Name: Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj metodę ChEC-seq do mapowania interakcji białko-DNA w całym genomie Saccharomyces cerevisiae. Technika wykorzystuje fuzje białek z nukleazą MNase, oferując wysoką rozdzielczość i niskie tło bez utrwalania formaldehydem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Moustafie Salehowi i Jayowi Tourigny'emu za krytyczne przeczytanie manuskryptu oraz Stevenowi Hahnowi i Stevenowi Henikoffowi za mentoring i wsparcie podczas rozwoju ChEC-seq i jego zastosowania w kompleksie Mediator. S.G. jest wspierany przez granty NIH R01GM053451 i R01GM075114, a G.E.Z. jest wspierany przez fundusze startowe Indiana University.

1. Generacja szczepów drożdży
<ol>
	<li>Wygeneruj szczep drożdży noszący interesujący czynnik oznaczony MNazą.
	<ol>
		<li>PCR amplifikuje kasetę znakującą MNazę z żądanego wektora (Tabela 1) przy użyciu określonej mieszaniny reakcyjnej (Tabela 2) i warunków cyklicznych (Tabela 3). Wymieszaj 5 μl reakcji PCR i 1 μl 6-krotnego barwnika ładującego DNA. Uruchom każdą podwielokrotność PCR na 0,8% żelu agarozowym pod napięciem 120 V przez 40 minut. Oczekiwany rozmiar produktu to ~2.3 kb.</li>
		<li>Przekształć amplifikowaną kasetę znakującą w wybrany szczep za pomocą standardowego octanu litu transformation22 i przeprowadź selekcję.</li>
		<li>Sprawdź, czy kaseta znakująca jest prawidłowo zintegrowana z PCR kolonii.
		<ol>
			<li>Przygotować określoną mieszaninę reakcyjną (tabela 4) dla liczby kolonii, które mają być przesiewane. Trzymaj na lodzie, aż będzie potrzebny.</li>
			<li>Pobrać porcję każdej kolonii do badania na dno probówki do PCR za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety.</li>
			<li>Podgrzewaj zebrane kolonie w kuchence mikrofalowej z dużą mocą przez 1 minutę.</li>
			<li>Dodaj 50 μl mieszanki PCR (Tabela 4) do każdej kolonii podgrzanej w kuchence mikrofalowej i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Przeprowadzić PCR w określonych warunkach cyklicznych (tabela 5).</li>
			<li>Wymieszaj 50 μl reakcji PCR i 10 μl barwnika ładującego DNA 6X bezpośrednio w każdej probówce PCR. Umieścić 10 μl każdej próbki w 1% żelu agarozowym pod napięciem 120 V przez 40 minut. Oczekiwany rozmiar produktu to ~ 700 bp. 
			UWAGA: W razie potrzeby sprawdź prawidłową ekspresję białka fuzyjnego MNazy za pomocą western blotting. Oczekuje się przesunięcia o ~ 20,6 kilodaltonów w masie cząsteczkowej znakowanego białka.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj wolny szczep MNazy poprzez klonowanie promotora interesującego genu w oparciu o homologię do pGZ136 (Tabela 1) oraz transformację i selekcję, jak w kroku 1.1.2.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, złóż promotor interesującego genu i 3xFLAG-MNase-SV40 NLS w wektor plazmidowy, przekształć i wybrać jak w kroku 1.1.2, a następnie wyhodować szczep w odpowiednich warunkach selektywnych dla utrzymania plazmidu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. ChEC
<ol>
	<li>Po południu/wieczorem w dniu poprzedzającym doświadczenie ChEC zaszczepić 3 ml dekstrozy drożdżowo-peptonowej (YPD) lub odpowiednią selektywną pożywką pojedynczą kolonią szczepu zawierającą czynnik znakowany MNazą. Inkubować tę kulturę przez noc (wstrząsanie 180 obr./min, 30 °C).</li>
	<li>Rano w dniu eksperymentu ChEC rozcieńczyć nocną kulturę w 50 ml pożywki do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) 0,2 - 0,3. Inkubować tę kulturę (wstrząsanie 180 obr./min, 30 °C), aż osiągnie OD600 0,5-0,7. Gdy kultura zbliża się do odpowiedniego OD600, ustawić blok grzewczy lub łaźnię wodną na 30 °C i rozpocząć rozmrażanie dodatków buforu A (tabela 6).</li>
	<li>Przygotować 5 ml buforu A z dodatkami (tabela 6) na kulturę. Podczas zabiegu należy utrzymywać bufor A w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować probówki do mikrodymów zawierające 90 μl roztworu zatrzymującego (Tabela 7) i 10 μl 10% SDS dla każdego punktu czasowego, który ma być zebrany. Dla każdego nowego analizowanego czynnika należy pobrać próbki po 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min i 10 min.</li>
	<li>Zdekantować kulturę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 500 x g i temperaturze pokojowej (RT) przez 1 min.</li>
	<li>Dokładnie zawiesić komórki w 1 ml buforu A i przenieść zawieszone komórki do probówki do mikrofuge. Granulki zawieszone w mikrofugach o stężeniu 1 500 x g i RT przez 30 s.</li>
	<li>Odessać supernatant i dokładnie zawiesić komórki w 1 ml buforu A, pipetując w górę iw dół. Granulki zawieszone w mikrofugach o stężeniu 1 500 x g i RT przez 30 s. Powtórz ten krok raz.</li>
	<li>Dokładnie zawieś komórki w 570 μl buforu A. Dodaj 30 μl 2% digitoniny (0,1% stężenia końcowego), aby ułatwić przenikanie komórek i odwróć, aby wymieszać.</li>
	<li>Przepuszczać komórki w bloku grzewczym lub łaźni wodnej w temperaturze 30 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Pipetować reakcję w górę i w dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Usunąć 100 μl podwielokrotności przepuszczalnych komórek jako kontrolę ujemną do probówki do mikrodymki zawierającej roztwór zatrzymujący i SDS (krok 2.4) i krótko zmieszać w celu wymieszania.</li>
	<li>Dodaj 1,1 μl 1 M CaCl2 (2 mM stężenie końcowe) do przepuszczalnych komórek, aby aktywować MNazę i szybko odwrócić kilka razy lub krótko wirować w celu wymieszania. Natychmiast przywrócić mieszaną reakcję w temperaturze 30 °C i uruchomić stoper.</li>
	<li>W każdym punkcie, który ma być zebrany, pipetować reakcję w górę iw dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek, a następnie usunąć 100 μl porcji przepuszczalnych komórek do probówki z mikrodymą zawierającą roztwór zatrzymujący i SDS i krótko wirować w celu wymieszania. Dla każdego nowego analizowanego czynnika weź 0 s (bez dodatku CaCl2), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min i 10 min punkty czasowe. 
	UWAGA: Eksperymenty ChEC z czynnikami, które szybko rozszczepiają DNA w temperaturze 30°C, mogą być przeprowadzane w niższych temperaturach, aby spowolnić kinetykę cięcia MNazy.</li>
	<li>Po zebraniu wszystkich punktów czasowych dodać 4 μl 20 mg/ml proteinazy K do każdej próbki, krótko odwirować w celu wymieszania i inkubować w temperaturze 55 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 200 μl alkoholu fenolowo-chloroformowego w proporcji 25:24:1 do każdej próbki, energicznie wirować do wymieszania i odwirować z maksymalną prędkością i RT w mikrodyfie przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć każdą fazę wodną (~ 150 μl) do nowej probówki. Dodaj 30 μg glikogenu i 500 μl 100% etanolu. Energicznie wirować, mieszać i wytrącać na suchym lodzie przez 10 minut lub do momentu, gdy roztwór będzie lepki.</li>
	<li>Osad wytrącał DNA z maksymalną prędkością i w temperaturze 4 °C w mikrofugach przez 10 minut.</li>
	<li>Zdekantować supernatanty i przepłukać granulki 1 ml RT 70% etanolu.</li>
	<li>Zdekantuj etanol, usuwając pozostałą część przez odwrócenie i delikatnie stukając rurkami w ręcznik papierowy. Krótko odwirować próbki za pomocą wirówki stołowej i użyć pipety do usunięcia pozostałości etanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Suszenie na powietrzu granulek przy temperaturze rynkowej przez 5 min.</li>
	<li>Podczas suszenia granulek przygotuj mieszankę główną, aby ponownie zawiesić wysuszone granulki w 29 μl Tris, pH 8,0 + 1 μL 10 mg/ml RNazy A każdy. Trawić RNA w temperaturze 37 °C przez 20 min.</li>
	<li>Wymieszaj 1 μl barwnika 6X obciążającego DNA z 5 μl każdej próbki i uruchom na 1,5% żelu agarozowym pod napięciem 120 V przez 40 minut.</li>
</ol>
3. Wybór rozmiaru
UWAGA: Celem wyboru rozmiaru jest usunięcie wielokilozasadowych fragmentów genomowego DNA z próbki do sekwencjonowania i wzbogacenie fragmentów o wielkości ~150 pz (w przybliżeniu wielkości nukleosomalnego DNA) lub mniejszej. W danych sekwencjonowania fragmenty <400 pz są wzbogacone, z zauważalnym pikiem o wielkości nukleosomalnego DNA (~150 pz) i szczytem lub szerokim rozkładem fragmentów subnukleosomalnych.
<ol>
	<li>Do każdej próbki dodać 75 μl kulek odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej (SPRI) w roztworze glikolu polietylenowego (PEG)23 i pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Inkubować mieszaninę kulek:DNA w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Podczas inkubacji kulek SPRI należy przygotować probówki do mikrofuge zawierające 96 μl 10 mM Tris, pH 8,0 i 4 μl 5 M NaCl dla każdej próbki.</li>
	<li>Umieść rurki w stojaku magnetycznym, aby zebrać koraliki z boku tuby. Pozwól koralikom zebrać się z boku rurki przez 2 minuty.</li>
	<li>Przenieść każdy supernatant do nowej probówki zawierającej Tris i NaCl (krok 3.2).</li>
	<li>Dodać 200 μl alkoholu fenolowo-chloroformowego o proporcji 25:24:1 do każdej próbki, zwirować do wymieszania i odwirować z maksymalną prędkością i suchą temperaturą w mikrodymie przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń każdą fazę wodną do nowej probówki. Dodaj 30 μg glikogenu i 500 μl 100% etanolu. Wytrącić DNA na suchym lodzie przez 10 minut lub do momentu, gdy roztwór będzie lepki.</li>
	<li>Osad wytrącał DNA z maksymalną prędkością i w temperaturze 4 °C w mikrofugach przez 10 minut.</li>
	<li>Zdekantować supernatanty i przepłukać granulki 1 ml 70% etanolu.</li>
	<li>Zdekantuj etanol, usuwając pozostałą część przez odwrócenie i delikatnie stukając rurkami w ręcznik papierowy. Krótko odwirować próbki za pomocą wirówki stołowej i użyć pipety do usunięcia pozostałości etanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Suszenie na powietrzu granulek przy temperaturze rynkowej przez 5 min.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wysuszone granulki w 25 μl Tris, pH 8,0. Określ stężenie próbki za pomocą testu o wysokiej czułości. W przypadku eksperymentów TF ChEC rutynowo odzyskuje się 10-100 ng DNA po doborze wielkości.</li>
	<li>Przygotuj biblioteki sekwencjonowania. Protokoły przygotowania biblioteki, które nie opierają się na wyborze rozmiaru, jak opisano wcześniej24, są pożądane, aby umożliwić sekwencjonowanie szerokiego zakresu rozmiarów fragmentów (25-500 pz).</li>
	<li>Biblioteki sekwencji w trybie sparowanego końca. Do wysokiej jakości mapowania odczytu potrzebnych jest co najmniej 25 baz sekwencji na każdym końcu. Od 1 do 2 milionów odczytów zapewnia wystarczające pokrycie dla próbki ChEC. 
	UWAGA: Analiza danych ChEC-seq jest złożoną procedurą i wykracza poza zakres tego artykułu. Szczegółowe informacje na temat analizy danych można znaleźć w poprzednich publikacjach1,21, a niestandardowe skrypty wykorzystywane do analizy są dostępne na GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER25 (http://homer.salk.edu) może być również używany do analizy danych ChEC-seq za pomocą wiersza poleceń.</li>
</ol>

<ol><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nat Commun. 6, 8733(2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Dynamics+of+Enhanceosome+Assembly+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).</li>
<li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li>
<li>Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Misinterpretable+ChIP-seq+Bias+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83506(2013).</li>
<li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+promoters+give+rise+to+false+positive+%27Phantom+Peaks%27+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Krebs, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+transcription+factor+binding+map+accuracy+utilizing+knockout-mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).</li>
<li>Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Association+of+Mediator+and+RNA+Polymerase+II+in+Wild-Type+and+Mediator+Mutant+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast.</a> Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).</li>
<li>Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-targeted+transcription+factors+motifs+are+a+systemic+component+of+ChIP-seq+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets.</a> Genome Biol. 15 (7), 412(2014).</li>
<li>Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+Signals+in+Sequencing-Based+Chromatin-ImmunoPrecipitation+Control+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries.</a> PLoS ONE. 4 (4), 5241(2009).</li>
<li>Teytelman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Chromatin+Structures+on+DNA+Processing+for+Genomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses.</a> PLoS ONE. 4 (8), 6700(2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Genome-wide+Protein-DNA+Interactions+Detected+at+Single-Nucleotide+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).</li>
<li>Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+transcription+factor+binding+sites+on+native+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin.</a> Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).</li>
<li>Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleosomal+barrier+to+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II+is+overcome+by+the+chromatin+remodeler+Chd1%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1.</a> eLife. 3, 02042(2014).</li>
<li>Aughey, G. N., Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dam+it%27s+good%21+DamID+profiling+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).</li>
<li>Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calling+Cards+enable+multiplexed+identification+of+the+genomic+targets+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins.</a> Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIC+and+ChEC%3A+Genomic+Mapping+of+Chromatin+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins.</a> Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Merz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actively+transcribed+rRNA+genes+in+S.+cerevisiae+are+organized+in+a+specialized+chromatin+associated+with+the+high-mobility+group+protein+Hmo1+and+are+largely+devoid+of+histone+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules.</a> Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).</li>
<li>Schmid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nup-PI%3A+The+Nucleopore-Promoter+Interaction+of+Genes+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast.</a> Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).</li>
<li>Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+Ca2%2B+by+yeast+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles.</a> J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).</li>
<li>Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediator+binding+to+UASs+is+broadly+uncoupled+from+transcription+and+cooperative+with+TFIID+recruitment+to+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters.</a> The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective%2C+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li>
<li>Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOrsi%2C+GA+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Kungulovski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+histone+modification-specific+interaction+domains+as+an+alternative+to+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies.</a> Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).</li>
<li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).</li>
<li>Feeser, E. A., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Studies+of+the+Rap1+C-Terminus+Reveal+Novel+Separation-of-Function+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants.</a> J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).</li>
<li>Neph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expansive+human+regulatory+lexicon+encoded+in+transcription+factor+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints.</a> Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).</li>
<li>Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocortin+receptor-mediated+mobilization+of+intracellular+free+calcium+in+HEK293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells.</a> Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).</li>
<li>Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Like+Growth+Factor+Binding+Proteins+Increase+Intracellular+Calcium+Levels+in+Two+Different+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59323(2013).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Calcium+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Calcium in Neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Filion, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Protein+Location+Mapping+Reveals+Five+Principal+Chromatin+Types+in+Drosophila+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells.</a> Cell. 143 (2), 212-224 (2010).</li>
<li>van Bemmel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Network+Model+of+the+Molecular+Organization+of+Chromatin+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila.</a> Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).</li>
<li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykazaliśmy, że ChEC może mapować różne klasy białek drożdży na chromatynie i przewidujemy, że będzie miał szerokie zastosowanie do różnych rodzin TF i innych czynników wiążących chromatynę w drożdżach. ChEC-seq jest korzystny, ponieważ nie wymaga sieciowania, solubilizacji chromatyny ani przeciwciał. W ten sposób ChEC unika artefaktów potencjalnie obecnych w X-ChIP-seq, takich jak artefakt hiper-ChIPable 3,4, i natywnego ChIP, takiego jak fałszywie ujemne wyniki...

Mapowanie miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych (TF), remodelerów chromatyny i innych czynników regulacyjnych związanych z chromatyną jest kluczem do zrozumienia wszystkich procesów opartych na chromatynie. Chociaż metody immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq) zostały wykorzystane do uzyskania wielu ważnych informacji na temat biologii genomu, mają one znaczące ograniczenia. Niedawno wprowadziliśmy alternatywną metodę, zwaną endogennym rozszczepieniem chromatyny i sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (ChEC-seq)1, aby obejść te wady.
ChIP-seq jest najczęściej wykonywane z początkowym etapem sieciowania formaldehydu (X-ChIP-seq) w celu zachowania interakcji białko-DNA. Jednak wiele ostatnich badań wykazało, że X-ChIP-seq wychwytuje przejściowe lub niespecyficzne interakcje białko-DNA2,3,4,5,6,7,8, co powoduje powstawanie fałszywie dodatnich miejsc wiązania. Ponadto, sonikacja, powszechnie stosowana do fragmentacji chromatyny w eksperymentach X-ChIP-seq, preferencyjnie ścina regiony otwartej chromatyny, prowadząc do tendencyjnego odzyskiwania fragmentów z tych regionów9,10. Sonikacja daje również niejednorodną mieszaninę długości fragmentów, co ostatecznie ogranicza rozdzielczość miejsca wiązania, chociaż dodanie etapu trawienia egzonukleazą może znacznie poprawić rozdzielczość11,12. Natywne metody ChIP, takie jak zajęte regiony genomów z naturalnie izolowanej chromatyny (ORGANIC) oczyszczonej powinowactwem (ORGANIC)13 nie używają sieciowania i fragmentacji chromatyny za pomocą nukleazy mikrokokowej (MNazy), łagodząc potencjalne błędy związane z sieciowaniem formaldehydu i sonikacją. Jednak rozpuszczalność wielu białek związanych z chromatyną w stosunkowo łagodnych warunkach wymaganych do ekstrakcji natywnej chromatyny jest słaba, co może prowadzić do zmniejszenia zakresu dynamiki i/lub wyników fałszywie ujemnych14.
Podczas gdy różne iteracje ChIP-seq są najczęściej używane do mapowania całego genomu interakcji białko-DNA, zaimplementowano również kilka technik mapowania opartych na fuzji białek będących przedmiotem zainteresowania z różnymi enzymami modyfikującymi DNA. Jednym z takich podejść jest identyfikacja metylotransferazy adeninowej DNA (DamID)15, w której białko wiążące chromatynę, będące przedmiotem zainteresowania, jest genetycznie łączone z Dam, a fuzja ta ulega ekspresji w komórkach lub zwierzętach, co powoduje metylację sekwencji GATC proksymalnie do miejsc wiązania białka. DamID jest korzystny, ponieważ nie opiera się na immunoprecypitacji, a więc unika sieciowania, przeciwciał lub rozpuszczania chromatyny. Wykonuje się go również in vivo. Jednak rozdzielczość DamID jest ograniczona do skali kilozasadowej, a aktywność metylacyjna białka fuzyjnego Dam jest konstytutywna. Drugą metodą opartą na fuzji enzymatycznej jest Calling Card-seq16, która wykorzystuje fuzję czynnika będącego przedmiotem zainteresowania z transpozazą, kierując specyficzną dla miejsca integracją transpozonów. Podobnie jak DamID, Calling Card-seq nie opiera się na immunoprecypitacji, a zatem ma podobne zalety, z dodatkową korzyścią w postaci zwiększonej rozdzielczości. Jednak sekwencja kart telefonicznych może być ograniczona przez odchylenia sekwencji transpozaz i zależy również od obecności miejsc restrykcyjnych w pobliżu miejsc insercji transpozonów.
Trzecią metodą fuzji enzymatycznej, opracowaną w laboratorium Laemmli, jest endogenne rozszczepienie chromatyny (ChEC)17. W ChEC fuzja między białkiem związanym z chromatyną a MNazą ulega ekspresji w komórkach, a po dodaniu wapnia w celu aktywacji MNazy, DNA jest rozszczepiane proksymalnie do miejsc wiązania znakowanego czynnika (ryc. 1). W połączeniu z Southern blotting, ChEC został użyty do scharakteryzowania struktury chromatyny i wiązania białek w wielu indywidualnych loci w drożdżach17,18, i został połączony z analizą mikromacierzy o niskiej rozdzielczości w celu zbadania interakcji składników porów jądrowych z genomem drożdży19. ChEC oferuje korzyści podobne do DamID i Calling Card-seq, a jego rozdzielczość jest prawie pojedynczą parą zasad, gdy jest analizowana przez primer extension19. ChEC jest również kontrolowany: silne rozszczepienie DNA przez MNazę zależy od dodania milimolowego wapnia, co zapewnia, że MNaza jest nieaktywna przy niskich stężeniach wolnego wapnia obserwowanych w żywych komórkach drożdży20.
Wcześniej postulowaliśmy, że połączenie ChEC z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (ChEC-seq) dostarczy mapy miejsc wiązania TF o wysokiej rozdzielczości. Rzeczywiście, w ramach projektu ChEC-seq wygenerowano mapy o wysokiej rozdzielczości pączkujących ogólnych czynników regulacyjnych (GRF) drożdży Abf1, Rap1 i Reb1 w całym genomie1. Udało nam się również zastosować ChEC-seq do modułowego kompleksu Mediator, konserwatywnego, niezbędnego globalnego koaktywatora transkrypcji21, rozszerzając zastosowanie ChEC-seq do kompleksów o rozmiarach megadaltonów, które nie stykają się bezpośrednio z DNA i mogą być trudne do zmapowania metodami opartymi na ChIP. ChEC-seq to skuteczna metoda zarówno do niezależnej walidacji wyników ChIP-seq, jak i do generowania nowych informacji na temat regulacji procesów rezydujących w chromatynie. Tutaj przedstawiamy protokół krok po kroku dotyczący wdrożenia tej metody w pączkujących drożdżach.

<table><tbody><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Q5 polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Inne polimerazy DNA o wysokiej wierności, takie jak Phusion, mogą być używane do amplifikacji kasetowej.</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus Drabinka DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimeraza DNA</td><td>NEB</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td>Ważne jest, aby stosować mieszankę inhibitorów proteazy wolną od EDTA, aby nie hamować rozszczepienia MNazy przez chelatację Ca2+.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS Organics</td><td>AC215740010</td><td></td></tr><tr><td>digitonina, EMD</td><td>Millipore</td> o wysokiej czystości <td>300410-250MG</td><td>Przygotuj 2% bulionu, rozpuszczając 20 mg digitoniny w 1 ml DMSO z energicznym wirowaniem.</td></tr><tr><td>Proteinaza K, 20 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A, 10 mg/ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Ampure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Kulki podobne do ampure można wygenerować przy użyciu opublikowanego protokołu (ref 24).</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny MagneSphere</td><td>Promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie całego genomu interakcji białko-dna z sekwencją chec u saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Mapowanie interakcji białko-DNA w całym genomie jest kluczowe dla zrozumienia regulacji genów, przebudowy chromatyny i innych procesów rezydujących w chromatynie. Sieciowanie formaldehydu, a następnie immunoprecypitacja chromatyny i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe (X-ChIP-seq) zostały wykorzystane do uzyskania wielu cennych informacji na temat biologii genomu. Jednak X-ChIP-seq ma znaczące ograniczenia związane z sieciowaniem i sonikacją. Natywny ChIP pozwala uniknąć tych wad poprzez pominięcie sieciowania, ale często powoduje słabe odzyskiwanie białek związanych z chromatyną. Ponadto wszystkie metody oparte na ChIP podlegają rozważaniom na temat jakości przeciwciał. Enzymatyczne metody mapowania interakcji białko-DNA, które obejmują fuzję białka będącego przedmiotem zainteresowania z enzymem modyfikującym DNA, zostały również wykorzystane do mapowania interakcji białko-DNA. Niedawno połączyliśmy jedną z takich metod, endogenne rozszczepienie chromatyny (ChEC), z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym jako sekwencjonowanie ChEC. ChEC-seq opiera się na fuzji białka związanego z chromatyną, które jest przedmiotem zainteresowania z nukleazą mikrokokową (MNazą) w celu wytworzenia ukierunkowanego rozszczepienia DNA w obecności wapnia w żywych komórkach. Sekwencja ChEC nie opiera się na immunoprecypitacji, a więc omija potencjalne problemy związane z sieciowaniem, sonikacją, solubilizacją chromatyny i jakością przeciwciał, zapewniając jednocześnie mapowanie w wysokiej rozdzielczości przy minimalnym sygnale tła. Przewidujemy, że ChEC-seq będzie potężnym odpowiednikiem ChIP, zapewniając niezależne środki, za pomocą których można zarówno walidować wyniki ChIP-seq, jak i odkrywać nowe informacje na temat regulacji genomu.

W przypadku udanego eksperymentu ChEC analiza DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym wykaże zależny od wapnia wzrost fragmentacji DNA w czasie, co objawia się rozmyciem (smearing) i ostatecznie całkowitym trawieniem DNA genomowego. W niektórych przypadkach po przedłużonym trawieniu obserwuje się drabinę prążków podobną do tej widocznej przy tradycyjnym trawieniu MNase. Ma to miejsce w przypadku analizy ChEC białka Reb1, ogólnego czynnika regulacyjnego, który wiąże regiony pozbawion...

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie map interakcji białko-DNA w całej skali genomu in situ z wysoką rozdzielczością i niskim tłem, bez konieczności sieciowania formaldehydem, solubilizacji chromatyny lub stosowania przeciwciał. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie transkrypcji, takie jak miejsca wiązania różnych czynników regulacyjnych z chromatyną w odniesieniu do regionów regulacyjnych genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona mapy wiązań genomicznych o wysokiej rozdzielczości z pomijalnie niskim tłem oraz pozwala uniknąć ograniczeń związanych ze standardowymi protokołami ChEC-seq.Procedurę zademonstruje Sebastian Grunberg, mój kolega z Fred Hutchinson Cancer Research Center. Popołudniu lub wieczorem w dniu poprzedzającym eksperyment należy przygotować prekulturę szczepu wykorzystywanego w badaniu. Do trzech mililitrów użytego bulionu peptonowo-glukozowego lub odpowiedniej pożywki selektywnej należy wprowadzić pojedynczą kolonię szczepu posiadającego czynnik znakowany MNase.Inkubuj tę kulturę przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C. Następnego ranka rozcieńcz kulturę nocną w 50 ml pożywki do gęstości optycznej przy 600 nm wynoszącej 0,2 do 0,3. Inkubuj kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem, aż osiągnie gęstość optyczną przy 600 nm w zakresie od 0,5 do 0,7.Przygotować wymaganą ilość buforu A z dodatkami i przechowywać go w temperaturze pokojowej podczas procedury. Przygotować probówki do mikrowirówki do pobierania próbek. Dla każdego analizowanego nowego czynnika pobrać próbki bez dodatku wapnia oraz po 30 sekundach, jednej minucie, 2,5 minuty, 5 minutach i 10 minutach po dodaniu wapnia.Do każdej probówki należy dodać 90 µL roztworu zatrzymującego oraz 10 µL 10% SDS. Gdy hodowla osiągnie gęstość optyczną przy 600 nm w zakresie od 0,5 do 0,7, należy przelać ją do stożkowej probówki o pojemności 50 mL i wirować z prędkością 1 500 ×g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po usunięciu nadsączu komórki należy dokładnie resuspender w 1 mL buforu A, a następnie przenieść resuspensję do probówki do mikrowirówki.Odwirować resuspendowane komórki w mikrocentry fudze z prędkością 1 500 ×g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz i dokładnie resuspendować komórki w 1 ml Buforu A, pipetując roztwór w górę i w dół. Odwirować resuspendowane komórki z prędkością 1 500 ×g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.Usunąć nadsącz, resuspender komórki w 1 ml Buforu A i ponownie odwirować. Po usunięciu nadsączu dokładnie resuspender komórki w 570 µl Buforu A. Dodać 30 µl 2% digitoniny, aby ułatwić permeabilizację komórek, i wymieszać przez odwracanie probówki. Przeprowadzić permeabilizację komórek w bloku grzejnym w temperaturze 30 °C przez pięć minut.Pipetuj mieszaninę reakcyjną w górę i w dół, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek. Jako kontrolę negatywną przenieś 100 µl alikwoty permeabilizowanych komórek do probówki do mikrowirówki zawierającej roztwór stopujący i SDS, a następnie krótko wymieszaj na wortexie. Przed rozpoczęciem serii czasowej kluczowe jest ustawienie probówek z roztworem stopującym, pipety, końcówek do pipety oraz minutnika obok bloków grzejnych, aby umożliwić sprawne pobranie próbek w pierwszych punktach czasowych.Aby rozpocząć analizę kinetyczną, należy dodać 1,1 µL chlorku wapnia o stężeniu 1 M do permeabilizowanych komórek w celu aktywacji MNazy, a następnie kilkukrotnie i szybko odwrócić probówkę, aby wymieszać zawartość. Niezwłocznie należy przenieść wymieszaną reakcję z powrotem do temperatury 30 °C i uruchomić stoper. W każdym punkcie czasowym przeznaczonym do pobrania próbek, należy pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek, a następnie przenieść 100 µL aliquoty permeabilizowanych komórek do probówki mikrowirówkowej zawierającej roztwór zatrzymujący i SDS.Krótko wymieszać w wirówce typu vortex. Po zebraniu wszystkich punktów czasowych, do każdej próbki dodać 4 µL proteinazy K o stężeniu 20 mg/mL. Krótko wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować w temperaturze 55 °C przez 30 minut.Do każdej próbki należy dodać 200 µL fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego, wymieszać energicznie w wirówce typu vortex, a następnie wirować z maksymalną prędkością przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Fazę wodną należy przenieść do nowej probówki. Należy dodać 30 µg glikogenu oraz 500 mL 100% etanolu.Mocno wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie wytrącić na suchym lodzie przez 10 minut lub do momentu, aż roztwór stanie się lepki. Osadzone DNA odwirować z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odlać nadsącz i przemyć każdy osad 1 mL 70% etanolu o temperaturze pokojowej.Odlać etanol i usunąć pozostałości, odwracając probówki i delikatnie opukując je o ręcznik papierowy. Próbki krótko wirować w wirówce stołowej, a następnie za pomocą pipety usunąć resztki etanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Osady suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Podczas gdy granulaty DNA wysychają, przygotuj mieszaninę główną (master mix) buforu Tris i RNazy A do resuspensji granulatów po wyschnięciu, a następnie wymieszaj na wirówce typu vortex. Do każdego wysuszonego granulatu DNA dodaj 30 µL roztworu RNazy A, wymieszaj na vortexie i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu trawienia RNA. Po 20 minutach wymieszaj 1 µL 6X barwnika do ładowania DNA z 5 µL każdej próbki, a następnie przeprowadź elektroforezę na żelu agarozowym 1,5% przy napięciu 120 V przez 40 minut.Procedurę selekcji rozmiaru należy rozpocząć od dodania do każdej próbki 75 µL kulek SPRI w roztworze glikolu polietylenowego. Mieszaninę kulek i DNA należy wymieszać poprzez 10-krotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas inkubacji z kulkami SPRI należy przygotować probówki do mikrowirówki zawierające 96 µL 10 mM Tris pH 8.0 oraz 4 µL 5 M chlorku sodu dla każdej próbki.Probówki zawierające mieszaninę kulek i DNA należy umieścić w statywie magnetycznym na dwie minuty, aby zgromadzić kulki na ściance probówki, a następnie przenieść każdy nadsącz do nowej probówki zawierającej Tris i chlorek sodu. Do każdej próbki należy dodać 200 µL fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego, wymieszać za pomocą wstrząsarki vortex i wirować z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Każdą fazę wodną należy przenieść do nowej probówki, dodać 30 µg glikogenu oraz 500 µL 100% etanolu.Wytrąć DNA na suchym lodzie przez 10 minut lub do momentu, aż roztwór stanie się lepki. Osadź wytrącone DNA poprzez wirowanie z maksymalną prędkością w temperaturze czterech stopni Celsius przez 10 minut. Odlej nadsącz i przemyj każdy osad jednym mililitrem 70% ethanol.Zlej etanol, usuwając jego pozostałości poprzez odwrócenie probówek i delikatne uderzanie nimi o ręcznik papierowy. Krótko wiruj próbki w wirówce laboratoryjnej, a następnie za pomocą pipety usuń resztki etanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Osady susz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Każdy wysuszony osad zawiesić w 25 µL Tris pH 8. Stężenie każdej próbki oznaczyć za pomocą testu o wysokiej czułości. Elektroforeza żelowa na agarozy DNA z analizy endogennego cięcia chromatyny Reb1, ogólnego czynnika regulacyjnego wiążącego regiony pozbawione nukleosomów, wykazuje zależny od wapnia wzrost fragmentacji DNA w czasie, co objawia się rozmyciem prążków, a ostatecznie całkowitym trawieniem DNA genomowego.Wizualizacja końców fragmentów z eksperymentu sekwencjonowania endogennego cięcia chromatyny Reb1 wykazuje wyraźne wzbogacenie Reb1 względem tła, uzyskanego z szczepu z wolną MNase po 30 sekundach obróbki wapniem. Podobnie, znaczne cięcie DNA zaobserwowano w przypadku fuzji podjednostki mediatora Med8 z MNase, ale nie dla wolnej MNase sterowanej promotorem Med8 jedną minutę po dodaniu wapnia. Aby porównać dane z sekwencjonowania endogennego cięcia chromatyny Reb1 z danymi z immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania wysokoprzepustowego, 1 992 piki Reb1 wyznaczone metodą organiczną zostały wycentrowane względem motywu, a następnie określono średnią liczbę końców fragmentów w każdej pozycji zasady w oknie o szerokości 100 par zasad wokół punktu środkowego motywu.Zaobserwowano wyraźną asymetrię i cięcie, przy czym większość końców fragmentów uwolnionych przez Reb1-MNase mapowała się na stronę powyżej motywu. Po opanowaniu techniki można ją przeprowadzić w ciągu jednego pełnego dnia roboczego, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Przy próbie zastosowania tej procedury należy pamiętać o ograniczeniu liczby próbek analizowanych równolegle, aby zapewnić dokładne pipetowanie i odpowiedni czas obsługi.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się transkrypcją do po raz pierwszy jednoznacznego scharakteryzowania powiązań genomowych kompleksu białkowego o rozmiarze megadaltona, który nie wiąże się z DNA w drożdżach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak przeprowadzić metodę ChEC-Seq w celu mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie drożdży pączkowych.

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany test hybrydowy drożdży, który wykrywa wiele białek oddziałujących z docelowym DNA. Przekształcone komórki drożdży zawierają docelową sekwencję DNA przed genem reporterowym. Dodatkowo wykazują ekspresję białek czynnika transkrypcyjnego. Kiedy białka tworzą kompleksy i wiążą się z docelowym DNA, gen reporterowy ulega ekspresji i może być wykryty enzymatycznie.

Zmodyfikowany test hybrydowy drożdży i jeden do wykrywania interakcji heteromerycznego kompleksu białkowego z DNA

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Ten artykuł przedstawia czułą metodę o nazwie Circle-Seq do oczyszczania pozachromosomalnego kolistego DNA (eccDNA). Metoda obejmuje oczyszczanie kolumny, usuwanie pozostałego liniowego chromosomalnego DNA, amplifikację w okręgu toczonym i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Circle-Seq ma zastosowanie do badań przesiewowych eukariotycznego eccDNA w skali genomu oraz badania niestabilności genomu i zmienności liczby kopii.

Oczyszczanie całego genomu pozachromosomalnego kolistego DNA z komórek eukariotycznych

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Głębokie sekwencjonowanie populacji drożdży wybranych do pozytywnych interakcji drożdży z hybrydami 2 potencjalnie dostarcza wielu informacji na temat oddziałujących białek partnerskich. W tym miejscu opisujemy działanie konkretnych narzędzi bioinformatycznych i dostosowanego zaktualizowanego oprogramowania do analizy danych sekwencyjnych z takich ekranów.

Analiza informacyjna danych sekwencyjnych z przesiewów drożdżowych 2-hybrydowych

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Poznaj metodę ChEC-seq do mapowania interakcji białko-DNA w całym genomie Saccharomyces cerevisiae. Technika wykorzystuje fuzje białek z nukleazą MNase, oferując wysoką rozdzielczość i niskie tło bez utrwalania formaldehydem.

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów