Name: Podskórny wlew neurotrofiny 4 za pomocą pomp osmotycznych lub bezpośredniego wstrzyknięcia mięśniowego poprawia starzenie się mięśni krtani szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Poznaj metodę podawania Neurotrophin 4 w celu remodelowania starzejących się mięśni krtani szczura za pomocą pomp osmotycznych i wstrzyknięć. Technika ta poprawia funkcję głosową i ma potencjał zastosowania klinicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute on Deafness and Other communication Disorders (R21DC010806 dla C.A.M. i J.C.S. oraz R01DC011285 dla C.A.M.).

Użyj samców szczurów rasy norweskiej Fischer 344-Brown w wieku 6 i 30 miesięcy do tego protokołu. Szczury pozyskano z kolonii gryzoni National Institute of Aging. Do tego badania wykorzystaliśmy szczury, ponieważ struktura krtani szczura jest podobna do ludzkiej, funkcjonalnie służąc do ochrony dróg oddechowych i wokalizacji specyficznych dla gatunku Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z polityką PHS dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, oraz Ustawa o dobrostanie zwierząt (7 U.S.C. i nast.); protokół wykorzystania zwierząt został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kentucky.
1. Znieczulenie szczurów
<ol>
	<li>Przygotuj środki znieczulające, mieszając chlorowodorek ketaminy (znieczulanie dysocjacyjne) i chlorowodorek ksylazyny (uspokajający i przeciwbólowy) w buforowanym roztworze soli fizjologicznej. Stężenia ketaminy i ksylazyny w roztworze końcowym wynoszą odpowiednio 100 mg/8 mg na kg masy ciała.</li>
	<li>Wstrzyknąć środki znieczulające szczurowi po podaniu dootrzewnowym za pomocą strzykawki z igłą 25 G.</li>
	<li>Ustal, czy szczur jest wystarczająco znieczulony, ściskając palec u nogi lub stopę kleszczami. Jeśli szczur nie zareaguje na szczypanie, można rozpocząć operację. Jeśli szczur zareaguje na uszczypnięcie palca odruchowo lub skurczami mięśni, odczekaj 1-2 minuty i powtórz test szczypania. Jeśli szczur zareaguje ponownie, zastąp go nowym zwierzęciem i powtórz procedurę, zaczynając od kroku 1.2.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy szczura, po jego unieruchomieniu, aby zapobiec wysychaniu rogówki.</li>
</ol>
2. Implantacja pompy osmotycznej
<ol>
	<li>Umieść szczura brzusznie na aseptycznym obszarze operacyjnym. Podawaj meloksykam jako lek znieczulający wstępnie. Podawać dootrzewnowo w dawce 1-4 mg/kg masy ciała za pomocą strzykawki z igłą 25 G.</li>
	<li> Użyj maszynki do strzyżenia, aby usunąć około 1 "x 1" kwadrat futra z tyłu szyi i około 1 cala ogona przestrzeni między ramionami. Gol się jak najbliżej skóry.</li>
	<li>Zwilż plecy i szyję dezynfekującym etanolem (70%).</li>
	<li>Po goleniu wyszoruj grzbietową stronę szyi 3 kolejnymi peelingami z alkoholem jodowym, kończąc na alkoholu.</li>
	<li>Utrzymuj temperaturę ciała szczura, umieszczając go na poduszce grzewczej ustawionej na 34 °C.</li>
	<li>Napełnij aseptycznie przygotowane pompy osmotyczne 50 μl NTF4 lub soli fizjologicznej do ogólnoustrojowego leczenia NTF4 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Za pomocą skalpela wykonaj poziome nacięcie o szerokości około 2 cm przez skórę, tuż przy czaszce do przestrzeni między łopatkami. Podnieś tylną krawędź nacięcia za pomocą kleszczy jedną ręką, jednocześnie wkładając końcówkę hemostatyków i delikatnie popychając tylną część nacięcia.</li>
		<li>Po tym, jak czubek hemostatyków znajdzie się około 2 cm czaszki w stosunku do nacięcia, otwórz uchwyty na hemostatykach, rozszerzając końcówki, aby utworzyć pustą "kieszeń" podskórną do miejsca nacięcia. Będzie to miejsce umieszczenia pompy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po włożeniu należy ustawić portal tłoczny pompy najpierw koniec, aby zminimalizować interakcję NTF4 i gojenie się miejsca nacięcia kieszonki.</li>
	<li>Dostarcz 50 μl soli fizjologicznej NTF4 przez 7 do 14 dni. Grupa 7-dniowa otrzymywała 6,72 mg / dobę NTF4 w całkowitej dawce 47,04 mg. Grupa 14-dniowa otrzymywała 6,72 mg / dobę w całkowitej dawce 94,08 mg NTF425.</li>
	<li>Użyj nylonowej nici do szwów 5-0, hemostatyków i kleszczyków, aby zamknąć nacięcie wykonane do umieszczenia pompy.</li>
	<li>Obserwuj szczury przez co najmniej 30 minut, gdy dochodzą do siebie po znieczuleniu. Kryteria zakończenia monitorowania obejmują aktywność, poruszanie się zwierzęcia po klatce, picie wody i rozpoczęcie innych normalnych czynności, takich jak pielęgnacja zwierząt.</li>
	<li>Monitoruj zwierzęta codziennie przez pierwszy tydzień, obserwując gojenie się miejsca operowanego, normalne spożycie paszy i wody oraz oddawanie moczu/kału, a także wszelkie nietypowe objawy behawioralne stresu, bólu lub innych powikłań pooperacyjnych.</li>
	<li>Jeśli szczur wydaje się odczuwać ból lub niepokój, należy podać mu podskórne wstrzyknięcie karprofenu w dawce 5 mg/kg raz na 24 godziny przez okres do 5 dni w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Jeśli wydaje się, że występuje infekcja, skonsultuj się z weterynarzem, aby upewnić się, że rana goi się prawidłowo.</li>
	<li>W zależności od grupy eksperymentalnej, w której znajduje się szczur, usuń nylonowy szew 5-0 7-10 dni po operacji, aby zapobiec podrażnieniu nici.</li>
</ol>
3. Znieczulenie szczurów do bezpośredniego wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Wstrzymaj się z jedzeniem dla szczurów w noc przed zabiegiem. Gwarantuje to, że nie ma pokarmu, który mógłby zablokować endoskop lub igłę do wstrzykiwań.</li>
	<li>Zważyć szczury i przygotować acepromazynę 1-2 mg/kg masy ciała. Wstrzyknąć domięśniowo (miejsce IM to lewy mięsień tarczycowy).</li>
	<li>Umieść szczura w pudełku indukcyjnym. Wywołać znieczulenie w komorze indukcyjnej za pomocą 5% izofluranu i 1 LO2.</li>
	<li>Przenieś szczura do stożka nosowego z 2% izofluranem i 600 mlO2.</li>
	<li>Ustal, czy szczur jest wystarczająco znieczulony, ściskając palec u nogi lub stopę kleszczami. Jeśli szczur nie zareaguje na szczypanie, można rozpocząć protokół wstrzyknięcia. Jeśli szczur zareaguje na uszczypnięcie palca odruchowo lub skurczami mięśni, odczekaj 1-2 minuty i powtórz test szczypania. Jeśli szczur zareaguje ponownie, zastąp go nowym zwierzęciem i powtórz procedurę, zaczynając od kroku 3.4.</li>
</ol>
4. Bezpośrednia iniekcja i wizualizacja
<ol>
	<li>Przygotowane w warunkach aseptycznych dawki 50 μl zawierające NTF4 lub sól fizjologiczną należy umieścić w łaźniH2Oustawionej na 25°C na 30 minut przed wstrzyknięciem.</li>
	<li>Umieść szczura w pozycji leżącej na plecach na platformie z pleksiglasu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Zawieś szczura w pozycji półleżącej na czołowych górnych siekaczach za pomocą drutu prowadzącego nawleczonego na górną część platformy.</li>
	<li>Podłącz strzykawkę 50 mm, 30 gauge, 100 μl do endoskopu zatokowego 1,9 mm 30° (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
	UWAGA: Zespół strzykawki jest przymocowany za pomocą przyrządu, który mocno przytrzymuje kaniulę do zewnętrznej ścianki endoskopu. Endoskop pozwala na wizualizację fałdów głosowych i śródustne prowadzenie strzykawki. Pozycja końcówki kaniuli jest regulowana przed każdym zwierzęciem, aby zapewnić, że końcówka jest w pełni i wyraźnie widoczna w widoku endoskopowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Użyj kleszczy z gumową końcówką, aby przedłużyć język i przesuwać go na boki. Następnie włóż plastikowy wziernik, aby utrzymać drożność jamy ustnej. Przygotuj wziernik z plastikowej beczki strzykawkowej o pojemności 5 ml, która jest przycięta na długość od 1,5 do 2 cm, z przyciętymi krawędziami pozbawionymi zadziorów i wypolerowanymi na gładko.</li>
	<li>Wyłącz światła w pomieszczeniu i podłącz halogenowe źródło światła do endoskopu. Włącz magnetowid, aby uchwycić procedurę.</li>
	<li>Zanurz dystalny koniec endoskopu w ciepłej wodzie na kilka sekund, aby zminimalizować rozwój kondensatu na szklanej końcówce po włożeniu do pyska szczura.</li>
	<li>Korzystając z wizualnej informacji zwrotnej z monitora, ostrożnie poprowadź igłę do obszaru lewego fałdu głosowego.</li>
	<li>Wstrzykiwanie roztworu należy zsynchronizować z fazą wdechową cyklu oddychania zwierząt, aby uzyskać pełny dostęp do fałdu głosowego. Podczas wdechowej fazy oddychania fałd głosowy jest w pełni odsłonięty.
	<ol>
		<li>Gdy fałd głosowy jest w pełni widoczny, włóż igłę do lewej tarczycy, znajdującej się po boku białej przyśrodkowej krawędzi fałdu głosowego. Mając włożoną igłę, wstrzyknąć wstrzyknięcie przez wciśnięcie strzykawki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyłącz halogenowe źródło światła w endoskopie i odtwarzaczu wideo, a następnie ponownie włącz światła w pomieszczeniu.</li>
	<li>Wróć szczura do jego domowej klatki i umieść na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Pozwól szczurowi dojść do siebie przed wyjęciem z poduszki grzewczej. Wymień jedzenie i wodę w klatce.</li>
	<li>Monitoruj szczury przez 7 dni po wstrzyknięciu, a następnie poddaj się eutanazji. Usuń krtań do kriosekcji24.</li>
</ol>
5. Eutanazja szczurów
<ol>
	<li>Znieczulenie szczurów chlorowodorkiem ketaminy i chlorowodorkiem ksylazyny (100 mg/8 mg na kg masy ciała wstrzyknięte wstrzyknięcie dootrzewnowe).</li>
	<li>Eutanazja przez wykrwawienie po torakotomii przyśrodkowej.</li>
</ol>

<ol><li>Trupe, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+and+consequences+of+eating+dependency+in+institutionalized+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Geriatrics+Society%22%5BJournal%5D)">Correlates and consequences of eating dependency in institutionalized elderly.</a> J. Am. Geriatrics Society. 34 (3), 192-198 (1986).</li>
<li>Ward, P. H., Colton, R., McConnell, F., Malmgren, L., Kashima, H., Woodson, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2498813">Aging of the voice and swallowing.</a> Otolaryngol. Head Neck Surg. 100 (4), 283-286 (1989).</li>
<li>Gay, E. G., Kronenfeld, J. J., Dettmann, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+on+the+effect+of+regulation+on+health+care+for+the+older+American%3A+a+tale+of+two+states%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontologist%22%5BJournal%5D)">A comparison on the effect of regulation on health care for the older American: a tale of two states.</a> Gerontologist. 34 (6), 787-796 (1994).</li>
<li>Hagen, P., Lyons, G. D., Nuss, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysphonia+in+the+elderly%3Adiagnosis+and+management+of+age-related+voice+changes%5BTitle%5D)+AND+%22South.+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Dysphonia in the elderly:diagnosis and management of age-related voice changes.</a> South. Med. J. 89 (2), 204-207 (1996).</li>
<li>Broniatowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+evaluation+and+treatment+of+patients+with+swallowing+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol.+Head+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Current evaluation and treatment of patients with swallowing disorders.</a> Otolaryngol. Head Neck Surgery. 120 (4), 464-473 (1999).</li>
<li>Lundy, D. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10187936">Aspiration: cause and implications.</a> Otolaryngol. Head Neck Surg. 120 (4), 474-478 (1999).</li>
<li>Schindler, J. S., Kelly, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12150508">Swallowing disorders in the elderly.</a> Laryngoscope. 112 (4), 589-602 (2002).</li>
<li>Gambino, D. R., Malmgren, L. T., Gacek, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+the+neuromuscular+junctions+in+the+human+posterior+cricoarytenoid+muscles%3A+a+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in the neuromuscular junctions in the human posterior cricoarytenoid muscles: a quantitative study.</a> Laryngoscope. 100 (3), 262-268 (1990).</li>
<li>Sinard, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+voice%3A+how+to+differentiate+disease+from+normal+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Geriatrics%22%5BJournal%5D)">The aging voice: how to differentiate disease from normal changes.</a> Geriatrics. 53 (7), 76-79 (1998).</li>
<li>Baker, K. K., Olson-Raming, L., Sapir, S., Luschei, E. S., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+vocal+loudness+in+young+and+old+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Speech+Lang.+Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Control of vocal loudness in young and old adults.</a> J. Speech Lang. Hear Res. 44 (2), 297-305 (2001).</li>
<li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 64 (4), 435-442 (2009).</li>
<li>Lai, K., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+signaling+of+new+players+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic signaling of new players at the neuromuscular junction.</a> J. Neurocytol. 32 (5-8), 727-741 (2003).</li>
<li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins%3A+roles+in+neuronal+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins: roles in neuronal development and function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24 (1), 677-736 (2012).</li>
<li>Gonzalez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Trkb+mediated+signaling+induces+disassembly+of+postsynaptic+receptor+clusters+at+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of Trkb mediated signaling induces disassembly of postsynaptic receptor clusters at neuromuscular junctions.</a> Neuron. 24 (3), 567-583 (1999).</li>
<li>Hirano, S., Kishimoto, Y., Suehiro, A., Kanemaru, S., Ito, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19029860">Regeneration of aged vocal folds: first human case treated with fibroblast growth factor.</a> Laryngoscope. 118 (12), 2254-2259 (2008).</li>
<li>Branski, R. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19374154">Effects of transforming growth factor-beta 1 on human vocal fold fibroblasts.</a> Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 118 (3), 218-226 (2009).</li>
<li>Kishimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19746761">Effects of exogenous hepatocyte growth factor on vocal fold fibroblasts.</a> Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 118 (8), 606-611 (2009).</li>
<li>Belluardo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+disassembly+and+muscle+fatigue+in+mice+lacking+neurotrophin-4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction disassembly and muscle fatigue in mice lacking neurotrophin-4.</a> Mol. Cell. Neurosci. 18 (1), 56-57 (2001).</li>
<li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23671289">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanisms in the old rat.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li>
<li>Roscow, D. E., Parikh, P., Vivero, R. J., Casiano, R. R., Lundy, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+initial+dosing+of+botulinum+toxin+in+treatment+of+adductor+spasmodic+dysphonia%5BTitle%5D)+AND+%22Oto.+HeadNeck+Surg%22%5BJournal%5D)">Considerations for initial dosing of botulinum toxin in treatment of adductor spasmodic dysphonia.</a> Oto. HeadNeck Surg. 148 (6), 1003-1006 (2013).</li>
<li>Benninger, M. S., Hanick, A., Hicks, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cricothyroid+muscle+botulinum+toxin+injection+to+improve+airway+for+bilateral+recurrent+laryngeal+nerve+paralysis%2C+A+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Cricothyroid muscle botulinum toxin injection to improve airway for bilateral recurrent laryngeal nerve paralysis, A case series.</a> J. Voice. 30 (1), 96-99 (2016).</li>
<li>Coppoolse, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+study+of+composite+microgels+based+on+hyaluronic+acid+and+gelatin+for+the+reconstruction+of+surgically+injured+rat+vocal+folds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Speech+Lang+Hear+Res%22%5BJournal%5D)">An in vivo study of composite microgels based on hyaluronic acid and gelatin for the reconstruction of surgically injured rat vocal folds.</a> J. Speech Lang Hear Res. 57 (2), S658-S673 (2014).</li>
<li>Hertegård, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linked+hyaluronan+used+as+augmentation+substance+for+treatment+of+glottal+insufficiency%3A+Safety+aspects+and+vocal+fold+function%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Cross-linked hyaluronan used as augmentation substance for treatment of glottal insufficiency: Safety aspects and vocal fold function.</a> Laryngoscope. 112 (12), 2211-2219 (2002).</li>
<li>Walker, W. F. Jr, Homberger, D. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+WF+%22Anatomy+and+dissection+of+the+rat%22">Anatomy and dissection of the rat</a>. , Third Edition, W.H. Freeman and Company. New York. (1997).</li>
<li>Ohno, T., Hirano, S., Rousseau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+the+expression+and+deposition+of+vocal+fold+collagen+and+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oto.+Rhinol.+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in the expression and deposition of vocal fold collagen and hyaluronan.</a> Ann. Oto. Rhinol. Laryngol. 25 (1), 192-197 (2009).</li>
<li>Stemple, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+aging+rat+laryngeal+muscles+with+endogenous+growth+factor+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Enhancement of aging rat laryngeal muscles with endogenous growth factor treatment.</a> Physiol. Rep. 4 (10), e12798(2016).</li>
<li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+dysfunction+and+altered+metabolic+profile+of+the+aging+rat+thyroarytenoid+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Contractile dysfunction and altered metabolic profile of the aging rat thyroarytenoid muscle.</a> J. Appl. Phys. 100 (2), 602-608 (2006).</li>
<li>Engle, W. K., Cunningham, G. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14079951">Rapid examination of muscle tissue. An improved trichrome method for fresh-frozen biopsy section.</a> Neurology. (13), 919-923 (1963).</li>
<li>Sheehan, D. C., Hrapchack, B. B. Theory and practice of histotechnology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+DC+%22Battelle%22">Battelle</a>. , Columbus, OH. (1980).</li>
<li>Kulakowski, S. A., Parker, S. D., Personius, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+TrkB+expression+results+in+precocious+age-like+changes+in+neuromuscular+structure%2C+neurotransmission%2C+and+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Reduced TrkB expression results in precocious age-like changes in neuromuscular structure, neurotransmission, and muscle function.</a> J. Appl. Phys. 111 (3), 844-852 (2011).</li>
<li>Nishida, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23100084">Age-related change in rat intrinsic laryngeal muscles: analysis of muscle fibers, muscle fiber proteins and subneural apparatuses.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (3), 975-984 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mięśnie krtani są podatne na niekorzystne skutki starzenia. Poprzednie badania wykazały zmiany w starzeniu się mięśni krtani, które obejmują zmiany wielkości włókien, całkowitej liczby włókien, zdolności regeneracyjnych, zmian wielkości i ilości NMJ, a także zmiany funkcji skurczu i przesunięć izoformy miozyny 4,11,27,30,31 . Starzenie się mięśni krtani może ...

Mięśnie krtani kurczą się szybko i konsekwentnie, i są podatne na niekorzystne skutki starzenia. Uważa się, że ta ciągła aktywność przyczynia się do problemów z głosem lub dysfagii obserwowanych u osób powyżej 65 roku życia 1,2,3,4,5,6,7. Kilka mechanizmów molekularnych i patofizjologicznych przyczynia się do tej dysfunkcji związanej z wiekiem. Mechanizmy te mogą obejmować przebudowę błony śluzowej krtani, zanik lub utratę włókien mięśniowych, brak regeneracji lub atrofię włókien mięśniowych, co powoduje wygięcie fałdów głosowych i niezdolność do zamykania głośni 8,9,10,11. W tej chwili nie ma sprawdzonej terapii medycznej, która mogłaby całkowicie zapobiec lub zrehabilitować te związane z wiekiem zmiany w tych mięśniach.
Modulacja skuteczności transmisji nerwowo-mięśniowej może znacznie wpłynąć na wydajność neuromotoryczną. Rodzina neurotrofin obejmuje czynnik wzrostu nerwów (NGF), czynnik wzrostu nerwów pochodzenia mózgowego (BDNF), neurotrofinę 3 (NTF3) i NTF4 12,13. Wykazano, że neurotrofiny modulują skuteczność synapsów1,4. Czynnik wzrostu hepatocytów, transformujący czynnik wzrostu beta i czynnik wzrostu fibroblastów są ostatnio stosowane u ludzi w leczeniu bliznowacenia fałdów głosowych 15-17. NTF4 reguluje również skuteczność NMJ; myszy bez NTF4 pokazują zdemontowane NMJ 11,18,19. Badania te prowadzą do obiecujących efektów leczenia starzejących się zaburzeń mięśni krtani i odnerwienia czynnikami wzrostu.
Bezpośrednie wstrzyknięcia do tkanek fałdów głosowych nie są bezprecedensowe u ludzi. Na przykład miejscowe iniekcje toksyny botulinowej są obecnie stosowane jako skuteczne leczenie neurologicznych zaburzeń ruchowych, które wpływają na mięśnie krtani, takich jak spazmatyczna dysfonia i obustronne nawracające porażenie nerwu krtaniowego 20,21. Hydrożel z kwasem hialuronowym to kolejny środek do wstrzykiwań, który jest stosowany w leczeniu straszenia fałdami głosowymi i niewydolności krtani 22,23. Laryngoplastyka iniekcyjna może być stosowana w leczeniu różnych zaburzeń komunikacji 24. Te metody bezpośredniego wstrzykiwania dają nadzieję na poprawę funkcji głosowych i połykania w starzejących się populacjach.

<table><tbody><tr><td>Neurotrofin 4</td><td>Pepro Tech</td><td>450-04</td><td>200 ng w 50 &mu; L</td></tr><tr><td>Pompa osmotyczna Alzet</td><td>DURECT Corporation</td><td>2001D</td><td></td></tr><tr><td>30 &deg; endoskop</td><td>Stoltz</td><td>61029D</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 30 miernik 100-&mu; L strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>84850 i 201812</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna (roztwór chlorku sodu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek ketaminy</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek ksylazyny</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Igła 25 G 5/8</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305901</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>maść okulistyczna</td><td>Henry Schein</td><td>8897</td><td></td></tr><tr><td>maszynki do strzyżenia</td><td>Oster</td><td>44-018</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Decon</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>jod (Betadine)</td><td>Purdue Pharma L.P.</td><td></td><td></td>606404</tr><tr><td>poduszka grzewcza</td><td>Sunbeam</td><td>731-5</td><td></td></tr><tr><td>5-0 nylonowa nić do szwów</td><td>AD Surgical</td><td>PMN-518R6</td><td></td></tr><tr><td>crile hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13005-14</td><td></td></tr><tr><td>delikatne kleszcze do wiązania szwów</td><td>Fine Science Tools</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>meloksykam</td><td>Henry Schein</td><td>49756</td><td></td></tr><tr><td>karprofen</td><td>Merritt Veterinary Supplies</td><td>148700</td><td></td></tr><tr><td>maść z antybiotykiem</td><td>Henry</td><td>Schein 57110</td><td></td></tr><tr><td>acepromizyna Aceproject</td><td>Henry Schein</td><td>3845</td><td></td></tr><tr><td>izofluran Isothesia</td><td>Henry Schein</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>skrzynka indukcyjna (skrzynka anestezjologiczna)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>50-0116</td><td></td></tr><tr><td>zbiornik sprężonego tlenu</td><td>Scott Gross</td> Platforma z pleksiglasu <td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Small Parts Inc (Amazon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszcze z gumową końcówką</td><td>Guma do narzędzi naukowych</td><td>11075-00</td><td></td></tr><tr><td>płynna guma do kleszczy powyżej</td><td>plastikowego widma Lowe's</td><td>42518</td><td></td></tr><tr><td>(strzykawka BD przycięta na długość)</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>halogenowe źródło światła nosorożecowo-krtaniowego stroboskop</td><td>Kay-Pentax</td><td>RLS 9100 B</td><td></td></tr><tr><td>magnetowid</td><td>Kay-Pentax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr> sól <tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>kriostat Mictotom HM525</td><td>Thermo Scientific</td><td>HM 525</td><td></td></tr><tr><td>Gill 1 hematoksylina</td><td>VWR</td><td>10143-142</td><td></td></tr><tr><td>Shandon eozyna-Y alkoholowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6766007</td><td></td></tr><tr><td>kanał antysodowy przeciwciało Nav1.5 wytwarzane u królika</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0819</td><td></td></tr><tr><td>Texas red-X falloidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>alfa-bungarotoksyna alexa fluor 488 koniugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B-13422</td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie małych zwierząt maszyna</td><td>Smiths Medical</td><td>CDS 9000</td><td></td></tr></tbody></table>

podskórny wlew neurotrofiny 4 za pomocą pomp osmotycznych lub bezpośredniego wstrzyknięcia mięśniowego poprawia starzenie się mięśni krtani szczura

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Dysfunkcja krtani u osób starszych jest główną przyczyną niepełnosprawności, od zaburzeń głosu po dysfagię i utratę odruchów ochronnych dróg oddechowych. Istnieje niewiele, jeśli w ogóle, terapii, które są ukierunkowane na dysfunkcję mięśni krtani związaną z wiekiem. Neurotrofiny biorą udział w unerwieniu mięśni i różnicowaniu połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ). Uważa się, że neurotrofiny zwiększają przekaźnictwo nerwowo-mięśniowe poprzez zwiększenie uwalniania neuroprzekaźników. Połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) stają się mniejsze i mniej obfite w starzejących się mięśniach krtani szczura, co świadczy o funkcjonalnym odnerwieniu. Zbadaliśmy wpływ NTF4 na przyszłe zastosowanie kliniczne jako środek terapeutyczny poprawiający funkcję starzejących się mięśni krtani ludzkiej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół stosowania ogólnoustrojowego i bezpośredniego wstrzykiwania NTF4 w celu zbadania zdolności starzejących się mięśni krtani szczura do przebudowy w odpowiedzi na aplikację NTF4. W tej metodzie szczury otrzymywały NTF4 albo ogólnoustrojowo za pomocą pompy osmotycznej, albo przez bezpośrednie wstrzyknięcie przez fałdy głosowe. Mięśnie krtani zostały następnie wypreparowane i wykorzystane do badania histologicznego morfologii i odnerwienia związanego z wiekiem.

Szczury zostały poddane eutanazji po 2 tygodniach infuzji z pompy osmotycznej lub 1 tygodniu po bezpośrednim wstrzyknięciu NTF4. Pobrano krtanie, umieszczono je w krioprotektorze (30% sacharozy i 70% soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo), a następnie wykonano seryjne cięcia o grubości 10- µm za pomocą kriostatu. Mięśnie krtani u starszych osobników reagują na podanie NTF4 25. Oprócz porównania młodych i starych szczurów, zestawiono ze sobą stronę wstrzyknięt...

Tutaj prezentujemy protokół opisujący zastosowanie neurotrofiny 4 (NTF4) systemowo i bezpośrednio do przebudowy starzejących się mięśni krtani u szczurów.

Podskórny wlew neurotrofiny 4 za pomocą pomp osmotycznych lub bezpośredniego wstrzyknięcia mięśniowego poprawia starzenie się mięśni krtani szczura

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest dostarczenie neurotrofiny 4 w celu indukcji przebudowy mięśni krtani u starzejących się szczurów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji mięśni krtani, na przykład, czy zanik mięśni związany z wiekiem może zostać odwrócony w celu poprawy funkcji głosu.Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej łatwego przełożenia na ludzkie modele starzenia się krtani. Możemy zastosować metody iniekcyjne typowo używane przez lekarzy otolaryngologów u ludzi, aby podać roztwory niezbędne do poprawy funkcji głosu. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie będą napotykać trudności ze względu na delikatność procedur implantacji i iniekcji.Procedurę zademonstrują Tanya Seward, technik z wydziału fizjologii oraz Richard Andreatta, profesor nadzwyczajny w zakresie nauk o komunikacji i zaburzeniach, oboje z University of Kentucky. Aby zaimplantować pompę, najpierw umieść szczura w pozycji brzusznej w aseptycznym obszarze chirurgicznym. Zwilż grzbiet i szyję jodynem.Następnie przemyj grzbietną stronę szyi 70% etanolem. Potem przenieś zwierzę na podkładkę grzewczą o temperaturze 34 °C i podaj lek przedznieczulający. Wypełnij przygotowane aseptycznie pompy osmotyczne 50 µL Neurotrophin 4.Następnie za pomocą skalpela wykonaj poziome nacięcie skóry o szerokości 2 cm, bezpośrednio za przestrzenią między łopatkami. Unieś tylną krawędź nacięcia pęsetą i delikatnie wprowadź końcówki kleszczyków hemostatycznych pod nacięcie. Gdy końcówka znajdzie się w odległości około 2 cm za nacięciem, otwórz ramiona kleszczyków, aby stworzyć pustą przestrzeń podskórnie w miejscu nacięcia.Wprowadź pompę do kieszonki, orientując koniec portu podawczego w taki sposób, aby zminimalizować jakąkolwiek inną interakcję między terapią a gojeniem się miejsca nacięcia kieszonki. Następnie, używając nici nylonowej 5-0, hemostatu i pęsety, zamknij nacięcie po umieszczeniu pompy i monitoruj zwierzę, aż odzyska pełną przytomność i zdolność poruszania się. Na 30 minut przed iniekcją ogrzej aseptycznie przygotowane dawki 50 µL neurotrofiny lub soli fizjologicznej w kąpieli wodnej o temperaturze 25 °C.Po przygotowaniu preparatów ułożyć znieczuplonego szczura w pozycji grzbietnej na platformie z pleksiglasu i za pomocą drutu prowadzącego zawiesić zwierzę za górne siekacze przednie. Następnie przymocować strzykawkę o rozmiarze 30 G, długości 50 mm i objętości 100 µL do endoskopu zatokowego o średnicy 1,9 mm i kącie 30 stopni. Cały zestaw ze strzykawką należy przymocować do uchwytu na zewnętrznej ściance endoskopu.Po zabezpieczeniu strzykawki należy nabrać preparat do leczenia i podłączyć zestaw endoskopowy do kamery. Następnie, używając kleszczyków z gumowymi końcówkami, należy odsunąć język na bok i wprowadzić plastikowe wzierniki, aby utrzymać drożność jamy ustnej. Na koniec należy włączyć halogenowe źródło światła endoskopu.Przy włączonym rejestratorze wideo zanurz dystalny koniec endoskopu w ciepłej wodzie na kilka sekund, aby zminimalizowaćy powstawanie kondensacji na szklanej końcówce. Następnie ostrożnie wprowadź igłę w obszar lewej fałdy głosowej, kierując się informacją wizualną z monitora. Gdy fałda głosowa będzie w pełni widoczna, wprowadź igłę do lewej części bocznej chrząstki tarczowo-nalewkowej, bocznie w stosunku do białej, przyśrodkowej krawędzi fałdy głosowej.Następnie naciśnij tłok, aby podać preparat. Jeśli nagłośnia pozostaje zamknięta, uniemożliwiając wyraźny wgląd w krtani, wykonaj końcówką strzykawki ruchy w górę, aby delikatnie odsunąć tkankę. Następnie wyjmij igłę i umieść zwierzę w jego klatce domowej na podkładce grzewczej do momentu pełnego powrotu do sprawności.Zazwyczaj u zwierząt traktowanych Neurotrofiną 4 z wiekiem obserwuje się zmianę rozmiaru włókien. U starszych zwierząt traktowanych Neurotrofiną obserwuje się również niższy poziom włóknienia i generacji włókien. Jednocześnie zwiększona jest liczba złączeń nerwowo-mięśniowych.Po opanowaniu techniki, zarówno obsługa pompy osmotycznej, jak i procedura iniekcji mogą zostać wykonane w ciągu godziny, pod warunkiem ich prawidłowego przeprowadzenia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby posługiwać się igłą powoli i delikatnie, aby zapobiec zadrapaniom i uszkodzeniom w okolicy krtani. Choć metoda ta pozwala na zgłębienie mechanizmów funkcjonowania fałdów głosowych w procesie starzenia, może ona zostać zastosowana również w innych układach, takich jak gardło oraz w przypadku zaburzeń połykania.

subcutaneous-neurotrophin-4-infusion-using-osmotic-pumps-or-direct

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.

Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

Opisujemy procedury powtarzalnego podawania inhibitorów sygnalizacji muskarynowej do mięśnia dźwigacza małżowiny usznej (LAL) u młodych dorosłych myszy oraz późniejszego barwienia immunocytochemicznego jego złącz neuromięśniowych (NMJs) w preparatach całych organów. Mięsień LAL posiada wyjątkowe zalety w kontekście ujawniania farmakologicznych efektów in vivo w złączach NMJs.

Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych oraz potrójne barwienie immunocytochemiczne mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy

Źródło: Andreatta, R. D. et al., Podskórny wlew neurotrofiny 4 przy użyciu pomp osmotycznych lub bezpośredniego wstrzyknięcia mięśni poprawia starzenie się mięśni krtani szczura. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia infuzję neurotrofiny 4 (NTF4) w starzejącym się modelu szczurzym w celu przywrócenia funkcji mięśni krtani dotkniętej odnerwieniem związanym ze starzeniem się i zmniejszonymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi. NTF4 wyzwala regenerację nerwów i wspomaga tworzenie połączeń...

Napar Neurotrofiny 4 do regeneracji nerwu krtaniowego u starzejącego się szczura

Komórki otoczki węchowej (OEC) to komórki grzebienia nerwowego, które umożliwiają wzrost pierwotnych neuronów węchowych. Ta specyficzna właściwość może być wykorzystana do przeszczepu komórkowego. Przedstawiamy w niniejszej pracy model transplantacji komórkowej oparty na zastosowaniu OEC w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego.

Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Skuteczność domięśniowego wychwytu i wstecznego transportu cząsteczek do odpowiednich neuronów ruchowych zależy od lokalizacji miejsc wstrzyknięć w stosunku do płytek końcowych silnika (MEP). W tym miejscu opisujemy, jak zlokalizować MEP na mięśniach szkieletowych, aby zoptymalizować wsteczny transport znaczników do neuronów ruchowych.

Iniekcje domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych

Podskórne wszczepianie pomp osmotycznych zapewnia wygodne podejście do długotrwałego i konsekwentnego dostarczania związków. Podejście to było szeroko stosowane do badania tętniaków aorty brzusznej i piersiowej u myszy.

Podskórny wlew angiotensyny II za pomocą pomp osmotycznych indukuje tętniaki aorty u myszy

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania autologicznych komórek macierzystych pochodzących z mięśni w pobliżu nawrotnego nerwu krtaniowego za pomocą elektrycznego stymulatora nerwów. Ta nowatorska technika może stać się przydatna w leczeniu nawracającej neuropatii krtani koni.

Wstrzyknięcie autologicznych komórek macierzystych pod sterowaniem stymulatorem nerwów w pobliżu lewego nerwu krtaniowego wstecznego konia

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji wszczepialnego systemu do chronologicznego zapisu in vivo wywołanych i spontanicznych potencjałów elektromiograficznych. System jest stosowany do badania unerwienia mięśni krtani po uszkodzeniu nerwów.

Wszczepialny system do przewlekłej elektromiografii in vivo

Ten protokół opisuje metody używane do przygotowania fałdów głosowych szczurów do histochemicznego badania nerwowo-mięśniowego.

Przygotowanie fałdu głosowego szczura do analiz nerwowo-mięśniowych

Tutaj prezentujemy protokół, który łączy elektroporację in vivo i denerwację mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL). Zabieg ten umożliwia badanie potencjalnej roli białek pochodzenia mięśniowego w regeneracji synapsy nerwowo-mięśniowej.

Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

Przedstawiamy protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego u szczurów, umożliwiający dostarczanie leku bezpośrednio do nerwu bez powikłań po wstrzyknięciu. Metoda ta ma zastosowanie w przedklinicznych badaniach neurologicznych obejmujących manipulację autonomicznego układu nerwowego. Może być stosowany do bezpośredniego wstrzykiwania nerwów dla innych nerwów u szczurów i innych gatunków, z niezbędnymi modyfikacjami.

Protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego dla szczurów

Poznaj metodę podawania Neurotrophin 4 w celu remodelowania starzejących się mięśni krtani szczura za pomocą pomp osmotycznych i wstrzyknięć. Technika ta poprawia funkcję głosową i ma potencjał zastosowania klinicznego.

Podskórny wlew neurotrofiny 4 za pomocą pomp osmotycznych lub bezpośredniego wstrzyknięcia mięśniowego poprawia starzenie się mięśni krtani szczura (Wideo) | JoVE Journal

Podskórny wlew neurotrofiny 4 za pomocą pomp osmotycznych lub bezpośredniego wstrzyknięcia mięśniowego poprawia starzenie się mięśni krtani szczura

Przeglądaj więcej filmów