Name: Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Poznaj zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji do ilościowego określania mian przeciwciał przeciwko grypie. Ta metoda pozwala szybko i dokładnie ocenić odpowiedź immunologiczną po szczepieniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Prevention and control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62, Centers for Disease, C. & Prevention. RR-07 1-43 (2013).</li>
<li>Dominguez-Cherit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critically+Ill+patients+with+2009+influenza+A%28H1N1%29+in+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Critically Ill patients with 2009 influenza A(H1N1) in Mexico.</a> JAMA. 302 (17), 1880-1887 (2009).</li>
<li>Fox, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandemic+influenza+%28H1N1%29%3A+impact+on+lung+transplant+recipients+and+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pandemic influenza (H1N1): impact on lung transplant recipients and candidates.</a> J Heart Lung Transplant. 29 (9), 1034-1038 (2010).</li>
<li>Piercy, J., Miles, A., Krankheiten, S. B. fG. S. V., Values, M. The Economic Impact of Influenza in Switzerland: Interpandemic Situation. , Swiss Federal Office of Public Health, Division of Epidemiology and Infectious Diseases, Section of Viral Diseases and Sentinel Systems. (2003).</li>
<li>Barclay, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+network+assortativity+of+influenza+vaccination+at+a+high+school%3A+implications+for+outbreak+risk+and+herd+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Positive network assortativity of influenza vaccination at a high school: implications for outbreak risk and herd immunity.</a> PLoS One. 9 (2), 87042(2014).</li>
<li>Baluch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+controlled+trial+of+high-dose+intradermal+versus+standard-dose+intramuscular+influenza+vaccine+in+organ+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Randomized controlled trial of high-dose intradermal versus standard-dose intramuscular influenza vaccine in organ transplant recipients.</a> Am J Transplant. 13 (4), 1026-1033 (2013).</li>
<li>Haralambieva, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Immunosenescence+on+Humoral+Immune+Response+Variation+after+Influenza+A%2FH1N1+Vaccination+in+Older+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Impact of Immunosenescence on Humoral Immune Response Variation after Influenza A/H1N1 Vaccination in Older Subjects.</a> PLoS One. 10 (3), 0122282(2015).</li>
<li>Egli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+adjuvants--understanding+molecular+mechanisms+to+improve+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Med+Wkly%22%5BJournal%5D)">Vaccine adjuvants--understanding molecular mechanisms to improve vaccines.</a> Swiss Med Wkly. 144, 13940(2014).</li>
<li>O'Shea, D., Widmer, L. A., Stelling, J., Egli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+face+of+vaccination+in+immunocompromised+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Infect+Dis+Rep%22%5BJournal%5D)">Changing face of vaccination in immunocompromised hosts.</a> Curr Infect Dis Rep. 16 (9), 420(2014).</li>
<li>Meulemans, G., Carlier, M. C., Gonze, M., Petit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hemagglutination-inhibition%2C+agar+gel+precipitin%2C+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+measuring+antibodies+against+influenza+viruses+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of hemagglutination-inhibition, agar gel precipitin, and enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibodies against influenza viruses in chickens.</a> Avian Dis. 31 (3), 560-563 (1987).</li>
<li>Martins, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+internal+controls+for+the+Luminex+instrument+as+part+of+a+multiplex+seven-analyte+viral+respiratory+antibody+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of internal controls for the Luminex instrument as part of a multiplex seven-analyte viral respiratory antibody profile.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (1), 41-45 (2002).</li>
<li>Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO Animal Influenza Manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).</li>
<li>Mittelholzer, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cell+lines+used+in+a+micro+neutralization+test+for+measuring+influenza-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human cell lines used in a micro neutralization test for measuring influenza-neutralizing antibodies.</a> Scand J Immunol. 63 (4), 257-263 (2006).</li>
<li>Hamilton, R. S., Gravell, M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+titers+determined+by+hemagglutination+inhibition+and+enzyme+immunoassay+for+JC+virus+and+BK+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody titers determined by hemagglutination inhibition and enzyme immunoassay for JC virus and BK virus.</a> J Clin Microbiol. 38 (1), 105-109 (2000).</li>
<li>Kumakura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hemagglutination+inhibition+assay+and+enzyme+immunoassay+for+determination+of+mumps+and+rubella+immune+status+in+health+care+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Comparison of hemagglutination inhibition assay and enzyme immunoassay for determination of mumps and rubella immune status in health care personnel.</a> J Clin Lab Anal. 27 (5), 418-421 (2013).</li>
<li>Ogundiji, O. T., Okonko, I. O., Adu, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+measles+hemagglutination+inhibiting+antibody+levels+among+school+children+in+Ibadan%2C+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay+Immunochem%22%5BJournal%5D)">Determination of measles hemagglutination inhibiting antibody levels among school children in Ibadan, Nigeria.</a> J Immunoassay Immunochem. 34 (2), 208-217 (2013).</li>
<li>Cwach, K. T., Sandbulte, H. R., Klonoski, J. M., Huber, V. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21883963">Contribution of murine innate serum inhibitors toward interference within influenza virus immune assay.</a> Influenza Other Respir Viruses. 6 (2), 127-135 (2012).</li>
<li>Lee, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+mimicry+by+antibody+F045-092+facilitates+universal+binding+to+the+H3+subtype+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Receptor mimicry by antibody F045-092 facilitates universal binding to the H3 subtype of influenza virus.</a> Nat Commun. 5, 3614(2014).</li>
<li>Blumel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+prevalence+of+cross-reactive+antibodies+against+influenza+A%28H3N2%29+variant+virus%2C+Germany%2C+2003+to+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Age-related prevalence of cross-reactive antibodies against influenza A(H3N2) variant virus, Germany, 2003 to 2010.</a> Euro Surveill. 20 (32), 16-24 (2015).</li>
<li>Reber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+Influenza+Vaccination+of+Children+Induces+Humoral+and+Cell-Mediated+Immunity+Beyond+the+Current+Season%3A+Cross-reactivity+with+Past+and+Future+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Seasonal Influenza Vaccination of Children Induces Humoral and Cell-Mediated Immunity Beyond the Current Season: Cross-reactivity with Past and Future Strains.</a> J Infect Dis. , (2016).</li>
</ol>

A.E. otrzymało stypendium badawcze z programu "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), Uniwersytetu w Bazylei "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte", Stiftungsinfektionskrankheiten Basel oraz Bangeter Rhyner Stiftung. Projekt L.K. otrzymał stypendium Uniwersytetu Technicznego w Grazu w Austrii. J.L. dziękuje za wsparcie ze strony stypendium doktoranckiego programu SystemsX.ch initiative in systems biology (9. zaproszenie ).

Kwantyfikacja mian przeciwciał swoistych dla wirusa grypy przed i po szczepieniu jest ważnym narzędziem niezbędnym do badań nad szczepionkami. W oparciu o zastępcze środki ochrony przed zakażeniem wirusem, takie jak seroprotekcja (>1:40) lub serokonwersja (4-krotne zwiększenie miana), można zoptymalizować strategie szczepień9. Korzystając z dostarczonych protokołów, można określić: (i) potencjał hemaglutynacji danego wirusa oraz (ii) miana przeciwciał dla wirusa będącego przedmiotem zainteresowani...

Zakażenie wirusem grypy wiąże się ze znaczną zachorowalnością, śmiertelnością i wysokimi kosztami opieki zdrowotnej1,2,3,4. W szczególności osoby starsze, noworodki, kobiety w ciąży i pacjenci z chorobami przewlekłymi są narażeni na cięższe wyniki kliniczne. W związku z tym szczepienie przeciwko krążącym szczepom wirusa grypy jest podstawowym środkiem mającym na celu zmniejszenie obciążenia chorobami w tych populacjach wysokiego ryzyka. Wzrost indywidualnej odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu, np. przeciwciała swoiste dla grypy powyżej progu ochronnego, zmniejsza indywidualne ryzyko infekcji i ogólnie prawdopodobieństwo transmisji wirusa w populacji5. Szczegółowe zrozumienie humoralnej odpowiedzi immunologicznej wywołanej szczepionką w różnych populacjach i w różnych grupach wiekowych jest kluczowym elementem odpowiedzi na ważne pytania kliniczne6,7,8,9, takie jak: Dlaczego niektórzy starsi pacjenci mają infekcje pomimo wcześniejszego szczepienia? Co to jest "dobra" i "wystarczająca" ochrona wywołana szczepionką? Jak często należy podawać szczepionkę pacjentowi z obniżoną odpornością, aby osiągnąć ochronne miano? Jaka jest najskuteczniejsza dawka? Jaki jest wpływ nowego adiuwantu na miana przeciwciał po szczepieniu? Pomiar produkcji przeciwciał specyficznych dla szczepionki może pomóc odpowiedzieć na te ważne pytania i poprawić wyniki szczepień.
Kwantyfikacja mian przeciwciał specyficznych dla wirusa może być przeprowadzona za pomocą różnych metod immunologicznych. Obejmuje to testy fazy stałej10 lub testy ELISA11, test HI12 oraz testy neutralizujące13. Metody oparte na teście ELISA umożliwiają badanie przesiewowe stosunkowo dużych ilości próbek surowicy pod kątem różnych antygenów. Również immunoglobuliny (Ig)M i IgG specyficzne dla patogenu mogą być badane oddzielnie. Chociaż charakterystyka antygenu, np. liniowa sekwencja aminokwasów lub cząstka wirusopodobna, może wpływać na wiązanie przeciwciał, spektrum potencjalnych epitopów jest bardzo szerokie i nie dostarcza informacji o tym, czy odpowiedź przeciwciała ma znaczenie funkcjonalne.
Natomiast test neutralizacji określa potencjał przeciwciał do funkcjonalnego hamowania infekcji komórek, a zatem odzwierciedla potencjał neutralizacji. Metoda ta jest jednak bardzo pracochłonna, wymaga hodowli określonych linii komórkowych i żywych wirusów, a co za tym idzie, jest czasochłonna, kosztowna i wymaga specjalnego sprzętu.
Ten artykuł opisuje krok po kroku protokół HI oparty na Światowej Organizacji Zdrowia (WHO)12 do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy. Hemagglutynacja jest charakterystycznym efektem niektórych wirusów prowadzącym do aglutynacji erytrocytów. Zahamowanie tego efektu za pomocą surowic pacjenta pozwala na pomiar stężeń przeciwciał hamujących, co odzwierciedla działanie neutralizujące.
Zmodyfikowaliśmy przepływ pracy protokołu WHO, aby umożliwić bardziej efektywną obsługę wielu próbek w tym samym czasie, a tym samym skrócić wymagany czas. Pierwszy protokół opisuje określenie potencjału aglutynacyjnego określonego antygenu grypy. W ten sposób określa się prawidłowe stężenie antygenu grypy dla drugiego protokołu. Ta część powinna być powtarzana z każdym nowym antygenem wirusowym, a także z każdą partią krwi.
Drugi protokół opisuje oznaczanie mian przeciwciał specyficznych dla grypy. Przedstawione protokoły są zoptymalizowane pod kątem badania próbek wirusa grypy i surowicy ludzkiej, jednak mogą być również stosowane do próbek surowicy myszy lub supernatantów z kultur komórkowych ze stymulowanych komórek odpornościowych, np. limfocytów B specyficznych dla wirusa. Wyniki można określić jako bezwzględne zmierzone miana. W wielu badaniach nad szczepionkami średnia geometryczna miana i 95% przedział ufności są pokazane dla każdej poszczególnej populacji. Dla interpretacji seroprotekcja lub serokonwersja są często używane do opisania podatności populacji na określonego wirusa. Seroprotekcję definiuje się jako miano ≥1:40, a serokonwersję jako ponad 4-krotny wzrost miana wraz z osiągnięciem miana seroprotekcyjnego między dwoma punktami czasowymi (najczęściej stosuje się miano przed szczepieniem i 30 dni po szczepieniu).
Oba protokoły są łatwe w użyciu i mogą być dostosowane do szerokiego zakresu pytań badawczych. W szczególności mogą być używane do wiarygodnego i szybkiego określania miana przeciwciał przeciwko różnym innym wirusom zdolnym do hemaglutynacji, takim jak odra, poliomawirusy, świnka lub różyczka14,15,16.

<table><tbody><tr><td>25 ml Jednorazowe wielokanałowe zbiorniki na pipety</td><td>Integra</td><td>4312</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe probówki do PCR</td><td>Marka GMBH</td><td>781332</td><td>Do podwielokrotności surowicy</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania,</td><td>TPP</td> w kształcie litery U <td>92097</td><td>Do testu HI przy użyciu krwinek czerwonych</td></tr><tr><td>ssaków 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania, w kształcie litery V</td><td>Corning Costar</td><td>3897</td><td>Do testu HI przy użyciu ptasich krwinek czerwonych</td></tr><tr><td>Aqua ad iniect. Steril</td><td>Bichsel AG</td><td>1000004</td><td>Do przygotowywania roztworów antygenu grypy i filtratu</td></tr><tr><td>RBC kurczaka (10%)</td><td>Cedarlan</td><td>CLC8800</td><td>10% zawiesina czerwonych krwinek kurczaka w roztworze Alsevera</td></tr><tr><td>Filtrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8772</td><td>Stosowany jako enzym niszczący receptory (RDE)</td></tr><tr><td>PBS Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Do rozcieńczania próbek surowicy, krwinek czerwonych i antygenów</td></tr><tr><td>Eppendorf Pipeta wielokanałowa, 12-kanałowa, 10-100 i mikro; l</td><td>Pipeta wielokanałowa Sigma-Aldrich</td><td>Z683949</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf, 8-kanałowa, 10-100 i mikro; l</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683930</td><td></td></tr><tr><td>Świnka morska RBC (10%)</td><td>Cedarlane</td><td>CLC1800</td><td>10% zawiesina czerwonych krwinek świnki morskiej w roztworze Alsevera</td></tr><tr><td>Influenza Anti-A/California/7/09 Surowica HA&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>14/134&nbsp;</td><td>Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI</td></tr><tr><td>Surowica HA przeciw grypie Anti-A/Szwajcaria/9715293/2013&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>14/272</td><td>Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI</td></tr><tr><td>Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Surowica&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>13/178</td><td>Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI</td></tr><tr><td>Surowica Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>13/254&nbsp;</td><td>Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI</td></tr><tr><td>Grypa Anti-B/Massachusetts/02/2012 Surowica HA&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>13/182</td><td>Stosowany jako kontrola pozytywna w teście HI</td></tr><tr><td>Antygen grypy A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)&nbsp;</td><td>NIBSC</td><td>12/168</td><td>Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)&nbsp; (ca. 46&micro; gHA/ml)</td></tr><tr><td>Antygen grypy A/Szwajcaria/9715293/2013 (NIB88)</td><td>NIBSC</td><td>14/254</td><td>Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus A/Szwajcaria/9715293/2013 (NIB88) (ok. 55&mikro; gHA/ml)</td></tr><tr><td>Antygen grypy A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)</td><td>NIBSC</td><td>13/112</td><td>Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) (ca. 74&micro; gHA/ml)</td></tr><tr><td>Antygen grypy B/Brisbane/60/2008</td><td>NIBSC</td><td>13/234</td><td>Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus B/Brisbane/60/2008 (ok. 42&mikro; gHA/ml)</td></tr><tr><td>Antygen grypy B/Massachusetts/02/2012</td><td>NIBSC</td><td>13/134</td><td>Inaktywowany, częściowo oczyszczony wirus B/Massachusetts/02/2012 (ok. 35&mikro; gHA/ml)</td></tr><tr><td>Surowica-Probówki</td><td>S-Monovette, Sardstedt</td><td>01.1601.100</td><td>Do ekstrakcji surowicy z aktywatorem krzepnięcia</td></tr><tr><td>Pojedynczy dawca Ludzkie RBC, Typ 0</td><td>Innowacyjne badania</td><td>IPLA-WB3&nbsp;</td><td>Zawiesina krwinek czerwonych ludzkich od pojedynczego dawcy w roztworze Alsevera (ok. 26%)</td></tr><tr><td>Indyk RBC (10%)</td><td>Cedarlane</td><td>CLC1180</td><td>10% zawiesina czerwonych krwinek indyka w roztworze Alsevera</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (hi) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Miana przeciwciał są powszechnie używane jako zastępcze markery do ochrony serologicznej przed grypą i innymi patogenami. Szczegółowa wiedza na temat produkcji przeciwciał przed i po szczepieniu jest niezbędna do zrozumienia odporności indukowanej przez szczepionkę. W tym artykule opisano wiarygodny protokół punkt po punkcie do określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy. Pierwszy protokół opisuje metodę określania ilości antygenu wymaganych do hemaglutynacji, która standaryzuje stężenia do późniejszego wykorzystania w drugim protokole (test hemaglutynacji, test HA). Drugi protokół opisuje kwantyfikację mian przeciwciał specyficznych dla grypy przeciwko różnym szczepom wirusa przy użyciu seryjnego rozcieńczania surowicy ludzkiej lub supernatantów z hodowli komórkowych (test hamowania hemaglutynacji, test HI).
Jako przykład, pokazujemy odpowiedź przeciwciał zdrowej kohorty, która otrzymała trójwalentną inaktywowaną szczepionkę przeciw grypie. Dodatkowo pokazano reaktywność krzyżową między różnymi wirusami grypy i wyjaśniono metody minimalizacji reaktywności krzyżowej przy użyciu różnych typów zwierzęcych krwinek czerwonych (RBC). Dyskusja zwraca uwagę na zalety i wady prezentowanych testów oraz na to, w jaki sposób określenie miana przeciwciał swoistych dla grypy może poprawić zrozumienie odporności związanej ze szczepionką.

Odpowiedź przeciwciał indukowana przed i po szczepieniu przeciwko grypie A H3N2 
Odpowiedź przeciwciał indukowaną szczepionką oceniono u 26 zdrowych ochotników, którzy przed sezonem grypowym 2014/2015 otrzymali inaktywowaną trójskładnikową podjednostkową szczepionkę przeciw grypie zawierającą szczepy Influenza A/H1N1/California/209, A/H3N2/Texas/2012 oraz B/Massachusetts/02/2012. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywny przykład dla 2 osób za...

Przedstawione protokoły opisują, jak przeprowadzić test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla grypy z próbek surowicy biorców szczepionki przeciw grypie. Pierwszy test określa optymalne stężenia antygenu wirusowego za pomocą hemaglutynacji. Drugi test określa ilościowo miana przeciwciał swoistych dla grypy poprzez hamowanie hemaglutynacji.

Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Ogólnym celem niniejszego testu inhibicji hemaglutynacji jest pomiar mian przeciwciał przeciwko konkretnym, badanym wirusom. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wakcynologii dotyczące odporności indukowanej szczepionką oraz ochrony w różnych populacjach, grupach wiekowych i grupach pacjentów. Głównymi zaletami tej techniki są jej dokładność oraz możliwość szybkiego oznaczenia miana obecnych przeciwciał neutralizujących.Choć metoda ta pozwala na określenie mian przeciwciał u ludzi, można ją również zastosować w innych układach, takich jak miana przeciwciał w surowicy mysiej oraz w nadsączach hodowli. Należy rozpocząć od opisania płytek mikrotitracyjnych 96-dołkowych odpowiednimi informacjami eksperymentalnymi. Następnie ustawić płytkę w orientacji pionowej i za pomocą pipety wielokanałowej dodać 25 µL PBS do każdego dołka, z wyjątkiem pierwszego dołka w dolnym tylnym rzędzie titracji.Do pierwszej studni rzędu miareczkowania wstecznego należy dodać 50 µL świeżo przygotowanego roztworu badanego antygenu, a następnie dodać 25 µL próbek surowicy traktowanej RDE do pierwszych studni dziesięciu górnych rzędów. Do pierwszej studni 11. rzędu należy dodać 25 µL odpowiedniego antyserum jako kontrolę dodatnią. Następnie należy przenieść 25 µL z pierwszej studni każdego rzędu do kolejnych studni w celu wykonania seryjnych rozcieńczeń dwukrotnych.Pipetuj w górę i w dół od 10 do 15 razy na każdym etapie rozcieńczania, odrzucając końcowe 25 µL z ostatnich studzienek. Następnie dodaj 25 µL roztworu antygenu do każdej studzienki od rzędu 1 do 11 oraz 25 µL samego PBS do każdej studzienki w rzędzie miareczkowania wstecznego. Ostrożnie opukaj płytkę 10 razy z każdej z czterech stron, aby wymieszać zawartość.Następnie przykryć płytkę i pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji dodać 50 µL roztworu erytrocytów do każdej studzienki i wymieszać zawartość płytki, delikatnie nią stukając. Następnie ponownie przykryć płytkę i inkubować erytrocyty zgodnie z gatunkiem użytym, jak opisano w tabeli.Po dodaniu erytrocytów do płytki należy przestrzegać odpowiedniego czasu inkubacji dla rodzaju krwi użytej w teście. Zbyt krótka lub zbyt długa inkubacja doprowadzi do błędnej interpretacji wyników. Po zakończeniu inkubacji należy ocenić hemaglutynację, przechylając płytkę o 90 stopni na 25 sekund, a następnie zaznaczyć wyniki dla każdej studzienki na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej, gdy płytka wciąż jest przechylona.W niniejszym eksperymencie oceniono indukowaną szczepionką odpowiedź przeciwciał u 26 zdrowych ochotników, którzy przed sezonem grypowym 2015/2016 otrzymali nieaktywowaną, trójwalentną szczepionkę przeciw grypie zawierającą szczepy A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 oraz B/Massachusetts/O2/2012. Zaobserwowano krzyżową odpowiedź immunologiczną dla szczepów wirusa A/H3N2/Switzerland/2013 i A/H3N2/Texas/2012, przy czym odnotowano znacznie niższe geometryczne średnie miana hamowania hemaglutynacji oraz indukowaną seroprotekcję przeciwko grypie A/H3N2/Switzerland/2013 w porównaniu do grypy A/H3N2/Texas/2012. Po szczepieniu miana przeciwciał przeciwko obu szczepom wzrosły, mimo że szczep A/H3N2/Switzerland/2013 nie znajdował się w składzie szczepionki.Wirusowa hemaglutynina wykazuje potencjał hemaglutynacji erytrocytów zależny od gatunku. Co istotne, krew świnki morskiej nie ulega prawidłowej hemaglutynacji w przypadku grypy B, natomiast krew indyka wykazuje potencjał do hemaglutynacji przy wysokich mianach i niskiej reaktywności krzyżowej. Po opanowaniu techniki, w przypadku jej prawidłowego przeprowadzenia, procedurę można ukończyć w ciągu trzech godzin.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o traktowaniu surowicy RDE w celu inaktywacji nieswoistych inhibitorów oraz zapobiegania nieswoistemu wiązaniu podczas hemaglutynacji wirusa. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące roli poszczególnych immunoglobulin specyficznych dla patogenu. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii wirusowej do pogłębienia wiedzy na temat odporności związanej z szczepieniami u pacjentów zdrowych i z immunosupresją w różnych grupach wiekowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania testu hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego oznaczenia mian przeciwciał specyficznych dla szczepów grypy na dużą skalę. Należy pamiętać, że praca z antygenami wirusowymi, krwią zwierzęcą i próbkami surowicy ludzkiej może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w laboratorium poziomu BSL2.

an-optimized-hemagglutination-inhibition-hi-assay-to-quantify

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opracowano prostą metodę slot blot do ilościowego oznaczania hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy przy użyciu uniwersalnych przeciwciał skierowanych przeciwko ich najbardziej konserwatywnym sekwencjom, zidentyfikowanym za pomocą analiz bioinformatycznych. To innowacyjne podejście może stanowić przydatną alternatywę dla ilościowego określania wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusowych.

Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A z wykorzystaniem uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Film demonstruje test hamowania hemaglutynacji do wykrywania przeciwciał surowicy przeciwko określonym antygenom. Potwierdzenie zahamowania hemaglutynacji w studzience testowej i hemaglutynacji w studzience kontrolnej uzyskuje się za pomocą wyraźnych wzorców wizualnych. Test ten odgrywa kluczową rolę w ocenie odpowiedzi immunologicznej, skuteczności szczepionki i badaniu infekcji wirusowych w wirusologii i immunologii.

Test zahamowania hemaglutynacji w celu wykrycia przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi docelowemu

Ten film demonstruje technikę generowania wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy. Zawiesina wirusa zneutralizowanego przez przeciwciała jest wstrzykiwana do zarodków jaj kurzych w celu selektywnego rozmnażania wariantów ucieczki. W ten sposób powstaje populacja wirusa składająca się głównie z wariantów ucieczki, potwierdzonych za pomocą testu hemaglutynacji.

Wytwarzanie wariantów ucieczki wirusa grypy przeciwko przeciwciałom neutralizującym

Ten film pokazuje test mierzący miano przeciwciał influenza neuraminidazy (NA) w próbce surowicy. Próbkę surowicy zawierającą przeciwciała przeciwko NA dodaje się do płytki mikrodołkowej pokrytej fetuiną. Po dodaniu wirusa przeciwciała zapobiegają rozszczepianiu przez wirusa NA fetuiny i odsłanianiu jej ugrupowania galaktozy. Następnie dodaje się lektynę sprzężoną z peroksydazą, która wiąże się z odsłoniętą galaktozą. Miano przeciwciał hamujących NA określa się za pomocą testu...

Test do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Opisujemy test lektyny sprzężony z enzymem (ELLA) do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy (NA) w surowicach. Test wykorzystuje aglutyninę z orzeszków ziemnych do ilościowego określenia reszt galaktozy, które stają się dostępne, gdy NA usuwa kwas sjalowy z 96-dołkowych płytek pokrytych fetuiną.

Pomiar mian przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy za pomocą testu lektyny sprzężonej z enzymem

Opisujemy metodę, za pomocą której identyfikujemy krytyczne pozostałości wymagane do wiązania ludzkich lub mysich przeciwciał monoklonalnych, które celują w wirusową hemaglutyninę wirusów grypy A. Protokół można dostosować do innych glikoprotein powierzchniowych wirusa i odpowiadających im przeciwciał neutralizujących.

Wytwarzanie wariantów ucieczki neutralizujących przeciwciał monoklonalnych wirusa grypy

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Przeciwciała neutralizujące grypę korelują z ochroną przed infekcjami grypowymi. Testy mikroneutralizacji mierzą przeciwciała neutralizujące w surowicach ludzkich i są często stosowane w serologii grypy u ludzi. Opisujemy test mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących wobec współczesnych wirusów 3C.2a i 3C.3a A(H3N2) po szczepieniu lub zakażeniu grypą.

Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1

Ten artykuł przedstawia uproszczoną metodę przygotowania 4 jednostek hemagglutynacji antygenu do testów serologicznych wirusa rzekomego pomoru drobiu. Dzięki dokładnemu określeniu miana hemaglutynacji antygenu, w połączeniu z bardziej rygorystyczną metodą miareczkowania wstecznego i dobrze zdefiniowanym procesem regulacji, zwiększa wydajność testu, zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich i poprawia nadzór nad chorobami u drobiu.

Optymalizacja preparatu antygenowego do oznaczania hamowania hemaglutynacji wirusa rzekomego pomoru drobiu

Poznaj zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji do ilościowego określania mian przeciwciał przeciwko grypie. Ta metoda pozwala szybko i dokładnie ocenić odpowiedź immunologiczną po szczepieniu.

Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

Przeglądaj więcej filmów