Name: Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metody manipulacji architekturą hydrożeli białkowych do hodowli komórkowej 3D. Techniki modyfikacji porowatości i funkcjonalizacji peptydami RGD umożliwiają optymalizację materiałów dla różnych linii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Fundacji Baden-Württemberg za wsparcie finansowe w ramach "Bioinspired Material Synthesis" (BioMatS-14).

1. Przygotowanie hydrożelu
<ol>
	<li>Wymieszać 200 mg BSA z 1 mL dejonizowanej H2O, aby przygotować 20% (w/v) roztwór zapasowy BSA (roztwór zapasowy A).</li>
	<li>Wymieszać 165 µL roztworu THPC (134 mg/mL) z 4,835 mL dejonizowanej wody, aby przygotować roztwór zapasowy THPC (roztwór zapasowy B).</li>
	<li>Odważyć 1 mg peptydy KCSSGKSRGDS (1 111,1 g/mol) (lub równoważnego peptydy adhezyjnego dla komórek) i rozpuścić w 100 µL sterylnej H2O, aby otrzymać roztwór o stężeniu 10 mg/mL (roztwór zapasowy C). 
	UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i należy go wykonać tylko wtedy, gdy hydrożel jest przeznaczony do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Usunąć dno płytki 96-dołkowej i zastąpić je zdejmowalną folią plastikową. 
	UWAGA: W przypadku płytek użytych w tej procedurze dno można łatwo usunąć, wywierając nacisk na spód każdego dołka; cienkie plastikowe dno po prostu wypadnie.</li>
	<li>Wymieszać 100 µL roztworu zapasowego BSA (A) i 100 µL roztworu zapasowego THPC (B) (opcjonalnie: 4 µL roztworu zapasowego C w przypadku funkcjonalizowanych, adhezyjnych dla komórek hydrożeli) w płytce 96-dołkowej, aby otrzymać 200 µL hydrożelu. Składniki wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół co najmniej 5 razy, aby zagwarantować jednorodność hydrożelu po polimeryzacji.</li>
	<li>Pozostawić płytkę 96-dołkową w temperaturze pokojowej (RT) przez około 10 min, aż wszystkie hydrożele ulegną prawidłowej polimeryzacji.</li>
	<li>Ostrożnie i powoli usunąć folię plastikową z dna płytki.</li>
	<li>Wypchnąć hydrożele z płytki 96-dołkowej za pomocą małej stempla i przenieść je do probówek 1,5 mL z sterylnym PBS, pH 7,4. 
	UWAGA: Hydrożele mają kształt cylindryczny o średnicy około 4 mm i wysokości 8 mm.</li>
	<li>Przechowywać hydrożele w roztworze soli fosforanowej (PBS) w temperaturze 4 °C przez maksymalnie kilka miesięcy.</li>
</ol>
2. Liofilizacja hydrożeli
<ol>
	<li>Napełnić probówki 1,5 mL ilością 500 µL sterylnej wody dejonizowanej H2O i zdjąć nakrętki. Przenieść hydrożele do probówek reakcyjnych 1,5 mL za pomocą szpatułki.</li>
	<li>Szczelnie owinąć probówki 1,5 mL folią parafinową – przynajmniej trzy warstwy dla każdej probówki. Za pomocą igły wykonać małe otwory w folii, aby umożliwić uwalnianie gazów z probówki.</li>
	<li>Przejść do jednego z poniższych kroków:
	<ol>
		<li>Przenieść probówki do ciekłego azotu na 5 min, aby zapewnić całkowite zamrożenie wody i hydrożelu. Natychmiast po wyjęciu z ciekłego azotu przenieść probówki do liofilizatora, aby zapobiec rozmrożeniu materiału. 
		UWAGA: Ta procedura pozwala uzyskać pory o promieniu około 10-15 µm.</li>
		<li>Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C przez noc, aby powoli zamrozić hydrożele. Natychmiast po wyjęciu z temperatury -20 °C przenieść probówki do liofilizatora, aby zapobiec rozmrożeniu materiału. 
		UWAGA: Ta procedura pozwala uzyskać pory o promieniu około 50-60 µm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 24 h (i całkowitym odparowaniu wody wewnątrz i wokół hydrożelu) rozmrozić materiał, wyjmując go z liofilizatora. 
	UWAGA: Wielkość porów można przeanalizować za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (krok 5, „Wizualizacja hydrożelu”).</li>
</ol>
3. Ługowanie cząstek
<ol>
	<li>Przygotować hydrożel zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.5.</li>
	<li>Bezpośrednio po wymieszaniu składników dodać NaCl aż do uzyskania stanu nasycenia (36 mg/mL). Dodać sól do momentu, gdy w roztworze pojawi się biały osad w postaci kryształków soli.</li>
	<li>Przenieść płytkę 96-dołkową na wytrząsarkę i wytrząsać do czasu zajścia polimeryzacji (około 10 min). Usunąć hydrożele z płytki zgodnie z opisem w krokach 1.7-1.8.</li>
	<li>Inkubować hydrożele przez co najmniej 24 h w RT w sterylnej wodzie na wytrząsarce (20 rpm), aby wymyć całą sól z matrycy hydrożelu. Przechowywać hydrożele w 4 °C w PBS przez okres do kilku miesięcy.</li>
</ol>
4. Formowanie kanału
<ol>
	<li>Przygotować hydrożele zgodnie z opisem w kroku 1. Wyjąć hydrożel z roztworu za pomocą pęsety, usunąć nadmiar wody za pomocą wysoce chłonnego papieru i umieścić go na bloku suchego lodu.</li>
	<li>Zamrozić hydrożel przez 30 s i ostrożnie zdjąć go z bloku. Należy uważać, aby nie uszkodzić hydrożelu; do jego zdrapywania z bloku należy ostrożnie użyć szpatułki. Przenieść hydrożel do probówki 1.5 mL i suszyć go przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Wizualizacja hydrożelu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy rodaminy B, rozpuszczając 1 mg rodaminy B w 10 mL PBS. Przygotować rozcieńczenia seryjne, rozcieńczając roztwór zapasowy rodaminy w PBS, aż do uzyskania stężenia 0,001 mg/mL (czynnik rozcieńczenia: 100)</li>
	<li>Wyjąć hydrożel z roztworu do przechowywania (np. z kroku 2.4.) i przenieść go do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 1 mL roztworu rodaminy B o stężeniu 0,01 mg/mL. Barwić hydrożel w roztworze rodaminy B przez noc w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Następnego dnia przenieść hydrożel przeznaczony do wizualizacji do 10 mL PBS (pH 7,4) i płukać przez co najmniej 3 h.</li>
	<li>Przenieść hydrożel do dołka płytki µ-slide 8 i przykryć go PBS.</li>
	<li>Za pomocą ostrza wyciąć z hydrożelu cienkie plastry (o wysokości około 0,5 mm).</li>
	<li>Przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego zwizualizować hydrożel przy długości fali 514 nm (obiektyw: EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC M27, tryb skanowania płaszczyzny: 514 nm, powiększenie: 1X).</li>
</ol>
6. Wykonalność hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Przefiltruj sterylnie wszystkie roztwory zapasowe (A, B i C) za pomocą filtra 0,45 µm.</li>
	<li>Przygotuj hydrożel zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.4, dodając peptyd adhezyjny dla komórek przed polimeryzacją hydrożelu.</li>
	<li>Po zmieszaniu składników natychmiast nanieś pipetą mieszaninę do dołka µ-slide 8, aż dno zostanie całkowicie pokryte. 
	UWAGA: Krok ten należy wykonać szybko i bezpośrednio po zmieszaniu składników, ponieważ polimeryzacja w szkiełku zachodzi w ciągu kilku minut.</li>
	<li>Hoduj komórki adhezyjne i pasażuj je w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, stosując standardowe techniki hodowli komórkowych. Przenieś komórki do uprzednio ogrzanej, sterylnej pożywki DMEM uzupełnionej o płodową surowicę bydlęcą (FBS, 10% (w/v)), penicylinę-streptomycynę (1% (w/v)) oraz roztwór niezasadniczych aminokwasów (MEM, 1% (w/v)).</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory Neubauera i ostrożnie nanieś pipetą 200 µL pożądanej liczby komórek (2 x 105 komórek/cm2) na powierzchnię hydrożelu.</li>
	<li>Przykryj dołek µ-slide 8 pokrywką i przenieś do inkubatora (37 °C, 5% CO2). Inkubuj przez co najmniej 4 h w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po co najmniej 4 h przylegania komórek przemyj je dwukrotnie 200 µL sterylnego PBS do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Utrwal komórki za pomocą 200 µL 3,7% (v/v) formaldehydu przez 10 min w RT i przemyj dwukrotnie PBS-em (~200 µL). 
	UWAGA: Podczas pracy z formaldehydem należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Permeabilizuj komórki za pomocą 200 µL 0,1% Triton X przez 5 min. Przemyj dwukrotnie PBS-em.</li>
	<li>Przebarw komórki faloidyną z rhodaminą, mieszając 5 µL roztworu zapasowego w metanolu z 195 µL PBS i dodając mieszaninę do komórek w RT. Barw komórki przez 20 min w ciemności. Przemyj dwukrotnie PBS-em.</li>
	<li>Zbadaj właściwości adhezji komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego przy 514 nm (obiektyw: EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC M27, tryb skanowania płaszczyzny: 514 nm, powiększenie: 1X). Przeanalizuj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
7. Właściwości hydrożelu
<ol>
	<li>Stopień pęcznienia.
	<ol>
		<li>Całkowicie wysuszyć hydrożele w temperaturze 37 °C przez co najmniej jeden dzień.</li>
		<li>Zważyć każdy hydrożel i zapisać dokładną masę.</li>
		<li>Napełnić probówkę reakcyjną o objętości 2 mL ilością 1,5 mL PBS.</li>
		<li>Przenieść hydrożel do tej probówki reakcyjnej 2 mL i całkowicie zanurzyć go w PBS.</li>
		<li>Pozostawić hydrożel w PBS w RT przez co najmniej dwa dni, aby osiągnął stan równowagi z PBS.</li>
		<li>Po trzech dniach wyjąć hydrożel z roztworu i osuszyć go ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody z powierzchni hydrożelu.</li>
		<li>Zważyć hydrożel.</li>
		<li>Obliczyć stopień pęcznienia, korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Wzór na obliczenie stopnia pęcznienia, Ws-Wd/Wd, równanie analizy rozszerzenia materiału." src="/files/ftp_upload/55813/55813eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
		gdzie Wd to masa wysuszonego żelu (krok 7.1.2.), a Ws to masa mokrego żelu (krok 7.1.7). Pomnożyć wynik przez 100, aby otrzymać procentowy stopień pęcznienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stabilność pH i temperatury.
	<ol>
		<li>Przenieść 5 mL PBS do probówki reakcyjnej o objętości 15 mL.</li>
		<li>Dostosować pH roztworu do odpowiedniej wartości (np. pH 2, 7 lub 10) za pomocą NaOH i HCl. Doprowadzić roztwór do odpowiedniej temperatury (np. RT, 37 °C lub 80 °C).</li>
		<li>Przenieść hydrożel, którego stabilność ma zostać zbadana, do odpowiedniego roztworu. W razie potrzeby ponownie skorygować pH. 
		UWAGA: Na tym etapie wszystkie hydrożele powinny być całkowicie spęczniałe (patrz: stopień pęcznienia), aby zapobiec błędnej interpretacji masy wynikającej z pęcznienia materiału.</li>
		<li>Po określonych odstępach czasu wyjąć hydrożel z roztworu (np. co godzinę przez maksymalnie 2 dni), osuszyć go bardzo chłonnym ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody, a następnie zważyć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Degradacja enzymatyczna.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór zapasowy enzymów o stężeniu 300 U trypsyny i pepsyny, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Przenieść hydrożel (np. z kroku 1.8) do odpowiedniego roztworu. 
		UWAGA: Na tym etapie wszystkie hydrożele powinny być całkowicie spęczniałe, aby zapobiec błędnej interpretacji masy.</li>
		<li>Po określonych odstępach czasu wyjąć hydrożel z roztworu (np. co godzinę), osuszyć go bardzo chłonnym ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody, a następnie zważyć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomimetic+hydrogel+based+on+methacrylated+dextran-graft-lysine+and+gelatin+for+3D+smooth+muscle+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture.</a> Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).</li>
<li>Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+macroporous+PEG+hydrogels+as+3D+scaffolds+for+the+multiplication+of+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).</li>
<li>Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-component+protein-engineered+physical+hydrogels+for+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).</li>
<li>Zhu, J., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+properties+of+hydrogel+tissue-engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devic%22%5BJournal%5D)">Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds.</a> Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).</li>
<li>Samaryk, V., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/app.30426/abstract">Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties.</a> J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).</li>
<li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+3D+cell+culture%3A+potential+application+for+tissue-based+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).</li>
<li>Park, H., Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Swelling+Ratio+of+Injectable+Hydrogel+Composites+on+Chondrogenic+Differentiation+of+Encapsulated+Rabbit+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro.</a> Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).</li>
<li>Stokols, S., Tuszynski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fabrication+and+characterization+of+linearly+oriented+nerve+guidance+scaffolds+for+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury.</a> Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).</li>
<li>Sung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Impact+of+2D+and+3D+Fibroblast+Cultures+on+In+Vitro+Breast+Cancer+Models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models.</a> PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).</li>
<li>Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+hydrogel+guidance+channels+facilitate+regeneration+of+adult+rat+brainstem+motor+axons+after+complete+spinal+cord+transection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection.</a> J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).</li>
<li>Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+hydrogels+used+in+cell+encapsulation%3A+An+in+vitro+comparison+of+alginate+and+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose.</a> Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).</li>
<li>Chiu, Y. -C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+physical+and+mechanical+properties+of+porous+poly+%28ethylene+glycol%29-co-%28L-lactic+acid%29+hydrogels+during+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation.</a> PloS One. 8 (4), e60728(2013).</li>
<li>Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm202640w">Peptide- and Protein-Based Hydrogels.</a> Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).</li>
<li>Bodenberger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+bread+and+beer%3A+whole+cell+protein+extracts+from+baker%27s+yeast+as+a+bulk+source+for+3D+cell+culture+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biot%22%5BJournal%5D)">Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices.</a> Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).</li>
<li>Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/slct.201600206/abstract">A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties.</a> Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).</li>
<li>Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrospinning+technique+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Use of electrospinning technique for biomedical applications.</a> Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).</li>
<li>Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-electrospraying+and+droplet-based+microfluidics%3A+control+of+cell+numbers+within+living+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biome+Mater%22%5BJournal%5D)">Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues.</a> Biome Mater. 5 (2), 21001(2010).</li>
<li>Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electrospinning+highly+concentrated+cellular+suspensions+containing+primary+living+organisms+into+cell-bearing+threads+and+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds.</a> Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).</li>
<li>Selimović, Š, Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+strategies+for+generating+cell-encapsulating+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels.</a> Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).</li>
<li>Annabi, N., Nichol, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+porosity+and+microarchitecture+of+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).</li>
<li>Bodenberger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+pore+generation+and+their+influence+on+physio-chemical+properties+of+a+protein+based+hydroge%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge.</a> Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).</li>
<li>Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+and+redox+sensitive+albumin+hydrogel%3A+A+self-derived+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial.</a> Sci Rep. 5, 15977(2015).</li>
<li>Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+crosslinking+methods+to+design+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliver+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel crosslinking methods to design hydrogels.</a> Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).</li>
<li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrakis%28hydroxymethyl%29+phosphonium+chloride+as+a+covalent+cross-linking+agent+for+cell+encapsulation+within+protein-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).</li>
<li>Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014305714004091">Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products.</a> Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).</li>
<li>Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+transformation+and+physical+properties+of+a+hydrogel-forming+peptide+studied+by+NMR%2C+transmission+electron+microscopy%2C+and+dynamic+rheometer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer.</a> Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).</li>
<li>Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+leaching+for+scaffold+porosity+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci%22%5BJournal%5D)">Microspheres leaching for scaffold porosity control.</a> J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).</li>
<li>Whang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bone+Regeneration+with+Bioabsorbable+Scaffolds+with+Novel+Microarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture.</a> Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).</li>
<li>Ziv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+silk-alginate+hydrogel+scaffold+for+stem+cell+culture+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation.</a> Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).</li>
<li>Butruk-Raszeja, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Athrombogenic+hydrogel+coatings+for+medical+devices--Examination+of+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+B%22%5BJournal%5D)">Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties.</a> Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).</li>
<li>Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/sm/c1sm06053h">Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization.</a> Soft Matter. 7 (22), 10763(2011).</li>
<li>Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+in+cell+adhesion%3A+RGD+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins.</a> Science. 238 (4826), 491-497 (1987).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Produkcja matryc makroporowatych może być korzystna dla wielu różnych dziedzin. Posiada duży potencjał techniczny i ekonomiczny ze względu na zdefiniowaną strukturę hydrożelu oraz możliwość kontrolowania i dostrajania określonych właściwości materiału. Jednak wprowadzenie supramolekularnych elementów strukturalnych, takich jak pory lub kanały, do szablonu 3D może wpłynąć na ogólne właściwości materiału, takie jak współczynnik pęcznienia lub sztywność. Może to spowodować niepożądany rozkład, degradację lub awarię sieci, c...

Hydrożele to materiały, które tworzą nierozpuszczalne sieci 3D zdolne do wiązania dużych ilości wody. Takie materiały mogą zapewnić doskonałe warunki środowiskowe dla żywych komórek. Obecnie obserwuje się coraz większe zainteresowanie wytwarzaniem trójwymiarowych struktur hydrożelowych oraz opracowywaniem procesów dostosowujących ich właściwości chemiczne i fizyczne. Gdy to zostanie osiągnięte, można wygenerować szablon do wzrostu komórek i manipulowania ich zachowaniem1,2,3,4. Te struktury 3D nie tylko tworzą bardziej naturalne i realistyczne środowisko niż konwencjonalne podejścia dwuwymiarowe, ale także ujawniają nowe możliwości wzrostu komórek macierzystych lub modeli nowotworowych5. Różne materiały mają szereg cech, które zależą głównie od wielkości porów żelu6. Pory odgrywają kluczową rolę w zastosowaniach związanych z hodowlą komórek, inżynierią tkankową i ukierunkowanym wzrostem komórek macierzystych. Na przykład tlen i składniki odżywcze dyfundują przez matrycę, a odpowiednie ilości muszą być w stanie dotrzeć do komórek7. Z drugiej strony, szkodliwe metabolity muszą być usuwane tak szybko, jak to możliwe, a do wzrostu komórek musi być dostępna wystarczająca ilość miejsca7. W związku z tym właściwości materiału, a tym samym wielkość porów, mają duży wpływ na potencjalne korzyści i możliwe zastosowania matrycy. W zależności od właściwości materiału, w hodowli komórkowej 3D mogą zachodzić różne procesy wzrostu komórek, w tym tworzenie struktur neuronalnych; wzrost i różnicowanie komórek skóry lub kości; oraz ukierunkowany wzrost specjalnych linii komórek macierzystych, takich jak hepatocyty lub fibroblasty2,3,8,9,10,11. Kolejnym istotnym punktem wpływającym na możliwe zastosowanie materiału jest jego stabilność na bodźce zewnętrzne12. Na przykład hydrożel musi zachować swoją integralność mechaniczną w pożywce do hodowli komórkowych lub w organizmie ludzkim.
W ostatnich latach zintensyfikowano badania nad hydrożelami do hodowli komórkowych 3D i przeprowadzono wiele badań mających na celu rozwiązanie architektur 3D systemów13. Hydrożele złożone z chemicznie syntetyzowanych składników są najczęściej badane, ponieważ można je łatwo syntetyzować i modyfikować chemicznie oraz wykazują wysoką stabilność (patrz Zhu et al., 2011 w celu przeglądu)5. Białka mają jednak wiele korzystnych właściwości: jako tak zwane "polimery precyzyjne" są biokompatybilne; mają określoną długość; są stosunkowo łatwe do modyfikacji; i mają dużą liczbę stron docelowych14,15. W związku z tym można generować wysoce specyficzne, innowacyjne struktury do zastosowania w wielu dziedzinach. W tym badaniu wykorzystano hydrożel16 na bazie białka, aby zademonstrować zdolność dobrze znanych metod do wpływania na architekturę 3D materiału. Ponadto zbadano zdolność i zastosowanie do generowania porów.
Dostępnych jest wiele różnych technik modyfikacji struktur 3D, w tym zarówno proste metody, jak i wyrafinowane, wysoce specjalistyczne techniki z różnych dziedzin materiałoznawstwa. Szeroko rozpowszechnioną techniką jest wykorzystanie elektroprzędzenia do generowania dobrze zdefiniowanych struktur17. Naładowane włókna są wyciągane z roztworu przez pole elektryczne, a następnie krzepną pod wpływem tlenu. W ten sposób można wyprodukować włókna w zakresie od kilku nanometrów do kilku mikronów. Dodatkowe techniki dostrajania rozmiaru, struktury i rozmieszczenia porów w matrycy to litografia miękka, fotolitografia, ogniskowanie hydrodynamiczne, natryskiwanie elektronatryskowe i biodrukowanie18,19,20. Istotną wadą tych technik jest ich zależność od specyficznego, drogiego sprzętu i specjalnych chemikaliów lub materiałów. Co więcej, doświadczenia z tymi technikami często nie można bezpośrednio przenieść na materiały na bazie białek, a wiele substancji chemicznych i metod nie jest kompatybilnych z komórkami.
Z drugiej strony, wiele technik nie opiera się na specjalnym sprzęcie, co czyni je łatwiejszymi i tańszymi do zastosowania i odtworzenia. Szeroko rozpowszechnioną metodą manipulacji strukturą jest odlewanie rozpuszczalnikiem21,22,23. Cząstki są dodawane przed reakcją polimeryzacji i rozprowadzane jednorodnie w celu nasycenia roztworu. Po polimeryzacji zmiana warunków, taka jak rozcieńczenie lub zmiana pH, prowadzi do solwatacji cząstek, podczas gdy pory pozostają w materiale. Chemikalia używane w tych technikach, takie jak sól, cukier, parafina, żelatyna i kreda, są tanie i łatwo dostępne. Podczas liofilizacji spęczniałe hydrożele są zamrażane. Następnie przeprowadzana jest sublimacja faz ciekłych w próżni23,24,25. Sublimacja wody z sieci jest na tyle delikatna, że pozwala zachować specyficzne struktury 3D materiału. W przypadku spieniania gazowego roztwór jest strumieniowany gazem podczas polimeryzacji, pozostawiając pory w żelu21. Wielkość i rozmieszczenie porów można regulować w zależności od strumienia gazu.
Aby utworzyć hydrożel białkowy, BSA reaguje z tetrakis (hydroksymetylo)chlorkiem fosfoniowym (THPC) w reakcji typu Mannicha, aby umożliwić tworzenie wiązań kowalencyjnych między aminami pierwszorzędowymi a grupami hydroksylowymi czteroramiennej cząsteczki łącznika26. Ewentualne szkodliwe produkty pośrednie są usuwane przez nadmierne mycie materiału po zajściu reakcji.
To badanie pokazuje możliwość obróbki materiału opartego na BSA za pomocą różnych technik manipulowania i dostosowywania wielkości porów. Każda z technik może być stosowana w dowolnym laboratorium na całym świecie, ponieważ nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt. Ponadto zbadano i porównano ze sobą różne parametry, takie jak współczynnik pęcznienia, degradowalność enzymatyczna, stabilność pH i wrażliwość na temperaturę, ze szczególnym uwzględnieniem wpływu różnych technik na generowanie architektur 3D. Na koniec materiały funkcjonalizowano peptydami adhezyjnymi w celu zbadania możliwego zastosowania materiałów w hodowli komórkowej. Wykorzystano dwie różne modelowe linie komórkowe: A549 i MCF7.

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (wysoka glukoza)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&nbsp;</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Technologie życia / Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM Nieistotny roztwór aminokwasów</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 0,05% Fenol Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99,8%, verg&auml; llt</td><td>&Ouml; lfabrik Schmidt</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Frakcja albuminy V</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>3854.2</td><td></td></tr><tr><td>THPC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>0,1% Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Lekko toksyczny</td></tr><tr><td>falloidyna-rodamina&nbsp;</td><td>Technologie życia / Thermo Fisher&nbsp;</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>3,7% Formaldehyd&nbsp;</td><td>Technologie życia / Thermo Fisher&nbsp;</td><td>F8775-25ML</td><td>Toksyczna</td></tr><tr><td>rodamina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0,2&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>2 83.1826.001&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&micro; slide 8 well</td><td>Ibidi GmbH</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>KCSSGKSRGDS peptyd</td><td>UPEP Ulm</td><td>Niestandardowy sysnthesis</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99,8%, verg&auml; llt</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>K928.5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Polistynowa tuba okrągłodenna&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml&nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 2 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>MIKROPŁYTKA DO HODOWLI KOMÓRKOWYCH, 96 DOŁKÓW, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner</td><td>655073</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator Epsilon 1-6D,&nbsp;</td><td>Christ, Osterode am Harz, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7</td><td>GSA GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrożele są uznawane za obiecujące materiały do zastosowań w hodowlach komórkowych ze względu na ich zdolność do dostarczania wysoce nawodnionego środowiska komórkowego. Pole szablonów 3D rośnie ze względu na potencjalne podobieństwo tych materiałów do naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Hydrożele na bazie białek są szczególnie obiecujące, ponieważ można je łatwo funkcjonalizować i osiągać określone struktury o regulowanych właściwościach fizykochemicznych. Jednak produkcja makroporowatych szablonów 3D do zastosowań w hodowlach komórkowych przy użyciu materiałów naturalnych jest często ograniczona ze względu na ich słabsze właściwości mechaniczne w porównaniu z materiałami syntetycznymi. W tym przypadku oceniono różne metody wytwarzania makroporowatych systemów hydrożelowych opartych na albuminie surowicy bydlęcej (BSA), z regulowaną wielkością porów w zakresie od 10 do 70 μm w promieniu. Ponadto opracowano metodę generowania kanałów w tym materiale białkowym o długości kilkuset mikronów. Przeanalizowano różne metody wytwarzania porów, a także wpływ wielkości porów na właściwości materiału, takie jak współczynnik pęcznienia, pH, stabilność temperaturowa i degradacja enzymatyczna. Rozmiary porów badano w natywnym, spuchniętym stanie hydrożeli za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Wykonalność zastosowań w hodowlach komórkowych oceniono przy użyciu adhezyjnej peptydu RGD systemu białkowego i dwóch modelowych linii komórkowych: ludzkich komórek raka piersi (A549) i adenokracynomicznych ludzkich komórek podstawnego nabłonka pęcherzyków płucnych (MCF7).

Opracowywanie hydrożeli stało się jedną z najważniejszych dziedzin badań biologicznych związanych z inżynierią materiałową, z tysiącami wpisów w archiwach badań naukowych. Choć zachowanie wielu systemów jest dobrze przebadane, manipulowanie sieciami 3D, zwłaszcza w przypadku wrażliwych materiałów białkowych, często stanowi istotny problem w nauce o materiałach. Kolenym często niedocenianym wyzwaniem jest prawidłowy pomiar natywnej struktury materiału przy użyciu kriomikroskopii elektronow...

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Ogólnym celem tej metodologii jest stworzenie makroporowatych hydrożeli o różnych rozmiarach porów do zastosowań w hodowli komórkowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie hodowli komórkowej 3D, takie jak zasadnicza wykonalność zastosowania nowego materiału hydrożelowego w hodowlach 3D. Główną zaletą tej metodologii jest to, że oferuje ona szereg technik pozwalających na optymalizację i dostosowanie nowego materiału do wymagań różnych typów komórek.Aby rozpocząć, należy rozpuścić jeden miligram peptydu RGD lub równoważnego peptydu adhezyjnego w 100 µL sterylnej wody, aby otrzymać roztwór o stężeniu 10 mg/mL. Następnie należy usunąć dno płytki 96-dołkowej i zastąpić je folią plastikową. W dołku płytki 96-dołkowej należy zmieszać 100 µL roztworu zapasu BSA i 100 µL roztworu zapasu THPC, aby uzyskać 200 µL hydrożelu.Wymieszaj składniki, pipetując roztwór w górę i w dół co najmniej pięć razy, aby zapewnić jednorodność hydrożelu po polimeryzacji. Pozostaw płytkę 96-dołkową w temperaturze pokojowej przez około 10 minut, aż wszystkie hydrożele ulegną prawidłowej polimeryzacji. Po polimeryzacji ostrożnie i powoli usuń folię plastikową z dna płytki.Wydrukuj hydrożele z płytki 96-dołkowej za pomocą małego rylca i przenieś je do probótek 1,5 ml z jałowym PBS pH 7.4. Przechowuj hydrożele w roztworze soli fosforanowej w temperaturze 4 °C do kilku miesięcy. Aby liofilizować hydrożele, najpierw napełnij probótki 1,5 ml 500 µl jałowej wody dejonizowanej i zdejmij zakrętki.Przenieść hydrożele do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml za pomocą pęsety. Szczelnie owinąć probówki 1,5 ml folią parafinową, stosując co najmniej trzy warstwy dla każdej fiolki. Za pomocą igły wykonać w folii niewielkie otwory, aby umożliwić ucieczkę gazów z probówek.Aby zagwarantować całkowite zamrożenie wody i hydrożelu, przenieś fiolkę do ciekłego azotu na pięć minut. Natychmiast po wyjęciu z ciekłego azotu przenieś fiolki do liofilizatora, aby zapobiec rozmarzaniu materiału. Jako alternatywny etap mrożenia można pozostawić fiolki w temperaturze -20 °C przez noc, aby powoli zamrozić hydrożele.Niezwłocznie po wyjęciu z temperatury -20 °C przenieść fiolki do liofilizatora, aby zapobiec rozmrożeniu materiału. Po 24 godzinach i całkowitym odparowaniu wody wewnątrz oraz wokół hydrożelu, rozmrozić materiał, wyjmując go z liofilizatora. W celu wymywania cząstek wymieszać składniki hydrożelu w sposób opisany wcześniej.Po wymieszaniu natychmiast dodaj chlorek sodu aż do momentu nasycenia. Dodawaj sól, dopóki w roztworze nie pojawią się kryształy soli w postaci białego osadu. Wielkość porów można zmieniać poprzez rozcieranie kryształów soli przed użyciem.Przenieś płytkę 96-dołkową na wytrząsarkę i wytrząsaj do momentu zajścia polimeryzacji. Po około 10 minutach usuń hydrożele z płytki w ten sam sposób co wcześniej. Inkubuj hydrożele przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej w sterylnej wodzie na rotatorze, aby wypłukać całą sól z matrycy hydrożelowej.Przechowywać hydrożele w temperaturze 4 °C w PBS przez okres do kilku miesięcy. W celu łagodnego formowania przygotować hydrożele zgodnie z opisem. Następnie wyjąć hydrożel z roztworu za pomocą pęsety.Usuń nadmiar wody za pomocą silnie chłonnego papieru i umieść go na bloku suchego lodu. Zamroź hydrożel przez 30 s, a następnie ostrożnie zdejmij go z bloku. Należy uważać, aby nie uszkodzić hydrożelu.Używając szpatułki, ostrożnie zeskrob go z bloku. Przenieś hydrożel do probówki o pojemności 1,5 ml i susz go przez noc w temperaturze 37 °C. Przygotuj roztwór zapasowy rodaminy B oraz rozcieńczenia szeregowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Wyjmij hydrożel z roztworu przechowującego i przenieś go do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml roztworu rodaminy B o stężeniu 0,01 mg/ml. Barwi hydrożel w roztworze rodaminy B przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia przenieś hydrożel przeznaczony do wizualizacji do 10 ml PBS i płucz przez co najmniej trzy godziny.Za pomocą ostrza wytnij niewielkie plasterki hydrożelu. Następnie przenieś hydrożel na ośmiogniazdowy szkiełko mikroskopowe i pokryj go PBS. Wykorzystując konfokalny skaningowy mikroskop laserowy, zwizualizuj hydrożel przy długości fali 514 nanometrów.Wszystkie roztwory stokowe przefiltruj sterylnie przez filtr 0,45 mikrona. Rozpocznij przygotowanie hydrożelu, dodając peptyd adhezyjny dla komórek przed polimeryzacją hydrożelu. Po wymieszaniu składników natychmiast pipetuj mieszaninę na ośmiopolową szkiełko mikroskopowe, aż dno zostanie całkowicie pokryte.Przenieś komórki do uprzednio ogrzanej, sterylnej pożywki DMEM uzupełnionej o surowicę wołową płodu, penicylinę, streptomycynę oraz roztwór aminokwasów nieessentialnych. Po przeliczeniu komórek za pomocą komory Neubauera, ostrożnie nanieś pipetą 200 µL zawiesiny o pożądanej liczbie komórek na powierzchnię hydrożelu. Przykryj szkiełko mikroskopowe z ośmioma dołkami pokrywką i przenieś je do inkubatora.Po co najmniej czterech godzinach przylegania komórek, przemyj je dwukrotnie 200 µL sterylnego PBS do hodowli komórkowych. Następnie utrwal komórki, dodając 200 µL 3,7% formaldehydu, inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj dwukrotnie PBS. Przeprowadź permeabilizację komórek za pomocą 200 µL 0,1% Triton X przez pięć minut, po czym ponownie przemyj je dwukrotnie PBS.Zbarw komórki Toluidine Rhodamine, mieszając 5 µL roztworu zapasowego w metanolu z 195 µL PBS i dodając mieszaninę do komórek w temperaturze pokojowej. Inkubuj barwnik z komórkami przez 20 minut w ciemności, a następnie przemyj je dwukrotnie PBS. Właściwości adhezji komórek zbadaj przy użyciu mikroskopu konfokalnego przy 514 nm.Należy przeanalizować właściwości hydrożelu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Jak pokazano tutaj, spolimeryzowane i barwione hydrożele nie posiadają charakterystycznej architektury. Po liofilizacji hydrożeli w różnych temperaturach, średnia wielkość porów wewnątrz hydrożelu może zostać zwiększona do 60 mikronów.Wymywanie soli prowadzi do powstania jednorodnych sieci o rozmiarach porów wynoszących około 10 mikronów. Rozmiar ten można dodatkowo dostosować poprzez rozcieranie kryształów soli przed użyciem. Zastosowanie metody zamrażania gradientowego na bloku suchego lodu prowadzi do utworzenia kanałów o średnicy około 20 mikronów i długości wynoszącej kilkaset mikronów.Przed funkcjonalizacją za pomocą grupy adhezyjnej komórki nie mogą przylegać do powierzchni hydrożelu i wykazują okrągłą morfologię. Dopiero po wyposażeniu materiału w peptyd adhezyjny komórki odnajdują punkty adhezji ogniskowej, które umożliwiają prawidłowe przyleganie komórki do materiału. Jest to kluczowe dla wykorzystania nowych materiałów w zastosowaniach związanych z trójwymiarową hodowlą komórkową.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak modyfikować architekturę hydrożelu za pomocą prostych metod. Metodę tę można zastosować w przypadku większości nowoczesnych systemów hydrożelowych, aby zapoznać się z ich wykorzystaniem w hodowlach komórkowych oraz zoptymalizować architekturę hydrożelu w zależności od zamierzonego zastosowania.

easy-manipulation-architectures-protein-based-hydrogels-for-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Prezentujemy syntezę hydrożelu białkowego, w którym pośredniczy rozszczepiona inteina. Budulcem tego hydrożelu są dwa kopolimery białkowe, z których każdy zawiera podjednostkę białka trimerycznego, która służy jako środek sieciujący i połowę rozszczepionej inteiny. Zmieszanie dwóch kopolimerów białkowych wyzwala reakcję splicingu trans-inteinowego, w wyniku której powstaje jednostka polipeptydowa, która samoorganizuje się w hydrożel. Ten hydrożel jest wysoce stabilny pod względem pH i...

Synteza sztucznego hydrożelu białkowego za pośrednictwem inteiny

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Tutaj przedstawiono protokół hermetyzacji i hodowli komórek w hydrożelach z poli(glikolu etylenowego) (PEG) funkcjonalizowanych peptydem degradowalnym przez metaloproteinazę o matrycy fluorogennej (MMP). Komórkowy MMP i aktywność metaboliczną mierzy się bezpośrednio z kultur hydrożelowych za pomocą standardowego czytnika mikropłytek.

Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D

Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.

Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

Poznaj metody manipulacji architekturą hydrożeli białkowych do hodowli komórkowej 3D. Techniki modyfikacji porowatości i funkcjonalizacji peptydami RGD umożliwiają optymalizację materiałów dla różnych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

Przeglądaj więcej filmów