Name: Ujednolicone ramy metodologiczne dla badań nad schwannomakiem przedsionkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych komórek schwannoma przedsionkowego z próbek ludzkich. Technika minimalnie inwazyjna umożliwia zachowanie żywotności komórek i testowanie kandydatów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Narodowego Instytutu Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych R01DC015824 (K.M.S.) i T32DC00038 (wspierające J.E.S i S.D.), grant Departamentu Obrony W81XWH-14-1-0091 (K.M.S.), Fundację Bertarelli (K.M.S.), Fundację Nancy Sayles Day (K.M.S.), Centrum Badań nad Szumami Usznymi Lauer (K.M.S.), oraz Fundacja Barnesa (K.M.S.).

<ol><li>Babu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+schwannomas+in+the+modern+era%3A+epidemiology%2C+treatment+trends%2C+and+disparities+in+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management.</a> J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).</li>
<li>Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+epidemiology+and+management+trends+in+acoustic+neuroma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).</li>
<li>Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+epidemiology+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas.</a> Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).</li>
<li>Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((True+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">True incidence of vestibular schwannoma?</a> Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).</li>
<li>Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+real+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">What is the real incidence of vestibular schwannoma?</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).</li>
<li>Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+natural+history+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas.</a> Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).</li>
<li>Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+patterns+of+care+of+brain+tumor+patients+in+the+United+States%3A+a+study+of+the+Brain+Tumor+Section+of+the+AANS+and+the+CNS+and+the+Commission+on+Cancer+of+the+ACS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS.</a> Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).</li>
<li>Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+sporadic+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Management of sporadic vestibular schwannoma.</a> Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+vestibular+schwannomas+associated+with+good+hearing+secrete+higher+levels+of+fibroblast+growth+factor+2+than+those+associated+with+poor+hearing+irrespective+of+tumor+size%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size.</a> Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+VEGF+receptor-1+concentration+in+vestibular+schwannoma+homogenates+correlates+to+tumor+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate.</a> Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).</li>
<li>Koutsimpelas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VEGF%2FVEGF-R+axis+in+sporadic+vestibular+schwannomas+correlates+with+irradiation+and+disease+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22ORL+J+Otorhinolaryngol+Relat+Spec%22%5BJournal%5D)">The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence.</a> ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).</li>
<li>Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+VEGF-A+and+cMET+signaling+in+human+vestibular+schwannomas+and+schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells.</a> Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+medications+are+cytostatic+against+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas.</a> Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+validation+of+anti-nuclear+factor-kappa+B+therapy+to+inhibit+human+vestibular+schwannoma+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth.</a> Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Blakeley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+drug+treatments+for+neurofibromatosis+type+2-associated+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).</li>
<li>Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF2%2Fmerlin+in+hereditary+neurofibromatosis+2+versus+cancer%3A+biologic+mechanisms+and+clinical+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations.</a> Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).</li>
<li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human vestibular schwannomas.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+Schwann+and+schwannoma+cells%3A+improved+and+simplified+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol.</a> Hear Res. , 25-33 (2014).</li>
<li>Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+expression+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).</li>
<li>Cioffi, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+overexpression+contributes+to+vestibular+schwannoma+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival.</a> Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).</li>
<li>Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB+and+Nrg%3A+potential+molecular+targets+for+vestibular+schwannoma+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy.</a> Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).</li>
<li>Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+between+the+growth+fraction+of+bilateral+vestibular+schwannomas+in+neurofibromatosis+2+%28NF2%29+and+unilateral+vestibular+schwannomas+using+the+monoclonal+antibody+MIB+1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1.</a> Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).</li>
<li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+recombinant+parts+of+the+Ki-67+antigen+%28MIB+1+and+MIB+3%29+detect+proliferating+cells+in+microwave-processed+formalin-fixed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections.</a> J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).</li>
<li>Hung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+study+of+human+vestibular+nerve+schwannoma+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation.</a> Glia. 38 (4), 363-370 (2002).</li>
<li>Archibald, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+expression+in+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 expression in vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforaphane%2C+a+natural+component+of+broccoli%2C+inhibits+vestibular+schwannoma+growth+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 36215(2016).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).</li>
<li>Lysaght, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+of+human+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome of human perilymph.</a> J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+genes+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+nerve+microenvironment+for+schwannoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The importance of nerve microenvironment for schwannoma development.</a> Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).</li>
<li>Torres-Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+in+vestibular+schwannomas+shows+critical+deregulation+of+microRNAs+and+upregulation+in+those+included+in+chromosomal+region+14q32%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32.</a> PLoS One. 8 (6), e65868(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy manuskrypt opisuje ujednolicone ramy metodologiczne dla badań nad VS, przedstawiając zarys jednoczesnego przetwarzania ludzkich próbek VS i GAN do dalszych zastosowań badawczych. W miarę jak badania VS wkraczają w erę medycyny precyzyjnej, przygotowanie tej samej próbki w formie zdolnej do udzielenia odpowiedzi na wiele pytań badawczych umożliwi odkrycie wglądów molekularnych, komórkowych, genetycznych i proteomicznych specyficznych dla poszczególnych pacjentów.
Czystość ludzkich kom...

Nerzaki przedsionkowe (VS) są najczęstszymi nowotworami kąta móżdżkowo-oponowego, diagnozowanymi u 1 na 100 000 osób. Chociaż nie ma przerzutów, guzy te poważnie wpływają na jakość życia pacjenta1,2,3,4,5,6. Osoby dotknięte chorobą często żyją z ubytkiem słuchu, szumami usznymi i uczuciem pełności słuchowej. Objawy stają się coraz bardziej wyniszczające w miarę wzrostu guza, powodując problemy z równowagą, paraliż twarzy i upośledzenie innych funkcji nerwów czaszkowych. Mogą również wystąpić zagrażające życiu powikłania spowodowane uciskiem pnia mózgu7.
Opcje zarządzania VS są zasadniczo ograniczone do czujnego oczekiwania na guzy statyczne i radioterapii stereotaktycznej lub chirurgicznej resekcji rosnących guzów8. Chirurgiczne usunięcie tych guzów w szpitalach związanych z badaniami daje możliwość pozyskania i analizy świeżej tkanki nowotworowej pobranej podczas operacji pacjentów. Jedno ze specyficznych podejść chirurgicznych do VS, resekcja translabiryntowa, może nawet zapewnić dostęp do cennego ludzkiego nabłonka czuciowego z ucha wewnętrznego i perylimfy.
Ponieważ VS powstają z obwodowego nerwu czuciowego (tj. nerwu przedprzedsionkowego), ważne jest porównanie obserwacji związanych z VS z tymi pochodzącymi z odpowiedniego nerwu kontrolnego, takiego jak ludzki wielki nerw uszny (GAN). Zdrowe GAN są regularnie poświęcane podczas parotydektomii lub sekcji szyi i mogą być używane jako solidne modele dla zdrowej fizjologii komórek Schwanna9.
Ponieważ nie ma zatwierdzonych przez FDA leków do leczenia lub zapobiegania sporadycznym VS, konieczne jest, aby badacze wyjaśnili mechanizmy molekularne leżące u podstaw choroby, aby zidentyfikować cele terapeutyczne. Białka, które odgrywają rolę w patogenezie VS, obejmują merlinę, czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), cyklooksygenazę 2 (COX-2), czynnik jądrowy kappa B (NF-κB), czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-alfa), receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i powiązane cząsteczki sygnałowe10,11,12,13,14,15,16,17.
Ostatnie postępy rozszerzyły i ulepszyły protokoły gromadzenia, przetwarzania, hodowli i dalszego badania pierwotnych ludzkich nerwiaków przedsionkowych i zdrowych tkanek nerwowych18,19. Jednak większość istniejących protokołów jest zaprojektowana tak, aby umożliwić przygotowanie takich tkanek do pojedynczego dalszego zastosowania badawczego (tj. samej hodowli komórkowej). W artykule przedstawiono ujednolicone ramy metodologiczne dla jednoczesnego przetwarzania pojedynczej pierwotnej próbki ludzkiej VS lub GAN do wielu dalszych zastosowań: hodowla specyficzna dla typu komórki, ekstrakcja białek, konserwacja RNA, pobieranie wydzieliny guza i utrwalanie tkanek. Praca ta szczegółowo opisuje również chirurgiczne pobieranie i przetwarzanie ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i perylimfy podczas translabiryntowej resekcji VS, ponieważ te blisko spokrewnione tkanki mogą służyć jako ważne źródła biomarkerów VS. Wreszcie, protokół ten przedstawia etapy transdukcji wirusa pierwotnych ludzkich komórek VS w hodowli jako nowatorskie zastosowanie tej tkanki do zastosowania w terapii genowej.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 Niemieckie szkiełko nakrywkowe</td><td>Corning</td><td>354087</td><td>Lub przygotuj szkiełka nakrywkowe z Corning Laminin (CB-40232) i Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe CELLSTAR 15 mL, stożkowe dno, podziałka, sterylne</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Probówki wirówkowe, stożkowe dno, podziałka, sterylny</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych CELLSTAR, 60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum, sterylnie filtrowana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24 dobrze przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC, sterylne</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian, bez glutaminy, 500 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 500 ml</td><td>Kleszcze Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze, standardowa końcówka, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, kwalifikowane, zatwierdzone przez USDA, 500 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028</td><td>Podwielokrotność w probówkach 50 ml i przechowywać w temperaturze -20& C zamrażarka</td></tr><tr><td>Hialuronidaza z jąder bydlęcych, typ I-S, liofilizowany proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m, polieterosulfon, 33 mm, sterylny</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, klasa odczynnika, krystaliczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Przed użyciem: Ustal standardowe procedury operacyjne w oparciu o protokoły dostępne online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 500 ml</td><td>Autoklaw Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL), 100 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP Tabletki inhibitora fosfatazy</td><td>Roche</td><td>04906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Tabletki inhibitora proteazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Pipety i końcówki do pipet, 5/10/25 mL</td><td>Zmienny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastikowy tłuczek homogenizacyjny do mikroprobówek 1,5/2,0 ml</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-10539</td><td></td></tr><tr><td>Igły PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 cala</td><td>BD</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater (roztwór stabilizujący RNA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, polipropylen, 0,5 ml</td><td>autoklaw</td> <td>Eppendorf</td><td>022363719</td> przed użyciem</tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, polipropylen, 1,5 ml</td><td>Autoklaw Eppendorf</td><td>022363204</td><td>przed użyciem</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna - 0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, bakteriostatyczny, 20 ml</td><td>Hospira</td><td>0409-1966-05</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Schuknecht Rura ssąca 24 gauge</td><td>Bausch + Lomb</td><td>N1698 42</td><td>Przydatny do dostępu chirurgicznego (oprócz typowych otologicznych narzędzi chirurgicznych) i np. niebieski marker chirurgiczny</td></tr><tr><td>Pojemnik na próbki, LUB sterylny, 4OZ</td><td>Medline</td><td>DYND30331H</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>Kombinacja strzykawka/igła, końcówka Luer-Lok, 5 mL, 22 G x 1 cal.</td><td>BD</td><td>309630</td><td></td></tr><tr><td>Tylko strzykawka tuberkulinowa, końcówka poślizgowa, 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Tylko strzykawka tuberkulinowa, końcówka poślizgowa, 3 ml</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator ultradźwiękowy, seria 4710, sonda CV18</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP25013</td><td></td></tr></tbody></table>

ujednolicone ramy metodologiczne dla badań nad schwannomakiem przedsionkowym

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

Nerwiaki osłonkowe przedsionkowe są najczęstszymi nowotworami kąta móżdżkowo-móżdżkowego, stanowiąc 6-8% wszystkich narośli wewnątrzczaszkowych. Chociaż guzy te powodują odbiorczy ubytek słuchu nawet u 95% osób dotkniętych tym ubytkiem, mechanizmy molekularne leżące u podstaw tego ubytku słuchu pozostają nieuchwytne. W tym artykule przedstawiono kroki ustalone w naszym laboratorium w celu ułatwienia pobierania i przetwarzania różnych pierwotnych próbek tkanek ludzkich do dalszych zastosowań badawczych integralnych z badaniem nerwiaków osłonkowych. W szczególności praca ta opisuje ujednolicone ramy metodologiczne dla pobierania, przetwarzania i hodowli komórek Schwanna i nerwiaka osłonkowego z próbek chirurgicznych. Jest to zintegrowane z równoległymi etapami przetwarzania, które są obecnie uważane za niezbędne dla obecnych badań: zbieraniem wydzielin nowotworowych i nerwowych, konserwacją RNA i ekstrakcją białka z pobranych tkanek, utrwalaniem tkanki do przygotowania skrawków oraz ekspozycją pierwotnych komórek ludzkich na wirusy związane z adenowirusami w celu zastosowania w terapii genowej. Ponadto praca ta podkreśla translabiryntowe podejście chirurgiczne do pobrania tego guza jako wyjątkową okazję do uzyskania ludzkiego nabłonka czuciowego z ucha wewnętrznego i perylimfy. Podano wskazówki dotyczące poprawy jakości eksperymentów i podkreślono typowe pułapki.

Pierwotne ludzkie komórki VS w hodowli, przygotowane zgodnie z sekcją 5, mogą służyć jako informatywne modele procesów związanych z chorobą w wielu późniejszych zastosowaniach badawczych (Rysunek 1). Zdrowe komórki Schwanna hodowane w sekcji 6 stanowią bezpośredni i pouczający punkt odniesienia. Jak opisano poniżej, obszerne dane z VS i GAN opracowane zgodnie z tą jednolitym ramami metodologicznymi są dostępne w wielu wcześniej opublikowanych artykułach<sup c...

Celem tego protokołu jest nakreślenie procesu zbierania i przetwarzania ludzkich próbek chirurgicznych do wielu dalszych zastosowań w badaniach nad schwannoma przedsionkowym i komórkami Schwanna.

Ujednolicone ramy metodologiczne dla badań nad schwannomakiem przedsionkowym

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie próbki ludzkiego nerwiaka przedsionkowego pobranej z bloku operacyjnego w celu stworzenia pierwotnej hodowli komórkowej oraz zbioru wydzielin nowotworowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad nerwiakami przedsionkowymi, takie jak optymalny sposób odbierania, przechowywania i przetwarzania pierwotnej próbki ludzkiego nowotworu przeznaczonej do zastosowania w wielu analizach biomolekularnych. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie metody hodowli o minimalnym stopniu manipulacji do namnażania pierwotnych ludzkich komórek nerwiaka przedsionkowego.Implikacje tej techniki obejmują terapię schwannomy nerwu przedsionkowego, ponieważ obiecujące kandydaty terapeutyczne mogą być testowane bezpośrednio na hodowlach komórkowych. Rozpocznij od przeniesienia pojemnika z próbką świeżo pobranej schwannomy nerwu przedsionkowego lub nerwu małżowinowego z lodu używanego do transportu z sali operacyjnej do komory z laminarnym przepływem powietrza w laboratorium. Za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie przenieś próbkę do pierwszej z trzech probówek o pojemności 1,5 ml wypełnionych 1,4 ml zewnętrznego PBS.Zamknij każdą probówkę po umieszczeniu w niej preparatu i delikatnie wstrząśnij w celu przemycia. Umieść próbkę w suchej 60 milimetrowej płytce Petriego i za pomocą pęsety usuń wszystkie martwe tkanki w obszarach z wyraźnymi naczyniami krwionośnymi. Użyj pęsety lub ostrza skalpela, aby podzielić próbkę na oddzielne fragmenty do konserwacji RNA, ekstrakcji białek, pobierania wydzieliny, fiksacji oraz hodowli komórkowych.Przenieś fragment preparatu przeznaczony do hodowli komórkowej do nowej 60 milimetrowej płytki hodowlanej zawierającej od pięciu do ośmiu mililitrów zimnej, suplementowanej pożywki DMEM F12. Umieść fragment nerwiaka przedsionkowego lub nerwu usznego wielkiego, przeznaczony do pobierania wydzielin, w pustej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Rozpocznij od pipetowania 500 mikrolitrów pożywki DMEM bez suplementacji FBS do dwóch probówek o pojemności 1,5 mililitra.Pierwsza probówka zostanie wykorzystana do zbierania wydzielin guza, a druga posłuży jako dopasowana kontrola. Umieść jedną z probówek zawierających DMEM na skalibrowanej wadze cyfrowej. Wytaruj wagę, umieść w probówce fragment preparatu przeznaczony do zbierania wydzielin i zważ go.Zanotuj wynik, który będzie reprezentował masę samej tkanki. Pod laminarnym dygestorium dopasuj objętość DMEM w probówce do 100 µL na każde 10 mg próbki. Umieść probówkę zawierającą próbkę tkanki oraz odpowiadającą jej kontrolę w inkubatorze.Inkubować przez co najmniej 72 godziny, aby zebrać biologicznie użyteczne ilości wydzielin nowotworowych lub nerwowych. Po 72 godzinach inkubacji użyć pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć z próbki pożywkę zawierającą wydzielinę. Aby zapobiec wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania, podzielić pożywkę na aliquoty w nowych probówkach, zgodnie z planowaną dalszą analizą.Przechowywać oryginalny fragment tkanki, wydzieliny oraz kontrolne DMEM w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia dalszych aplikacji. Procedurę hodowli rozpocząć od rozdzielenia tkanki nerwiaka przedsionkowego na fragmenty o objętości około 1 mm³ za pomocą pęsety w każdej dłoni. Następnie odessać medium i fragmenty guza za pomocą pipety serologicznej 10 mm i przenieść całą zawartość do stożkowej probówki 15 ml.Wiruj przez trzy minuty przy 1000G w temperaturze 25 stopni celsius. Podczas wirowania przygotuj medium do dezintegracji, łącząc 4,7 mililitrów uzupełnionej pożywki DMEM F12 z 250 mikrolitrów kolagenazy i 50 mikrolitrów hialuronidazy w 60 milimetrowej płytce hodowlanej. Po wirowaniu fragmenty guza utworzą osad na dnie probówki stożkowej.Ostrożnie odpipetuj i odrzuć nadsącz. Następnie dodaj dwa mililitry świeżo przygotowanego medium do dezintegracji zawierającego enzym do podniebienia z nowotworem. Kilkukrotnie pipetuj w górę i w dół, aby zmobilizować tkankę, a następnie przenieś ją do 60 milimetrowej szalki hodowlanej.Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze na 18 godzin. Następnego dnia podgrzej pożywkę DMEM F12 uzupełnioną o 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Wyjmij naczynie zawierające hodowlę nerwiaka splotu błędnika z inkubatora i przenieś je do dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą igły 22 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 6 ml odessać pożywkę z hodowli i przenieść ją do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Wiruj przez pięć minut przy 1000G w temperaturze 37 °C. W międzyczasie, używając sterylnej pęsety, umieść odpowiednią liczbę szkiełek nakrywkowych pokrytych polideksylocelem i lamininą w 24-dołkowej płytce hodowlanej. Z kostki guza o boku jednego centymetra można przygotować hodowle w 24 do 32 dołkach, zatem w przypadku większości mniejszych guzów odpowiednie będzie zaplanowanie hodowli komórek w ośmiu do 16 dołków.Po wirowaniu odlej supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w podgrzanym medium, tak aby uzyskać jeden mililitr zawiesiny komórkowej na każdą planowaną studzienkę. Użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby pobrać dwa mililitry zawiesiny komórkowej i nanieść jeden mililitr do studzienki płytki 24-dołkowej. Kontynuuj pobieranie i naniesienie medium zawierającego komórki nowotworowe, pobierając medium w ilościach dwóch mililitrów, z których jeden mililitr nanosi się do każdej planowanej studzienki, aż zawiesina komórek nowotworowych zostanie równomiernie podzielona pomiędzy wszystkie przygotowane studzienki.Umieść płytkę 24-dołkową w inkubatorze w temperaturze 37 °C na całą noc. Sprawdź płytkę następnego dnia; jeśli na dnie dołków zauważysz znaczne ilości zanieczyszczeń, ostrożnie wymień pożywkę w każdym dołku na nową suplementowaną pożywkę DMEM F12, uważając, aby nie usunąć przytwierdzonych komórek. Jeśli zanieczyszczenia nie są obecne, wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora i wymień pożywkę po raz pierwszy w piątym dniu, a następnie co trzy dni.Ten obraz w jasnym polu ilustruje typowy wzorzec organizacyjny komórek nerwiaka przedsionkowego w hodowli. Te obrazy immunofluorescencyjne z pierwotnej hodowli ludzkiego nerwiaka przedsionkowego zostały wykonane po 48 godzinach ekspozycji na GFP wyrażający ink 80, pokazany na zielono. Czerwona fluorescencja pochodzi z immunobarwienia aktyny F falloidyną, która barwi cytoszkielet, a niebieska fluorescencja to DAPI, który barwi jądro komórkowe.Wstawka przedstawia obraz powiększony obszaru widocznego na zdjęciu o niskiej rozdzielczości. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zapisywanie czasu umieszczenia próbki wydzieliny oraz próbki hodowli w inkubatorze, aby zapewnić wykonanie kolejnych etapów po prawidłowym czasie inkubacji. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak transdukcja wirusowa, fiksacja, immunofluorescencja, traktowanie lekiem oraz ekstrakcja RNA, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące ekspresji różnych wirusów w komórkach lub zmian w ekspresji genów po zastosowaniu leku.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie nerwiaków przedsłuchowych do zbadania sposobu, w jaki pierwotne ludzkie komórki reagują na różne leki u pacjentów, którzy przeszli operację.

a-unified-methodological-framework-for-vestibular-schwannoma-research

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano metodę pomiaru trójwymiarowych odruchów przedsionkowo-ocznych (3D VOR) u ludzi z wykorzystaniem symulatora ruchu o sześciu stopniach swobody (6DF). Wzmocnienie oraz błąd ustawienia kątowego 3D VOR stanowią bezpośrednią miarę jakości funkcji przedsionkowej. Przedstawiono reprezentatywne dane uzyskane od zdrowych osób...

Trójwymiarowe badanie odruchu przedsionkowo-okulistycznego z wykorzystaniem platformy ruchowej o sześciu stopniach swobody

Nerzaki przedsionkowe (VSs) to niezłośliwe nowotwory pochodzenia z komórek Schwanna (SC), związane z mutacjami w genie supresorowym NF2. Przedstawiamy powtarzalny, skuteczny protokół dla pierwotnej hodowli komórek ludzkich i komórkowych, który pozwala na molekularną i komórkową manipulację eksperymentalną i analizę oraz podsumowuje niejednorodną naturę ludzkiej choroby.

Pierwotna hodowla ludzkich nerwiaków osłonkowych przedsionkowych

Aby ocenić zmiany morfologiczne nerwów czaszkowych, takie jak utrata struktur nerwowych lub obrzęk nerwów czaszkowych w chorobie Menière'a (MD) lub u zdrowych osób in vivo, opracowano protokół oceny za pomocą obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI). Wykonano dodatkowe potwierdzenie MD za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Analiza morfometryczna nerwów czaszkowych człowieka z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego w uszach chorych Menière'a i uszach prawidłowo słyszących

Prezentowana jest nowa metoda rehabilitacji w celu przywrócenia równowagi układu przedsionkowego u pacjentów z asymetrycznymi reakcjami, która polega na jednokierunkowych rotacjach w kierunku słabszej strony. Poprzez bezpośrednią modyfikację szlaku przedsionkowego, a nie wzmacnianie multisensorycznych aspektów kompensacji, asymetria może zostać znormalizowana w ciągu 1-2 sesji i przynieść trwałe efekty.

Wykorzystanie rotacji jednokierunkowych w celu poprawy asymetrii układu przedsionkowego u pacjentów z dysfunkcją układu przedsionkowego

Postrzeganie grawitacji jest zwykle determinowane przez subiektywne widzenie pionowe w pozycji pionowej głowy. Dodatkowa ocena przy pochyleniu głowy ± 15° i ± 30° w płaszczyźnie przechyłu zapewnia zwiększoną zawartość informacji w celu wykrycia upośledzonej percepcji grawiceptywnej.

Ocena statycznej percepcji grawiceptywnej w płaszczyźnie toczenia przy użyciu subiektywnego wizualnego paradygmatu wertykalnego

W tym artykule opisujemy eksperymentalne ustawienia, materiał i procedury do oceny odruchowych ruchów gałek ocznych, percepcji własnych ruchów i zadań poznawczych pod wpływem magnetycznej stymulacji przedsionkowej, a także anatomicznej orientacji narządów przedsionkowych, w skanerze tomografii rezonansu magnetycznego 7 Tesli (7T-MRT).

Pomiar wpływu magnetycznej stymulacji przedsionkowej na oczopląs, percepcję ruchu własnego i sprawność poznawczą w MRT 7T

Tutaj opisujemy technikę pobierania ludzkich narządów przedsionkowych w warunkach fizjologicznych podczas labiryntektomii i ich analizę za pomocą barwienia immunologicznego.

Pobieranie końcowych narządów przedsionkowych w warunkach fizjologicznych podczas labiryntektomii

Metodologia badała wkład wzrokowy i przedsionkowy w stabilizację spojrzenia podczas rotacji optokinetycznej i całego ciała. Stymulacje przeprowadzono poprzez badania wzrokowe, przedsionkowe i wizuo-przedwostykowe. Wzmocnienie ruchu oczu skrętne i częstotliwości oczopląsów służyły jako wskaźniki podkorowego przekazywania informacji o ruchu specyficznym dla sensorycznych do odruchowej odpowiedzi pnia mózgu w każdym badaniu.

Wykorzystanie śledzenia oczu do oceny względnego znaczenia bodźców wzrokowych i przedsionkowych dla przetwarzania ruchu podkorowego w płaszczyźnie przechylania

Leczenie izolowanego nawrotu raka płuc w polu wcześniej napromieniowanym jest wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy wstrzyknięcie cisplatyny pod kontrolą ultrasonografii wewnątrzoskrzelowej (EBUS) w leczeniu pacjentów z zlokalizowanym nawrotem raka płuc w polu wcześniej napromieniowanym.

Wewnątrzoskrzelowe wstrzyknięcie doguzowe cisplatyny pod kontrolą USG w leczeniu izolowanego nawrotu śródpiersia raka płuca

Myszy z rakiem okrężnicy-26 (C26) reprezentują klasyczny model kacheksji nowotworowej. Postępujący zanik mięśni występuje w związku ze wzrostem guza, nadmierną ekspresją specyficznych dla mięśni ligaz ubikwityny i zmniejszeniem pola przekroju poprzecznego mięśni. Obserwuje się również utratę tkanki tłuszczowej. Kaeksja jest badana w sposób zależny od czasu z rosnącym nasileniem wyniszczenia.

Mysz z rakiem okrężnicy 26 jako model do badania kacheksji nowotworowej

Poznaj metodę hodowli pierwotnych komórek schwannoma przedsionkowego z próbek ludzkich. Technika minimalnie inwazyjna umożliwia zachowanie żywotności komórek i testowanie kandydatów terapeutycznych.

Ujednolicone ramy metodologiczne dla badań nad schwannomakiem przedsionkowym

Przeglądaj więcej filmów