Name: Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj odwracalną modulację szlaku MAPK za pomocą światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Ta metoda pozwala precyzyjnie kontrolować aktywność kinazy w komórkach i organizmach wielokomórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez University of Illinois at Urbana-Champaign (UIUC) oraz National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podczas budowy kasetonu należy zmierzyć moc poszczególnych diod LED. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach, moc wyjściowa może się różnić między poszczególnymi diodami LED ze względu na różnice produkcyjne. Wybierz zestaw diod LED, które mają moc wyjściową w granicach 10% od siebie. Liczba diod LED, rezystor ograniczający prąd i pobór mocy mogą być modyfikowane dla różnych typów pojemników do hodowli komórkowych (np. płytka 6-dołkowa lub 24-dołkowa). 24 godziny oświetlenia światłem o mocy 0,2 mW/c...

Czynniki wzrostu są zaangażowane w szerokie spektrum funkcji komórek, w tym proliferację, różnicowanie, migrację i apoptozę, i odgrywają kluczową rolę w wielu zdarzeniach biologicznych, w tym w rozwoju embrionalnym, starzeniu się i regulacji stanu psychicznego1,2,3,4,5. Wiele czynników wzrostu sygnalizuje poprzez złożone wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne. Te zdarzenia sygnalizacyjne są często obsługiwane przez odwracalną fosforylację białek w precyzyjnie regulowany sposób6,7. W związku z tym zrozumienie wyników sygnalizacji kinaz białkowych, które są odpowiedzialne za fosforylację białek, ma fundamentalne znaczenie.
Różne czynniki wzrostu działają poprzez dość powszechną wewnątrzkomórkową sieć sygnalizacyjną, mimo że stymulują różne reakcje komórkowe8,9. Typowe wewnątrzkomórkowe mediatory receptorowych kinaz tyrozynowych obejmują Ras, Raf, kinazę regulowaną sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK), kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK)/kinazę ERK (MEK), kinazę fosfoinozytolu 3 (PI3K), Akt i fosfolipazę C gamma (PLCγ)10,11. Coraz więcej dowodów sugeruje, że różnorodność i swoistość sygnalizacji zależą od przestrzennej i czasowej regulacji aktywności sygnalizacyjnej12. Na przykład w komórkach guza chromochłonnego szczura (PC12) stymulacja naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), która powoduje proliferację komórek, przejściowo aktywuje szlak ERK9. Z drugiej strony, stymulacja czynnikiem wzrostu nerwów (NGF), który prowadzi do różnicowania komórek, aktywuje szlak ERK w sposób trwały9,13. W hodowanych neuronach hipokampa szczurów przejściowa sygnalizacja przez neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) sprzyja pierwotnemu wzrostowi neurytów, podczas gdy trwała sygnalizacja prowadzi do zwiększonego rozgałęziania się neurytów14. Podczas wczesnego rozwoju embrionalizowanego aktywność fosforylowanego ERK jest dynamiczna czasowo i jest szeroko rozpowszechniona w całym embryo6. Niedawne genetyczne badanie przesiewowe przeprowadzone podczas wczesnej embriogenezy Xenopus wykazało, że kaskady sygnalizacyjne ERK i Akt, dwa dalsze szlaki głównego czynnika wzrostu, wykazują profile aktywacji specyficzne dla danego etapu7. W związku z tym zrozumienie wyników sygnalizacji kinazy wymaga narzędzi, które mogą badać przestrzenne i czasowe cechy aktywności kinazy z wystarczającą rozdzielczością.
Konwencjonalne eksperymentalne podejścia do badania dynamicznej natury transdukcji sygnału podczas rozwoju nie mają pożądanej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Na przykład podejścia farmakologiczne wykorzystują małe cząsteczki chemiczne lub biologiczne do stymulowania lub tłumienia transdukcji sygnału w komórkach i tkankach. Dyfuzyjny charakter tych małych cząsteczek sprawia, że ograniczenie ich działania do określonego obszaru zainteresowania jest wyzwaniem15. Podejścia genetyczne (np. transgeneza, system Cre-Lox lub mutageneza) często prowadzą do nieodwracalnej aktywacji lub represji ekspresji docelowego genu lub aktywności białka16,17,18. System Tet-On/Tet-Off19 oferuje lepszą kontrolę czasową transkrypcji genów, ale brakuje mu ścisłej kontroli przestrzennej, ponieważ opiera się na dyfuzji tetracykliny. Ostatnie osiągnięcia w zakresie chemicznie indukowanej dimeryzacji białek20 lub foto-uncaging21,22,23,24 znacznie poprawiły czasową kontrolę sieci sygnalizacyjnych. Kontrola przestrzenna pozostaje jednak trudna ze względu na dyfuzyjny charakter chemikaliów przechowywanych w klatkach.
Ostatnio pojawiające się podejścia optogenetyczne, które wykorzystują moc światła do kontrolowania interakcji białko-białko, pozwalają na modulację szlaków sygnałowych z wysoką precyzją czasoprzestrzenną, jak również odwracalnością. Krótko po początkowym sukcesie w kontrolowaniu wypalania neuronów25,26,27, optogenetyka została rozszerzona o kontrolę innych procesów komórkowych, takich jak transkrypcja genów, translacja, migracja komórek, różnicowanie i apoptoza28,29,30,31,32,33,34. Niedawno opracowano strategię wykorzystującą fotoaktywowaną parę białek Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) i N-końcową domenę kryptochromowej helisy zasady interakcji kryptochromowej (CIBN) w celu kontrolowania aktywności kinazy Raf1 w komórkach ssaków i zarodkach Xenopus35. CRY2 wiąże się z CIBN po stymulacji światłem niebieskim, a kompleks białkowy CRY2/CIBN dysocjuje spontanicznie w ciemności34. Światło niebieskie wzbudza kofaktor CRY2, dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), co prowadzi do zmiany konformacyjnej CRY2, a następnie jego wiązania się z CIBN. Konsekwentnie aktywne (W374A) i ubogie w flawiny (D387A) mutanty CRY2 mogą być wytwarzane poprzez mutacje w kieszeni wiążącej FAD: mutantCRY2 W374A wiąże się z CIBN niezależnie od światła, podczas gdy mutant CRY2D387A nie wiąże się z CIBN pod wpływem stymulacji światłem niebieskim36,37. System optogenetyczny opisany w tym protokole wykorzystuje CRY2 i CIBN typu dzikiego do indukowania aktywacji Raf1 za pośrednictwem translokacji białek w żywych komórkach. Wiadomo, że rekrutacja Raf1 przez błonę zwiększa jego aktywność38. W tym systemie tandemowy moduł CIBN jest zakotwiczony w błonie plazmatycznej, a CRY2-mCherry jest połączony z N-końcem Raf135. Przy braku światła niebieskiego CRY2-mCherry-Raf1 pozostaje w cytoplazmie, a Raf1 jest nieaktywny. Stymulacja światłem niebieskim indukuje wiązanie CRY2-CIBN i rekrutuje Raf1 do błony komórkowej, gdzie Raf1 jest aktywowany. Aktywacja RAF stymuluje kaskadę sygnalizacyjną Raf/MEK/ERK. Zarówno białka fuzyjne CRY2, jak i CIBN są kodowane w bicystronicznym systemie genetycznym. Strategię tę można uogólnić w celu kontrolowania innych kinaz, takich jak Akt, których stan aktywacji może być również włączony przez translokację białek w komórkach39. W pracy przedstawiono szczegółowe protokoły realizacji tej strategii optogenetycznej w hodowlach komórek ssaków i organizmach wielokomórkowych.

<table><tbody><tr><td>Szkiełko nakrywkowe&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 230</td><td>Podłoże do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Uchwyt szkiełka nakrywkowego&nbsp;</td><td>Nowości Dostawa</td><td>6817B</td><td>Uchwyt do szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Detergent&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>16 000 104</td><td>Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Kwas borowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500G</td><td>Do wytwarzania buforu PLL</td></tr><tr><td>Tetraboran disodowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71996-250G</td><td>Do wytwarzania&nbsp; Bufor PLL</td></tr><tr><td>Zlewka plastikowa</td><td>Nalgene</td><td>1201-1000</td><td>Do czyszczenia szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-2.5KG</td><td>Do regulacji pH</td></tr><tr><td>Bromek poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274-500MG</td><td>Do powlekania szkiełka nakrywkowego</td></tr><tr><td>Woda uzdatniona dietylopirowęglanem (DEPC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>750024</td><td>Do przygotowania DNA</td></tr><tr><td>Kleszcze do szkła nakrywkowego</td><td>Ted Pella</td><td>5645</td><td>Obsługa szkła nakrywkowego</td></tr><tr><td>Naczynie na sztućce Thermofisher</td><td></td><td>12565321</td><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Sterylne probówki wirówkowe</td><td>ThermoFisher</td><td>12-565-271</td><td>Przechowywanie buforowe</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji</td><td>ThermoFisher</td><td>R0534</td><td>Transfekcja</td></tr><tr><td>CO2-independent ThermoFisher</td><td></td><td>18045088</td><td>Do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Ellsworth Kleje</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td>Forma komory komórkowej</td></tr><tr><td>Zestaw plazmidowy Maxiprep</td><td>Qiagen</td><td>12965</td><td>Preparat plazmidowy</td></tr><tr><td>Pożywka DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965-084</td><td>Pożywka do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Składnik F12K ThermoFisher</td><td></td><td>21127022</td><td>Składnik pożywki do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>ThermoFisher</td><td>16050122</td><td>Składnik pożywki do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Signa-Aldrich</td><td>12303C-500 mL</td><td>Pożywka do hodowli komórek Składnik</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td>Pożywka do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15050065&nbsp;</td><td>Do dysocjacji komórek ssaków</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>Do przygotowania DNA</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Heathcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>Do buforu zarodkowego</td></tr><tr><td>Monohydrat chlorowodorku L-cysteiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.02839.0025</td><td>Preparat oocytów</td></tr><tr><td>ApaI</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1414</td><td>Do linearyzacji plazmidów</td></tr><tr><td>Dnaza I</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2222</td><td>Do usuwania matrycy DNA w teście transkrypcyjnym in vitro</td></tr><tr><td>Materiały o dopasowanym indeksie (olejek immersyjny)</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-20LN</td><td>Do dopasowania indeksu między substratem próbki a obiektywem</td></tr><tr><td>Niebieska dioda LED</td><td>Adafruit</td><td>301</td><td>Źródło światła do stymulacji optogenetycznej</td></tr><tr><td>Zestaw rezystorów</td><td>Amazon</td><td>EPC-103</td><td>Rezystor ograniczający prąd</td></tr><tr><td>Skrzynki aluminiowe</td><td>Kaseton świetlny BUD Industries</td><td>AC-401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BreadBoard</td><td>Jekewin</td><td>837654333686</td><td>Do wykonania tablicy LED</td></tr><tr><td>Hook up Wire</td><td>Electronix Express</td><td>27WK22SLD25</td><td>Do wykonania</td></tr><tr><td>modułu przekaźnika</td> LED <td>Jbtek</td><td>SRD-05VDC-SL-C</td><td>Do przerywanego sterowania oświetleniem</td></tr><tr><td>Zasilacz prądu stałego&nbsp;</td><td>TMS</td><td>DCPowerSupply-LW-(PS-305D)</td><td>Zasilacz do LED</td></tr><tr><td>Silicon&nbsp; Moc&nbsp; Głowica</td><td>Thorlabs</td><td>S121C</td><td>Do pomiaru natężenia światła</td></tr><tr><td>Miernik mocy</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D&nbsp;</td><td>Do pomiaru natężenia światła</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMI8</td><td>Do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>ThermoFisher</td><td>1300 Series A2</td><td>Do obsługi komórek ssaków</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>ThermoFisher</td><td>Isotemp</td><td>Do hodowli komórek ssaków</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>Do mikromanipulacji zarodkami</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td>Do mikroiniekcji zarodków Ściągacz</td></tr><tr><td>do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P87</td><td>Ściągacz igieł</td></tr> <tr><td>in vitro zestaw do transkrypcji</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1340</td><td>Do transkrypcji in vitro. W skład zestawu wchodzi woda wolna od nukleaz, SP6 RNA&nbsp; Polimeraza, mieszanina rybonukleotydów, analog kapu, roztwór do wytrącania chorydu litu i kolumna wirowa&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania RNA</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Kolumna wirowa z membraną krzemionkową do oczyszczania zsyntetyzowanego RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Piec konwekcyjny</td><td>MTI corporation</td><td>&nbsp; EQ-DHG-9015</td><td>Utwardzanie PDMS</td></tr><tr><td>Mieszalnik odśrodkowy i pojemnik teflonowy</td><td>THINKY</td><td>AR310</td><td>Do mieszania PDMS</td></tr><tr><td>Wafel</td><td>krzemowy UniversityWafer</td><td>452</td><td>Baza do wykonywania urządzeń PDMS&nbsp;</td></tr><tr><td>Ostrze</td><td>Techni Edge</td><td>01-801</td><td>Do cięcia PDMS</td></tr><tr><td>Szkło kapilarne</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Do produkcji igieł iniekcyjnych. nbsp;</td></tr></tbody></table>

odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego xenopus

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Aktywność kinazy jest kluczowa dla wielu funkcji komórkowych, w tym proliferacji komórek, różnicowania, migracji i apoptozy. We wczesnym okresie rozwoju embrionalnego aktywność kinazy jest bardzo dynamiczna i szeroko rozpowszechniona w całym zarodku. Podejścia farmakologiczne i genetyczne są powszechnie stosowane do badania aktywności kinazy. Niestety, osiągnięcie doskonałej rozdzielczości przestrzennej i czasowej przy użyciu tych strategii jest trudne. Ponadto nie jest możliwe kontrolowanie aktywności kinazy w sposób odwracalny w żywych komórkach i organizmach wielokomórkowych. Takie ograniczenie pozostaje wąskim gardłem w osiągnięciu ilościowego zrozumienia aktywności kinazy podczas rozwoju i różnicowania. W niniejszej pracy przedstawiono strategię optogenetyczną, która wykorzystuje system bicystroniczny zawierający fotoaktywowane białka Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) oraz N-końcową domenę podstawowej helisy pętli oddziałującej z kryptochromem (CIBN). Odwracalna aktywacja szlaku sygnałowego kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) odbywa się poprzez translokację białek za pośrednictwem światła w żywych komórkach. Podejście to można zastosować do hodowli komórek ssaków i żywych zarodków kręgowców. Ten bicystroniczny system może być uogólniony w celu kontrolowania aktywności innych kinaz o podobnych mechanizmach aktywacji i może być stosowany do innych systemów modelowych.

Ratiometryczna ekspresja par białek fotoaktywowalnych: Rycina 1A przedstawia konstrukcję bicistronowego konstruktu optogenetycznego CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (oznaczanego jako CRY2-2A-2CIBN), opartego na peptydzie 2A (P2A) z porcine teschovirum-1, który wykazuje najwyższą wydajność pomijania rybosomu wśród linii komórek ssaków42. W poprzednich badaniach ustalono, że optymalny stosunek CIBN-GFP-CaaX:CRY2-mCherry-Raf1 wyno...

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykorzystanie światła do kontrolowania szlaku sygnalizacyjnego kinazy białkowej aktywowanej przez mitogeny w nienaruszonych komórkach oraz w embrionach Xenopus. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórkowej i rozwojowej, takie jak wpływ czasowej modulacji aktywności kinazy na samostanowienie podczas różnicowania komórkowego oraz rozwoju embrionalnego. Główną zaletą tej techniki jest możliwość odwracalnego kontrolowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej przez mitogeny w nienaruszonych komórkach i w organizmach wielokomórkowych, takich jak rozwijające się embriony.Ta metoda pozwala uzyskać wgląd w kinetykę sygnalizacji podczas rozwoju embrionalnego Xenopus. Można ją również zastosować w innych systemach modelowych, takich jak socotra, zebrafish lub mysz. Dziś doktorant z mojego laboratorium, Vishnu Krishnamurthy, zaprezentuje tę procedurę.Aurora Turgeon, doktorantka w moim laboratorium, zademonstruje wszystkie procedury wykonywane na embrionach Xenopus. W pierwszej kolejności należy złożyć urządzenie do hodowli komórkowych, umieszczając jedną autoklawowaną sterylną komorę PDMS na sterylnym szkiełku nakrywkowym pokrytym PLL w 60 mm szalce Petriego. Następnie należy użyć 0,5 mL 0,25% trypsyny, aby odciąć komórki pHK21 z jednej studni 6-dołkowej płytki do hodowli tkanek.Po obliczeniu gęstości komórek za pomocą komory licznikowej, zasiać w komorze 20 000 komórek w 200 µL pożywki hodowlanej. 24 godziny po wysianiu komórek, przeprowadzić transfekcję komórek przy użyciu od 50 do 100 ng plazmidu CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG of PCaA X zgodnie z protokołem producenta. Trzy godziny po transfekcji wymienić pożywkę na 200 µL świeżej pożywki hodowlanej i pozostawić komórki do regeneracji przez noc, inkubując kulturę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.Następnego dnia należy rozpocząć indukcję optogenetyczną i obrazowanie, najpierw zastępując pożywkę hodowlana 200 µL pożywki niezależnej od dwutlenku węgla. Następnie należy skonfigurować protokół akwizycji danych. Do stymulacji optogenetycznej wybierz kanał FITC z wzbudzeniem 488 nm, a do śledzenia lokalizacji komórkowej białka znakowanego mCherry — kanał CRITC z wzbudzeniem 561 nm.Zmierz moc niebieskiego światła, umieszczając miernik mocy w pobliżu okna obiektywu. Całkowita moc wynosząca 2 µW jest wystarczająca do wywołania asocjacji CIBN CRY2-PHR. Skonfiguruj akwizycję znaczników czasu z pięciosekundowym odstępem.Całkowity czas akwizycji wynosi dwie minuty. Nanieś odpowiedni materiał dopasowujący współczynnik załamania światła na okno obiektywu. Umieść komorę z komórkami na stoliku mikroskopu i w trybie jasnego pola ustaw ostrość na komórki znajdujące się na powierzchni szkiełka nakrywnego, korzystając z okularów.Następnie przesuń stoлик mikroskopu, aby zlokalizować przetransfekowaną komórkę pod światłem zielonym. Zarejestruj serię obrazów z określonym znacznikiem czasu w kanałach FITC i CITC. Podstawowy obraz próbki przedstawia CIBNGPCAAX zlokalizowany w błonie komórkowej.To jest obraz CRY2 mCherry raf1 przed stymulacją światłem niebieskim, natomiast ten obraz przedstawia CRY2 mCherry raf1 po dziesięciu impulsach stymulacji światłem niebieskim. Przygotuj macierz LED, umieszczając niebieskie diody LED w dwóch płytkach stykowych i łącząc je z rezystorami ograniczającymi prąd. Umieść płytki stykowe w aluminiowej obudowie.Wprowadź dwa metalowe przewody, aby połączyć płytki z zasilaczem. Upewnij się, że długość przewodu jest wystarczająca, gdy pudełko świetlne zostanie umieszczone w inkubatorze z dwutlenkiem węgla. Następnie umieść przezroczysty dyfuzor światła, który będzie pełnił funkcję pokrywy pudełka świetlnego.Na koniec należy skalibrować moc wyjściową każdej diody LED dla różnych wartości napięcia wejściowego. W 24-godzinnym badaniu różnicowania komórek PC12 należy zastosować moc wynoszącą 0,2 mW/cm². Tablicę LED należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO₂.Podłącz urządzenie do zasilania za pomocą metalowych przewodów i ustaw moc diody LED na 0,2 mW/cm². Umieść płytkę 12-dołkową zawierającą transfektowane komórki PC12 na oknie matrycy LED. Ustaw płytkę tak, aby każdy dołek był w pełni oświetlony.Stosuj ciągłe naświetlenie przez 24 godziny. Aby zobrazować zróżnicowane komórki, skonfiguruj akwizycję danych dla pojedynczych migawek. Ustaw czas naświetlania na 200 milisekund dla kanałów GFP oraz TexasRed.Należy zarejestrować obrazy transfekowanych komórek w kanałach GFP oraz TexasRed, a następnie zapisać pliki do analizy danych. Niniejszą procedurę należy rozpocząć od wykonania igieł do mikroiniekcji RNA poprzez wyciąganie kapilar szklanych za pomocą wyciągarki kapilarnej. Następnie należy usunąć otoczkę galaretowatą z embrionów, traktując je 3% cysteiną rozpuszczoną w 0,2 XMMR przez 15 minut.Przenieś embriony do 3% roztworu polisukrozy i 0,5x MMR w celu mikroiniekcji. Precyzyjnie wstrzyknij od 500 pg do 1 ng RNA CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX do każdego embrionu. Następnie inkubuj mikroiniektowane embriony w roztworze do mikroiniekcji w temperaturze pokojowej.Gdy embriony osiągną stadium średniej gastruli, przenieś je do roztworu 0,2x MMR i kontynuuj hodowlę do pożądanego stadium rozwoju. Następnie umieść płytkę 12-dołkową na własnoręcznie zbudowanej matrycy LED w celu poddania ich działaniu światła niebieskiego. Umieść lustro nad płytką 12-dołkową, aby zapewnić pełne naświetlenie embrionów światłem niebieskim.Pobierz embriony do analizy histologicznej, western blot lub analizy ekspresji genów po ekspozycji na niebieskie światło przez wybrany czas. Na obrazie przedstawiono wielokanałowe migawki komórek PC12 przetransfekowanych CRY2-2A-2CIBN po 24 godzinach stymulacji niebieskim światłem o natężeniu 0,2 mW/cm². Widoczne są oba reportery: GFP oraz mCherry.Kółka oznaczają komórki zróżnicowane, a kwadraty komórki niezróżnicowane. W tym przypadku komórki były traktowane w ten sam sposób co w poprzednim obrazie, z wyjątkiem tego, że nie zastosowano stymulacji światłem niebieskim. Nie obserwuje się różnicowania.Komórki te przedstawiają reprezentatywne wyniki po transfekcji raf1 GFPCaaX, konstytutywnie aktywnym raf1. Okręgi i prostokąty zaznaczają odpowiednio komórki zróżnicowane i niezróżnicowane. Ten histogram przedstawia wskaźniki różnicowania komórek PC12 po transfekcji CA-Raf1, kotransfekcji CRY2 mCherry raf1 oraz CIBN GFP Caax, a także po pojedynczej transfekcji CRY2A 2CIBN.Tylko komórki poddane działaniu światła niebieskiego wykazały istotną różnicowanie. Ten obraz przedstawia morfologię prawidłowych zarodków Xenopus bez wstrzyknięcia MRNA i bez zabiegów świetlnych. Ten obraz przedstawia zarodki, którym wstrzyknięto MRNA CRY2 2A2CIBN i które poddano stymulacji światłem niebieskim.Aktywacja raf1 poprzez naświetlanie światłem niebieskim embrionów wstrzykniętych z CRY2 2A2CIBN indukuje powstawanie ektopowych struktur przypominających ogon w regionie głowy. Po zastosowaniu tej procedury można odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób specyficzna dla etapu rozwoju aktywacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem reguluje ekspresję genów. Tę metodę optogenetyczną można uogólnić w celu kontrolowania innych szlaków sygnalizacyjnych o podobnych mechanizmach aktywacji.

light-mediated-reversible-modulation-mitogen-activated-protein-kinase

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Opisana jest prosta metoda indukcji przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT) w różnych typach komórek.  Uwzględniono metody analizy komórek w stanach EMT za pomocą immunocytochemii.

Indukcja i analiza przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Tutaj prezentujemy ilościowy i skalowalny protokół do przeprowadzania ukierunkowanych badań przesiewowych małych cząsteczek dla regulatorów kinaz naiwnie zaszczepionego przejścia pluripotencjalnego.

Prosta metoda identyfikacji kinaz, które regulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Test nasiąkniętych kulek polega na ukierunkowanym dostarczeniu odczynnika testowego w dowolnym momencie rozwoju w celu zbadania regulacji różnicowania i morfogenezy komórek. Przedstawiono szczegółowy protokół, mający zastosowanie do każdego doświadczalnego modelu zwierzęcego, dotyczący przygotowania trzech różnych rodzajów namoczonych koralików i wszczepienia ich w komórkę międzypalcową zarodka kurczaka.

Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Poznaj odwracalną modulację szlaku MAPK za pomocą światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Ta metoda pozwala precyzyjnie kontrolować aktywność kinazy w komórkach i organizmach wielokomórkowych.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus (Wideo) | JoVE Journal

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Przeglądaj więcej filmów