Name: Pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym za pomocą testu cAMP. Technika umożliwia efektywny screening ligandów przy użyciu systemu ekspresji heterologicznej w komórkach Hana3A.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Chińską Narodową Fundację Nauki (31070972), Komisję Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (16ZR1418300), Program dla Innowacyjnego Zespołu Badawczego Miejskiej Komisji Edukacji w Szanghaju, Shanghai Eastern Scholar Program (J50201) oraz Narodowy Program Badań Podstawowych Chin (2012CB910401).

1. Hodowla i utrzymanie komórek Hana3A
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki w 10 ml minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny i 1,25 μg/ml amfoterycyny B w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Co drugie pasaż dodawać 1 μg/ml puromycyny, aby utrzymać stabilną transfekcję plazmidów (patrz Wprowadzenie). 
	UWAGA: Wszystkie czynności związane z hodowlą komórkową należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby zapewnić sterylne środowisko.</li>
	<li>Subkultura w proporcji 10-20% w naczyniach 100-milimetrowych co 2-3 dni.</li>
</ol>
2. Komórki poszycia do transfekcji
<ol>
	<li>Obserwuj komórki Hana3A pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić żywotność komórek i oszacować konfluencję.</li>
	<li>Odessać całe podłoże z naczynia do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Umyj komórki, dodając 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na płytkę, obracając naczynie i zasysając PBS.</li>
	<li>Dodaj 3 ml 0,05% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na płytkę. Mieszaj przez 1 minutę lub do momentu, gdy wszystkie komórki będą pływać. 
	UWAGA: W razie potrzeby obserwuj postęp odłączania się komórek od dna płytki pod mikroskopem.</li>
	<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml MEM z 10% FBS i pipetując w górę iw dół, aby rozbić kawałki masy komórkowej. 
	UWAGA: W przypadku posiewu przed transfekcją stosowane podłoże nie powinno zawierać antybiotyków. Dodanie antybiotyków może zmniejszyć skuteczność transfekcji.</li>
	<li>Przenieś odpowiednią ilość komórek do probówki o pojemności 15 mLl w zależności od liczby płytek do transfekcji. Na każdą 96-dołkową płytkę, płytkę 2 x 106 komórek lub około 1/5 100% zlewającej się płytki o średnicy 100 mm, co daje liczbę komórek 2 x 104 komórki na studzienkę lub gęstość około 15-30% konfluencji na studzienkę. Odwirować probówki o masie 200 x g przez 5 minut i zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. 
	UWAGA: Oblicz prawidłową ilość komórek, które należy posiać na 96-dołkowych płytkach, aby uniknąć przerostu lub niedorostu komórek przed stymulacją.</li>
	<li>Dodaj odpowiednią ilość MEM z 10% FBS do probówki 15 ml i pipetuj w górę iw dół, aby rozbić kawałki masy komórkowej. Na każdą 96-dołkową płytkę ponownie zawiesić komórki 6 ml MEM z 10% FBS. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie wytwarzać pęcherzyków powietrza w rurce.</li>
	<li>Dodaj zawieszone komórki do zbiornika. Za pomocą pipety wielokanałowej odpipetuj 50 μl komórek na każdą studzienkę 96-dołkowej płytki. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Transfekcja plazmidów
<ol>
	<li>Przed transfekcją należy obserwować posiane komórki, aby zapewnić prawidłową konfluencję około 30-50% na studzienkę pod mikroskopem z kontrastem fazowym i wrócić do inkubatora.</li>
	<li>Przygotuj z wyprzedzeniem oznaczone tagiem Rho OR construct11,21,22,28, konstrukcje czynnika akcesoriów (RTP1S22,36 i M3R23), oraz wariant biosensora construct29,30 przez miniprep. Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą spektrofotometru i w razie potrzeby dostosować stężenie plazmidowego DNA (np. do 100 ng/μl) wodą destylowaną.</li>
	<li>Przygotowanie mieszanin transfekcyjnych
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę transfekcji plazmidu w 500 μl MEM dla każdej płytki 96-dołkowej zgodnie z tabelą 1. 
		UWAGA: Gdy różne OR są badane na tej samej 96-dołkowej płytce, objętość mieszaniny transfekcyjnej i ilość dodanego plazmidowego DNA muszą być dostosowane w funkcji liczby baseników transfekowanych danym OR.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę do transfekcji w probówce z 18 μl odczynnika do transfekcji za pośrednictwem lipidów w 500 μl MEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszaninę plazmidu zmieszać z mieszaniną transfekcyjną, pipetując w górę i w dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 5 ml MEM z 10% FBS.</li>
	<li>Rozłóż grubą warstwę sterylnych ręczników papierowych w kapturze do hodowli komórkowych. Pobrać 96-dołkową płytkę z komórkami z inkubatora. Delikatnie i wielokrotnie postukaj talerzem do góry nogami o stos ręcznika papierowego, tak aby podłoże zostało całkowicie wchłonięte przez ręcznik papierowy. 
	UWAGA: Nie stukaj w płytkę na siłę ani gwałtownie, ponieważ można stracić komórki.</li>
	<li>Przenieść 50 μl połączonej mieszaniny transfekcyjnej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i inkubować przez noc przez 18-24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Harmonogram transfekcji i stymulacji z zarządzaniem czasem powinien poprzedzać pomiar, gdy w jednym eksperymencie testuje się więcej niż jedną płytkę 96-dołkową, aby wszystkie płytki zostały zmierzone po tym samym czasie transfekcji i czasie ekspozycji na bodziec.</li>
</ol>
4. Stymulacja i pomiar aktywności OR za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Obserwuj transfekowane komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym, aby zapewnić prawidłowe zbieganie 50-80% na studzienkę i wróć do inkubatora.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę stymulującą, dodając 10 mM kwasu hydroksyetylopiperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 5 mM glukozy do zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS).</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotności odczynnika substratowego do testu cAMP w czasie rzeczywistym na lodzie. Odczynnik substratowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C po 55 μl na probówkę w probówkach do PCR. Użyj 1 probówki na talerz.</li>
	<li>Przygotować 2% roztwór równoważący, mieszając 55 μl odczynnika substratowego i 2750 μL HBSS/HEPES/roztworu glukozy.</li>
	<li>Rozłóż grubą warstwę ręczników papierowych na ławce. Delikatnie i wielokrotnie postukaj talerzem do góry nogami w ręcznik papierowy, aby medium transfekcyjne zostało całkowicie wchłonięte przez ręcznik papierowy.</li>
	<li>Przemyć komórki, pipetując 50 μl roztworu HBSS/HEPES/glukozy do każdego dołka.</li>
	<li>Delikatnie i wielokrotnie wystukiwać roztwór HBSS/HEPES/glukozy z płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Odpipetować 25 μl 2% roztworu równoważącego do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 2 godziny.</li>
	<li>Przygotować z wyprzedzeniem 1 M roztwory podstawowe nawaniacza w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Przed zakończeniem czasu inkubacji rozcieńczyć roztwory podstawowe środka zapachowego do stężeń roboczych w pożywce do stymulacji HBSS/HEPES/glukozy. 
	UWAGA: Stężenia rozcieńczonych substancji zapachowych przygotowanych na tym etapie należy podwoić, aby uzyskać prawidłowe stężenia końcowe w każdym dołku.</li>
	<li>Korzystając z czytnika płytek chemiluminescencyjnych i przed dodaniem środka zapachowego, zmierz podstawowy poziom luminescencji płytki 2 razy z rzędu z szybkością 1000 ms na studzienkę34.</li>
	<li>Szybko wyjmij płytkę z czytnika płytek i dodaj 25 μl rozcieńczeń nawaniacza do każdej studzienki i natychmiast rozpocznij ciągły pomiar luminescencji wszystkich studzienek przez 20 cykli w ciągu 30 min. 
	UWAGA: Pipetuj ostrożnie, aby uniknąć zanieczyszczenia sąsiednich studzienek podczas używania różnych substancji zapachowych i/lub różnych stężeń tych samych substancji zapachowych na tej samej płytce.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Eksport danych z oprogramowania czytnika płytek chemiluminescencyjnych.</li>
	<li>Oblicz znormalizowaną odpowiedź OR dla każdego punktu czasowego, korzystając ze wzoru 
	(luminescencjaN – luminescencjapodstawowa)/(luminescencja najwyższa – luminescencjapodstawowa) 
	gdzie N = wartość luminescencji pewnej studni; podstawowy = średnia wartość luminescencji dwóch podstawowych wartości luminescencji; Najwyższa = Najwyższa wartość luminescencji płyty lub zestawu płyt. 
	UWAGA: W zależności od celu eksperymentu można przyjąć alternatywne reprezentacje graficzne. Na przykład do testów przesiewowych (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1) i do generowania krzywych stężenie-odpowiedź, można użyć wartości luminescencji określonej studzienki w żądanym punkcie czasowym podczas pomiaru kinetycznego, takiej jak wartość maksymalna lub wartość końcowa.</li>
</ol>

<ol><li>Malakoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+scent+of+avian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Following the scent of avian olfaction.</a> Science. 286 (5440), 704-705 (1999).</li>
<li>Zippel, H. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/037663578290033X">The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8.</a> Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).</li>
<li>Dryer, L., Berghard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors%3A+a+plethora+of+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).</li>
<li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+human+olfactory+subgenome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+the+holy+grail%3A+establishing+a+molecular+basis+for+Mammalian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction.</a> Cell. 116 (2), 329-336 (2004).</li>
<li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+eugenol-responsive+and+muscone-responsive+mouse+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors.</a> J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).</li>
<li>Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+mammalian+olfactory+receptors%3A+measurement+of+receptor+activation+via+luciferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity.</a> J. Vis. Exp. (88), e51640(2014).</li>
<li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Sci Signal. 2 (60), ra9(2009).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+activated+olfactory+neurons+identifies+odorant+receptors+for+odors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li>
<li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li>
<li>Kajiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bases+of+odor+discrimination%3A+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li>
<li>von der Weid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+profiling+of+chemosensory+neurons+identifies+receptor-ligand+pairs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).</li>
<li>D'Hulst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MouSensor%3A+A+Versatile+Genetic+Platform+to+Create+Super+Sniffer+Mice+for+Studying+Human+Odor+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding.</a> Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).</li>
<li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+retention%2C+degradation%2C+and+aggregation+of+olfactory+G-protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).</li>
<li>Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ligands+for+olfactory+receptors+by+functional+expression+of+a+receptor+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library.</a> Cell. 95 (7), 917-926 (1998).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li>
<li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Sci Signal. 4 (155), ra1(2011).</li>
<li>Durocher, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+gene+assay+for+high-throughput+screening+of+G-protein-coupled+receptors+stably+or+transiently+expressed+in+HEK293+EBNA+cells+grown+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture.</a> Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).</li>
<li>Liberles, S. D., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+class+of+chemosensory+receptors+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium.</a> Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+effects+of+odorants+on+mouse+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial effects of odorants on mouse behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).</li>
<li>Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+analysis+of+odor+coding+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium.</a> J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).</li>
<li>Fan, B. F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="https://www.promega.com/~/media/files/resources/reprints/glosensor_gen_2009_gr001.ashx?la=en">Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).</li>
<li>Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Butter+Aroma+Recombinate+Activates+Human+Class-I+Odorant+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors.</a> J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).</li>
<li>Noe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OR2M3%3A+A+Highly+Specific+and+Narrowly+Tuned+Human+Odorant+Receptor+for+the+Sensitive+Detection+of+Onion+Key+Food+Odorant+3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.</a> Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).</li>
<li>Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+broadly+tuned+odorant+receptor+OR1A1+is+highly+selective+for+3-methyl-2%2C4-nonanedione%2C+a+key+food+odorant+in+aged+wines%2C+tea%2C+and+other+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods.</a> Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+copper+in+detection+of+metal-coordinating+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smelling+Sulfur%3A+Copper+and+Silver+Regulate+the+Response+of+Human+Odorant+Receptor+OR2T11+to+Low-Molecular-Weight+Thiols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols.</a> J Am Chem Soc. , (2016).</li>
<li>Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-transporting+protein+1+short+%28RTP1S%29+mediates+translocation+and+activation+of+odorant+receptors+by+acting+through+multiple+steps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps.</a> J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).</li>
<li>Shirasu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+receptor+and+neural+pathway+responsible+for+highly+selective+sensing+of+musk+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors.</a> Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).</li>
<li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li>
<li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors%3A+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li>
<li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780(2013).</li>
<li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dokładny pomiar aktywacji sali operacyjnej po ekspozycji na określony środek zapachowy jest pierwszym krokiem do rozszyfrowania kodowania informacji węchowych. Eksperymenty pokazane w tym badaniu stanowią przykład tego, w jaki sposób można zidentyfikować, za pomocą systemu ekspresji OR in vitro, reagujące OR w ludzkim repertuarze OR na zapachową substancję chemiczną będącą przedmiotem zainteresowania, a następnie scharakteryzować farmakologię receptora przy użyciu różnych stężeń substancji chemicznej. Nasze wyni...

Zmysł węchu odgrywa ważną rolę w przetrwaniu zwierząt, ponieważ polegają one na swoich zdolnościach węchowych, aby zdobyć pożywienie, uniknąć drapieżników i niebezpieczeństw, rozróżnić gatunki i wybrać partnera1,2. Realizacja tych funkcji zależy od receptorów zapachowych (OR), które są indywidualnie wyrażane na powierzchni rzęskowej węchowych neuronów czuciowych (OSN) zlokalizowanych w nabłonku węchowym (OE). OR stanowią największą rodzinę nadrodziny receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) z około 400 i 1200 różnymi genami OR odpowiednio u ludzi i myszy3,4,5. Receptory operacyjne aktywowane przez substancje zapachowe prowadzą do zwiększenia wewnątrzkomórkowego poziomu cAMP poprzez sekwencyjną aktywację węchowego białka G (Golf) i cyklazy adenylowej typu III (ACIII). Wynikający z tego zwiększony poziom wewnątrzkomórkowego cAMP może funkcjonować jako drugi przekaźnik, który otwiera kanał bramkowany nukleotydami na powierzchni komórki, wyzwalając napływ kationów, w tym Ca2+ i potencjałów czynnościowych, a ostatecznie inicjując transmisję neuropotencjału i percepcję węchową. Proces wykrywania i rozróżniania dużej liczby substancji zapachowych przez OR jest uważany za pierwszy krok percepcji węchowej6,7.
Ponieważ Buck i Axel8 jako pierwsi z powodzeniem sklonowali receptory zapachowe i wyjaśnili mechanizm percepcji węchowej zainicjowanej przez OR, desierotyzacja rodziny OR stała się jednym z punktów zapalnych w tej dziedzinie. Opisano różne metody pomiaru aktywacji OR in vivo, ex vivo i in vitro9,10,11,12. Tradycyjna metoda, w której wykorzystano obrazowanie Ca2+, a następnie jednokomórkowy RT-PCR na OSN, umożliwiła identyfikację różnych OR do alifatycznych środków zapachowych13,14,15. Niedawne pojawienie się wielkoskalowych analiz transkryptomu przyczyniło się do rozwoju bardziej przepustowych metod in vivo. Test z Kentucky zidentyfikował mysie OR reagujące na eugenol i muskon za pomocą szczepu reporterowego myszy S100a5-tauGFP i analizy mikromacierzy9. Opierając się na spadku poziomu mRNA OR po ekspozycji na nazapach, w technologii DREAM zastosowano podejście transkryptomiczne w celu określenia profili aktywacji OR zarówno u gatunków kręgowców, jak i bezkręgowców16. Podobnie, biorąc pod uwagę fosforylację S6 w aktywacjach neuronalnych, grupa Matsunami zsekwencjonowała mRNA z fosforylowanych immunoprecypitacji rybosomów, aby zidentyfikować reagujące ORs12. Wreszcie, grupa Feinsteina opisała myszy super sniffer, które mogą służyć jako platforma do badania kodowania zapachów in vivo, znana jako technologia MouSensor17.
W sferze in vitro, wyzwanie hodowli OSN-ów sprawia, że heterologiczny system ekspresji, który naśladuje ekspresję funkcjonalną OR in vivo, jest idealnym rozwiązaniem do przeprowadzenia na dużą skalę badań przesiewowych substancji zapachowych na obecność OR. Niemniej jednak, ponieważ hodowane linie komórkowe pochodzenia niewęchowego różnią się od natywnych OSN, białka OR są zatrzymywane w retikulum endoplazmatycznym i niezdolne do transportu do błony plazmatycznej, co powoduje degradację OR i utratę funkcji receptora18,19. Aby rozwiązać ten problem, przeprowadzono szeroko zakrojone prace mające na celu replikację ekspresji funkcjonalnej OR na błonie komórkowej w heterologicznych liniach komórkowych. Krautwurst i wsp. najpierw przyłączyli pierwsze 20 aminokwasów rodopsyny (Rho-tag) do N-końca białka OR, co promowało ekspresję niektórych OR na powierzchni komórki w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK)20. Przeprowadzając analizę biblioteki ekspresji genów (SAGE) z pojedynczych OSN, Saito i wsp. najpierw sklonowano członków rodziny białek transportujących receptory (RTP), RTP1 i RTP2, oraz białko zwiększające ekspresję receptora 1 (REEP1), które ułatwiało transport OR do błony komórkowej i wzmacniało odpowiedzi OR za pośrednictwem odorantów w komórkach HEK293T21. Opierając się na tych odkryciach, grupa Matsunami z powodzeniem stworzyła linię komórkową Hana3A, stabilnie transfekowaną RTP1, RTP2, REEP1 i Gαolf w HEK293T oraz przejściowo transfekowaną OR znakowanymi Rho, w celu uzyskania efektywnej ekspresji funkcjonalnej OR. Późniejsze badania ujawniły 1) krótszą formę RTP1, RTP1S, która może silniej promować funkcję OR niż oryginalne białko RTP1 oraz 2) muskarynowy receptor acetylocholiny typu 3 (M3R), który może zwiększać aktywność OR poprzez hamowanie rekrutacji β-arrestin-2, z których oba zostały wprowadzone do heterologicznego systemu ekspresji w celu optymalizacji wyników eksperymentalnych22, 23.
Użyto kilku metod wykrywania do ilościowego określenia aktywacji receptorów w systemach heterologicznych. Test wydzielanej fosfatazy alkalicznej łożyska (SEAP) działa z enzymem reporterowym regulowanym transkrypcyjnie przez elementy odpowiedzi cAMP (CRE), co czyni go atrakcyjną opcją do oceny aktywacji sali operacyjnej. Fluorescencja jest łatwo wykrywalna w próbce pożywki hodowlanej po inkubacji z odczynnikiem detekcyjnym SEAP24. Za pomocą tej metody scharakteryzowano funkcje OR, a także drugorzędną klasę receptorów chemosensorycznych wyrażonych w OE - receptory związane z aminami śladowymi (TAARs)25,26,27. Inna powszechna metoda, test lucyferazy, wykorzystuje gen reporterowy lucyferazy świetlika pod kontrolą elementu odpowiedzi cAMP (CRE). Pomiar luminescencji generowanej przez produkcję lucyferazy zapewnia wydajny i niezawodny sposób ilościowego określania aktywacji OR10,11,28.
Testy cAMP w czasie rzeczywistym są również szeroko stosowane w dynamicznym monitorowaniu funkcji heterologicznych lub endogennych GPCR. Jednym z przykładów takich zaawansowanych testów jest wykorzystanie genetycznie kodowanego wariantu biosensora, który posiada domenę wiążącą cAMP połączoną ze zmutowaną formą lucyferazy. Kiedy cAMP się wiąże, zmiana konformacyjna prowadzi do aktywacji lucyferazy, której luminescencję można następnie zmierzyć za pomocą czytnika chemiluminescencyjnego29,30. Technologia cAMP w czasie rzeczywistym została uznana za odpowiednią do usuwania osieroconych ludzkich receptorów zapachowych w komórkach HEK293 i NxG 108CC1531,32,33, a także w komórkach Hana3A pochodzących z HEK293T34,35. Grupa Krautwurst szczegółowo opisała również technologię cAMP w czasie rzeczywistym, która ma być odpowiednia dla dwukierunkowych podejść do badań przesiewowych na dużą skalę32,33.
Tutaj opisujemy protokół pomiaru aktywacji OR za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym w komórkach Hana3A. W tym protokole luminescencja wstępnie zrównoważonych żywych komórek jest mierzona kinetycznie przez 30 minut po traktowaniu określonymi związkami lotnymi, co stanowi bardziej wydajną i dokładną analizę aktywacji OR, które są mniej podatne na artefakty występujące w środowisku komórkowym przez dłuższy czas i toksyczność komórkową wywołaną zapachem. Ten pomiar w czasie rzeczywistym pozwala na badania przesiewowe na dużą skalę zarówno OR, jak i ligandów, a także na scharakteryzowanie określonych par OR-ligandów będących przedmiotem zainteresowania. Korzystając z tej metody, udało nam się zidentyfikować OR5AN1 jako receptor dla muskonu ze związku piżma, przeprowadzając badanie przesiewowe przeciwko 379 ludzkim OR, a następnie potwierdzając pozytywny wynik badania przesiewowego.

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor odczynnik cAMP</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F cAMP plazmid</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Hana3A ogniwa</td><td></td><td></td><td>dostępne u autorów na żądanie</td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia i magnezu</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyklon</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid</td><td></td><td></td> M3R <td>sklonowany do wektora ekspresyjnego ssaków, takiego jak pCI</td></tr><tr><td>MEM, z EBSS i L-glutaminą</td><td>Hyclon</td><td>SH30024</td><td></td></tr><tr><td>Muscone</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>Piżmo tybetańskie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S359165</td><td></td></tr><tr><td>plazmidy</td><td></td><td></td> OR <td>sklonowane za pomocą znacznika Rho do wektora ekspresyjnego ssaków, takiego jak pCI</td></tr><tr><td>PBS, bez wapnia i magnezu</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Hyklon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw minipreparacyjny plazmidu</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr>Plazmid <td></td><td></td><td>RTP1S</td><td>sklonowany do wektora ekspresyjnego ssaków, takiego jak pCI</td></tr><tr><td>Hyclon</td><td>trypsyny-EDTA</td><td>SH30236</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml probówka PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 17 mm x 120 mm rurka stożkowa</td><td>Piper wielokanałowy BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowy i/lub 12-dołkowy</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płaskodenna płytka do hodowli białych krwinek</td><td>Greiner</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Komora</td><td></td> bezpieczeństwa biologicznego <td>BD Falcon</td> 353003 <td></td></tr><tr><td>klasy II z przepływem</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>laminarnymInkubator do hodowli komórkowych, z wirówką 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, z wahliwym wirnikiem kubełkowym do probówek</td><td></td><td></td><td></td>stożkowych 15 ml</tr><tr><td>Nieskończony czytnik płytek F200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z kontrastem fazowym z obiektywami</td><td></td><td></td><td></td>x10 i x20</tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne zbiorniki na odczynniki do dystrybucji</td><td></td><td></td><td></td>wielokanałowej</tr><tr><td>Sterylny ręcznik papierowy</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu camp w czasie rzeczywistym

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Ogromne rozmiary rodzin receptorów zapachowych (OR) u ssaków sprawiają trudności w znalezieniu ich pokrewnych ligandów wśród licznych lotnych substancji chemicznych. Aby skutecznie i dokładnie zdesierocić OR, łączymy wykorzystanie heterologicznej linii komórkowej do ekspresji OR ssaków oraz genetycznie zmodyfikowanego plazmidu biosensora do pomiaru produkcji cAMP po aktywacji OR w czasie rzeczywistym. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych substancji zapachowych pod kątem sal operacyjnych i odwrotnie. Pozytywne interakcje między nawaniaczem a receptorem z ekranów można następnie potwierdzić poprzez testowanie różnych stężeń zapachów, generując krzywe stężenie-odpowiedź. Tutaj zastosowaliśmy tę metodę do przeprowadzenia wysokoprzepustowego badania przesiewowego związku zapachowego przeciwko ludzkiej bibliotece OR ulegającej ekspresji w komórkach Hana3A i potwierdziliśmy, że receptor o pozytywnej odpowiedzi jest receptorem pokrewnym dla związku będącego przedmiotem zainteresowania. Stwierdziliśmy, że ta wysokoprzepustowa metoda wykrywania jest skuteczna i wiarygodna w ocenie aktywacji sali operacyjnej, a nasze dane stanowią przykład jej potencjalnego zastosowania w badaniach funkcjonalnych sali operacyjnej.

Muskon jest głównym komponentem aromatycznym naturalnego piżma. Niedawne badania zidentyfikowały OR5AN1 jako ludzki receptor dla muskonu i innych makrocyklicznych związków piżmowych, w oparciu o homologię do mysiego receptora OR, MOR215-1, sklonowanego z kłębek rozmieszczonych w opuszkach węchowych myszy reagujących na muskon37,38. Poprzez przesiewanie repertuaru ludzkich receptorów OR, nasza grupa oraz grupa Touhary zidentyfikowa...

Scharakteryzowanie funkcji receptorów zapachowych jest nieodzowną częścią procesu desierotyzacji. Opisujemy metodę pomiaru aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym za pomocą testu cAMP.

Pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Ogólnym celem tego wysokoprzepustowego testu cAMP w czasie rzeczywistym jest przesiewanie substancji zapachowych pod kątem receptorów węchowych i odwrotnie. Myszy są użyteczne w badaniu funkcjonowania receptorów węchowych, ponieważ umożliwiają prowadzenie przesiewów receptorów węchowych oraz ligandów na większą skalę, a także charakterystykę farmakologiczną interesujących par receptor-ligand. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wydajnej i niezawodnej oceny aktywacji receptorów przez substancje zapachowe.Heterologiczny system ekspresji receptorów zapachowych z wykorzystaniem żywych komórek. Rozpocznij od obserwacji komórek Hana3A pod mikroskopem fazokontrastowym, aby upewnić się co do żywotności komórek i oszacować stopień konfluencji. Następnie odessij całą pożywkę z naczynia hodowlanego.Następnie należy wypłukać komórki, dodając do płytki 10 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), delikatnie kołysząc naczyniem, a następnie odsysając PBS. Następnie należy dodać do płytki 3 ml 0,5% trypsyny-EDTA. Trypsynę pozostawia się na komórkach przez jedną minutę lub do momentu, aż wszystkie komórki oddzielą się od podłoża i zaczną unosić.Zneutralizować trypsynę, dodając 5 mililitrów MEM z 10% FBS i pipetując próbkę w górę i w dół, aby rozbić skupiska komórek. Po wykonaniu odliczania komórek, przenieść 2x10⁶ komórek na płytkę 96-dołkową przeznaczoną do transfekcji do probówki o pojemności 15 mililitrów. Ważne jest obliczenie prawidłowej liczby komórek do wysiania na płytkę 96-dołkową, aby uniknąć nadmiernego wzrostu lub zbyt niskiej gęstości komórek przed stymulacją.Wirować probówki przy 200 ×g przez pięć minut. Następnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Dodać sześć mililitrów pożywki bez antybiotyków dla każdej płytki 96-dołkowej i pipetować w górę i w dół, nie tworząc pęcherzyków powietrza, aby rozbić grudki masy komórkowej.Przenieś zawiesinę komórkową do zbiornika. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 50 µL komórek do każdej studzienki płytek 96-dołkowych. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.Przed transfekcją należy obejrzeć wysiane komórki pod mikroskopem fazowo-kontrastowym, aby upewnić się, że osiągnęły one odpowiednią konfluencję na poziomie około 30 do 50% na studzienkę, a następnie przenieść je z powrotem do inkubatora. Postępuj zgodnie z wierszem dotyczącym konstruktu receptor-zapachowy, konstruktów czynników akcesoryjnych oraz konstruktu wariantu biosensora cAMP. Następnie przygotuj mieszaninę do transfekcji plazmidowej w 500 µL MEM dla każdej płytki 96-dołkowej.Następnie przygotuj mieszaninę do transfekcji zawierającą 18 µL odczynnika do transfekcji za pośrednictwem lipidów w 500 µL MEM. Wymieszaj mieszaninę do transfekcji z mieszaniną plazmy, pipetując w górę i w dół. Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Po inkubacji przerwać reakcję, dodając 5 mililitrów MEM z 10%FBS do mieszaniny do transfekcji. Następnie w komorze do hodowli komórek rozłożyć grubą warstwę sterylnych ręczników papierowych. Wyjąć z inkubatora płytkę 96-dołkową z komórkami.Delikatnie i wielokrotnie uderzaj odwróconą płytką o stos ręczników papierowych, aby medium zostało całkowicie wchłonięte przez papier. Przenieś 50 µL połączonej mieszaniny do transfekcji do każdej studzienki płytki 96-dołkowej i inkubuj przez noc, od 18 do 24 godzin, w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Można zarządzać harmonogramem transfekcji i stymulacji w przypadku badania więcej niż jednej płytki 96-dołkowej w jednym eksperymencie, tak aby wszystkie płytki były traktowane analogicznie pod względem odstępów czasu transfekcji i ekspozycji na stymulatory.Przed stymulacją należy zaobserwować transfekowane komórki pod mikroskopem fazokontrastowym, aby upewnić się, że stopień konfluencji w każdej studzience wynosi od 50 do 80%, a następnie przenieść je z powrotem do inkubatora. Następnie należy przygotować pożywkę do stymulacji, dodając 10 mM HEPES i 5 mM glukozy do zrównoważonego roztworu soli Hanksa. Odmrozić na lodzie aliquoty po 55 µL substratu do testu cAMP w czasie rzeczywistym.Przygotować 2% roztwór abration, mieszając 55 µL odczynnika substratowego z 2 750 µL medium stymulującego. Po rozłożeniu grubej warstwy ręczników papierowych na blacie, delikatnie i wielokrotnie opukiwać płytkę odwróconą dnem do góry o ręczniki papierowe, aby medium do transfekcji zostało przez nie wchłonięte. Przemyć komórki, pipetując 50 µL medium stymulującego do każdej studni.Delikatnie i wielokrotnie wystukaj medium stymulujące z płytki 96-dołkowej. Pipetuj 25 µL 2% roztworu równoważącego do każdego dołka i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez dwie godziny. Przed zakończeniem czasu inkubacji rozcieńcz rozmrożone roztwory zapachowe z zapasów do stężenia roboczego w medium stymulującym.Przed dodaniem substancji zapachowej należy użyć czytnika płytek chemiluminescencyjnych, aby zmierzyć podstawowy poziom luminescencji na płytce. Szybko wyjmij płytkę z czytnika i dodaj 25 µL rozcieńczeń substancji zapachowej do każdej studzienki. Następnie natychmiast rozpocznij ciągły pomiar luminescencji wszystkich studzienek przez 20 cykli w ciągu 30 minut.Za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym przebadano 379 unikalnych ludzkich receptorów zapachowych w odpowiedzi na 30 μM muskonu. Kolorowe bloki wzdłuż osi X wskazują różne rodziny ludzkich receptorów zapachowych. Oś Y przedstawia znormalizowaną luminescencję 30 minut po dodaniu substancji zapachowej, gdy odpowiedź dla kontroli pozytywnej osiągnęła wartość maksymalną.Przedstawiono odpowiedź OR5AN1. Rysunek ten pokazuje pomiary aktywacji OR5AN1 w czasie rzeczywistym pod wpływem różnych stężeń muskonu oraz wynik z negatywnej kontroli bez zapachu. Strzałka wskazuje moment dodania substancji zapachowej.Tutaj przedstawiono krzywą odpowiedzi stężeniowej OR5AN1 na muskon 30 minut po dodaniu substancji zapachowej. Opisana tutaj technika trwa łącznie trzy dni, zaczynając od płytki zapasowej z warstwami kultur w pierwszym dniu. Po opanowaniu metody, proces w ostatnim dniu może zostać ukończony w ciągu trzech godzin dla każdej płytki 96-dołkowej, jeśli jest przeprowadzany prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak kontrolować aktywację receptorów zapachowych z wykorzystaniem testu cAMP w celu analizy uzyskanych wyników.

live-cell-measurement-odorant-receptor-activation-using-real-time

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym materiale prezentujemy protokół barwienia żywych komórek, który umożliwia wygodne wykrywanie receptorów zapachowych na powierzchni komórek HEK293T. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do analizy ekspresji powierzchniowej innych receptorów chemosensorycznych lub receptorów GPCR.

Oznaczanie ekspresji powierzchniowej receptorów chemosensorycznych w komórkach heterologicznych

Ten film demonstruje protokół pomiaru aktywacji receptora zapachowego w transfekowanych komórkach za pomocą cyklicznego biosensora adenozynomonofosforanu (cAMP) i detekcji luminescencji. Metoda ta jest stosowana do badania interakcji receptor-ligand i szlaków sygnałowych w neuronach węchowych.

Pomiar aktywacji receptora zapachowego za pomocą cyklicznego testu monofosforanu adenozyny w czasie rzeczywistym

Źródło: de March, C. A. et. al., Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora odorantu przez nawaniacz w fazie gazowej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film przedstawia metodę monitorowania aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym w rekombinowanych komórkach ssaków za pomocą pomiaru luminescencji. Wiązanie odorantu wyzwala aktywację białka G i produkcję cAMP, aktywując białka glosensor, które emitują luminescencję po związaniu substratu, zapewniając ilościową miarę...

Monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji receptorów zapachowych w komórkach rekombinowanych

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Wzorce aktywacji receptorów węchowych kodują tożsamość zapachu, ale brak opublikowanych danych identyfikujących ligandy zapachowe dla receptorów węchowych ssaków utrudnia opracowanie kompleksowego modelu kodowania zapachu. Protokół ten opisuje metodę ułatwiającą wysokoprzepustową identyfikację ligandów receptorów węchowych i ilościowe określenie aktywacji receptora.

Wysokoprzepustowa analiza receptorów węchowych ssaków: pomiar aktywacji receptorów poprzez aktywność lucyferazy

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Fizjologicznie, receptory zapachowe są aktywowane przez cząsteczki odorantu wdychane w fazie gazowej. Jednak większość systemów in vitro wykorzystuje stymulację odorantem w fazie ciekłej. W tym artykule przedstawiamy metodę, która pozwala na monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego po stymulacji odoranta w fazie gazowej.

Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

Protokół przedstawiony w tym badaniu ilustruje skuteczność detektora różnic cAMP In Situ w pomiarze cAMP za pomocą dwóch metod. Jedna z metod wykorzystuje 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek z ogniwami HEK-293. Druga metoda polega na demonstracji pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ

Neurony receptorowe węchu (ORNs) przekształcają sygnały zapachowe najpierw w prąd receptorowy, który z kolei wywołuje potencjały czynnościowe przekazywane do neuronów drugiego rzędu w opłatce węchowej. W niniejszej pracy opisujemy technikę pipety ssącej służącą do jednoczesnego rejestrowania indukowanego substancją zapachową prądu receptorowego oraz potencjałów czynnościowych z ORNs myszy.

Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

Poznaj metodę pomiaru aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym za pomocą testu cAMP. Technika umożliwia efektywny screening ligandów przy użyciu systemu ekspresji heterologicznej w komórkach Hana3A.

Pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów