Pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym
2 października 2017
Scharakteryzowanie funkcji receptorów zapachowych jest nieodzowną częścią procesu desierotyzacji. Opisujemy metodę pomiaru aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym za pomocą testu cAMP.
Ogólnym celem tego cyklicznego testu AMP w czasie rzeczywistym o wysokiej przepustowości jest badanie przesiewowe substancji zapachowych pod kątem receptorów zapachowych i odwrotnie. Ponieważ myszy są przydatne do badania funkcjonowania receptora zapachowego, pozwala to na badania przesiewowe na większą skalę zarówno receptorów zapachowych, jak i ligandów, a także farmakologiczne kartelizacje interesujących par receptor-ligand. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy skutecznie i wiarygodnie ocenić aktywację od odorantu do receptora.
Heterologiczny system ekspresji odorant-receptor wykorzystujący żywe komórki. Zacznij od obserwacji komórek Hana3A pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić żywotność komórek i oszacować konfluencję. Następnie odessać całą pożywkę z naczynia do hodowli komórkowych.
I umyj komórki, dodając 10 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem na talerz, obracając naczynie i zasysając PBS. Następnie dodaj trzy mililitry 0,5% trypsyny-EDTA na płytkę. Pozostaw trypsynę na komórkach na jedną minutę lub do momentu, gdy wszystkie komórki będą się unosić na powierzchni.
Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 mililitrów MEM z 10% FBS i pipetując w górę iw dół, aby rozbić kawałki masy komórkowej. Po wykonaniu zliczania komórek przenieś 2x10 do 6 komórek na 96-dołkową płytkę, która ma być transfekowana do 15-mililitrowej probówki. Ważne jest, aby obliczyć prawidłową liczbę komórek, które należy przygotować na 96-dołkowej płytce, aby uniknąć nadmiernego lub niedostatecznego wzrostu komórek przed stymulacją.
Odwirować probówki o sile 200 razy G przez pięć minut. A następnie odessać supernatant bez naruszania palety komórek. Dodaj sześć mililitrów pożywki bez antybiotyków na każdą 96-dołkową płytkę i pipetuj w górę iw dół, nie tworząc pęcherzyków powietrza w celu rozbicia kawałków masy komórkowej.
Przenieś zawieszone komórki do zbiornika. Za pomocą pipety wielokanałowej należy odpipetować 50 mikrolitrów komórek do każdego dołka z 96-dołkowych płytek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Przed transfekcją należy obserwować posiane komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić prawidłowe zbieganie około 30 do 50% na studzienkę, a następnie wrócić do inkubatora. Postępuj zgodnie z wierszem oznaczonym konstruktem nawaniacza do receptora, konstruktami czynnika akcesoriów i konstruktem cyklicznego wariantu bioczujnika AMP. Następnie przygotuj mieszaninę transfekcji plazmowej w 500 mikrolitrach MEM na każdą 96-dołkową płytkę.
Następnie przygotuj mieszaninę do transfekcji zawierającą 18 mikrolitrów odczynnika do transfekcji za pośrednictwem lipidów w 500 mikrolitrach MEM. Mieszaninę do transfekcji zmieszać z mieszaniną osocza, pipetując w górę i w dół. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
Po inkubacji zatrzymaj reakcję, dodając 5 mililitrów MEM z 10% FBS do mieszanki transfekcyjnej. Następnie rozłóż grubą warstwę sterylnych ręczników papierowych w kapturze do hodowli komórkowych. Pobrać 96-dołkową płytkę z komórkami z inkubatora.
Delikatnie i wielokrotnie postukaj talerzem do góry nogami o stos ręczników papierowych, tak aby podłoże zostało całkowicie wchłonięte przez ręcznik papierowy. Przenieść 50 mikrolitrów połączonej mieszaniny transfekcji do każdego dołka 96-dołkowej płytki i inkubować przez noc przez 18 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Możesz zarządzać transfekcją, a harmonogram stymulacji powinien utrzymywać się na instrumencie, ponieważ więcej niż jedna 96-dołkowa płytka jest testowana w jednym eksperymencie, tak aby wszystkie płytki były lustrzane po tym samym interwale transfekcji i ekspozycji destylatorów.
Przed stymulacją obserwuj transfekowane komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić prawidłową konfluencję od 50 do 80% na studzienkę przed powrotem do inkubatora. Następnie przygotuj pożywkę stymulującą, dodając 10 milimolowych hałd i pięć milimolowych glukozy do zbilansowanego roztworu soli Hanksa. Rozmrozić 55 mikrolitrów stopów cyklicznych odczynników substratowych AMP w czasie rzeczywistym na lodzie.
Przygotować 2% roztwór o równej abracji, mieszając 55 mikrolitrów odczynnika substratowego i 2 750 mikrolitrów pożywki stymulującej. Po rozłożeniu grubej warstwy ręczników papierowych na ławce, delikatnie i wielokrotnie postukaj talerzem do góry nogami o ręczniki papierowe, tak aby medium transfekcyjne zostało wchłonięte przez ręczniki papierowe. Umyj komórki, pipetując 50 mikrolitrów pożywki stymulacyjnej do każdej studzienki.
Delikatnie i wielokrotnie wystukaj pożywkę stymulającą z 96-dołkowej płytki. Odpipetować 25 mikrolitrów 2% roztworu equillibration do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez dwie godziny. Przed zakończeniem czasu inkubacji rozcieńczyć rozmrożone roztwory podstawowe nawaniaczy do stężenia roboczego i pożywki stymulującej.
Przed dodaniem środka zapachowego należy użyć czytnika płytek chemiluminescencyjnych, aby zmierzyć podstawowy poziom luminescencji płytki. Szybko wyjmij płytkę z czytnika płytek i dodaj 25 mikrolitrów rozcieńczonych nawaniaczy do każdej studzienki. Następnie natychmiast rozpocznij ciągły pomiar luminescencji wszystkich studzienek przez 20 cykli w ciągu 30 minut.
379 unikalnych ludzkich receptorów zapachowych zostało przebadanych pod kątem 30 mikromolowych mięśni za pomocą cyklicznego testu AMP w czasie rzeczywistym. Kolorowe bloki wzdłuż osi X wskazują różne rodziny ludzkich receptorów zapachowych. Oś Y reprezentuje znormalizowaną luminescencję 30 minut po dodaniu środka zapachowego, gdy odpowiedź osiągnęła maksimum dla kontroli pozytywnej.
Wskazana jest odpowiedź OR5AN1. Rysunek ten przedstawia pomiary w czasie rzeczywistym aktywacji OR5AN1 przez różne stężenia mięśniaków oraz wynik kontroli ujemnej bez zapachu. Strzałka wskazuje punkt czasowy dodania odrantu.
W tym miejscu pokazano krzywą stężenie-odpowiedź OR5AN1 w stosunku do muskonu 30 minut po dodaniu odariantu. Opisana tutaj technika trwa w sumie trzy dni, zaczynając od talerza podstawowego poziomów kultur pierwszego dnia. Po opanowaniu, proces ostatniego dnia może zostać zakończony w ciągu trzech godzin dla każdej płytki 96-dołkowej, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zarządzać aktywacją receptorów odórowych za pomocą cyklicznego testu AMP, aby wykorzystać wyniki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę pomiaru aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem testu cAMP. Technika ta umożliwia wydajny screening substancji zapachowych w odniesieniu do receptorów, wykorzystując zalety heterologicznego systemu ekspresji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia węchu
- Farmakologia
Wprowadzenie
- Receptory zapachowe odgrywają kluczową rolę w zmyśle węchu.
- Zrozumienie aktywacji receptorów jest niezbędne dla procesu deorphanizacji.
- Myszy są powszechnie wykorzystywane do badania funkcji receptorów zapachowych.
- Testy w czasie rzeczywistym zwiększają efektywność procesów przesiewowych.
Cel badania
- Opracowanie wysokoprzepustowej metody przesiewania substancji zapachowych.
- Ocena aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym.
- Ułatwienie charakterystyki farmakologicznej par receptor-ligand.
Zastosowane metody
- Analiza cyklicznego AMP w czasie rzeczywistym o wysokiej przepustowości.
- Heterologiczny system ekspresji z wykorzystaniem żywych komórek.
- Obserwacja komórek Hana3A pod kątem żywotności i konfluencji.
- Przesiewanie substancji zapachowych przeciwko receptorom węchowym.
Główne wyniki
- Test ten umożliwia wiarygodną ocenę aktywacji receptora przez substancję zapachową.
- Osiągnięto wydajny screening zarówno receptorów, jak i ligandów.
- Metoda ta pozwala na prowadzenie badań na większą skalę.
- Przed rozpoczęciem eksperymentów potwierdzono żywotność komórek.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie funkcji receptorów węchowych.
- Stanowi ona wiarygodną platformę do badań farmakologicznych.
- Podejście to można zastosować do różnych oddziaływań receptor-ligand.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten test cAMP w czasie rzeczywistym umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie receptorów węchowych, rozwiązując kluczowy problem wąskiego gardła w procesie deorphanizacji celów olfaktorycznych. Dzięki zapewnieniu ilościowych odczytów aktywacji receptorów w czasie rzeczywistym, metoda ta wspiera wczesną walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w programach odkrywania w obszarze neuronauki i biologii sensorycznej. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływań receptor-ligand, dostarczając danych niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych dla programów badań nad celami olfaktorycznymi.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie ekspozycji na substancje zapachowe ze specyficznymi dla receptorów odpowiedziami cAMP.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację receptorów osieroconych poprzez profilowanie aktywacji zależnej od dawki.
- Wartość translacyjna: Generuje dane dotyczące zależności stężenie-odpowiedź, które pozwalają określić pewność wyboru celu oraz priorytetyzację związków wiodących.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje znormalizowane wyniki luminescencji, które umożliwiają bezpośrednie porównanie mocy odorantów pomiędzy rodzinami receptorów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalny screening bibliotek chemicznych przeciwko panelom receptorów w formacie płytek 96-dołkowych.
- Wartość skalowalności: Kompatybilność z analizami wielopłytkowymi wspiera kampanie o średniej przepustowości w celu odkrywania ligandów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy aktywację receptora z sygnalizacją w dół strumienia, zapewniając wgląd mechanistyczny w szlaki transdukcji węchowej.
- Wartość translacyjna: Generuje istotne farmakologicznie dane (EC50, skuteczność), które mogą pomóc w opracowaniu strategii biomarkerów w zaburzeniach sensorycznych.
- Zgodność przedkliniczna: Wykorzystuje bibliotekę receptorów ludzkich w linii komórkowej ssaków, co zwiększa istotność w odniesieniu do biologii człowieka.
Integracja potoków i przepływów pracy
Test ten wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając walidację celu po klonowaniu receptora i przed optymalizacją związku wiodącego, poprzez dostarczenie funkcjonalnego potwierdzenia wiązania receptora z ligandem.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez biologicznych dotyczących specyficzności receptorów i aktywacji ligandów w kontekście żywych komórek.
- Screening: Dostarczanie ilościowych pomiarów cAMP w czasie rzeczywistym, które umożliwiają identyfikację i ranking hitów.
- Analityka: Zapewnienie znormalizowanej luminescencji i profili kinetycznych, które wspierają porównania między dołkami oraz między płytkami.
- Badania translacyjne: Wykorzystanie ludzkich receptorów zapachowych w komórkach Hana3A, co zwiększa istotność w odniesieniu do ludzkiej funkcji węchowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stworzenie platformy wielokrotnego użytku do screeningu różnorodnych celów chemosensorycznych poza zakresem olfaktoryki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w aktywacji receptorów poprzez pomiar produkcji wtórnych przekaźników w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje warunki analizy we wszystkich płytkach, co poprawia powtarzalność i zmniejsza zmienność w kampaniach przesiewowych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go w kwestii walidacji celu poprzez wczesne potwierdzenie odpowiedzi funkcjonalnych w procesie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Wspiera optymalizację postępów z uwzględnieniem ryzyka poprzez odfiltrowanie obiektów nieodpowiadających i koncentrację zasobów na zwalidowanych parach receptor-ligand.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek ssaków, transfekcji oraz prowadzeniu testów na żywych komórkach.
- Wymaga zastosowania czytników płytek luminescencyjnych zdolnych do pomiarów kinetycznych w odstępach 30-minutowych.
- Konieczna jest standaryzacja wydajności transfekcji oraz konfluencji komórek w poszczególnych studzienkach w celu uzyskania wiarygodnych sygnałów.
- Wymagana jest optymalizacja rozpuszczalności i rozcieńczenia odorantów w medium stymulującym, aby uniknąć artefaktów.
- Metoda ograniczona do receptorów sprzężonych z białkiem Gs, które modulują cAMP; nie dotyczy szlaków sprzężonych z białkami Gi lub Gq bez adaptacji biosensora.
