Ujednolicone ramy metodologiczne dla badań nad schwannomakiem przedsionkowym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie próbki ludzkiego nerwiaka przedsionkowego pobranej z bloku operacyjnego w celu stworzenia pierwotnej hodowli komórkowej oraz zbioru wydzielin nowotworowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad nerwiakami przedsionkowymi, takie jak optymalny sposób odbierania, przechowywania i przetwarzania pierwotnej próbki ludzkiego nowotworu przeznaczonej do zastosowania w wielu analizach biomolekularnych. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie metody hodowli o minimalnym stopniu manipulacji do namnażania pierwotnych ludzkich komórek nerwiaka przedsionkowego.

Implikacje tej techniki obejmują terapię schwannomy nerwu przedsionkowego, ponieważ obiecujące kandydaty terapeutyczne mogą być testowane bezpośrednio na hodowlach komórkowych. Rozpocznij od przeniesienia pojemnika z próbką świeżo pobranej schwannomy nerwu przedsionkowego lub nerwu małżowinowego z lodu używanego do transportu z sali operacyjnej do komory z laminarnym przepływem powietrza w laboratorium. Za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie przenieś próbkę do pierwszej z trzech probówek o pojemności 1,5 ml wypełnionych 1,4 ml zewnętrznego PBS.

Zamknij każdą probówkę po umieszczeniu w niej preparatu i delikatnie wstrząśnij w celu przemycia. Umieść próbkę w suchej 60 milimetrowej płytce Petriego i za pomocą pęsety usuń wszystkie martwe tkanki w obszarach z wyraźnymi naczyniami krwionośnymi. Użyj pęsety lub ostrza skalpela, aby podzielić próbkę na oddzielne fragmenty do konserwacji RNA, ekstrakcji białek, pobierania wydzieliny, fiksacji oraz hodowli komórkowych.

Przenieś fragment preparatu przeznaczony do hodowli komórkowej do nowej 60 milimetrowej płytki hodowlanej zawierającej od pięciu do ośmiu mililitrów zimnej, suplementowanej pożywki DMEM F12. Umieść fragment nerwiaka przedsionkowego lub nerwu usznego wielkiego, przeznaczony do pobierania wydzielin, w pustej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Rozpocznij od pipetowania 500 mikrolitrów pożywki DMEM bez suplementacji FBS do dwóch probówek o pojemności 1,5 mililitra.

Pierwsza probówka zostanie wykorzystana do zbierania wydzielin guza, a druga posłuży jako dopasowana kontrola. Umieść jedną z probówek zawierających DMEM na skalibrowanej wadze cyfrowej. Wytaruj wagę, umieść w probówce fragment preparatu przeznaczony do zbierania wydzielin i zważ go.

Zanotuj wynik, który będzie reprezentował masę samej tkanki. Pod laminarnym dygestorium dopasuj objętość DMEM w probówce do 100 µL na każde 10 mg próbki. Umieść probówkę zawierającą próbkę tkanki oraz odpowiadającą jej kontrolę w inkubatorze.

Inkubować przez co najmniej 72 godziny, aby zebrać biologicznie użyteczne ilości wydzielin nowotworowych lub nerwowych. Po 72 godzinach inkubacji użyć pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć z próbki pożywkę zawierającą wydzielinę. Aby zapobiec wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania, podzielić pożywkę na aliquoty w nowych probówkach, zgodnie z planowaną dalszą analizą.

Przechowywać oryginalny fragment tkanki, wydzieliny oraz kontrolne DMEM w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia dalszych aplikacji. Procedurę hodowli rozpocząć od rozdzielenia tkanki nerwiaka przedsionkowego na fragmenty o objętości około 1 mm³ za pomocą pęsety w każdej dłoni. Następnie odessać medium i fragmenty guza za pomocą pipety serologicznej 10 mm i przenieść całą zawartość do stożkowej probówki 15 ml.

Wiruj przez trzy minuty przy 1000G w temperaturze 25 stopni celsius. Podczas wirowania przygotuj medium do dezintegracji, łącząc 4,7 mililitrów uzupełnionej pożywki DMEM F12 z 250 mikrolitrów kolagenazy i 50 mikrolitrów hialuronidazy w 60 milimetrowej płytce hodowlanej. Po wirowaniu fragmenty guza utworzą osad na dnie probówki stożkowej.

Ostrożnie odpipetuj i odrzuć nadsącz. Następnie dodaj dwa mililitry świeżo przygotowanego medium do dezintegracji zawierającego enzym do podniebienia z nowotworem. Kilkukrotnie pipetuj w górę i w dół, aby zmobilizować tkankę, a następnie przenieś ją do 60 milimetrowej szalki hodowlanej.

Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze na 18 godzin. Następnego dnia podgrzej pożywkę DMEM F12 uzupełnioną o 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Wyjmij naczynie zawierające hodowlę nerwiaka splotu błędnika z inkubatora i przenieś je do dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą igły 22 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 6 ml odessać pożywkę z hodowli i przenieść ją do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.

Wiruj przez pięć minut przy 1000G w temperaturze 37 °C. W międzyczasie, używając sterylnej pęsety, umieść odpowiednią liczbę szkiełek nakrywkowych pokrytych polideksylocelem i lamininą w 24-dołkowej płytce hodowlanej. Z kostki guza o boku jednego centymetra można przygotować hodowle w 24 do 32 dołkach, zatem w przypadku większości mniejszych guzów odpowiednie będzie zaplanowanie hodowli komórek w ośmiu do 16 dołków.

Po wirowaniu odlej supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w podgrzanym medium, tak aby uzyskać jeden mililitr zawiesiny komórkowej na każdą planowaną studzienkę. Użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby pobrać dwa mililitry zawiesiny komórkowej i nanieść jeden mililitr do studzienki płytki 24-dołkowej. Kontynuuj pobieranie i naniesienie medium zawierającego komórki nowotworowe, pobierając medium w ilościach dwóch mililitrów, z których jeden mililitr nanosi się do każdej planowanej studzienki, aż zawiesina komórek nowotworowych zostanie równomiernie podzielona pomiędzy wszystkie przygotowane studzienki.

Umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze w temperaturze 37 °C na całą noc. Sprawdź płytkę następnego dnia; jeśli na dnie dołków zauważysz znaczne ilości zanieczyszczeń, ostrożnie wymień pożywkę w każdym dołku na nową suplementowaną pożywkę DMEM F12, uważając, aby nie usunąć przytwierdzonych komórek. Jeśli zanieczyszczenia nie są obecne, wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora i wymień pożywkę po raz pierwszy w piątym dniu, a następnie co trzy dni.

Ten obraz w jasnym polu ilustruje typowy wzorzec organizacyjny komórek nerwiaka przedsionkowego w hodowli. Te obrazy immunofluorescencyjne z pierwotnej hodowli ludzkiego nerwiaka przedsionkowego zostały wykonane po 48 godzinach ekspozycji na GFP wyrażający ink 80, pokazany na zielono. Czerwona fluorescencja pochodzi z immunobarwienia aktyny F falloidyną, która barwi cytoszkielet, a niebieska fluorescencja to DAPI, który barwi jądro komórkowe.

Wstawka przedstawia obraz powiększony obszaru widocznego na zdjęciu o niskiej rozdzielczości. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zapisywanie czasu umieszczenia próbki wydzieliny oraz próbki hodowli w inkubatorze, aby zapewnić wykonanie kolejnych etapów po prawidłowym czasie inkubacji. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak transdukcja wirusowa, fiksacja, immunofluorescencja, traktowanie lekiem oraz ekstrakcja RNA, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące ekspresji różnych wirusów w komórkach lub zmian w ekspresji genów po zastosowaniu leku.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie nerwiaków przedsłuchowych do zbadania sposobu, w jaki pierwotne ludzkie komórki reagują na różne leki u pacjentów, którzy przeszli operację.