Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy
1 grudnia 2017
Przedstawione protokoły opisują, jak przeprowadzić test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla grypy z próbek surowicy biorców szczepionki przeciw grypie. Pierwszy test określa optymalne stężenia antygenu wirusowego za pomocą hemaglutynacji. Drugi test określa ilościowo miana przeciwciał swoistych dla grypy poprzez hamowanie hemaglutynacji.
Ogólnym celem niniejszego testu inhibicji hemaglutynacji jest pomiar mian przeciwciał przeciwko konkretnym, badanym wirusom. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wakcynologii dotyczące odporności indukowanej szczepionką oraz ochrony w różnych populacjach, grupach wiekowych i grupach pacjentów. Głównymi zaletami tej techniki są jej dokładność oraz możliwość szybkiego oznaczenia miana obecnych przeciwciał neutralizujących.
Choć metoda ta pozwala na określenie mian przeciwciał u ludzi, można ją również zastosować w innych układach, takich jak miana przeciwciał w surowicy mysiej oraz w nadsączach hodowli. Należy rozpocząć od opisania płytek mikrotitracyjnych 96-dołkowych odpowiednimi informacjami eksperymentalnymi. Następnie ustawić płytkę w orientacji pionowej i za pomocą pipety wielokanałowej dodać 25 µL PBS do każdego dołka, z wyjątkiem pierwszego dołka w dolnym tylnym rzędzie titracji.
Do pierwszej studni rzędu miareczkowania wstecznego należy dodać 50 µL świeżo przygotowanego roztworu badanego antygenu, a następnie dodać 25 µL próbek surowicy traktowanej RDE do pierwszych studni dziesięciu górnych rzędów. Do pierwszej studni 11. rzędu należy dodać 25 µL odpowiedniego antyserum jako kontrolę dodatnią. Następnie należy przenieść 25 µL z pierwszej studni każdego rzędu do kolejnych studni w celu wykonania seryjnych rozcieńczeń dwukrotnych.
Pipetuj w górę i w dół od 10 do 15 razy na każdym etapie rozcieńczania, odrzucając końcowe 25 µL z ostatnich studzienek. Następnie dodaj 25 µL roztworu antygenu do każdej studzienki od rzędu 1 do 11 oraz 25 µL samego PBS do każdej studzienki w rzędzie miareczkowania wstecznego. Ostrożnie opukaj płytkę 10 razy z każdej z czterech stron, aby wymieszać zawartość.
Następnie przykryć płytkę i pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji dodać 50 µL roztworu erytrocytów do każdej studzienki i wymieszać zawartość płytki, delikatnie nią stukając. Następnie ponownie przykryć płytkę i inkubować erytrocyty zgodnie z gatunkiem użytym, jak opisano w tabeli.
Po dodaniu erytrocytów do płytki należy przestrzegać odpowiedniego czasu inkubacji dla rodzaju krwi użytej w teście. Zbyt krótka lub zbyt długa inkubacja doprowadzi do błędnej interpretacji wyników. Po zakończeniu inkubacji należy ocenić hemaglutynację, przechylając płytkę o 90 stopni na 25 sekund, a następnie zaznaczyć wyniki dla każdej studzienki na wydrukowanym schemacie płytki 96-dołkowej, gdy płytka wciąż jest przechylona.
W niniejszym eksperymencie oceniono indukowaną szczepionką odpowiedź przeciwciał u 26 zdrowych ochotników, którzy przed sezonem grypowym 2015/2016 otrzymali nieaktywowaną, trójwalentną szczepionkę przeciw grypie zawierającą szczepy A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 oraz B/Massachusetts/O2/2012. Zaobserwowano krzyżową odpowiedź immunologiczną dla szczepów wirusa A/H3N2/Switzerland/2013 i A/H3N2/Texas/2012, przy czym odnotowano znacznie niższe geometryczne średnie miana hamowania hemaglutynacji oraz indukowaną seroprotekcję przeciwko grypie A/H3N2/Switzerland/2013 w porównaniu do grypy A/H3N2/Texas/2012. Po szczepieniu miana przeciwciał przeciwko obu szczepom wzrosły, mimo że szczep A/H3N2/Switzerland/2013 nie znajdował się w składzie szczepionki.
Wirusowa hemaglutynina wykazuje potencjał hemaglutynacji erytrocytów zależny od gatunku. Co istotne, krew świnki morskiej nie ulega prawidłowej hemaglutynacji w przypadku grypy B, natomiast krew indyka wykazuje potencjał do hemaglutynacji przy wysokich mianach i niskiej reaktywności krzyżowej. Po opanowaniu techniki, w przypadku jej prawidłowego przeprowadzenia, procedurę można ukończyć w ciągu trzech godzin.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o traktowaniu surowicy RDE w celu inaktywacji nieswoistych inhibitorów oraz zapobiegania nieswoistemu wiązaniu podczas hemaglutynacji wirusa. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące roli poszczególnych immunoglobulin specyficznych dla patogenu. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii wirusowej do pogłębienia wiedzy na temat odporności związanej z szczepieniami u pacjentów zdrowych i z immunosupresją w różnych grupach wiekowych.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania testu hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego oznaczenia mian przeciwciał specyficznych dla szczepów grypy na dużą skalę. Należy pamiętać, że praca z antygenami wirusowymi, krwią zwierzęcą i próbkami surowicy ludzkiej może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w laboratorium poziomu BSL2.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły przeprowadzania testu hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego oznaczenia mian przeciwciał swoistych dla grypy w próbkach surowicy. Metoda ta jest kluczowa dla zrozumienia odporności indukowanej szczepionkami w różnych populacjach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wakcynologia
- Immunologia
- Serologia
Wstęp
- Test hamowania hemaglutynacji służy do pomiaru odpowiedzi przeciwciał na wirusa grypy.
- Dostarcza on informacji na temat skuteczności szczepionek oraz odporności populacyjnej.
- Metodę tę można zastosować do różnych rodzajów próbek, w tym do surowicy ludzkiej i mysiej.
- Zrozumienie miana przeciwciał jest niezbędne do oceny wydajności szczepionki.
Cel badania
- Ilościowe oznaczenie mian przeciwciał specyficznych przeciwko grypie u osób zaszczepionych.
- Ocena odpowiedzi immunologicznej w różnych grupach demograficznych.
- Zapewnienie szybkiej i dokładnej metody oznaczania miana.
Zastosowane metody
- Oznakowanie płytek mikrotitracyjnych 96-dołkowych informacjami eksperymentalnymi.
- Użycie pipety wielokanałowej do dodania PBS do dołków.
- Wykonanie testu hemaglutynacji w celu określenia optymalnych stężeń antygenu wirusowego.
- Przeprowadzenie testu hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego oznaczenia mian przeciwciał.
Główne wyniki
- Test ten pozwala na dokładne oznaczenie miana przeciwciał przeciwko grypie.
- Wykazuje on obecność przeciwciał neutralizujących w próbkach surowicy.
- Wyniki mogą być pomocne przy opracowywaniu szczepionek i strategii zdrowia publicznego.
- Metoda ta jest dostosowywalna do różnych typów próbek i populacji.
Wnioski
- Test hamowania hemaglutynacji jest wiarygodnym narzędziem do pomiaru odpowiedzi immunologicznych.
- Technika ta pozwala na lepsze zrozumienie odporności indukowanej szczepionką.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne infekcje wirusowe i populacje.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładne ilościowe oznaczenie mian przeciwciał specyficznych dla grypy jest niezbędne do oceny odporności indukowanej szczepionką oraz kierowania ocenami immunogenności w rozwoju przedklinicznym i klinicznym. Test hamowania hemaglutynacji (HI) stanowi standaryzowaną i szybką metodę pomiaru odpowiedzi neutralizujących przeciwciał w różnych populacjach, wspierając podejmowanie decyzji typu go/no-go w oparciu o dane podczas rozwoju szczepionek. Dzięki umożliwieniu analizy reaktywności krzyżowej między szczepami oraz optymalizacji erytrocytów specyficznych dla gatunku, test ten zwiększa pewność prognostyczną w translacyjnych badaniach immunologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analiza odpowiedzi immunologicznej wywołanej szczepionką poprzez ilościowe oznaczenie mian przeciwciał specyficznych dla danego szczepu, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w wyborze celów antygenowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację hemaglutyniny jako kluczowego antygenu wirusa grypy poprzez hamowanie aglutynacji wirusowej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Standaryzacja stężeń antygenów poprzez miareczkowanie w teście hemaglutynacji (HA), zapewniająca powtarzalność materiałów wejściowych do późniejszego przesiewu HI.
- Wartość operacyjna: Wsparcie wysokoprzepustowego przesiewu surowic z wykorzystaniem seryjnych rozcieńczeń dwukrotnych w formacie 96-dołkowym, co zwiększa skalowalność testu.
- Wartość naukowa: Minimalizacja reaktywności krzyżowej poprzez empiryczny dobór erytrocytów zwierzęcych (np. świnki morskiej, indyka), co zwiększa swoistość testu w odniesieniu do wirusa grypy B oraz szczepów heterologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pomiar seroprotekcji indukowanej szczepionką oraz geometrycznych średnich mian (GMT) w zdrowych kohortach, co dostarcza translacyjnych biomarkerów immunogenności.
- Wartość operacyjna: Umożliwia międzyfunkcyjne porównanie odpowiedzi immunologicznych w różnych grupach wiekowych i populacjach pacjentów przy użyciu standaryzowanych wartości odcięcia mian.
- Wartość naukowa: Wykrywanie krzyżowych odpowiedzi immunologicznych na szczepy nieobecne w szczepionce (np. A/H3N2/Switzerland/2013), co dostarcza informacji istotnych dla projektowania szczepionek o szerokim spektrum działania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test HI wpisuje się w proces badania immunogenności – od wczesnego etapu odkrywania po walidację przedkliniczną, dostarczając ilościowych danych na temat przeciwciał, które pozwalają na optymalizację doboru antygenu, adiuwantów oraz badań nad zakresem dawek.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących skuteczności szczepionek poprzez pomiar funkcjonalnego hamowania hemaglutynacji przez przeciwciała.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki mian z rozcieńczeń seryjnych, umożliwiając wiarygodną ocenę związków lub kandydatów na szczepionki.
- Analityka: Generuje miana końcowe oraz średnie geometryczne, które pozwalają na statystyczne porównanie odpowiedzi immunologicznych w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez ocenę immunogenności w modelach zwierzęcych (np. surowica mysia) przed rozpoczęciem badań na ludziach.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Ustanawia zstandaryzowaną platformę serologiczną, którą można zastosować do wielu szczepów grypy i formatów szczepionek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w odniesieniu do odporności indukowanej szczepionką poprzez pomiar miana przeciwciał neutralizujących jako korelatu ochrony.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność testu dzięki standaryzowanemu przygotowaniu antygenu, zastosowaniu surowicy traktowanej RDE oraz gatunkowo specyficznym czasom inkubacji erytrocytów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wczesną identyfikację niewystarczającej immunogenności, co redukuje ryzyko biologiczne na późniejszych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na szczepionki z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o szerokość miana dla różnych szczepów oraz wskaźniki seroprotekcji.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu wirusologii i serologii w celu pracy z antygenami wirusowymi, przygotowania surowicy traktowanej RDE oraz interpretacji punktów końcowych hemaglutynacji.
- Metoda jest zależna od dostępu do zaplecza zgodnego ze standardem BSL2 w celu bezpiecznego obchodzenia się z wirusami grypy oraz produktami krwi ludzkiej i zwierzęcej.
- Konieczna jest standaryzacja źródeł erytrocytów (np. świnka morska, indyk, człowiek grupa O), aby zminimalizować reaktywność krzyżową i zapewnić aglutynację specyficzną dla gatunku.
- Wymagana jest precyzyjna kontrola czasu inkubacji erytrocytów, aby uniknąć fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich odczytów hemaglutynacji.
- Metoda ogranicza się do pomiaru funkcjonalnej aktywności przeciwciał; nie pozwala na ilościowe oznaczenie nieneutralizujących lub niefunkcjonalnych klas immunoglobulin bez zastosowania uzupełniających testów (np. ELISA).
