Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

Przedstawione protokoły opisują, jak przeprowadzić test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla grypy z próbek surowicy biorców szczepionki przeciw grypie. Pierwszy test określa optymalne stężenia antygenu wirusowego za pomocą hemaglutynacji. Drugi test określa ilościowo miana przeciwciał swoistych dla grypy poprzez hamowanie hemaglutynacji.

Ogólnym celem tego testu hamowania hemaglutynacji jest pomiar miana przeciwciał przeciwko określonym wirusom będącym przedmiotem zainteresowania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wakcynologii dotyczące odporności i ochrony za pośrednictwem szczepionki w różnych populacjach oraz w różnych grupach wiekowych i pacjentów. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest dokładna i umożliwia szybkie określenie miana przeciwciał neutralizujących.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w miana przeciwciał ludzkich, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak miana przeciwciał w surowicy myszy, a także supernatanty hodowlane. Rozpocząć od oznaczenia 96-dołkowych płytek do mikromiareczkowania odpowiednimi informacjami doświadczalnymi. Następnie obróć płytkę w orientacji pionowej i za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 25 mikrolitrów PBS do każdej studzienki, z wyjątkiem pierwszej studzienki w dolnym tylnym rzędzie miareczkowania.

Dodać 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu antygenu będącego przedmiotem zainteresowania do pierwszego dołka z tylnego rzędu miareczkowania, a następnie dodać 25 mikrolitrów próbek surowicy poddanych działaniu RDE do pierwszych studzienek w pierwszych dziesięciu górnych rzędach. Dodać 25 mikrolitrów odpowiedniej surowicy do pierwszego dołka 11. rzędu jako kontrolę pozytywną. Przenoszą 25 mikrolitrów z pierwszego dołka każdego rzędu do kolejnych dołków, aby wykonać seryjne, dwukrotne rozcieńczenia.

Pipetować w górę i w dół od 10 do 15 razy na każdym etapie rozcieńczania, odrzucając ostatnie 25 mikrolitrów z ostatnich studzienek. Następnie dodaj 25 mikrolitrów roztworu antygenu do każdej studzienki w rzędach od jednego do 11 i 25 mikrolitrów PBS tylko do każdej studzienki tylnego rzędu miareczkowania. Ostrożnie postukaj w talerz 10 razy ze wszystkich czterech stron, aby wymieszać.

Następnie przykryj talerz na 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów roztworu czerwonych krwinek do każdej studzienki i wymieszać płytkę, bardziej stukając. Następnie ponownie przykryj płytkę i inkubuj czerwone krwinki zgodnie z użytymi gatunkami, jak przedstawiono w tabeli.

Po dodaniu czerwonych krwinek do płytki należy przestrzegać odpowiedniego czasu inkubacji dla rodzaju krwi użytej w teście. Zbyt krótka lub zbyt długa inkubacja doprowadzi do nieprawidłowej interpretacji wyników. Pod koniec inkubacji ocenić hemaglutynację, przechylając płytkę o 90 stopni przez 25 sekund i zaznaczyć wyniki dla każdej studzienki, gdy płytka jest nadal przechylona, na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej.

W tym eksperymencie odpowiedź przeciwciał wywołaną szczepionką oceniano u 26 zdrowych ochotników, którzy otrzymali inaktywowaną, trójwalentną szczepionkę przeciw grypie zawierającą grypę A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 i B/Massachusetts/O2/2012 przed sezonem grypowym 24 2015. Zaobserwowano krzyżową odpowiedź immunologiczną na szczepy wirusa A/H3N2/Switzerland/2013 i A/H3N2/Texas/2012, ze znacznie niższymi średnimi geometrycznymi mianami zahamowania hemaglutynacji i indukowaną seroprotekcją przeciwko grypie A/H3N2/Szwajcaria/2013 w porównaniu z grypą A/H3N2/Texas/2012. Po szczepieniu miana przeciwciał przeciwko obu szczepom wzrosły, mimo że szczep A/H3N2/Szwajcaria/2013 nie był obecny w szczepionce.

Wirusowa hemaglutynina wykazuje zależny od gatunku potencjał hemaglutynacji erytrocytów. Co ciekawe, krew świnki morskiej nie ulega prawidłowej hemaglutynacji z grypą B, a krew indyka ma potencjał do hemaglutynacji z wysokimi mianami i niską reaktywnością krzyżową. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o surowicy z RDE, aby dezaktywować wszelkie niespecyficzne inhibitory i niespecyficzne wiązanie podczas hemaglutynacji wirusa. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące roli immunoglobulin specyficznych dla poszczególnych patogenów. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii wirusowej do pogłębienia naszej wiedzy na temat odporności związanej ze szczepionką u zdrowych i z obniżoną odpornością pacjentów w różnych grupach wiekowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla szczepu grypy na dużą skalę. Nie zapominaj, że praca z antygenami wirusowymi, krwią zwierzęcą i próbkami surowicy ludzkiej może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w laboratorium BSL2.