Przełączana mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości akustycznej i optycznej do obrazowania naczyń krwionośnych in vivo małych zwierząt

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie przełączalnego systemu mikroskopii fotoakustycznej o rozdzielczości akustycznej i optycznej do obrazowania in vivo naczyń krwionośnych małych zwierząt. Mikroskopia fotoakustyczna to szybko rozwijająca się metoda obrazowania in vivo, która łączy optykę i ultradźwięki, zapewniając głębię obrazowania poza ścieżką optyczną o wysokiej rozdzielczości. Obecna praca to przełączany akustyczny system mikroskopii fotoakustycznej o rozdzielczości optycznej, zdolny do obrazowania w wyższej rozdzielczości na płytkiej głębokości, a także obrazowania głębokich tkanek o niższej rozdzielczości tej samej próbki in vivo.

Procedurę zademonstrują dr Mohesh Moothanchery, pracownik naukowy z mojego laboratorium, oraz Arunima Sharma, doktorantka z mojego laboratorium. Po pierwsze, zbuduj nanosekundowy, przestrajalny system laserowy z pompowanego diodą, półprzewodnikowego lasera Nd:YAG i ditunable lasera o zasięgu od 559 do 576 nanometrów. Ustaw ditunable laser na 570 nan.

Zamontuj na stole optycznym akrylowy zbiornik z siedmiocentymetrowym okienkiem obrazowania z polietylenu w podłodze zbiornika. Przymocuj stolik obrazowania do słupka optycznego pod oknem obrazowania. Nad zbiornikiem zamontuj klatkę optyczną zawierającą system obrazowania AR-OR-PAM na płycie przełączającej przymocowanej do sterowanego komputerowo trójosiowego zmotoryzowanego stolika translacyjnego.

Aby skonfigurować system dla AR-PAM, użyj prawego pryzmatu anioła zamontowanego na zmotoryzowanym ciągłym stoliku obrotowym, aby skierować wiązkę przez filtr o zmiennej gęstości neutralnej do wielomodowego światłowodowego ze złączem światłowodowym 25 NA. Podłącz wyjście światłowodu do stopnia translacji XY w systemie obrazowania. Skieruj wiązkę przez wypukłą soczewkę plano 25 milimetrów od wyjścia, a następnie przez soczewkę stożkową, aby utworzyć wiązkę w kształcie pierścienia.

Skoncentruj wiązkę w kształcie pierścienia na kondensatorze optycznym wokół 50-megahercowego przetwornika ultradźwiękowego z soczewką akustyczną zamontowaną na wyjściu przetwornika. Następnie, aby skonfigurować system dla OR-PAM, obróć pierwszy pryzmat kąta prostego o 90 stopni, aby skierować wiązkę laserową przez tęczówkę, filtr o zmiennej gęstości neutralnej, soczewkę kondensatora i otwór otworkowy ustawiony w odległości 75 milimetrów od soczewki skraplacza. Użyj jednomodowego łącznika światłowodowego 1 NA i światłowodu jednomodowego, aby wysłać wiązkę do etapu translacji Z w systemie obrazowania.

Skieruj wiązkę przez achromatyczną soczewkę dubletową zamontowaną w odległości 50 milimetrów od wyjścia światłowodu. Skieruj wiązkę za pomocą kinematycznego, sterowanego, eliptycznego zwierciadła na drugą achromatyczną soczewkę dubletową w tubusie obiektywu. Skoncentruj wiązkę na pryzmacie pod kątem prostym oddzielonym warstwą oleju silikonowego od romboidalnego pryzmatu, wyposażonym w soczewkę akustyczną i 50-megahercowy przetwornik ultradźwiękowy, który tworzy głowicę skanującą OR-PAM.

Przed przystąpieniem do wyrównywania systemu należy napełnić zbiorniki akrylowe odgazowaną wodą. Następnie użyj trzyosiowego zmotoryzowanego stolika, aby przesunąć zespół skanujący nad zbiornikiem. Opuść zespół, aż soczewki akustyczne obu systemów zostaną zanurzone.

Włącz laser. Podłącz przetworniki ultradźwiękowe do dwóch 25-decybelowych wzmacniaczy o stałym wzmocnieniu. Umieść głowicę skanującą AR-PAM nad oknem obrazowania.

Umieść szklany szkiełko owinięte czarną taśmą izolacyjną na stoliku do obrazowania i podnieś stolik, aby zetknął się z okienkiem obrazowania. Wyreguluj soczewkę stożkową, aż amplituda sygnału fotoakustycznego generowanego przez szkiełko osiągnie maksimum, co oznacza, że soczewki optyczne i akustyczne są konfokalne. Następnie ręcznie przełącz się na system OR-PAM.

Wyreguluj achromatyczną soczewkę dubletową, aż soczewki optyczne i akustyczne staną się konfokalne, jak wskazano poprzez maksymalizację amplitudy sygnału fotoakustycznego ze szkiełka pokrytego taśmą. Aby określić rozdzielczość poprzeczną każdego systemu, najpierw umieść 1 mililitr rozcieńczonego roztworu 100 nanonanometrów nanocząstek złota w wodzie na szkiełku nakrywkowym. Umieść szkiełko na stoliku do obrazowania.

i podnieś stolik, aż roztwór nanocząstek zetknie się z oknem obrazowania. Przełącz laser i głowicę skanującą na system AR-PAM. Skonfiguruj oprogramowanie instrumentu do skanowania AR-PAM i wykonaj pojedyncze skanowanie rastrowe.

Powtórz ten proces dla systemu OR-PAM. Następnie zdejmij szkiełko i wyczyść okienko obrazowania wacikiem nasączonym alkoholem. Dopasuj funkcje rozrzutu punktowego wyznaczone na podstawie uzyskanych obrazów do krzywej Gaussa.

Pełna szerokość w połowie maksimum to rozdzielczość boczna dla odpowiedniego systemu skanowania. Następnie, aby określić maksymalną głębokość obrazowania w tkance, najpierw włóż ostrą metalową płytkę owiniętą czarną taśmą w mały fragment tkanki kurczaka pod płytkim kątem. Umieść chusteczkę w zbiorniku na wodę pod głowicą skanera.

Uzyskaj pojedynczy obraz B-scan dla każdego systemu. Zmierz głębokość pod powierzchnią tkanki, na której taśma nie jest już wyraźnie widoczna. Przed przystąpieniem do obrazowania należy upewnić się, że okienko obrazowania z polietylenu i etap obrazowania zwierząt są czyste.

Następnie należy uzyskać 25-gramową, czterotygodniową samicę myszy do procedury obrazowania po znieczuleniu myszy. Usuń włosy z powierzchni ucha za pomocą kremu do depilacji. Nałóż sterylną maść do oczu myszy, aby zapobiec wysuszeniu i zablokować rozproszone wiązki laserowe.

Umieść mysz na stoliku do obrazowania z płytką do ustawiania ucha na obrazie. Monitoruj stan fizjologiczny myszy za pomocą pulsoksymetru przymocowanego do ogona lub nogi myszy. Nałóż żel ultradźwiękowy na ucho, które ma być zobrazowane.

Powoli podnieś stolik do obrazowania, aby delikatnie zetknąć ucho z okienkiem obrazowania z polietylenu. Skany rastrowe ucha myszy w sieciach AR-PAM i OR-PAM umożliwiają monitorowanie stanu fizjologicznego myszy przez cały czas. Pozwól myszy w pełni odzyskać sprawność po obrazowaniu.

Układ krwionośny myszy został zobrazowany in vivo za pomocą przełączalnego systemu AR-OR-PAM. Naczynia krwionośne grubsze niż 45 mikrometrów były wyraźnie widoczne na obrazie AR-PAM. Pojedyncze naczynia włosowate o szerokości około pięciu mikrometrów rozdzielono za pomocą obrazowania OR-PAM.

Połączony system AR-OR-PAM ma rozdzielczość boczną około czterech mikronów. W tym momencie obrazowanie cztery mm dla OR-PAM i rozdzielczość boczna około 45 mikrometrów oraz obrazowanie 7,8 mm dla AR-PAM. Przełączany system AR-OR-PAM umożliwia obrazowanie bez przenoszenia próbki między różnymi systemami obrazowania.

Opracowany system może być wykorzystywany do obrazowania przedklinicznego. Główne zastosowania przedkliniczne obejmują obrazowanie androgenezy, mikrośrodowisk guza, mikrokrążenia, reakcji na leki, funkcji mózgu, biomarkerów i aktywności genów.