiękowego.
	<ol>
		<li>Ustaw wzmocnienie w wzmacniaczu echa impulsowego na 24 db w trybie nadawania/odbioru.</li>
		<li>Użyj sygnału wyjścia synchronizacji ze wzmacniacza echa impulsowego jako wyzwalacza i wykryj sygnał rozpraszany wstecznie ze szklanego szkiełka (włożonego od dna zbiornika na wodę) za pomocą oscyloskopu. 
		UWAGA: Do suwaka powinna być przyklejona taśma.</li>
		<li>Przesuń oś Z, aby zmaksymalizować amplitudę sygnału echa impulsowego (viewed na oscyloskopie). 
		UWAGA: Gdy szklana płytka jest ostra, echo będzie miało maksymalną amplitudę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz laser i podłącz UST do dwóch wzmacniaczy, każdy o stałym wzmocnieniu 24 dB, za pomocą BNC. 
	UWAGA: Wyjścia wzmacniaczy są podłączone do karty akwizycji danych (DAQ).</li>
	<li>Wykorzystaj sygnał z fotodiody (PD) umieszczonej przed laserem jako wyzwalacz dla systemu akwizycji danych.</li>
	<li>W AR-PAM zmieniaj odległość między soczewką stożkową (kon. L) oraz kondensatora optycznego (OC) w celu maksymalizacji amplitudy sygnału fotoakustycznego generowanego z badanego obiektu (taśma naklejona na szklane szkiełko). Upewnij się, że ogniska optyczne i akustyczne są konfokalne, określając maksymalną amplitudę sygnału fotoakustycznego (PA).
	<ol>
		<li>Zwróć uwagę na opóźnienie maksymalnych sygnałów PA; użyj go później, aby sprawdzić ostrość w oprogramowaniu do akwizycji danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poluzuj głowicy skanującej i ręcznie przełącz głowicę skanującą z AR-PAM na OR-PAM. Następnie dokręć.</li>
	<li>W OR-PAM zmieniaj odległość między dubletem achromatycznym skupiającym (wewnątrz tubusu obiektywu (LT)) a sumatorem optoakustycznym, aby zmaksymalizować amplitudę sygnału PA pokazaną na oscyloskopie.
	<ol>
		<li>Zwróć uwagę na opóźnienie maksymalnych sygnałów PA. 
		UWAGA: Dostrojenie jest konieczne do określenia układu konfokalnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kroki eksperymentalne
<ol>
	<li>Kwantyfikacja rozdzielczości bocznej i głębokości obrazowania
	<ol>
		<li>Użyj nanocząstek złota o średnicy 100 nm, aby określić rozdzielczość boczną układu AR i OR.</li>
		<li>Rozcieńczyć 0,1 ml roztworu nanocząstek równą ilością wody. Rozprowadzić 0,1 ml rozcieńczonego roztworu na szkiełku nakrywkowym i umieścić go w kontakcie z membraną polietylenową pod zbiornikiem.</li>
		<li>Upewnij się, że AR-PAM i OR-PAM są ustawione na ostrość w oprogramowaniu do akwizycji danych (patrz Spis materiałów) przed skanowaniem (kroki 2.8 i 2.10). 
		UWAGA: Znając mikrosekundowe opóźnienie maksymalnych sygnałów PA z kroków 2.9 i 2.10, pomnożone przez częstotliwość próbkowania (250 MS/s), obraz będzie ostry w oprogramowaniu do akwizycji danych. Opóźnienie, które należy pominąć podczas pozyskiwania danych, można określić w oprogramowaniu w taki sposób, aby zapisać tylko niezbędne punkty danych do późniejszego przetwarzania.</li>
		<li>Ustaw parametry skanowania dla AR-PAM i naciśnij przycisk "skanuj", aby rozpocząć skanowanie rastrowe.
		<ol>
			<li>Ustaw parametry skanowania dla AR-PAM w oprogramowaniu do akwizycji danych na "4" mm/s prędkość skanowania w zakładce "prędkość", "1" kHz w zakładce "częstotliwość powtarzania impulsów", "0,5" mm w zakładce "Zakres Y-skanowania" i "0,5" mm w zakładce "Zakres X-scan". Ustaw rozmiar kroku w kierunku x na "4" μm w Zakładka "DX". 
			UWAGA: Rozmiar kroku w kierunku y jest automatycznie określany na podstawie prędkości skanowania stolika i częstotliwości powtarzania impulsów (w tym przypadku 4 000 μm/1 000 Hz = 4 μm)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustaw parametry skanowania dla OR-PAM i naciśnij przycisk "skanuj", aby rozpocząć skanowanie rastrowe.
		<ol>
			<li>Ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu do akwizycji danych na "2.5" mm/s prędkość skanowania w zakładce "prędkość", "5" kHz w zakładce "częstotliwość powtarzania impulsów", "0.5" mm w zakładce "Zakres Y-skan" i "0.5" mm w zakładce "Zakres X-scan". Ustaw rozmiar kroku w kierunku x a "0.5" μm w "dx"" tab. 
			UWAGA: Rozmiar kroku w kierunku y jest określany automatycznie na podstawie prędkości skanowania stolika i częstotliwości powtarzania impulsów (w tym przypadku 2 500 μm / 5 000 Hz = 0,5 μm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Upewnij się, że podczas procesu skanowania dane są w sposób ciągły przechwytywane i przechowywane na komputerze 
		UWAGA: Dane będą rejestrowane tylko w jednym kierunku ruchu stolika Y.</li>
		<li>Użyj wielu danych B-scan przechowywanych w komputerze, aby pobrać obrazy projekcji maksymalnej amplitudy (MAP) za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Użyj obrazu pojedynczej nanocząstki (z wielu obrazów) ze skanu, aby określić rozdzielczość poprzeczną, ręcznie kreśląc linię przez centralny obszar obrazu nanocząstki, aby uzyskać funkcję rozrzutu punktowego, która wygląda jak krzywa Gaussa. Zobacz Rysunek 2.</li>
		<li>Dopasuj funkcję rozrzutu punktowego uzyskaną z obrazu pojedynczej nanocząstki za pomocą funkcji dopasowania Gaussa i zmierz pełną szerokość przy połowie maksimum (FWHM) za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów). Użyj tego jako rozdzielczości bocznej. Zobacz Rysunek 2.</li>
		<li>Włóż kawałek czarnej taśmy ukośnie na kawałek pokrojonej tkanki kurczaka jako obiekt docelowy do obrazowania głębi. Umieść chusteczkę z taśmą w zbiorniku na wodę. 
		UWAGA: taśma jest przyklejona do metalowej płytki z ostrą końcówką, która pomaga przymocować taśmę do tkanki.</li>
		<li>Ustaw parametry skanowania dla AR-PAM w oprogramowaniu do akwizycji danych, a następnie naciśnij przycisk "skanuj", aby przechwycić pojedynczy obraz B-scan w celu określenia maksymalnej głębokości obrazowania.
		<ol>
			<li>Ustaw parametry skanowania na "15" mm/s prędkość skanowania w zakładce "velocity", "1" kHz w zakładce "pulse repetition rate", "5" cm w zakładce "Y-scan range" i "0.1" mm w zakładce "X-scan range". Ustaw rozmiar kroku w kierunku x na "0.1" mm w zakładce "dx".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustaw parametry skanowania dla OR-PAM i naciśnij przycisk "skanuj", aby przechwycić pojedynczy obraz B-scan w celu określenia maksymalnego zakresu obrazowania.
		<ol>
			<li>Ustaw parametry skanowania w oprogramowaniu do akwizycji danych jako "15" mm/s prędkości skanowania w zakładce "prędkość", "5" kHz w zakładce "częstotliwość powtarzania impulsów", "2" cm w zakładce "Y-scan range" i "0,1" mm w zakładce "X-scan range". Ustaw rozmiar kroku w kierunku x na "0.1" mm w "dx" tab. 
			UWAGA: Ponieważ zakres X-scan i dx są takie same, zostanie przechwycony tylko jeden B-scan. Czasowo-rozdzielcze sygnały PA pomnożone przez prędkość dźwięku w tkance miękkiej (1540 m/s) dadzą obraz w linii A. Wiele linii A jest przechwytywanych podczas ciągłego ruchu stolika Y w celu uzyskania skanu B.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie in vivo unaczynienia krwi ucha myszy
	<ol>
		<li>Użyj samicy myszy o masie ciała 25 g i wieku 4 tygodni.</li>
		<li>Znieczulić zwierzę za pomocą koktajlu z ketaminy (120 mg/kg) i ksylazyny (16 mg/kg) wstrzykiwanych dootrzewnowo (dawka 0,1 ml/10 g).</li>
		<li>Usuń włosy z ucha zwierzęcia za pomocą kremu do depilacji. Wytrzyj obszar do czysta. Przykryj oko zwierzęcia sterylną maścią do oczu, aby uniknąć rozproszonej wiązki laserowej spadającej na oczy.</li>
		<li>Umieść zwierzę na stoliku, na którym znajduje się również miniaturowa płytka do ustawiania ucha.</li>
		<li>Utrzymuj znieczulenie wziewnym izofluranem (0,75% w 1 l/min tlenu) w okresie obrazowania.</li>
		<li>Zamocuj pulsoksymetr na nodze lub ogonie myszy i monitoruj stan fizjologiczny. Pozwól, aby obszar obrazowania stykał się z membraną polietylenową za pomocą żelu ultradźwiękowego.</li>
		<li>Ustaw parametry skanowania dla AR-PAM i naciśnij przycisk "skanuj", aby rozpocząć skanowanie rastrowe.
		<ol>
			<li>Ustaw parametry skanowania dla AR-PAM w oprogramowaniu do akwizycji danych na "15" mm/s prędkość skanowania w zakładce "prędkość", "1" kHz w zakładce "częstotliwość powtarzania impulsów", "10 mm" w zakładce "Zakres Y-skanowania" i "6" mm w zakładce "Zakres X-scan". Ustaw rozmiar kroku w kierunku x jako "30" μm in Zakładka "DX". 
			UWAGA: Wielkość kroku w kierunku y jest określana automatycznie na podstawie prędkości skanowania stolika i częstotliwości powtarzania impulsów (w tym przypadku 15 000 μm/1 000 Hz = 15 μm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po zakończeniu skanowania AR-PAM zmień pozycję głowicy obrazowania z AR-PAM na OR-PAM (jak opisano w rozdziale 2).</li>
		<li>Ustaw parametry skanowania dla OR-PAM i naciśnij przycisk "skanuj", aby rozpocząć skanowanie rastrowe.
		<ol>
			<li>Ustaw parametry skanowania dla OR-PAM w oprogramowaniu do akwizycji danych na prędkość skanowania "15" mm/s w zakładce "prędkość", "5" kHz w zakładce "częstotliwość powtarzania impulsów", "10" mm w zakładce "Zakres Y-skan" i "6" mm w zakładce "Zakres X-scan". Ustaw rozmiar kroku w kierunku x jako "6" μm w Zakładka "DX". 
			UWAGA: Rozmiar kroku w kierunku y jest określany automatycznie na podstawie prędkości skanowania stolika i częstotliwości powtarzania impulsów (w tym przypadku 15 000 μm/5 000 Hz = 2 μm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj wielu danych B-scan przechowywanych w komputerze, aby pobrać obrazy MAP za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów.</li>
		<li>Obserwuj zwierzę przez cały okres obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hu, S., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+imaging+and+characterization+of+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature.</a> J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).</li>
<li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+deeper+than+microscopy%3A+the+optical+imaging+frontier+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology.</a> Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).</li>
<li>Wang, L. V., Yao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+photoacoustic+tomography+in+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences.</a> Nat Methods. 13, 627-638 (2016).</li>
<li>Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial+on+photoacoustic+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Tutorial on photoacoustic tomography.</a> J Biomed Opt. 21 (6), 061007(2016).</li>
<li>Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Developments+in+Vascular+Imaging+Techniques+in+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Intl%22%5BJournal%5D)">Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine.</a> BioMed Res Intl. 2015, (2015).</li>
<li>Yao, J., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+Brain+Imaging%3A+from+Microscopic+to+Macroscopic+Scales%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales.</a> Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).</li>
<li>Wang, L. V., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+Tomography%3A+In+Vivo+Imaging+from+Organelles+to+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs.</a> Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).</li>
<li>Beard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+photoacoustic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Biomedical photoacoustic imaging.</a> Interface Focus. 1 (4), 602-631 (2011).</li>
<li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+photoacoustic+imaging+of+angiogenesis+with+integrin-targeted+gold+nanobeacons%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons.</a> FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).</li>
<li>Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+tomography+of+foreign+bodies+in+soft+biological+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue.</a> J Biomed Opt. 16 (4), 046017(2011).</li>
<li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoacoustic+detection+of+sentinel+lymph+nodes+with+gold+nanobeacons%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons.</a> Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).</li>
<li>Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+photoacoustic+microscopy+and+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photon%22%5BJournal%5D)">Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography.</a> Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).</li>
<li>Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+high-resolution+3D+photoacoustic+imaging+of+superficial+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy.</a> Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).</li>
<li>Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s13534-014-0153-z">Acoustic resolution photoacoustic microscopy.</a> Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).</li>
<li>Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+photoacoustic+microscopy+for+high-resolution+and+noninvasive+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).</li>
<li>Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dark-field+reflection-mode+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy.</a> Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).</li>
<li>Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7317491/">Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review.</a> IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215(2016).</li>
<li>Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+optical-resolution+photoacoustic+microscopy+using+a+2-axis+water-proofing+MEMS+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner.</a> Sci Rep. 5, 07932(2015).</li>
<li>Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+photoacoustic+microscopy+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves.</a> J Biomed Opt. 19 (1), 016004(2014).</li>
<li>Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+optical-resolution+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Near-infrared optical-resolution photoacoustic microscopy.</a> Opt Lett. 39 (17), 5192-5195 (2014).</li>
<li>Danielli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+photoacoustic+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free photoacoustic nanoscopy.</a> J Biomed Opt. 19 (8), 086006(2014).</li>
<li>Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflection-mode+submicron-resolution+in+vivo+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy.</a> J Biomed Opt. 17 (2), 020501(2012).</li>
<li>Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+optical-resolution+photoacoustic+microscopy+with+improved+sensitivity+and+speed%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed.</a> Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).</li>
<li>Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical-resolution+photoacoustic+microscopy+for+in+vivo+imaging+of+single+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries.</a> Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).</li>
<li>Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://biomedicaloptics.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=2589941">Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study.</a> J Biomed Opt. 22, 045001(2017).</li>
<li>Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+photoacoustic+microscopy+using+photonic+nanojets%3A+a+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study.</a> J Biomed Opt. 19 (11), 116003(2014).</li>
<li>Allen, T. J. <a target="_blank" href="http://proceedings.spiedigitallibrary.org/proceeding.aspx?articleid=2505655">Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al.</a> Proc SPIE. , 97080W(2016).</li>
<li>Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+optical-and+acoustic-resolution+photoacoustic+microscopy+based+on+an+optical+fiber+bundle%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle.</a> Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).</li>
<li>Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/1612-2011/11/4/045601">Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution.</a> Laser Phys Lett. 11 (4), 045601(2014).</li>
<li>Jeon, S., Kim, J., Kim, C. <a target="_blank" href="http://proceedings.spiedigitallibrary.org/proceeding.aspx?articleid=2504761">In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy.</a> Proc SPIE. , 970845(2016).</li>
<li>Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+reflection-mode+photoacoustic%2C+two-photon%2C+and+second+harmonic+generation+microscopy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo.</a> Sci Rep. 6, 32240(2016).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay-multiply-and-sum-based+synthetic+aperture+focusing+in+Photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy.</a> J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10(2016).</li>
<li>ANSI Standard Z136.1-2000. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22American+National+Standard+for+Safe+Use+of+Lasers%22">American National Standard for Safe Use of Lasers</a>. , NY. (2000).</li>
<li>Moothanchery, M., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+Characterization+of+a+Switchable+Acoustic+Resolution+and+Optical+Resolution+Photoacoustic+Microscopy+System%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System.</a> Sensors. 17 (2), 357(2017).</li>
</ol>

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi i przepisami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Technologicznego Nanyang w Singapurze (numer protokołu dla zwierząt ARF-SBS/NIE-A0263). Autorzy nie mają żadnych istotnych interesów finansowych w manuskrypcie ani żadnych innych potencjalnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podsumowując, opracowano przełączany system AR i OR PAM, który może osiągnąć zarówno obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na niższych głębokościach obrazowania, jak i obrazowanie w niższej rozdzielczości na wyższych głębokościach obrazowania. Określono rozdzielczość poprzeczną i głębokość obrazowania systemu przełączalnego. Zalety tego przełączanego systemu PAM obejmują: (1) obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przy użyciu ścisłego ogniskowania optycznego; (2) obrazowanie tkanek głębokich z wykorzystaniem ogniskowania ...

Metody obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna tomografia koherentna, mikroskopia konfokalna i mikroskopia wielofotonowa, mają wiele zalet. Jednak rozdzielczość przestrzenna znacznie spada wraz ze wzrostem głębokości obrazowania. Wynika to z rozproszonego charakteru transportu światła w tkankach miękkich1,2. Integracja wzbudzenia optycznego i detekcji ultradźwiękowej stanowi rozwiązanie pozwalające sprostać wyzwaniu, jakim jest obrazowanie optyczne w wysokiej rozdzielczości w głębokich tkankach. Mikroskopia fotoakustyczna (PAM) jest jedną z takich metod, która może zapewnić głębsze obrazowanie niż inne metody obrazowania optycznego. Został z powodzeniem zastosowany do obrazowania strukturalnego, funkcjonalnego, molekularnego i komórkowego in vivo3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 bada, łącząc silny kontrast absorpcji optycznej z wysoką rozdzielczością przestrzenną z ultradźwięków.
W PAM, krótki impuls laserowy naświetla tkankę/próbkę. Absorpcja światła przez chromofory (np. melaninę, hemoglobinę, wodę itp.) powoduje wzrost temperatury, co z kolei skutkuje wytwarzaniem fal ciśnienia w postaci fal akustycznych (fale fotoakustyczne). Generowane fale fotoakustyczne mogą być wykrywane przez szerokopasmowy przetwornik ultradźwiękowy poza granicą tkanki. Wykorzystując słabe optyczne i ścisłe ogniskowanie akustyczne, obrazowanie głębokich tkanek można uzyskać w mikroskopii fotoakustycznej o rozdzielczości akustycznej (AR-PAM)14,15,16. W AR-PAM zademonstrowano rozdzielczość boczną 45 μm i głębokość obrazowania do 3 mm15. W celu akustycznego rozdzielenia pojedynczych kapilar (~5 μm) wymagane są przetworniki ultradźwiękowe pracujące na częstotliwościach centralnych >400 MHz. Przy tak wysokich częstotliwościach głębokość penetracji jest mniejsza niż 100 μm. Problem spowodowany ciasnym ogniskowaniem akustycznym można rozwiązać za pomocą ścisłego ogniskowania optycznego. Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) jest w stanie rozdzielić pojedyncze kapilary, a nawet pojedynczą komórkę17, a rozdzielczość boczna 0,5 μm została osiągnięta18,19,20,21,22,23,24. Zastosowanie nanodżetu fotonicznego może pomóc w osiągnięciu rozdzielczości wykraczającej poza rozdzielczość ograniczoną dyfrakcją25,26. W OR-PAM głębokość penetracji jest ograniczona ze względu na skupienie światła i może obrazować do ~1,2 mm wewnątrz tkanki biologicznej23. Dlatego AR-PAM może obrazować głębiej, ale z niższą rozdzielczością, a OR-PAM może obrazować z bardzo wysoką rozdzielczością, ale z ograniczoną głębią obrazowania. Szybkość obrazowania systemu AR i OR-PAM zależy głównie od częstotliwości powtarzania impulsów źródła lasera27.
Połączenie AR-PAM i OR-PAM przyniesie ogromne korzyści aplikacjom, które wymagają zarówno wysokiej rozdzielczości, jak i głębszego obrazowania. Niewiele wysiłku włożono w połączenie tych systemów. Zwykle do obrazowania używa się dwóch różnych skanerów obrazowania, co wymaga przenoszenia próbki między obydwoma systemami, co utrudnia wykonywanie obrazowania in vivo. Jednak obrazowanie hybrydowe zarówno z AR, jak i OR PAM umożliwia obrazowanie ze skalowalnymi rozdzielczościami i głębokościami. W jednym z podejść wiązka światłowodu jest używana do dostarczania światła zarówno do AR, jak i OR PAM. W tym podejściu stosuje się dwa oddzielne lasery (laser wysokoenergetyczny o długości fali 570 nm dla AR i laser o niskiej energii i wysokiej częstotliwości powtarzania o długości fali 532 nm dla sali operacyjnej), co sprawia, że system jest niewygodny i kosztowny28. Długość fali lasera OR-PAM jest stała, a wiele badań, takich jak nasycenie tlenem, nie jest możliwe przy użyciu tego połączonego systemu. Badania porównawcze między AR i OR PAM nie są również możliwe ze względu na różnicę w długościach fal lasera między AR i OR. Co więcej, AR-PAM wykorzystuje oświetlenie jasnego pola; Stąd silne sygnały fotoakustyczne z powierzchni skóry ograniczają jakość obrazu. Z tego powodu system nie może być używany do wielu zastosowań bioobrazowania. W innym podejściu do wykonywania AR i OR PAM ognisko optyczne i ultradźwiękowe jest przesunięte, co powoduje, że ognisko światła i ognisko ultradźwiękowe są niewyrównane. W związku z tym jakość obrazu nie jest optymalna29. Korzystając z tej techniki, AR-PAM i OR-PAM mogą osiągnąć rozdzielczość odpowiednio tylko 139 μm i 21 μm, co czyni go systemem o słabej rozdzielczości. Inne podejście, które obejmuje zmianę światłowodu i kolimację optyczną, powodowało przełączanie między AR i OR PAM, co utrudniało proces wyrównania30. We wszystkich tych przypadkach AR-PAM nie korzystał z oświetlenia ciemnego pola. Zastosowanie oświetlenia ciemnego pola może zmniejszyć generowanie silnych sygnałów fotoakustycznych z powierzchni skóry. W związku z tym obrazowanie tkanek głębokich można przeprowadzić przy użyciu oświetlenia w kształcie pierścienia, ponieważ czułość wykrywania głębokich sygnałów fotoakustycznych będzie wyższa w porównaniu z oświetleniem jasnego pola.
Ta praca informuje o przełączanym systemie obrazowania AR i OR PAM (AR-OR-PAM) zdolnym do obrazowania tkanek głębokich tej samej próbki zarówno w wysokiej rozdzielczości, jak i w niskiej rozdzielczości, przy użyciu tego samego lasera i skanera dla obu systemów. Wydajność systemu AR-OR-PAM charakteryzowano poprzez wyznaczenie rozdzielczości przestrzennej i głębokości obrazowania za pomocą eksperymentów fantomowych. Obrazowanie naczyń krwionośnych krwi in vivo przeprowadzono na uchu myszy, aby zademonstrować jego zdolność do obrazowania biologicznego.

<table><tbody><tr><td>Laser Nd:YAG z przełączaniem Q</td><td>Edgewave</td><td>BX80-2-L</td><td>Laser pompowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Credo-Wysoka powtarzalność Barwnik Laser</td><td>Widma Fizyka</td><td>CREDO-DYE-N</td><td>Laser barwnikowy</td></tr><tr><td>Precyzyjny liniowy stolik</td><td>Physik Instrumente</td><td>PLS 85&nbsp;</td><td>Stolik skanowania rastrowego XY</td></tr><tr><td>Etap tłumaczenia</td><td>Physik Instrumente</td><td>VT 80&nbsp;</td><td>Określenie konfokalne</td></tr><tr><td>Zamontowana fotodioda krzemowa</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PD1A</td><td>Wariant wyzwalania/impulsu</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany ciągły Etap obrotowy&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>CR1 / M-Z7</td><td>Przekierowująca wiązka laserowa</td></tr><tr><td>Zamontowany bezstopniowy filtr ND</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td> światłowodowy <td>o zmiennej intensywności</td></tr><tr><td>Thorlabs</td><td>M29L01</td><td>Wielomodowy mikroskop światłowodowy</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Newport</td><td>M-10X</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mocowanie translacyjne XY</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td>Mocowanie translatywne</td></tr><tr><td>Wypukła soczewka Plano</td><td>Thorlabs</td><td>LA1951</td><td>Soczewka kolimacyjna</td></tr><tr><td>Soczewka stożkowa&nbsp;</td><td>Altechna</td><td>APX-2-B254</td><td>Belka w kształcie pierścienia</td></tr><tr><td>Etap translacji</td><td>Thorlabs</td><td>CT1</td><td>Etap translacyjny</td></tr><tr><td>Kondensator optyczny</td><td>Domowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przetwornik ultradźwiękowy</td><td>Przetwornik Olympus-NDT</td><td>V214-BB-RM</td><td>50MHz</td></tr><tr><td>Soczewka wklęsła Plano</td><td>Thorlabs</td><td>LC4573</td><td>Soczewka akustyczna</td></tr><tr><td>Pulser / Odbiornik</td><td>Olympus-NDT</td><td>5073PR</td><td>Wzmacniacz echa impulsowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Zamontowana standardowa przysłona</td><td>Thorlabs</td><td>ID12/M</td><td>Kształtowanie wiązki</td></tr><tr><td>Wypukła soczewka Plano</td><td>Thorlabs</td><td>LA4327</td><td>Soczewka kondensatora</td></tr><tr><td>Zamontowany precyzyjny otwórek</td><td>Thorlabs</td><td>P50S</td><td>Filtrowanie przestrzenne</td></tr><tr><td>Jednomodowy światłowodowy</td><td>Thorlabs</td><td>P1-460B-FC-1</td><td>Światłowód jednomodowy</td></tr><tr><td>Łącznik światłowodowy</td><td>Newport</td><td>F-91-C1</td><td>Pojedynczy tryb sprzęgło</td></tr><tr><td>Achromatyczny obiektyw dubletowy</td><td>Edmund Optics</td><td>32-317</td><td>Dublet achromatyczny</td></tr><tr><td>Zabezpieczone srebrne lustro eliptyczne</td><td>Thorlabs</td><td>PFE10-P01</td><td>Lustro</td></tr><tr><td>Mocowanie lustra kinematycznego pod kątem prostym</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>Mocowanie lustra</td></tr><tr><td>Oś Z Montaż translacyjny</td><td>Thorlabs</td><td>SM1Z</td><td>z translator</td></tr><tr><td>Tubus obiektywu</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td>SM05L10</tr><tr><td>Pryzmat kątowy z krzemionki topionej UV</td><td></td><td>PS615</td><td>Pryzmat</td>kątowy</tr><tr><td>Pryzmat romboidalny</td><td>Edmund Optics</td><td>47-214</td><td>Fala poprzeczna</td></tr><tr><td>Dimetylopolisiloksan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DMPS1M</td><td>Wzmacniacz oleju silikonowego</td></tr><tr><td></td><td>Mini obwody</td><td>Wzmacniacz ZFL-500LN</td><td></td></tr><tr><td>16-bitowy szybki digitizer</td><td>Spectrum</td><td>M4i.4420</td><td>Karta akwizycji danych</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>Agilent Technologies</td><td>DS06014A</td><td></td></tr><tr><td>Myszy&nbsp;</td><td>InVivos Pte.Ltd</td><td>ICR</td><td>Model zwierzęcy</td></tr><tr><td>Żel do ultradźwięków&nbsp;</td><td>Progress/parker acquasonic gel</td><td>PA-GEL-CLEA-5000 Sprzęgło</td><td>akustyczne</td></tr><tr><td>Zbiornik na wodę</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etap tłumaczenia</td><td>Domowe przełączanie</td><td></td><td>AR-OR</td></tr><tr><td>Nanocząstki złota</td><td>Sigma Aldrich</td><td>742031</td><td>Rozdzielczość boczna</td></tr><tr><td>Sterylna maść do oczu</td><td>Alcon</td><td>Duratears</td><td>Obrazowanie zwierząt</td></tr><tr><td>1951 USAF cel testu rozdzielczości</td><td>Edmund Optics</td><td>38257</td><td>Wyrównanie konfokalne</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>National Instrument</td><td>Labview</td><td>Domowe oprogramowanie za pomocą oprogramowania do</td></tr><tr><td>przetwarzania obrazu</td><td>Labview Mathworks</td><td>Matlab</td><td>Domowy program przy użyciu Matlaba</td></tr></tbody></table>

przełączana mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości akustycznej i optycznej do obrazowania naczyń krwionośnych in vivo małych zwierząt

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Mikroskopia fotoakustyczna (PAM) to szybko rozwijająca się metoda obrazowania invivo, która łączy w sobie zarówno optykę, jak i ultradźwięki, zapewniając penetrację poza średnią optyczną ścieżkę swobodną (~1 mm w skórze) o wysokiej rozdzielczości. Łącząc optyczny kontrast absorpcyjny z wysoką rozdzielczością przestrzenną ultradźwięków w jednej modalności, technika ta może przenikać do głębokich tkanek. Systemy mikroskopii fotoakustycznej mogą mieć albo niską rozdzielczość akustyczną i sondować głęboko, albo wysoką rozdzielczość optyczną i sondować płytko. Osiągnięcie wysokiej rozdzielczości przestrzennej i dużej głębokości penetracji za pomocą jednego systemu jest wyzwaniem. W niniejszej pracy przedstawiono system AR-OR-PAM zdolny zarówno do obrazowania w wysokiej rozdzielczości na płytkich głębokościach, jak i obrazowania głębokich tkanek tej samej próbki in vivo w niskiej rozdzielczości. Rozdzielczość boczna 4 μm z głębokością obrazowania 1,4 mm przy użyciu ogniskowania optycznego oraz rozdzielczość boczna 45 μm przy głębokości obrazowania 7,8 mm przy użyciu ogniskowania akustycznego zostały z powodzeniem zademonstrowane przy użyciu połączonego systemu. W tym przypadku wykonuje się obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt in vivo, aby wykazać ich zdolność do obrazowania biologicznego.

Schemat systemu AR-OR-PAM przedstawiono na Ryc. 1. W tej konfiguracji wszystkie komponenty zostały zintegrowane i zamontowane w układzie klatkowym (optical cage setup). Zastosowanie systemu klatkowego sprawia, że głowica skanująca AR-OR-PAM jest kompaktowa, a jej montaż, wyrównanie i integracja na pojedynczym stole skanującym są łatwe.
Podczas akwizycji obrazów zastosowano dwuwymiarowe ciągłe skanow...

Tutaj demonstrowany jest system do przełączania rozdzielczości akustycznej (AR) i rozdzielczości optycznej (OR) MIKROSKOPII FOTOAKUSTYCZNEJ (AR-OR-PAM), zdolny zarówno do obrazowania w wysokiej rozdzielczości na płytkiej głębokości, jak i obrazowania głębokich tkanek o niskiej rozdzielczości na tej samej próbce in vivo.

Przełączana mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości akustycznej i optycznej do obrazowania naczyń krwionośnych in vivo małych zwierząt

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie systemu mikroskopii fotoakustycznej z przełączalną rozdzielczością akustyczną i optyczną do obrazowania naczyń krwionośnych małych zwierząt in vivo. Mikroskopia fotoakustyczna jest szybko rozwijającą się metodą obrazowania in vivo, która łączy optykę i ultradźwięki, zapewniając głębokość obrazowania wykraczającą poza drogę optyczną przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości. Przedstawiona praca opisuje system mikroskopii fotoakustycznej z przełączalną rozdzielczością akustyczną i optyczną, zdolny do obrazowania o wyższej rozdzielczości na niewielkiej głębokości, a także do obrazowania głębokich tkanek o niższej rozdzielczości tej samej próbki in vivo.Procedurę zademonstrują dr Mohesh Moothanchery, stażysta naukowy z mojego laboratorium, oraz Arunima Sharma, doktorantka z mojego laboratorium. Najpierw należy zbudować nanosekundowy, przestrajalny układ laserowy, wykorzystując laser Nd:YAG w stanie stałym z pompowaniem diodowym oraz laser dwuprzestrajalny w zakresie od 559 do 576 nanometrów. Ustaw laser dwuprzestrajalny na 570 nan.Zamocuj na stole optycznym akrylowy zbiornik z siedmiocentymetrowym polietylenowym oknem obrazującym w dnie zbiornika. Przymocuj platformę obrazującą do słupka optycznego pod oknem obrazującym. Nad zbiornikiem zamontuj klatkę optyczną zawierającą system obrazowania AR-OR-PAM na płycie przełączającej przymocowanej do sterowanego komputerowo trójośowego zmotoryzowanego stołu translacyjnego.Aby skonfigurować system do AR-PAM, należy użyć pryzmatu prostokątnego zamontowanego na zmotoryzowanym stole obrotowym do kierowania wiązki przez zmienny filtr neutralnej gęstości do światłowodu wielomodowego z kuplerem światłowodowym 25 NA. Wyjście światłowodu należy połączyć ze stołem translacyjnym XY w systemie obrazowania. Wiązkę należy skierować przez soczewkę plano-konweksyjną w odległości 25 mm od wyjścia, a następnie przez soczewkę stożkową w celu utworzenia wiązki w kształcie pierścienia.Skompresuj wiązkę w kształcie pierścienia za pomocą kondensora optycznego wokół przetwornika ultradźwiękowego o częstotliwości 50 megahertz z soczewką akustyczną zamontowaną na wyjściu przetwornika. Następnie, aby skonfigurować system do OR-PAM, obróć pierwszy pryzmat kąta prostego o 90 stopni, aby skierować wiązkę laserową przez irys, zmienny filtr neutralnego zagęszczenia, soczewkę kondensatora oraz otwór pinhole umieszczony w odległości 75 millimeters od soczewki kondensatora. Użyj sprzęgacza światłowodowego jednomodowego o NA 1 oraz światłowodu jednomodowego, aby przesłać wiązkę do stolika translacyjnego Z w systemie obrazowania.Kieruj wiązkę przez soczewkę achromatyczną dublet montowaną 50 milimetrów od wyjścia światłowodu. Odchyl wiązkę za pomocą kinematycznego, sterowalnego lustra eliptycznego do drugiej soczewki achromatycznej dublet w tubusie soczewkowym. Skup wiązkę na pryzmacie prostokątnym oddzielonym warstwą oleju silikonowego od pryzmatu rombowego, wyposażonego w soczewkę akustyczną i przetwornik ultradźwiękowy 50 megahertz, który tworzy głowicę skanującą OR-PAM.Przed rozpoczęciem wyrównania systemu należy napełnić zbiorniki akrylowe odgazowaną wodą. Następnie należy użyć trójosiowej platformy zmotoryzowanej, aby przesunąć zespół skanujący nad zbiornikiem. Opuścić zespół, aż soczewki akustyczne obu systemów zostaną zanurzone.Włącz laser. Podłącz przetworniki ultradźwiękowe do dwóch wzmacniaczy o stałym wzmocnieniu wynoszącym 25 dB. Umieść głowicę skanującą AR-PAM nad oknem obrazowania.Umieść szkiełko przedmiotowe owinięte czarną taśmą izolacyjną na stole obrazującym i podnieś stół, aby doprowadzić szkiełko do kontaktu z oknem obrazującym. Dostrój soczewkę stożkową, aż amplituda sygnału fotoakustycznego generowanego z szkiełka osiągnie maksimum, co będzie wskazywać na konfokalność soczewek optycznej i akustycznej. Następnie przełącz się ręcznie na system OR-PAM.Reguluj achromatyczną soczewkę dubletową, aż soczewki optyczna i akustyczna staną się konfokalne, co zostanie wskazane przez maksymalizację amplitudy sygnału fotoakustycznego z oklejonego taśmą preparatu. Aby określić rozdzielczość lateralną każdego z systemów, należy najpierw nanieść 1 mililitra rozcieńczonego roztworu nanocząsteczek złota o rozmiarze 100 nanometrów w wodzie na szkiełko nakrywki. Umieść preparat na stole obrazującym.i podnieś stolik, aż roztwór nanocząsteczek zetknie się z oknem obrazującym. Przełącz laser oraz głowicę skanującą na system AR-PAM. Skonfiguruj oprogramowanie urządzenia do skanowania AR-PAM i wykonaj pojedynczy skan rastrowy.Powtórz ten proces dla systemu OR-PAM. Następnie wyjmij preparat i oczyść okno obrazowania za pomocą tamponu nasączonego alkoholem. Dopasuj funkcje rozproszenia punktu wyznaczone z uzyskanych obrazów do krzywej Gaussa.Pełna szerokość połówki maksymalnej (FWHM) stanowi rozdzielczość boczną dla odpowiadającego systemu skanowania. Następnie, aby określić maksymalną głębokość obrazowania w tkance, należy najpierw wprowadzić ostrą metalową płytkę owiniętą czarną taśmą do niewielkiego fragmentu tkanki kurczaka pod niewielkim kątem. Umieść tkankę w zbiorniku z wodą pod głowicą skanera.Uzyskaj pojedynczy obraz B-scan dla każdego układu. Zmierz głębokość pod powierzchnią tkanki, przy której czarna taśma nie jest już wyraźnie widoczna. Przed wykonaniem obrazowania upewnij się, że zarówno polietylenowe okno obrazujące, jak i platforma obrazująca zwierzęcia są czyste.Następnie, po znieczuleniu myszy, przygotuj samicę myszy w wieku czterech tygodni o masie 25 g do procedury obrazowania. Usuń owłosienie z powierzchni ucha za pomocą kremu depilacyjnego. Na oczy myszy nałóż sterylną maść okulistyczną, aby zapobiec ich wysuszeniu oraz zablokować rozproszone wiązki lasera.Umieść mysz na platformie obrazowej z płytką służącą do pozycjonowania ucha, które ma zostać zobrazowane. Monitoruj stan fizjologiczny myszy za pomocą pulsoksymetru przymocowanego do ogona lub nogi zwierzęcia. Nałóż żel ultradźwiękowy na obrazowane ucho.Powoli podnieś platformę obrazującą, aby delikatnie doprowadzić ucho do kontaktu z polietylenowym oknem obrazującym. Wykonaj rastrowe skany AR-PAM i OR-PAM ucha myszy, monitorując jej stan fizjologiczny przez cały czas trwania procedury. Pozostaw mysz do pełnego odpoczynku po zakończeniu obrazowania.Układ naczyniowy krwi myszy został tutaj zobrazowany in vivo za pomocą przełączalnego systemu AR-OR-PAM. Naczynia krwionośne o średnicy powyżej 45 µm były wyraźnie widoczne na obrazie AR-PAM. Pojedyncze kapilary o szerokości około 5 µm zostały rozdzielone dzięki obrazowaniu OR-PAM.Połączony system AR-OR-PAM posiada rozdzielczość boczną wynoszącą około czterech mikronów i głębokość obrazowania 0,4 mm dla OR-PAM oraz rozdzielczość boczną wynoszącą około 45 mikrometrów i głębokość obrazowania 7,8 mm dla AR-PAM. Przełączalny, połączony system AR-OR-PAM umożliwia obrazowanie bez konieczności przenoszenia próbki pomiędzy różnymi systemami obrazowania.Opracowany system może być wykorzystany do obrazowania przedklinicznego. Główne zastosowania przedkliniczne obejmują obrazowanie androgenezy, mikrośrodowisk nowotworowych, mikrokrążenia, odpowiedzi na leki, funkcji mózgu, biomarkerów oraz aktywności genów.

switchable-acoustic-optical-resolution-photoacoustic-microscopy-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) to rozwijająca się technologia umożliwiająca obrazowanie kontrastów absorpcji optycznej in vivo z rozdzielczością i czułością na poziomie komórkowym. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję wizualną dotyczącą protokołów eksperymentalnych OR-PAM, obejmującą konfigurację systemu, jego kalibrację, typowe procedury eksperymentalne in vivo oraz schematy obrazowania funkcjonalnego.

Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej

Oftalmologia fotoakustyczna (PAOM), będąca modalnością obrazowania opartą na absorpcji optycznej, umożliwia uzupełniającą ocenę siatkówki w stosunku do obecnie dostępnych technologii obrazowania okulistycznego. Przedstawiamy zastosowanie PAOM zintegrowanego z optyczną koherencyjną tomografią w domenie widmowej (SD-OCT) do jednoczesnego multimodalnego obrazowania siatkówki u szczurów.

Zintegrowana fotoakustyczna oftalmoskopia i optyczna koherentna tomografia w dziedzinie widmowej

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Obecna praca opisuje nowy protokół do wykonywania nieinwazyjnych ultradźwięków o wysokiej częstotliwości i obrazowania fotoakustycznego na mózgu szczura, aby efektywnie wizualizować głębokie obszary podkorowe i ich wzorce naczyniowe poprzez kierowanie sygnałów na otwór czaszki naturalnie występujący na zwierzęcej czaszce.

Nieinwazyjne miąższowe, naczyniowe i metaboliczne ultrasonografie wysokiej częstotliwości i fotoakustyczne obrazowanie głębokiego mózgu szczura

Pokazano kompaktowy system tomografii fotoakustycznej oparty na diodach impulsowych (PLD-PAT) do szybkiego obrazowania mózgu in vivo u małych zwierząt.

Wysokowydajny, kompaktowy system tomografii fotoakustycznej do obrazowania in vivo mózgu małych zwierząt

Kliniczny ręczny system obrazowania fotoakustycznego zostanie zademonstrowany do nieinwazyjnego obrazowania małych zwierząt w czasie rzeczywistym.

Ręczny kliniczny system obrazowania fotoakustycznego do nieinwazyjnego obrazowania małych zwierząt w czasie rzeczywistym

Ten manuskrypt opisuje nowatorską procedurę konfiguracji i obsługi mikroskopii fotoakustycznej i optycznej koherentnej tomografii dual-modality do nieinwazyjnego, bezznacznikowego obrazowania kosmówkowo-siatkówkowego większych zwierząt, takich jak króliki.

Nowatorska mikroskopia fotoakustyczna i optyczna tomografia koherentna Obrazowanie naczyniówkowe siatkówki dwumodalnej w żywych oczach królika

Kompaktowy system stacjonarnej tomografii fotoakustycznej oparty na pulsacyjnych diodach laserowych (PLD-PAT) jest demonstrowany do szybkiego dynamicznego obrazowania in vivo naczyń korowych małych zwierząt.

Pulsacyjna tomografia fotoakustyczna oparta na diodach laserowych do monitorowania wymywania i wymywania barwnika w uczynieniu kory mózgowej szczura

Zaprojektowano dwurastrowy skaner fotoakustyczny, który integrował obrazowanie szerokokątne i obrazowanie w czasie rzeczywistym.

Fotoakustyczny aparat do obrazowania małych zwierząt z podwójnym skanowaniem rastrowym do wizualizacji naczyń krwionośnych

Pokazano szybki i otwarty ultrafioletowy mikroskop fotoakustyczny, który może śródoperacyjnie dostarczać obrazy histologiczne do chirurgicznej analizy marginesów, w tym konfiguracji systemu, wyrównania optycznego, przygotowania próbki i procedur eksperymentalnych.

Szybka mikroskopia fotoakustyczna w ultrafiolecie do obrazowania histologicznego z wirtualnym barwieniem wspomagana przez głębokie uczenie

Obecny protokół opisuje pozyskiwanie wielospektralnych obrazów optoakustycznych in vivo ludzkiego układu krwionośnego. Obejmują one kwantyfikację hemoglobiny i melaniny, uważanych za chromofory będące przedmiotem zainteresowania dla analizy funkcjonalnej.

Wielospektralna tomografia optoakustyczna do obrazowania funkcjonalnego w badaniach naczyniowych

Poznaj przełączaną mikroskopię fotoakustyczną AR-OR-PAM do obrazowania naczyń krwionośnych małych zwierząt in vivo. System umożliwia wysoką rozdzielczość przy płytkich głębokościach i niższą w głębszych tkankach.

Przełączana mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości akustycznej i optycznej do obrazowania naczyń krwionośnych in vivo małych zwierząt (Wideo) | JoVE Journal

Przełączana mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości akustycznej i optycznej do obrazowania naczyń krwionośnych in vivo małych zwierząt

Przeglądaj więcej filmów