Name: Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Odkryj metody testów przesiewowych w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną. Ta technika umożliwia badanie mechanizmów rekrutacji leukocytów i rozwój terapii przeciwzapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) i Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (grant numer IERPY 1149/16 dla A.L.; MPY 1410/09 do S. Hortelano); przez MINECO za pośrednictwem Fondo de Investigación en Salud (FIS) (przyznaje numery PI11.0036 i PI14.0055 S. Hortelano). S. Herranz był wspierany przez IERPY 1149/16 z ISCIII.

1. Hodowla komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Płytki poddane działaniu kultur tkankowych
	<ol>
		<li>Pokryć 100 mm płytki do hodowli tkankowej 2,5 ml roztworu żelatyny (autoklawizowany, 0,1% żelatyny w wodzie destylowanej) przez 30 minut w temperaturze 37 °C; można to ekstrapolować do wymaganego formatu studzienki. Odessać roztwór żelatyny i pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Warunki hodowli tkankowej
	<ol>
		<li>Hoduj komórki MLEC-04 w inkubatorze biologicznym (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2 ). Hoduj komórki w kompletnym pożywce Zmodyfikowanego Eagle Medium firmy Dulbecco: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 jednostkami/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (P/S).</li>
		<li>Policz komórki standardową metodą komory Neubauera i dodaj komórki MLEC-04 do płytek o średnicy 100 mm poddanych działaniu żelatyny w 10 ml kompletnych pożywkach, przy niskiej gęstości 2 - 11 x 104 komórek/cm2. Podziel komórki 1:3, gdy dotrą do konfluencji. 
		UWAGA: Zwykle dzieje się to po dwóch do trzech dniach w hodowli.</li>
		<li>Hodowlę komórek należy przeprowadzić poprzez przemycie płytek 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie dodanie 2 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny, 5 mM EDTA) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję trypsyna-EDTA i odzyskaj zawieszone komórki, dodając 10 ml kompletnej pożywki. Odwirować komórki (300 x g, 5 min), odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce i odpowiednio subkulturze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Leczenie LPS i mediatory
<ol>
	<li>Umieść komórki MLEC-04 w kompletnym pożywce przy konfluencji poniżej do następującego formatu studzienki: 7 x 105 komórek/dołek na płytkach 6-dołkowych i 2,5 x 105 komórek/basenik na płytkach 96-dołkowych.</li>
	<li>Inkubować kulturę przez 6 godzin w inkubatorze komórkowym (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2 ). Zamień ogniwa na niekompletne podłoża (DMEM-F12, P/S) i pozostaw na noc (ON) w celu synchronizacji i zmniejszenia aktywności komórek.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i przetestować nowe związki farmakologiczne poprzez inkubację komórek śródbłonka z (lub bez) danego leku (np. DT10) rozcieńczonego w niekompletnej pożywce (30 min, 37 °C); dodać 1,4 ml/dołek dla płytki 6-dołkowej lub 0,14 ml/dołek dla płytki 96-dołkowej).</li>
	<li>Zbadaj komórki, dodając LPS do pożywki inkubacyjnej (100 ng/ml, stężenie końcowe) przez okres określony w każdym teście. Użyj PBS jako formantu.</li>
</ol>
3. Ocena profilu transkrypcyjnego na aktywowanym śródbłonku za pomocą RT-qPCR
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki MLEC-04 w momencie subkonfluencji na 6-dołkowych płytkach hodowlanych (7 x 10,5 komórek/dołek). Inkubować przez 6 godzin (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2 ), a następnie przejść do głodzenia surowicy (inkubacja ON).</li>
	<li>Usunąć pożywkę i poddać (lub nie leczyć) hodowle komórek śródbłonka badanym lekiem rozcieńczonym w niekompletnej pożywce (inkubować 30 minut, 37 °C); dodać 1,4 ml/basenik na płytkę 6-dołkową (30 min, 37 °C).</li>
	<li>Zbadać komórki, dodając 100 ng/ml LPS do inkubowanej pożywki (jak opisano w kroku 2.3) i inkubować przez 6 godzin. Zatrzymać reakcję przez dwukrotne przemycie zimnym PBS i utrzymać płytki w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia próbki.</li>
	<li>Ekstrakcja RNA
	<ol>
		<li>Rozmrozić płytki i dodać 1 ml/basenik buforu do ekstrakcji RNA (38% fenolu i 0,8 M izotiocyjanianu guanidyny; patrz tabela materiałów). Pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) pod mieszaniem i zebrać homogenat w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 200 μl chloroformu i delikatnie mieszać przez 15 s. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i odwirować (11 600 x g, 15 min, 4 °C).</li>
		<li>Przenieść fazę wodną do innej probówki o pojemności 1,5 ml. Wytrącić RNA przez dodanie 500 μl izopropanolu, a następnie 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować (11 600 x g, 4 °C).</li>
		<li>Odrzucić supernatant i przemyć osad 75% etanolem przez mieszanie wirowe, a następnie odwirowanie (7 500 x g, 4 °C).</li>
		<li>Wysuszyć osad na powietrzu i rozpuścić RNA w 25 μl czystegoH2O, inkubując przez 10 minut w temperaturze 55 °C. Utrzymać RNA w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilość i czystość RNA
	<ol>
		<li>Określić ilościowo stężenie RNA, mierząc absorbancję próbki przy długości fali 260 nm w spektrofotometrze (zob. tabela materiałów).</li>
		<li>Mierzyć przy 230 nm i 280 nm, aby określić czystość RNA. 
		UWAGA: Stosunek 260/280 wskazuje na zanieczyszczenie białkiem lub fenolem. Dopuszczalny jest stosunek bliski 2. Stosunek 260/230 wskazuje na zanieczyszczenia EDTA, węglowodanami lub fenolami. Dopuszczalne są wartości od 2,0 do 2,2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdzanie integralności RNA
	<ol>
		<li>Przeprowadzić 2 μg całkowitego RNA i drabinkę RNA na 1,5% denaturującym żelu agarozowym; wizualizować w systemie dokumentacji żelu (patrz Tabela Materiałów). 
		UWAGA: Stosunek 2:1 wyraźnych i ostrych prążków rRNA 28S i 18S wskazuje na nienaruszone RNA. Częściowo zdegradowane RNA rozpada się jako rozmazany wygląd.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RT-qPCR (Protokół RT-qPCR)
	<ol>
		<li>Zsyntetyzuj komplementarne DNA (cDNA) z jednoniciowego RNA zgodnie ze standardowym protokołem (patrz Tabela materiałów)11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena ekspresji genów za pomocą RT-qPCR
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną dla każdej próbki: zmieszać 2 μl cDNA, 7 μl związku fluorescencyjnego, starter 300 nM do przodu i starter do tyłu 300 nM (tabela 1) w końcowej objętości 13 μl i dodać do 96-dołkowej płytki reakcyjnej (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Uszczelnić płytkę optyczną osłoną z kleju, odwirować (300 x g, 1 min) i uruchomić reakcję w systemie Real-Time PCR (gorący start 95 °C przez 20 s, a następnie 40 cykli: 95 °C przez 3 s i 60 °C przez 30 s) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przeanalizować wyniki przez względną ocenę ilościową przy użyciu metody porównawczej 2-ΔΔCt z genami porządkowymi dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) lub kwaśnej fosfoproteiny rybosomalnej P0 (36B4)12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Oceń aktywację śródbłonka za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Komórki MLEC-04 należy traktować zgodnie z warunkami opisanymi w punkcie 2 i ocenić zmiany w białkach powierzchniowych śródbłonka za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Odłączyć komórki po 6 godzinach stymulacji LPS metodą trypsyny-EDTA opisaną w kroku 1.2.3 i przemyć niekompletną pożywką w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Policz komórki metodą komory Neubauera i umieść 10 x 104 komórki na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U. Odwirować (300 x g, 5 min) i wyrzucić supernatant poprzez zatrzask nadgarstka o 180° od góry do dołu i szybki powrót do pierwotnej pozycji.</li>
	<li>Dodać 50 μl wybranego przeciwciała rozcieńczonego w pożywce niekompletnej (10 μg/ml, stężenie końcowe) do komórek i inkubować (30 min, 4 °C).</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie niekompletną pożywką zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4.3 i inkubować w 50 μl w stężeniu 10 μg/ml odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z FITC lub podobnym koniugatem (30 min, 4 °C w ciemnym miejscu).</li>
	<li>Umyj komórki raz niekompletną pożywką, a następnie przepłucz PBS. Odzyskaj komórki za pomocą 300 μl PBS za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1 ml i umieść w probówkach cytometrycznych.</li>
	<li>Ocenić próbki w systemie cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów). Dostosuj populację komórek według parametrów rozpraszania do przodu i bocznego. Bramka populacji będącej przedmiotem zainteresowania. Dostosuj bramki w oparciu o kontrolę ujemną z komórek inkubowanych z kontrolą izotypu. Przeanalizuj wyniki jako procent komórek dodatnich lub średnią intensywność fluorescencji8.</li>
</ol>
5. Oceń aktywację śródbłonka za pomocą Western Blot
<ol>
	<li>Wysiewać śródbłonek w momencie konfluencji na 6-dołkowych płytkach hodowlanych (7 x 105 komórek/dołek) i traktować LPS, jak opisano w sekcji 2. Przeanalizuj ekspresję białka zapalnego za pomocą następującego protokołu western blot.</li>
	<li>Zatrzymaj stymulację LPS w różnych punktach czasowych, aby wyjaśnić różne aspekty odpowiedzi śródbłonka:
	<ol>
		<li>Ustal profil białek zapalnych po 6 godzinach stymulacji LPS.</li>
		<li>Określ sygnalizację komórkową co 15 minut przez okres 60 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W obu przypadkach należy przerwać reakcję poprzez dwukrotne przemycie zimnym PBS i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia próbki.</li>
	<li>Liza komórek i ekstrakcja białek
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl buforu do lizy do każdej studzienki (1% niejonowy środek powierzchniowo czynny, 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 150 mM chlorek sodu, 30 mM pirofosforan sodu, 50 mM fluorek sodu, 2,1 mM orthovanadan sodu o pH 7,6, uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C pod wpływem mieszania, zeskrobać studzienki końcówką pipety i zebrać homogenat do probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować probówki o stężeniu 11 600 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przechowywać supernatant w czystych probówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego zgodnie ze standardowym protokołem (patrz tabela materiałów)13.</li>
	<li>Rozpuść 30 μg całkowitego lizatu białkowego dla każdej próbki za pomocą standardowej techniki elektroforezy 0,1% dodecylosiarczanu sodu, 10% żelu poliakryloamidowego (SDS-PAGE)14. Badaj próbki z 10 mM β-merkaptoetanolem (warunki redukujące) lub bez (warunki nieredukujące) w zależności od przeciwciała użytego do wykrycia białka będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Przenieść oddzielone białka z żelu poliakryloamidowego do membrany transferowej z polifluorku winylidenu (PVDF) o wielkości porów 0,45 μm przy użyciu standardowej procedury.</li>
	<li>Po przeniesieniu należy dwukrotnie przemyć membranę PBS, 0,1% polisorbatem-20 (PBS-T) i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, dodając 20 ml 2% BSA rozcieńczonego w PBS-T dla wykrytych fosfoprotein lub 5% beztłuszczowego mleka w proszku w PBS-T dla białek całkowitych, pod mieszaniem (90 min, RT).</li>
	<li>Rozcieńczyć wybrane przeciwciało w 10 ml odpowiedniego buforu blokującego o zalecanym stężeniu i inkubować błonę w stanie mieszania (ON, 4 °C). Alternatywnie należy umieścić membranę w szczelnie zamkniętych plastikowych torebkach i użyć 5 ml rozcieńczonego przeciwciała.</li>
	<li>Następnego dnia umyj membranę trzykrotnie (nadmiar PBS-T, 15 min, RT).</li>
	<li>Inkubować błonę pod wpływem mieszania (30 min, RT) z 10 ml odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego związanego z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczonego w stosunku 1:10 000 w odpowiednim buforze blokującym.</li>
	<li>Umyć membranę trzykrotnie pod wpływem mieszania (nadmiar PBS-T, 15 min, RT).</li>
	<li>Inkubować błonę przez 1 minutę z 0,1 ml/cm2 substratu peroksydazy wzmocnionej chemiluminescencją (ECL). Umieść opróżnioną membranę między dwoma przezroczystymi arkuszami tworzywa sztucznego i włóż ją do systemu detekcji chemiluminescencji, który zawiera kamerę ze sprzężonym ładunkiem (CCD).
	<ol>
		<li>Użyj kamery CCD do wykrycia sygnału i jej oprogramowania do nagrywania obrazów za pomocą programu akumulacyjnego (obrazy wyświetlają skumulowany sygnał co 30 s ekspozycji przez łącznie 15 minut).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo intensywność pasma za pomocą densytometrii za pomocą oprogramowania ImageJ zgodnie z protokołem opisanym w podręczniku użytkownika15.
	<ol>
		<li>Otwórz próbkę w oprogramowaniu ImageJ i wybierz interesujące Cię pasmo za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokątnego.</li>
		<li>Wybierz jako pierwszy pas ruchu i naciśnij pasy działki, aby uzyskać działki profilu.</li>
		<li>Ogranicz obszar szczytów za pomocą zaznaczenia linii prostej.</li>
		<li>Zmierz rozmiar każdego pasma, klikając wnętrze każdego szczytu.</li>
		<li>Przedstawić wyniki w odniesieniu do kontroli białka obciążenia (β-aktyna, tubulina itp.).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Oceń czynnik śródbłonka uwolniony w wyniku aktywacji leukocytów za pomocą testów adhezyjnych
<ol>
	<li>Uzyskać pożywki kondycjonowane śródbłonkiem.
	<ol>
		<li>Poddać się działaniu komórek MLEC-04 zgodnie ze wskazaniami w sekcji 2 i zebrać supernatant hodowli po 24-godzinnej stymulacji LPS (100 ng / ml).</li>
		<li>Zebrać kondycjonowaną pożywkę z poddanych działaniu środka komórek MLEC-04 i odwirować (600 x g). Przechowywać supernatant w podwielokrotnościach o objętości 0,5 ml w temperaturze -80 °C aż do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test adhezji leukocytów
	<ol>
		<li>Pokryj 96-dołkowe płytki 50 μl/basenik wybranych białek macierzy zewnątrzkomórkowej rozcieńczonych w PBS (z wyjątkiem kolagenu, który rozcieńcza się w 0,1 M kwasie octowym): fibronektyna (1 - 10 μg / ml), laminina (1 - 10 μg / ml) i kolagen typu I (10 - 40 μg / ml). Pozostawić włączone w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić powlekane podłoże i zablokować niespecyficzne miejsca wiązania w studzienkach za pomocą 150 μl PBS, 1 % BSA inaktywowanego termicznie (1 min, 100 °C) przez 90 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć studzienki dwukrotnie PBS i dodać do studzie><nek 100 μl uprzednio zebranej pożywki kondycjonowanej śródbłonkiem (sekcja 6.1).
		UWAGA: Płytki są gotowe do wykonania testu adhezji.</li>
		<li>Hodowla mysiej linii komórkowej monocytów-makrofagów J774 w inkubatorze biologicznym (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2) z pożywką Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 10% FBS, 1% P / S. 
		UWAGA: Komórki J774 rosną w zawiesinie.</li>
		<li>Zebrać komórki J774 do probówki o pojemności 15 ml i odwirować (300 x g, 5 min). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml pożywki niezawierającej surowicy. Policz komórki w komorze Neubauera. Odwirować komórki (300 x g, 5 min), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce bez surowicy w proporcji 15 x 104 komórki J774 na 50 μl pożywki.</li>
		<li>Dodać 15 x 104 komórek J774 do każdej studzienki w 50 μl pożywki bez surowicy i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórek CO2.</li>
		<li>Umyć studzienki dwukrotnie, delikatnie, dodając ciepły PBS; odwirować (300 x g, 5 min) i wyrzucić supernatant przez pstryknięcie nadgarstka o 180° od góry do dołu i szybko powrócić do pierwotnej pozycji. Utrwalić przyłączone komórki, dodając 100 μl/studzienkę 4% paraformaldehydu (PFA) do PBS i inkubować (10 min, RT).</li>
		<li>Delikatnie odrzuć pożywkę i przepuszczaj komórki 2% metanolem w PBS przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Delikatnie wyrzuć pożywkę i zabarwij komórki, dodając 50 μl / studzienkę 0,5% fioletu krystalicznego w 20% metanolu przez 90 s w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj talerz dużą ilością bieżącej wody, wylej nadmiar płynu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Zgłaszaj dołączone komórki za pomocą kamery cyfrowej sprzężonej z mikroskopem świetlnym.</li>
		<li>Rozcieńczyć barwienie komórek, dodając 100 μl/basenik 0,1 M cytrynianu sodu, 50% etanolu. Zmierzyć absorbancję przy 545 nm i przedstawić wyniki jako dowolne jednostki absorbancji lub procent adhezji, biorąc pod uwagę 100% jako adhezję komórek osiągniętą do studzienek pokrytych wyższym stężeniem ligandów</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Test aktywacji śródbłonka za pomocą testu koadhezji leukocytów i śródbłonka
<ol>
	<li>Poddać działanie komórek MLEC-04 na 96-dołkowych płytkach, jak opisano w sekcji 2 i inkubować z LPS (6 godzin, 37 °C).</li>
	<li>Fluorescencyjnie znakuj komórki J774 estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CSFE).
	<ol>
		<li>Umyć komórki J774 w PBS zgodnie z procedurą opisaną w ppkt 6.2.5. Policz komórki metodą komory Neubauera i ponownie zawieś w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w PBS, 0,1% BSA.</li>
		<li>Inkubować komórki z CFSE (5 μM, stężenie końcowe) przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml niekompletnej pożywki i inkubować (5 min, 4 °C).</li>
		<li>Przemyć raz niekompletną pożywką, jak wyjaśniono w ppkt 6.2.5, ponownie zawiesić w 15 x 104 komórek/100 μl i przystąpić do testu koadhezji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po leczeniu śródbłonka należy trzykrotnie przemyć studzienki niekompletną pożywką. Dodaj komórki CFSE-J774 (15 x 104 komórki/100 μl) do każdej studzienki pokrytej śródbłonkiem. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przez 60 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie umyć studzienki, jak opisano w ppkt 6.2.7, używając ogrzanego PBS i podać adhezję J774 do warstwy śródbłonka za pomocą następujących dwóch metod:
	<ol>
		<li>Lizuj komórki w 0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 1% SDS (100 μL/dołek) i zmierz sygnał CFSE-J774 za pomocą fluorometrii (wzbudzenie/emisja = 492 nm/517 nm). Przedstawić wyniki jako dowolne jednostki intensywności fluorescencji lub procentu adhezji w odniesieniu do kontroli pozytywnej (sygnał z całkowitej liczby komórek dodanych do każdej studzienki).</li>
		<li>Utrwal komórki w 4% PFA i zgłoś przyłączenie komórek CFSE-J774 do śródbłonka poprzez wizualizację pod mikroskopem fluorescencyjnym (wzbudzenie/emisja = 492 nm/517 nm).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22914295">Crohn's disease.</a> Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li>
<li>Skeoch, S., Bruce, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+in+rheumatoid+arthritis%3A+is+it+all+about+inflammation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?</a> Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).</li>
<li>Gerhardt, T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+trafficking+across+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Monocyte trafficking across the vessel wall.</a> Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).</li>
<li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+that+exclusively+express+TLR4+on+endothelial+cells+can+efficiently+clear+a+lethal+systemic+Gram-negative+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection.</a> J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).</li>
<li>McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+cells+and+activation+of+endothelial+TLR4+coordinate+neutrophil+adhesion+within+liver+sinusoids+during+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).</li>
<li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).</li>
<li>Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+in+acute+stroke%3A+targeting+excitotoxicity%2C+oxidative+and+nitrosative+stress%2C+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation.</a> Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).</li>
<li>Hortelano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ILK+mediates+LPS-induced+vascular+adhesion+receptor+expression+and+subsequent+leucocyte+trans-endothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration.</a> Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).</li>
<li>Palazón, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist+anti-CD137+mAb+act+on+tumor+endothelial+cells+to+enhance+recruitment+of+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes.</a> Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).</li>
<li>Jiménez-García, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8%2C9-Dehydrohispanolone-15%2C16-lactol+diterpene+prevents+LPS-triggered+inflammatory+responses+by+inhibiting+endothelial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation.</a> Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).</li>
<li>SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf</a> (2013).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittge, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf</a> (2017).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).</li>
<li>ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf</a> (2017).</li>
<li>Hohsfield, L. A., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+infusion+of+monocytes+isolated+from+2-week-old+mice+enhances+clearance+of+Beta-amyloid+plaques+in+an+Alzheimer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model.</a> PloS One. 10 (4), e0121930(2015).</li>
<li>Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+during+TNF-%CE%B1+inhibitor+therapy%2C+despite+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening.</a> Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Tedgui, A., Mallat, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+mechanisms+in+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall.</a> Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).</li>
<li>Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+interleukin-1+receptor+2+binding+prevents+cleavage+and+activity+of+interleukin-1%CE%B1%2C+controlling+necrosis-induced+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation.</a> Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).</li>
<li>Pripp, A. H., Stanišić, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+correlation+between+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+in+chronic+subdural+hematoma+patients+assessed+with+factor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis.</a> PloS One. 9 (2), e90149(2014).</li>
<li>Guha, M., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS+induction+of+gene+expression+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">LPS induction of gene expression in human monocytes.</a> Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).</li>
<li>Tabas, I., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+therapy+in+chronic+disease%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities.</a> Science. 339 (6116), 166-172 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół śródbłonka opisuje stopniową technologię, która stanowi podstawę do zbadania nowych mechanizmów zaangażowanych w regulację odpowiedzi zapalnej. Podejścia te opierają się na badaniu aktywności śródbłonka stymulowanej przez LPS i oceniają krytyczne etapy związane z rekrutacją leukocytów podczas odpowiedzi zapalnej, w szczególności: uwalnianie cytokin śródbłonka, ekspresję cząsteczek adhezyjnych śródbłonka i adhezję leukocytów do warstwy naczyniowej. Po ustaleniu parametrów śródbłonka system może poszukiwać now...

Stan zapalny jest korzystną biologiczną odpowiedzią na czynniki zakaźne, której głównym celem jest eliminacja patogenu i naprawa uszkodzonej tkanki. W pewnych warunkach, takich jak przewlekłe infekcje lub choroby autoimmunologiczne, stan zapalny nie ustępuje. Zamiast tego występuje nieprawidłowa reakcja z ciągłym naciekaniem leukocytów, co skutkuje przedłużoną odpowiedzią immunologiczną, która prowadzi do uszkodzenia tkanek, zwłóknienia, utraty funkcji i ogólnie niepełnosprawności, a w niektórych przypadkach śmierci pacjenta. Wszystkie te ludzkie zaburzenia, skatalogowane jako choroby zapalne, obejmują naczynia krwionośne w celu kontroli wynaczynienia leukocytów1,2.
Komórki śródbłonka odgrywają fundamentalną rolę w regulacji odpowiedzi zapalnej poprzez kontrolowanie transportu leukocytów. Kiedy warstwa śródbłonka jest wystawiona na działanie mediatorów stanu zapalnego, takich jak LPS, spoczynkowy śródbłonek aktywuje i wyraża cytokiny prozapalne (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1 itp.) oraz cząsteczki adhezyjne (E-selektyna, VCAM-1 i ICAM-1), które sprzyjają rekrutacji krążących leukocytów do miejsca infekcji. Leukocyty zapoczątkowane przez uwolnione cytokiny pośredniczą następnie w toczeniu i interakcji z warstwą śródbłonka poprzez odpowiednie adhezyjne odpowiedniki: PSGL-1 do selektoryny, integrynę α4β1 do VCAM-1 i integrynę αLβ2 do ICAM-1. Na koniec leukocyty migrują przez naczynia krwionośne w kierunku ogniska zapalenia3.
Zasadnicza rola śródbłonka w regulacji odpowiedzi zapalnej została zademonstrowana na myszach, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji receptora LPS, receptora toll-podobnego 4 (TLR4), tylko na komórkach śródbłonka. Te śródbłonkowe zwierzęta TLR4 były w stanie zareagować na stan zapalny za pośrednictwem LPS i wykryć infekcję powstałą po zaszczepieniu bakterii, a w konsekwencji osiągnąć rozwiązanie infekcji i przeżycie na podobnym poziomie jak myszy typu dzikiego4,5.
Dla regulowanego śródbłonkiem szlaku odpowiedzi zapalnej, postulowano, że zahamowanie na niektórych etapach interakcji leukocyt-śródbłonek spowoduje zmniejszenie migracji przezśródbłonkowej i lepsze rokowanie w chorobach związanych z zapaleniem. W rzeczywistości zaprojektowano kilka strategii ukierunkowanych na aktywację śródbłonka i interakcję leukocytów-śródbłonka, aby utrudnić wynaczynienie komórek odpornościowych w leczeniu zaburzeń zapalnych6,7.
W tym raporcie opisujemy szczegółową grupę technik in vitro, aby w pełni scharakteryzować aktywność śródbłonka w odpowiedzi na bodziec zapalny LPS i jego rolę w aktywacji i adhezji leukocytów do warstwy naczyniowej. Model komórek śródbłonka użyty w tym manuskrypcie to linia komórek śródbłonka płuc myszy (MLEC-04), opisana przez Hortelano i wsp.8. Linia komórkowa MLEC-04 została potwierdzona w literaturze jako odpowiedni system do badania aktywacji śródbłonka9,10. Opierając się na zainteresowaniach badawczych, podejścia te można łatwo ekstrapolować na dowolne systemy śródbłonka lub leukocytów oraz profil zapalny. Po zdefiniowaniu parametrów śródbłonka w wybranych warunkach, system może testować nowe leki na proponowanym eksperymentie w celu oceny aktywacji naczyń krwionośnych. W tym kontekście zapalnym komórki śródbłonka testowane z badanym związkiem mogą być porównane z warunkami kontrolnymi komórek, a wszelkie wynikające z tego różnice mogą informować o wyniku prognostycznym leku w zakresie rozwoju i progresji stanu zapalnego. Podsumowując, proponujemy odpowiedni system do charakteryzowania nowych celów leków dla komórek śródbłonka, co może wpłynąć na projektowanie nowych terapii specyficznych dla naczyń krwionośnych przeciwko chorobom związanym z zapaleniem.

<table><tbody><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Lonza</td><td>BE17-160E</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>Bufor do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Panreac</td><td>1,310,861,612</td><td></td></tr><tr><td>Czysty H2O</td><td>Qiagen</td><td>1017979</td> wolny od <td>RNAzy</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Pronadisa</td><td>8020</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik do żeli agarozowych</td><td>Invitrogen</td><td>s33102</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Nit Synth</td><td>18080051</td><td>Odczynniki do RT-PCR</td><td></td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385610</td><td>Barwienie fluorescencyjne do qPCR</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td>Płytki do qPCR</td></tr><tr><td>U-bottom 96 dołków</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Probówki cytometryczne</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>TX100</td><td>Panreac</td><td>212314</td><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Panreac</td><td>1,319,401,211</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosforan sodu</td><td>Sigma</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>sigma</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Odczynniki do oznaczania kwasu bicynchoninowego</td></tr> <tr><td>i beta;-merkaptoetanol</td><td>merck</td><td>805,740</td><td></td></tr><tr><td>Membrana transferowa PVDF, 0,45 i mikro; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Panreac</td><td>1,623,121,611</td><td>Polisorbat 20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-515Q</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ECL Milipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>Sigma</td><td>c8919</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Panreac</td><td>1,310,081,611</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Panreac</td><td>1,310,911,612</td><td></td></tr><tr><td>Krystaliczny fiolet</td><td>Sigma</td><td>HT90132</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>C7254</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Panreac</td><td>1,410,851,212</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>M200</td><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek</td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad</td><td>2000</td><td>System dokumentacji żelu</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems</td><td>System qPCR</td><td>StepOnePlus</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Analyzer 10</td><td>Aparatura do cytometrii</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Bio-Rad</td><td>MP</td><td>System detekcji chemiluminescencji</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Stosować przy 10 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>ICAM-2</td><td>Biolegend</td><td>1054602</td><td>Stosować w stężeniach 10 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>E-selektyna</td><td>BD Biosciences</td><td>553749</td><td>Stosować w 10 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553330</td><td>Stosować przy 10 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>553250</td><td>Stosować przy 10 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>przeciw szczurom IgG-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-095-006</td><td>Stosować przy 10 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>anty chomik ormiański-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>127-095-160</td><td>Stosować przy 10 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Kontrola izotyopy IgG szczura</td><td>Invitrogen</td><td>10700</td><td>Stosować przy 10 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Chomik ormiański Kontrola izotypu IgG</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-33220</td><td>Stosować przy 10 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>P-I&kappa; &Beta;-&alfa;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2859</td><td>Użyj przy 10 &mikro; g / ml</td></tr> <tr><td>i beta; -Aktyna</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td>Stosować w 10 &mikro; Sygnalizacja komórkowa g / mL</td></tr><tr><td>P-ERK</td><td></td><td>9101</td><td>Użyj przy 10 i mikro; g/mL</td></tr><tr><td>przeciw myszom HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNXA931/AE</td><td>Stosować w stosunku 1:10 000</td></tr><tr><td>przeciw królikom HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>LNA934V/AG</td><td>Stosować w skali 1:10 000</td></tr><tr><td>przeciw szczurom HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-3823</td><td>stosować w skali 1:10 000</td></tr></tbody></table>

testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Warstwa śródbłonka jest niezbędna do utrzymania homeostazy w organizmie poprzez kontrolowanie wielu różnych funkcji. Regulacja odpowiedzi zapalnej przez warstwę śródbłonka ma kluczowe znaczenie dla skutecznej walki ze szkodliwymi czynnikami i pomocy w regeneracji uszkodzonych obszarów. Kiedy komórki śródbłonka są wystawione na działanie środowiska zapalnego, takiego jak zewnętrzny składnik błony bakterii Gram-ujemnych, lipopolisacharyd (LPS), wyrażają rozpuszczalne cytokiny prozapalne, takie jak Ccl5, Cxcl1 i Cxcl10, i wyzwalają aktywację krążących leukocytów. Ponadto ekspresja cząsteczek adhezyjnych E-selektyny, VCAM-1 i ICAM-1 na powierzchni śródbłonka umożliwia interakcję i adhezję aktywowanych leukocytów do warstwy śródbłonka, a ostatecznie wynaczynienie w kierunku tkanki objętej stanem zapalnym. W tym scenariuszu funkcja śródbłonka musi być ściśle regulowana, ponieważ nadmierna lub wadliwa aktywacja w rekrutacji leukocytów może prowadzić do zaburzeń związanych ze stanem zapalnym. Ponieważ wiele z tych zaburzeń nie ma skutecznego leczenia, należy zbadać nowe strategie koncentrujące się na warstwie naczyniowej. Proponujemy kompleksowe testy, które są przydatne w poszukiwaniu nowych regulatorów śródbłonka, które modyfikują funkcję leukocytów. Analizujemy aktywację śródbłonka przy użyciu specyficznych celów ekspresyjnych zaangażowanych w rekrutację leukocytów (takich jak cytokiny, chemokiny i cząsteczki adhezyjne) za pomocą kilku technik, w tym: ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR), western-blot, cytometrii przepływowej i testów adhezyjnych. Podejścia te określają funkcję śródbłonka w kontekście zapalnym i są bardzo przydatne do wykonywania testów przesiewowych w celu scharakteryzowania nowych regulatorów stanu zapalnego śródbłonka, które są potencjalnie cenne dla projektowania nowych strategii terapeutycznych.

Ocena aktywacji komórek śródbłonka indukowanej LPS za pomocą RT-qPCR
Komórki MLEC-04 po stymulacji surowiczej zostały pobudzone 100 ng/mL LPS przez 6 h, a ekspresja genów śródbłonka została oceniona za pomocą RT-qPCR poprzez porównanie ekspresji markerów aktywacji z warunkami spoczynku. Jak pokazano na Rysunku 1A, inkubacja komórek MLEC-04 z LPS indukowala ekspresję mRNA wybranych cząsteczek adhezyjnyc...

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Ogólnym celem tego testu przesiewowego jest scharakteryzowanie nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną, która jest przedmiotem zainteresowania w celu zaprojektowania nowych strategii terapeutycznych przeciwko zaburzeniom zapalnym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patologii, takie jak zdefiniowanie nowych leków ukierunkowanych na śródbłonek, które mogą łagodzić choroby związane ze stanem zapalnym. Główną zaletą tego protokołu śródbłonka jest to, że opisuje technologię testów, która stanowi podstawę do badania nowych mechanizmów zaangażowanych w regulację odpowiedzi zapalnej. Metodologię tę zademonstrują Maria Angeles Higueras, doktor habilitowany z naszego laboratorium oraz Sandra Herranz, technik z naszego laboratorium. Na początek hoduj komórki MLEC-04 w kompletnym pożywce DMEM F12 uzupełnionej 10% FBS i Pen-Strep.Inkubuj komórki w inkubatorze biologicznym w wieku 37 lat

screening-assays-to-characterize-novel-endothelial-regulators

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

W niniejszej pracy opisujemy nowatorski wysokoprzepustowy test chemicznie indukowanego stanu zapalnego, którego celem jest identyfikacja bioaktywnych substancji immunomodulujących. Skutecznie połączyliśmy zautomatyzowaną mikroskopię z autorskimi skryptami oprogramowania, co umożliwia automatyczną kwantyfikację odpowiedzi zapalnej, a także dalsze przetwarzanie, analizę, wydobywanie i przechowywanie danych.

Usprawnianie odkrywania leków: zautomatyzowany wysokotreściowy test stanu zapalnego u rybek danio pręgowanych

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Test tworzenia probówek jest szybką, mierzalną metodą pomiaru angiogenezy in vitro. Komórki śródbłonka łączy się z kondycjonowanymi pożywkami i plateruje ekstraktem z błony podstawnej. Tworzenie się rurki następuje w ciągu kilku godzin, a nowo utworzone kanaliki można łatwo określić ilościowo.

Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

Brakuje dostępu do wiarygodnych modeli do badania interakcji naczyniowych krwi u ludzi. Przedstawiamy model in vitro hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka w połączeniu z ludzką krwią pełną w celu zbadania interakcji komórkowych zarówno we krwi (ELISA), jak i w przedziale naczyniowym (mikroskopia).

Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

Opisujemy prosty test biologiczny oparty na komórkach do wykrywania, ilościowego określania i monitorowania aktywności członków rodziny ligandów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Test wykorzystuje receptory chimeryczne ulegające ekspresji w linii komórkowej zależnej od czynnika, aby zapewnić półilościową lub ilościową ocenę wiązania receptora i sieciowania przez ligand.

Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Prezentujemy model in vitro, który pozwala na badanie i analizę krzepnięcia w pełnej, nieantykoagulowanej krwi. Antykoagulacja w ustroju zależy od naturalnego działania przeciwzakrzepowego zdrowych komórek śródbłonka, a aktywacja komórek śródbłonka spowoduje krzepnięcie.

Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Ten protokół krok po kroku zawiera szczegółowy opis konfiguracji eksperymentu i analizy danych do oceny reakcji zapalnych w hiPSC-EC oraz analizy adhezji leukocytów w przepływie fizjologicznym.

Test mikroprzepływowy do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-EC)

Odkryj metody testów przesiewowych w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną. Ta technika umożliwia badanie mechanizmów rekrutacji leukocytów i rozwój terapii przeciwzapalnych.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Przeglądaj więcej filmów