Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae
3 czerwca 2017
Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie map całego genomu interakcji białko-DNA in situ o wysokiej rozdzielczości i niskim tle, bez konieczności sieciowania formaldehydu, rozpuszczania chromatyny lub przeciwciał. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transkrypcji, takie jak to, gdzie różne czynniki regulacyjne wiążą się z chromatyną w odniesieniu do regionów regulatorowych genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona mapy wiązań genomowych o wysokiej rozdzielczości przy znikomym tle i pozwala uniknąć ograniczeń związanych ze standardowymi protokołami sekwencyjnymi ChEC.
Procedurę zademonstruje Sebastian Grunberg, mój kolega z Fred Hutchinson Cancer Research Center. Po południu lub wieczorem w dniu poprzedzającym eksperyment należy rozpocząć wstępną hodowlę szczepu do użytku doświadczalnego. Zaszczepić trzy mililitry zużytej dekstrozy peptonowej lub odpowiednią selektywną pożywką pojedynczą kolonią szczepu, noszącą czynnik znakowany MNazą.
Inkubuj tę kulturę przez noc w inkubatorze z wytrząsarką o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego ranka rozcieńczyć nocną kulturę do 50 mililitrów pożywki do gęstości optycznej przy 600 nanometrach od 0,2 do 0,3. Inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsarką, aż osiągnie gęstość optyczną 0,5 do 0,7 nanometra przy 600 nanometrach.
Przygotuj potrzebną ilość buforu A wraz z dodatkami i utrzymuj go w temperaturze pokojowej podczas zabiegu. Przygotuj probówki do mikrofuge do pobrania próbki. Dla każdego nowego analizowanego czynnika należy pobrać próbki bez dodatku wapnia i dodawać 30 sekund, jedną minutę, 2,5 minuty, 5 minut i 10 minut po dodaniu wapnia.
Do każdej probówki dodaj 90 mikrolitrów roztworu zatrzymującego i 10 mikrolitrów 10% SDS. Gdy kultura osiągnie gęstość optyczną przy 600 nanometrach od 0,5 do 0,7, przelej kulturę do 50-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj przy 1500 razy g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant, dokładnie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu A i przenieść zawieszone komórki do probówki do mikrodymy.
Zawiesić zawieszone komórki w mikrofugach pod ciśnieniem 1 500 g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i dokładnie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu A, pipetując w górę iw dół. Zawiesić zawieszone komórki w temperaturze 1 500 g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.
Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu A i ponownie odwirować. Po usunięciu supernatantu dokładnie zawiesić komórki w 570 mikrolitrach buforu A. Dodać 30 mikrolitrów 2% digitoniny, aby ułatwić przepuszczalność komórek i odwrócić, aby wymieszać. Przepuszczalność komórek w bloku grzewczym w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Pipetować reakcję w górę i w dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Jako kontrolę ujemną przenieść 100 mikrolitrów podwielokrotności przepuszczalnych komórek do probówki z mikrodymą zawierającą roztwór zatrzymujący i SDS, a następnie krótko przemieszać. Przed rozpoczęciem pomiaru czasu bardzo ważne jest, aby obok bloków grzewczych znajdowały się probówki z roztworem zatrzymującym, pipeta, końcówki do pipet i timer, aby można było skutecznie zbierać wczesne punkty czasowe.
Aby rozpocząć bieg czasu, dodaj 1,1 mikrolitra jednomolowego chlorku wapnia do przepuszczalnych komórek, aby aktywować MNazę, i szybko odwróć kilka razy, aby wymieszać. Natychmiast przywróć mieszaną reakcję do 30 stopni Celsjusza i uruchom timer. W każdym punkcie, który ma zostać pobrany, pipetuj reakcję w górę iw dół, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek, a następnie usuń 100 mikrolitrów porcji przepuszczalnych komórek do probówki do mikrofugi zawierającej roztwór zatrzymujący i SDS.
Krótko zmieszaj, aby wymieszać. Po zebraniu wszystkich punktów czasowych dodaj cztery mikrolitry po 20 miligramów na mililitr proteinazy K do każdej próbki. Krótko zmieszać i inkubować w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Dodaj 200 mikrolitrów alkoholu fenolowego: chloroformowego: izoamylowego do każdej próbki, energicznie wiruj, aby wymieszać i wiruj z maksymalną prędkością przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usuń fazę wodną do nowej probówki. Dodaj 30 mikrogramów glikogenu i 500 mililitrów 100% etanolu.
Energicznie wirować, aby wymieszać i wytrącać na suchym lodzie przez 10 minut lub do momentu, gdy roztwór będzie lepki. Osadzaj wytrącone DNA, wirując z maksymalną prędkością i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Zdekantować sklarat i umyć każdą granulkę jednym mililitrem 70% etanolu o temperaturze pokojowej.
Zdekantuj etanol i usuń pozostałą część, odwracając i delikatnie stukając rurkami w ręcznik papierowy. Krótko odwirować próbki za pomocą wirówki stołowej, a następnie użyć pipety do usunięcia pozostałości ehtanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Suszyć granulki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Podczas suszenia granulek DNA należy przygotować główną mieszankę buforu Tris i RNazy A w celu ponownego zawieszenia granulek po ich wysuszeniu i wirowania, aby wymieszać. Dodaj 30 mikrolitrów roztworu RNazy A do każdej wysuszonej osadki DNA, wiruj do wymieszania i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby strawić RNa. Po 20 minutach wymieszaj jeden mikrolitr barwnika ładującego DNA 6X z pięcioma mikrolitrami każdej próbki i uruchom na 1,5% żelu agarozowym o napięciu 120 woltów przez 40 minut.
Procedurę wyboru wielkości należy rozpocząć od dodania do każdej próbki 75 mikrolitrów kulek SPRI w roztworze glikolu polietylenowego. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać kulki i mieszaninę DNA, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas inkubacji kulek SPRI przygotuj probówki do mikrofug zawierające 96 mikrolitrów 10 milimolowych Tris pH 8,0 i cztery mikrolitry pięciomolowego chlorku sodu na każdą próbkę.
Umieść probówki zawierające koraliki i mieszaninę DNA w stojaku magnetycznym na dwie minuty, aby zebrać kulki z boku probówki, a następnie przenieś każdy supernatant do nowej probówki zawierającej Tris i chlorek sodu. Dodaj 200 mikrolitrów alkoholu fenolowego: chloroformowego: izoamylowego do każdej próbki, wiruj do wymieszania i wiruj z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Usuń każdą fazę wodną do nowej probówki, dodaj 30 mikrogramów glikogenu i 500 mikrolitrów 100% etanolu.
Wytrącaj DNA na suchym lodzie przez 10 minut lub do momentu, gdy roztwór stanie się lepki. Osadzać wytrącone DNA, wirując z maksymalną prędkością i czterema stopniami Celsjusza przez 10 minut. Zdekantować supernatant i umyć każdą granulkę jednym mililitrem 70% etanolu.
Zdekantuj etanol, usuwając pozostałą część, odwracając i delikatnie stukając rurkami w ręcznik papierowy. Krótko odwirować próbki za pomocą wirówki stołowej i użyć pipety do usunięcia pozostałości etanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Suszyć granulki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Ponownie zawiesić każdą wysuszoną granulkę w 25 mikrolitrach Tris pH 8. Określić stężenie każdej próbki za pomocą testu o wysokiej czułości. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym z analizy endogennego rozszczepienia chromatyny Reb1, ogólnego czynnika regulacyjnego, który wiąże regiony zubożone w nukleosomy, ujawnia zależny od wapnia wzrost fragmentacji DNA w czasie, na co wskazuje rozmazywanie i ostateczne całkowite trawienie genomowego DNA.
Wizualizacja końców fragmentów z eksperymentu sekwencjonowania endogennego rozszczepienia chromatyny Reb1 ujawnia silne wzbogacenie Reb1 na tle, pochodzącym z wolnego szczepu MNazy po 30 sekundach leczenia wapniem. Podobnie, znaczne rozszczepienie DNA zaobserwowano w wyniku fuzji podjednostki mediatora Med8 z MNazą, ale nie przez wolną MNazę przez promotor Med8 minutę po dodaniu wapnia. Aby porównać dane sekwencjonowania endogennego rozszczepienia chromatyny Reb1 z danymi immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, 1 992 piki Reb1 oznaczone metodą organiczną wyśrodkowano motyw i określono średnią liczbę końców fragmentów w każdej pozycji podstawowej w oknie 100 par zasad wokół punktu środkowego motywu.
Zaobserwowano uderzającą asymetrię i rozszczepienie, przy czym większość końców fragmentów uwolnionych przez Reb1-MNazę odwzorowywała się na górnej stronie motywu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego pełnego dnia roboczego, jeśli działa prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ograniczeniu liczby próbek testowanych równolegle, aby zapewnić dokładny czas pipetowania i obsługi.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transkrypcją, aby po raz pierwszy jednoznacznie scharakteryzować asocjację genomową niewiążącego DNA kompleksu białkowego o rozmiarach megadaltonowych w drożdżach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak wykonać metodę ChEC-Seq do mapowania całego genomu miejsc wiązania białek w pączkującym genomie drożdży.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę endogennego cięcia chromatyny połączoną z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), służącą do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie. Technika ta wykorzystuje białka fuzyjne z nukleazą mikrokokalną (MNase) do generowania wysokorozdzielczych map oddziaływań białko-DNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia chromatyny
- Genomika
- Regulacja transkrypcji
Wstęp
- ChEC-seq jest metodą ortogonalną do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP).
- Pozwala ona uniknąć stosowania sieciowania formaldehydem oraz solubilizacji chromatyny.
- Metoda ta zapewnia mapy wiązań genomicznych o wysokiej rozdzielczości z niskim poziomem szumu tła.
- Rozwiązuje ona ograniczenia występujące w standardowych protokołach ChEC-seq.
Cel badania
- W celu wygenerowania map interakcji białko-DNA w całej skali genomu in situ.
- W celu zbadania powiązań czynników regulacyjnych z chromatyną.
- W celu pogłębienia zrozumienia regionów regulacyjnych genów.
Zastosowane metody
- Prekultury szczepów eksperymentalnych zawierających czynniki z etykietą MNase.
- Zastosowanie nukleazy mikrokokkowej do cięcia chromatyny.
- Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe w celu mapowania oddziaływań.
- Analiza genomowych miejsc wiązania.
Główne wyniki
- Z powodzeniem wygenerowano mapy interakcji białko-DNA o wysokiej rozdzielczości.
- Metoda wykazała pomijalne tło na mapach wiązania.
- Kluczowe czynniki regulacyjne zmapowano w odniesieniu do regionów regulacyjnych genów.
- Procedura została zwalidowana przez Sebastiana Grunberga z Fred Hutchinson Cancer Research Center.
Wnioski
- ChEC-seq stanowi potężne narzędzie do badania oddziaływań białko-DNA.
- Wysoka rozdzielczość oraz niskie tło tej techniki czynią ją korzystną w badaniach nad transkrypcją.
- Przyszłe zastosowania mogą w dalszym stopniu wyjaśnić dynamikę regulacji chromatyny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ChEC-seq umożliwia wysokorozdzielcze mapowanie oddziaływań białko-DNA bez konieczności sieciowania, sonikacji czy wykorzystania przeciwciał, co rozwiązuje kluczowe ograniczenia metody ChIP-seq w procesach walidacji celów terapeutycznych. To podejście ortogonalne wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie niezależnego potwierdzenia miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych oraz wzorców zajętości chromatyny. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkryć, dostarczając ilościowych danych o wiązaniu genomicznym z niskim poziomem tła, co służy wyjaśnianiu szlaków sygnałowych i testowaniu hipotez.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę miejsc wiązania regulatorów transkrypcyjnych w odniesieniu do regionów regulacyjnych genów w celu walidacji postawionych hipotez.
- Wartość operacyjna: Zapewnia mapowanie niezależne od przeciwciał, co eliminuje zmienność wynikającą z jakości odczynników i efektów serii.
- Wartość strategiczna: Wspiera ortogonalną walidację wyników ChIP-seq w celu redukcji liczby wyników fałszywie dodatnich podczas wyboru celów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie ilościowych map końców fragmentów o wysokiej rozdzielczości, co umożliwia precyzyjne określenie granic oddziaływań białko-DNA.
- Wartość operacyjna: Zapewnia niski poziom sygnału tła, co poprawia czułość i powtarzalność analizy w zależności od czasu oraz pomiędzy powtórzeniami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia skalowalny, multipleksowy pobór próbek w różnych punktach czasowych w celu profilowania kinetyki wiązania chromatyny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Mapuje kompleksy megadaltonowe niewiążące DNA (np. Mediator) względem chromatyny, co pozwala na mechanistyczny wgląd w funkcję białek rusztowaniowych w układach istotnych dla procesów chorobowych.
- Wartość operacyjna: Działa in situ w żywych komórkach drożdży, co pozwala na zachowanie natywnych stanów chromatyny i uniknięcie artefaktów wynikających z fiksacji lub ekstrakcji.
- Wartość strategiczna: Zapewnia platformę możliwą do zakodowania genetycznego w celu znakowania białek endogennych, co wspiera skalowalną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów molekularnych w bibliotekach szczepów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ChEC-seq wpisuje się w fazę biologii odkrywczej, wspierając testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych przed opracowaniem testów i kaskad przesiewowych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia bezpośrednie testowanie miejsc asocjacji czynników regulacyjnych z chromatyną, co pozwala na doprecyzowanie mechanistycznych modeli regulacji genów.
- Screening: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanych, ilościowych profili cięcia, odpowiednich do porównywania dynamiki wiązania typu dzikiego, mutantów lub wariantów specyficznych dla danych warunków.
- Analityka: Dostarcza danych o liczbie końców fragmentów oraz danych o piku wycentrowanym na motywie, co ułatwia statystyczne porównanie siły wiązania i lokalizacji.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość między modelami drożdżowymi a wyższymi eukariotami poprzez definiowanie konserwowanych zasad wiązania regulatorów transkrypcyjnych.
- Zastosowania przemysłowe: Tworzy wielokrotnego użytku platformę mapowania genomicznego, którą można zastosować do każdego białka asocjującego z chromatyną, zdolnego do fuzji z MNase, w systemach genetycznie modyfikowalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki mapom wiązania o wysokiej rozdzielczości i niskim tle.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja poprzez wyzwalane wapniem, rozdzielone w czasie cięcie oraz ustandaryzowany proces odzyskiwania DNA.
- Wartość strategiczna: Zmniejszenie ryzyka biologicznego w wyborze celu dzięki ortogonalnemu potwierdzeniu danych ChIP-seq oraz odkrywaniu nowych zdarzeń wiązania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane obłożenie chromatyny i istotność funkcjonalną.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie biologii molekularnej drożdży, znakowania białek oraz testów nukleaz zależnych od wapnia.
- Zależne od ekspresji indukowalnej fuzji MNase oraz optymalizacji permeabilizacji (np. miareczkowania digitoniną).
- Wymaga standaryzowanego pobierania próbek w określonych odstępach czasu oraz zsynchronizowanego dodawania wapnia w celu uzyskania powtarzalnej kinetyki.
- Adaptacja do systemów ssaków może wymagać uwzględnienia dostarczania do jądra komórkowego oraz dostępności chromatyny.
- Ograniczenie praktyczne: przepustowość ograniczona przez ręczną obsługę próbek i częstotliwość pobierania próbek w poszczególnych punktach czasowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
- Wartość naukowa: Liczba końców fragmentów zapewnia ilościowy odczyt częstotliwości cięcia dla każdej pary zasad w genomie.
- Wartość operacyjna: Umożliwia normalizację i porównywanie wyników w różnych punktach czasowych, szczepach lub warunkach eksperymentalnych.
- Wartość strategiczna: Wspiera ustalanie progów statystycznych dla wyznaczania szczytów (peak calling) oraz analizy różnicowego wiązania.
