Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ogólnym celem tej metodologii jest stworzenie makroporowatych hydrożeli o różnej wielkości porów do zastosowań w hodowlach komórkowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hodowli komórkowych 3D, takie jak podstawowa wykonalność nowego materiału hydrożelowego do zastosowań w hodowlach komórkowych 3D. Główną zaletą tej metodologii jest to, że oferuje ona szereg technik optymalizacji i dostosowania nowego materiału do wymagań różnych typów ogniw.

Na początek rozcieńczyć jeden miligram peptydu RGD lub równoważnego peptydu adhezyjnego w 100 mikrolitrach sterylnej wody, aby uzyskać roztwór 10 miligramów na mililitr. Następnie usuń spód płytki 96-dołkowej i zastąp ją folią do usuwania. Wymieszać 100 mikrolitrów roztworu podstawowego BSA i 100 mikrolitrów roztworu podstawowego THPC na płytce 96-dołkowej, aby uzyskać 200 mikrolitrów hydrożelu.

Wymieszać składniki, pipetując w górę i w dół co najmniej pięć razy, aby zagwarantować jednolity hydrożel po polimeryzacji. Umieść 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej na około 10 minut, aż wszystkie hydrożele zostaną odpowiednio spolimeryzowane. Po polimeryzacji ostrożnie i powoli usuń plastikową folię z dna płytki.

Wyciśnij hydrożele z płytki 96-dołkowej za pomocą małego dźgnięcia i przenieś je do 1,5 mililitrowej probówki o sterylnym PBS pH 7,4. Przechowuj hydrożele w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do kilku miesięcy. Aby liofilizować hydrożele, najpierw napełnij 1,5-mililitrowe probówki 500 mikrolitrami sterylnej wody dejonizowanej i zdejmij nakrętki.

Przenieś hydrożele do 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych za pomocą kleszczy. Owinąć szczelnie probówki o pojemności 1,5 mililitra folią parafinową, nakładając co najmniej trzy warstwy na każdą fiolkę. Użyj igły, aby przebić małe otwory w folii, aby umożliwić uwolnienie gazu z rurek.

Aby zagwarantować, że woda i hydrożel całkowicie zamarzną, przenieś fiolkę do ciekłego roztworu azotu na pięć minut. Natychmiast po usunięciu z ciekłego azotu przenieść fiolki do liofilizatora, aby zapobiec rozmrożeniu materiału. Alternatywnym etapem zamrażania jest utrzymywanie fiolek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc, aby powoli zamrażać hydrożele.

Natychmiast po wyjęciu z minus 20 stopni Celsjusza należy przenieść fiolki do liofilizatora, aby zapobiec rozmrożeniu materiału. Po 24 godzinach i całkowitym odparowaniu wody w hydrożelu i wokół niego, należy rozmrozić materiał, wyjmując go z liofilizatora. W celu wypłukiwania cząstek należy wymieszać składniki hydrożelu jak poprzednio.

Po wymieszaniu natychmiast dodać chlorek sodu, aż do momentu nasycenia. Dodaj sól, aż kryształki soli będą widoczne w roztworze jako biały osad. Wielkość porów można zmienić, mieląc kryształki soli przed użyciem.

Przenieś 96-dołkową płytkę do wytrząsarki i potrząsaj aż do polimeryzacji. Po około 10 minutach usuń hydrożele z płytki jak poprzednio. Inkubować hydrożele przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej w sterylnej wodzie na rotatorze, aby wymyć całą sól z matrycy hydrożelu.

Przechowuj hydrożele w temperaturze czterech stopni Celsjusza w PBS przez okres do kilku miesięcy. Aby uzyskać delikatne formowanie, przygotuj hydrożele zgodnie z opisem. Następnie usuń hydrożel z roztworu za pomocą szczypiec.

Usuń nadmiar wody za pomocą wysoce chłonnego papieru i umieść go na bloku suchego lodu. Zamroź hydrożel na 30 sekund i ostrożnie wyjmij go z bloku. Nie uszkadzaj hydrożelu.

Ostrożnie użyj szpatułki, aby zeskrobać go z bloku. Przenieś hydrożel do 1,5 mililitrowej tubki i wysusz przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotować roztwór podstawowy rodaminy B oraz seryjne rozcieńczenia zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Usuń hydrożel z przechowywanego roztworu i przenieś go do 1,5 mililitrowej probówki z jednym mililitrem 0,01 miligrama na mililitr roztworu rodaminy B. Hydrożel należy zabarwić przez noc w roztworze rodaminy B w temperaturze pokojowej. Następnego dnia przenieś hydrożel, który ma być uwidoczniony, do 10 mililitrów PBS i myj przez co najmniej trzy godziny.

Wytnij małe plasterki z hydrożelu za pomocą ostrza. Następnie przenieś hydrożel na ośmiodołkowe szkiełko mikroskopowe i przykryj go PBS. Za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego zwizualizuj hydrożel o długości fali 514 nanometrów.

Sterylny filtr wszystkich roztworów podstawowych z filtrem 0,45 mikrona. Rozpocznij przygotowanie hydrożelu i dołącz peptyd adhezyjny komórki przed polimeryzacją hydrożelu. Po wymieszaniu składników natychmiast odpipetować mieszaninę do mikroskopijnego szkiełka z ośmioma dołkami, aż dno zostanie całkowicie pokryte.

Przenieś komórki do wstępnie ogrzanej, sterylnej pożywki do hodowli komórek DMEM uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą, penicyliną streptomycyną i nieistotnym roztworem aminokwasów. Po zliczeniu komórek za pomocą komory liczącej Neubauera, ostrożnie odpipetować 200 mikrolitrów żądanej liczby komórek na powierzchnię hydrożelu. Przykryj ośmiodołkowe szkiełko mikroskopijne pokrywką i przenieś je do inkubatora.

Po co najmniej czterech godzinach przyłączenia komórkowego umyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami sterylnej hodowli komórkowej PBS. Następnie utrwal komórki 200 mikrolitrami 3,7% formaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i umyj dwukrotnie PBS. Udrażniaj komórki za pomocą 200 mikrolitrów 0,1% Triton X przez pięć minut, a następnie umyj je jeszcze dwukrotnie PBS.

Wybarwić komórki rodaminą toluidynową, mieszając pięć mikrolitrów bulionu metanolowego ze 195 mikrolitrami PBS i dodając go do komórek w temperaturze pokojowej. Barwić komórki przez 20 minut w ciemności, a następnie dwukrotnie umyć PBS. Zbadaj właściwości adhezyjne komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego o długości 514 nanometrów.

Przeanalizuj właściwości hydrożelu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Jak pokazano tutaj, spolimeryzowane i barwione hydrożele nie mają charakterystycznej architektury. Po liofilizacji hydrożeli w różnych temperaturach, średnia wielkość porów w hydrożelu może zostać rozszerzona do 60 mikronów.

Wypłukiwanie soli powoduje powstanie jednolitych sieci o wielkości porów około 10 mikronów. Rozmiar można dodatkowo dostosować, mieląc kryształki soli przed użyciem. Zastosowanie gradientowego podejścia zamrażania na bloku suchego lodu prowadzi do powstania kanałów o średnicy około 20 mikronów i długości kilkuset mikronów.

Przed funkcjonalizacją za pomocą ugrupowania adhezyjnego komórki nie mogą przylegać do powierzchni hydrożelu i wykazywać okrągłej morfologii. Dopiero po dostarczeniu do materiału peptydu adhezyjnego komórki, komórki znajdują ogniskowe punkty adhezji, które umożliwiają prawidłowe przyleganie komórki do materiału. Ma to kluczowe znaczenie dla wykorzystania nowych materiałów w zastosowaniach związanych z hodowlą komórkową 3D.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak manipulować architekturą hydrożelu za pomocą prostych metod. Metoda ta może być stosowana w przypadku większości nowatorskich systemów hydrożelowych, aby dowiedzieć się więcej o zastosowaniu w hodowli komórkowej i zoptymalizować architekturę hydrożelu w zależności od zamierzonego zastosowania.