Name: Oceny neurobehawioralne w mysim modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę oceny neurobehawioralnej w mysim modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków. Technika ta umożliwia badanie funkcji motorycznych i poznawczych po zabiegu okluzji tętnicy szyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z National Research Foundation (NRF-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), Ministerstwa Nauki i Technologii, Republiki Korei, Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych (HI16C1012), Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej, Republiki Korei, oraz Programu Pomocy Badawczej Wydziału "Dongwha" Kolegium Medycznego Uniwersytetu Yonsei (6-2016-0126).

Wszystkie zwierzęta były utrzymywane w standardowych klatkach (27 × 2,5 × 14 cm3) w placówce akredytowanej przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) i miały dostęp do pożywienia i wody ad libitum w cyklach 12-godzinnego światła i ciemności. Autorzy przestrzegali przepisów dotyczących ochrony zwierząt, a procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee przy Yonsei University College of Medicine (IACUC nr 2010-0252; 2013-020).
1. Myszowy model noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia mózgu
<ol>
	<li>Zanurz szczenięta w znieczuleniu izofluranem.
	<ol>
		<li>Umieść szczenięta (mniej niż 5) w komorze do znieczulania i zamknij pokrywę.</li>
		<li>Włącz system znieczulający na około 15 min; dostosuj dopływ gazu i izofluranu za pomocą stacjonarnego aparatu do znieczulania. Ustaw przepływomierz tlenu na 1.5 L/min. Ustaw parownik izofluranu na 3-5% w celu indukcji znieczulenia.</li>
		<li>Po 15 min ustaw parownik izofluranu na 1-2% w celu podtrzymania znieczulenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połóż całkowicie znieczulone szczenię pod mikroskopem sekcyjnym (brzuchem w stronę badacza) i zabezpiecz je taśmą.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie o długości ~0.7 mm w okolicy szyi za pomocą wysterylizowanych nożyczek.</li>
	<li>Ostrożnie usuń tkankę tłuszczową za pomocą wysterylizowanej pęsety i odsłoń prawą tętnicę szyjną.</li>
	<li>Podwiąż prawą tętnicę szyjną przy użyciu wchłanialnej nici chirurgicznej 5-0.</li>
	<li>Zszyj nacięcie na szyi nicią 5-0.</li>
	<li>Umieść każde szczenię w ogrzewanej do 37 °C komorze hipoksycznej na 1 h w celu rekonwalescencji. Nie zamykaj pokrywy komory.</li>
	<li>1 h po zabiegu, gdy szczenięta całkowicie się obudzą, zamknij pokrywę komory hipoksycznej i obniż poziom gazów, aby wytworzyć warunki hipoksji (8% O2 i 92% N2).</li>
	<li>Po 90 min hipoksji przenieś szczenięta z powrotem do klatek.</li>
	<li>Tydzień po urazie mózgu wywołanym HI powtórz krok 1.
	<ol>
		<li>Po znieczuleniu wykonaj nacięcie skóry głowy wysterylizowanymi nożyczkami i pęsetą, aby zidentyfikować uszkodzenie mózgu w obszarze posterolateralnym prawej półkuli. 
		Uwaga: Zabieg ten indukuje hipoksję u szczeniąt. Obecność i zakres uszkodzenia mózgu u wszystkich myszy są oceniane wizualnie gołym okiem przez półprzezroczystą czaszkę. Szczenięta są klasyfikowane do grup na podstawie rozmiaru lub objętości odbarwienia (tj. uszkodzenia mózgu). Jeśli nie ma widocznego uszkodzenia kory, mysz zostaje zaklasyfikowana do grupy „bez uszkodzenia kory”. Jeśli widoczne jest uszkodzenie kory (tj. zmiana w prawej półkuli), mysz zostaje zaklasyfikowana do grupy „z uszkodzeniem kory”. Ponieważ klasyfikacja myszy do grup odbywa się tydzień po operacji, podziały na grupy mogą zostać zmodyfikowane po dokładnym określeniu morfologii próbek mózgu w momencie uboju1,2,3,4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Chirurgia gryzoni; obrazy mózgu i MRI; monitor tlenu; eksperyment z zakresu neuronauki; wyniki analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55838/55838fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Modelowanie noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia (HI) mózgu u myszy. 
(A) Siedmiodniowe szczenię myszy zostało poddane zabiegowi chirurgicznemu, podczas którego wykonano podwiązanie prawej tętnicy szyjnej jednostronnie. (B) Szczenięta umieszczono w komorze hipoksycznej na 90 min przy stężeniu O2 wynoszącym 8%.2 oraz 92% N2(C, D i E) Mózgi z neonatalnym niedokrwieniem i niedotlenieniem (HI) wykazywały różny stopień nasilenia uszkodzeń i zostały skategoryzowane na podstawie stopnia ich zaawansowania. W 14. tygodniu pobrano mózgi i zwizualizowano zmiany chorobowe. (C) Obraz mózgu zaklasyfikowanego do grupy „bez uszkodzenia kory”. Zarówno (D), jak i (E) zostały zaklasyfikowane do grupy „uszkodzenia kory”. (F, G i H) Reprezentatywne obrazy MRI odpowiednio dla myszy (C), (D) i (E). (F) Uszkodzenie w hipokampie zaznaczono żółtą strzałką; zmiany w prawej półkuli również zaznaczono żółtymi strzałkami (G i H). Paski skali = 1 mm  <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55838/55838fig1v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Neonatalne testy behawioralne
Uwaga: W tym przypadku testy behawioralne przeprowadzono w 6. tygodniu życia.
<ol>
	<li>Zadanie unikania biernego (PAT). 
	UWAGA: Aby ocenić funkcję pamięci w oparciu o uczenie się i unikanie bodźca awersyjnego, należy przeprowadzić dwukomorowy test PAT z przejściem13,14,15,16.
	<ol>
		<li>Umieść mysz w jasnej komorze pleksiglasowej skrzynki transportowej (41,5 × 21 × 35 cm3) aparatury PAT.</li>
		<li>Po 30 s otwórz drzwi gilotynowe i zarejestruj czas latencji do momentu przejścia myszy do ciemnej komory (do 30 s).</li>
		<li>Zamknij drzwi gilotynowe, gdy wszystkie cztery kończyny myszy znajdą się całkowicie w ciemnej komorze.</li>
		<li>Podaj wstrząs elektryczny w stopę (0,5 mA) przez 2 s, a następnie zwróć mysz do klatki.</li>
		<li>Ponownie umieść mysz w jasnej komorze 24 h po podaniu wstrząsu elektrycznego.</li>
		<li>Otwórz drzwi gilotynowe 10 s po całkowitym umieszczeniu myszy w jasnej komorze i zarejestruj czas latencji do momentu przejścia myszy do ciemnej komory (do 30 s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test chodzenia po drabinie. 
	UWAGA: Zadanie chodzenia po szczeblach drabiny pozwala na rozróżnienie subtelnych zaburzeń funkcji motorycznych poprzez połączenie jakościowych i ilościowych analiz umiejętnego chodzenia17,18.
	<ol>
		<li>Włącz kamerę wideo.</li>
		<li>Umieść mysz na panelu startowym drabiny i niezwłocznie rozpocznij nagrywanie.</li>
		<li>Nagraj wideo, skupiając się na kończynach myszy.</li>
		<li>Zatrzymaj nagrywanie, gdy mysz dotknie ostatniego panelu drabiny. Powtórz przejście w obie strony cztery razy.</li>
		<li>Przeanalizuj nagranie wideo i ręcznie policz liczbę poślizgnięć każdej przedniej kończyny w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Odtwórz nagranie wideo na komputerze z małą prędkością (0,1x) i policz kroki ręcznie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test siły chwytu. 
	UWAGA: Test siły chwytu wykonuje się za pomocą miernika siły chwytu, który zawiera przetwornik siły typu push-pull.
	<ol>
		<li>Przymocuj aparaturę do pomiaru siły chwytu do akrylowego panelu.</li>
		<li>Umieść mysz na akrylowym panelu i przytrzymaj ją za ogon.
		<ol>
			<li>Przesuń rękę trzymającą ogon tak, aby mysz mogła dosięgnąć i chwycić metalowy drut aparatury.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj kilka prób, aż mysz chwyci trójkątny kawałek metalowego drutu (o średnicy 2 mm); szczytowa siła jest automatycznie rejestrowana przez aparaturę w gramach. 
		UWAGA: Do analizy wykorzystaj średnią szczytową siłę z trzech prób19,20,21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yager, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+newborn%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Animal models of hypoxic-ischemic brain damage in the newborn.</a> Semin Pediatr Neurol. 11 (1), 31-46 (2004).</li>
<li>Vannucci, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+model+of+perinatal+hypoxic-ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage.</a> J Neurosci Res. 55 (2), 158-163 (1999).</li>
<li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+striatal+neurogenesis+enhances+functional+recovery+in+an+adult+animal+model+of+neonatal+hypoxic-ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Induction of striatal neurogenesis enhances functional recovery in an adult animal model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury.</a> Neuroscience. 169 (1), 259-268 (2010).</li>
<li>Clowry, G. J., Basuodan, R., Chan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+Best+Animal+Models+for+Testing+Early+Intervention+in+Cerebral+Palsy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">What are the Best Animal Models for Testing Early Intervention in Cerebral Palsy?</a> Front Neurol. 5 (258), 1-17 (2014).</li>
<li>Colver, A., Fairhurst, C., Pharoah, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+palsy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cerebral palsy.</a> Lancet. 383 (9924), 1240-1249 (2014).</li>
<li>Levine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxic-ischemic+encephalopathy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Anoxic-ischemic encephalopathy in rats.</a> Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).</li>
<li>Rice 3rd, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Ann Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).</li>
<li>Lafemina, M. J., Sheldon, R. A., Ferriero, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hypoxia-ischemia+results+in+hydrogen+peroxide+accumulation+in+neonatal+but+not+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Acute hypoxia-ischemia results in hydrogen peroxide accumulation in neonatal but not adult mouse brain.</a> Pediatr Res. 59 (5), 680-683 (2006).</li>
<li>Brazel, C. Y., Rosti 3rd, R. T., Boyce, S., Rothstein, R. P., Levison, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+hypoxia%2Fischemia+damages+and+depletes+progenitors+from+the+mouse+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal hypoxia/ischemia damages and depletes progenitors from the mouse subventricular zone.</a> Dev Neurosci. 26 (2-4), 266-274 (2004).</li>
<li>Buono, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mouse+neural+precursor+expansion+after+neonatal+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mouse neural precursor expansion after neonatal hypoxia-ischemia.</a> J Neurosci. 35 (23), 8855-8865 (2015).</li>
<li>Rumajogee, P., Bregman, T., Miller, S. P., Yager, J. Y., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+Hypoxia-Ischemia+Models+for+Cerebral+Palsy+Research%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rodent Hypoxia-Ischemia Models for Cerebral Palsy Research: A Systematic Review.</a> Front Neurol. 7 (57), 1-20 (2016).</li>
<li>Hagberg, H., Peebles, D., Mallard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+white+matter+injury%3A+comparison+of+infectious%2C+hypoxic-ischemic%2C+and+excitotoxic+insults%5BTitle%5D)+AND+%22Ment+Retard+Dev+Disabil+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Models of white matter injury: comparison of infectious, hypoxic-ischemic, and excitotoxic insults.</a> Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 8 (1), 30-38 (2002).</li>
<li>Wi, S., Yu, J. H., Kim, M., Cho, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Expression+of+Reprogramming+Factors+Increases+Hippocampal+Neurogenesis+and+Synaptic+Plasticity+in+Chronic+Hypoxic-Ischemic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">In Vivo Expression of Reprogramming Factors Increases Hippocampal Neurogenesis and Synaptic Plasticity in Chronic Hypoxic-Ischemic Brain Injury.</a> Neural Plast. 2016 (2580837), 1-11 (2016).</li>
<li>Lu, Y., Christian, K., Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF%3A+a+key+regulator+for+protein+synthesis-dependent+LTP+and+long-term+memory%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">BDNF: a key regulator for protein synthesis-dependent LTP and long-term memory?</a> Neurobiol Learn Mem. 89 (3), 312-323 (2008).</li>
<li>Manabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+long-term+potentiation+and+memory+in+mice+lacking+nociceptin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Facilitation of long-term potentiation and memory in mice lacking nociceptin receptors.</a> Nature. 394 (6693), 577-581 (1998).</li>
<li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF-triggered+events+in+the+rat+hippocampus+are+required+for+both+short-+and+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">BDNF-triggered events in the rat hippocampus are required for both short- and long-term memory formation.</a> Hippocampus. 12 (4), 551-560 (2002).</li>
<li>Seo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Pluripotency+Factor+Expression+Promotes+Functional+Recovery+From+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">In Situ Pluripotency Factor Expression Promotes Functional Recovery From Cerebral Ischemia.</a> Mol Ther. 24 (9), 1538-1549 (2016).</li>
<li>Kim, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+enhances+synaptic+plasticity+by+internalization+of+striatal+dopamine+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment enhances synaptic plasticity by internalization of striatal dopamine transporters.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (12), 2122-2133 (2015).</li>
<li>Lee, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+synaptic+activity-regulating+genes+underlying+functional+improvement+by+long-term+exposure+to+an+enriched+environment+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Alteration of synaptic activity-regulating genes underlying functional improvement by long-term exposure to an enriched environment in the adult brain.</a> Neurorehabil Neural Repair. 27 (6), 561-574 (2013).</li>
<li>Rha, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+constraint-induced+movement+therapy+on+neurogenesis+and+functional+recovery+after+early+hypoxic-ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of constraint-induced movement therapy on neurogenesis and functional recovery after early hypoxic-ischemic injury in mice.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (4), 327-333 (2011).</li>
<li>Chong, H. J., Cho, S. R., Jeong, E., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finger+exercise+with+keyboard+playing+in+adults+with+cerebral+palsy%3A+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exerc+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Finger exercise with keyboard playing in adults with cerebral palsy: A preliminary study.</a> J Exerc Rehabil. 9 (4), 420-425 (2013).</li>
<li>Chong, H. J., Cho, S. R., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand+rehabilitation+using+MIDI+keyboard+playing+in+adolescents+with+brain+damage%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRehabilitation%22%5BJournal%5D)">Hand rehabilitation using MIDI keyboard playing in adolescents with brain damage: a preliminary study.</a> NeuroRehabilitation. 34 (1), 147-155 (2014).</li>
<li>Seo, J. H., Yu, J. H., Suh, H., Kim, M. S., Cho, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor-2+induced+by+enriched+environment+enhances+angiogenesis+and+motor+function+in+chronic+hypoxic-ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor-2 induced by enriched environment enhances angiogenesis and motor function in chronic hypoxic-ischemic brain injury.</a> PLoS One. 8 (9), e74405(2013).</li>
<li>Washington, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+injury+severity+on+behavior%3A+a+phenotypic+study+of+cognitive+and+emotional+deficits+after+mild%2C+moderate%2C+and+severe+controlled+cortical+impact+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">The effect of injury severity on behavior: a phenotypic study of cognitive and emotional deficits after mild, moderate, and severe controlled cortical impact injury in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (13), 2283-2296 (2012).</li>
<li>Cho, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+Activation+by+an+Enriched+Environment+after+Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Enhances+Angiogenesis+after+Hypoxic-Ischemic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Astroglial Activation by an Enriched Environment after Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Enhances Angiogenesis after Hypoxic-Ischemic Brain Injury.</a> Int J Mol Sci. 17 (9), 1-15 (2016).</li>
<li>Tsuji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+reproducible+model+of+neonatal+stroke+in+mice%3A+comparison+with+a+hypoxia-ischemia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel reproducible model of neonatal stroke in mice: comparison with a hypoxia-ischemia model.</a> Exp Neurol. 247, 218-225 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

W tym badaniu wywołaliśmy uszkodzenie mózgu HI u noworodka myszy P7-10 CD-1 i zidentyfikowaliśmy uszkodzenie mózgu z odpowiednimi deficytami poznawczymi i motorycznymi. Podczas tego zabiegu krytyczne było zamknięcie jednostronnej prawej tętnicy szyjnej. Na tym etapie tętnica może zostać uszkodzona i rozerwana. Większość szczeniąt, które doświadczyły pęknięcia tętnicy, zmarła. I odwrotnie, jeśli naukowcy podwiązali inną żyłę krwionośną zamiast jednostronnej prawej tętnicy szyjnej, mózg szczeniaka był tylko nieznacznie usz...

Noworodkowe uszkodzenie mózgu HI występuje we wczesnym dzieciństwie (około dwóch pacjentów na 1 000 dzieci)1,2,3,4,5. Badania dotyczące uszkodzenia mózgu u noworodków z przewrotu kości są ważne, a wykorzystanie uznanego mysiego modelu uszkodzenia mózgu u noworodków z przechodnim może ułatwić badania przedkliniczne in vivo nad uszkodzeniem mózgu w postaci hi.
Tradycyjne modele HI są używane na dorosłych szczurach6. W przypadku modelu noworodków metoda Rice'a-Vannucciego jest powszechnie stosowana u szczurów P77,8. Ponieważ jednak szczury i myszy są nieco różne9,10, mimo że oba są gryzoniami, przeprowadziliśmy zmodyfikowaną metodę Rice'a-Vannucciego na szczeniętach CD-1 w P7-10, w oparciu o wcześniejsze badania, które wykazały, że P7-10 to okres z niedojrzałymi oligodendrocytami, odpowiadający ludzkiemu terminowi P011,12. Mysi model HI u noworodków ustala się zarówno poprzez podwiązanie jednostronnej tętnicy szyjnej, jak i narażenie myszy na niedotlenienie 8% tlenem u szczeniąt P7-10.
Myszy poddane zabiegowi wykazywały różne stopnie uszkodzeń mózgu w tylno-bocznej części prawej półkuli. W celu zidentyfikowania deficytów poznawczych i motorycznych przeprowadzono oceny neurobehawioralne oparte na PAT, teście chodzenia po drabinie i teście siły chwytu. Przeanalizowano różnice między myszami nieoperowanymi (tj. Normalnymi) i HI. W pracy przedstawiono podstawowe informacje na temat modelu myszy HI. Obrazy MRI pokazują różne fenotypy, oddzielone w zależności od ciężkości uszkodzeń mózgu za pomocą testów motorycznych i poznawczych.

<table><tbody><tr><td>Komora hipoksyjna</td><td>Jeung Do Bio & Plant Co</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura PAT</td><td>Jeung Do Bio & Plant Co</td><td>Eksperymentalny budowniczy</td><td></td></tr><tr><td>Szczebel drabiny chodzący</td><td>Jeung Do Bio & Plant Co</td><td>Eksperymentalny budowniczy</td><td></td></tr><tr><td>SDI System siły chwytu</td><td>San Diego Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miernik siły chwytu</td><td>Ugo Basile</td><td>47200</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus System anestezjologiczny Fluovac&nbsp;</td><td>Aparat Harvard Pudełko</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>anestezjologiczne</td><td>Pudełko akrylowe</td></tr><tr><td>Fran Liquid (Isofluoran)</td> <td>Hana Pharm. Co., Ltd.</td><td></td><td>Znieczulenie ogólne ( izofluran 100ml)</td></tr> <tr><td>Myszy CD-1</td><td>Orient Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niebieski nylonowy mono niewchłanialny szew 5-0 50cm</td><td>Ailee Co., Ltd.</td><td>NB 521</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics</td><td>IBM</td><td>Ver. 23</td><td></td></tr></tbody></table>

oceny neurobehawioralne w mysim modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

Przeprowadziliśmy jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej na myszach CD-1, aby stworzyć model niedotlenienia niedotlenienia (HI) u noworodków i zbadaliśmy skutki uszkodzenia mózgu u noworodków, badając funkcje neurobehawioralne u tych myszy w porównaniu do myszy nieoperowanych (tj. normalnych). Podczas badania metodę Rice-Vannucci zastosowano w celu wywołania uszkodzenia mózgu u noworodków w wieku 7-10 dni (P7-10) myszy. Operację HI przeprowadzono na szczeniętach poprzez jednostronne podwiązanie tętnicy szyjnej i narażenie na niedotlenienie (8% O2 i 92% N2 przez 90 min). Tydzień po operacji uszkodzone mózgi oceniano gołym okiem przez półprzezroczystą czaszkę i podzielono na podgrupy na podstawie braku (grupa "brak uszkodzenia kory") lub obecności (grupa "uszkodzenie kory") uszkodzenia kory mózgowej, takiego jak zmiana w prawej półkuli. W 6 tygodniu przeprowadzono następujące testy neurobehawioralne w celu oceny funkcji poznawczych i motorycznych: zadanie pasywnego unikania (PAT), test chodzenia po drabinie i test siły chwytu. Te testy behawioralne są pomocne w określaniu skutków uszkodzenia mózgu u noworodków i są stosowane w innych mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych. W tym badaniu noworodki myszy z uszkodzeniem mózgu HI wykazywały deficyty motoryczne, które odpowiadały uszkodzeniu prawej półkuli. Wyniki testów behawioralnych są istotne dla deficytów obserwowanych u pacjentów z HI u noworodków, takich jak porażenie mózgowe lub pacjenci z udarem noworodkowym. W tym badaniu ustalono mysi model uszkodzenia mózgu u noworodków, który wykazał różne stopnie deficytów motorycznych i upośledzenia funkcji poznawczych w porównaniu z myszami nieoperowanymi. Ta praca zawiera podstawowe informacje na temat modelu myszy HI. Obrazy MRI pokazują różne fenotypy, oddzielone w zależności od stopnia uszkodzenia mózgu za pomocą testów motorycznych i poznawczych.

Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). Porównanie zmiennych między dwiema grupami przeprowadzono za pomocą niezależnego lub parowanego testu t w programie statystycznym SPSS. Wartość p &lt;0,05 uznano za istotną statystycznie.
Mózgi z noworodkowym niedotlenieniem i niedokrwieniem (HI) wykazywały różny stopień nasilenia uszkodzeń i zostały odpowiednio sklasyfikowane (<strong...

Przeprowadziliśmy jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej w 7-10 dniu po urodzeniu mysich szczeniąt CD-1, aby stworzyć model niedotlenienia niedotlenienia (HI) noworodka i zbadaliśmy skutki uszkodzenia mózgu HI. Badaliśmy funkcje neurobehawioralne u tych myszy w porównaniu z normalnymi myszami, które nie były operowane.

Oceny neurobehawioralne w mysim modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

Ogólnym celem operacji wywołania niedotlenienia i niedokrwienia mózgu noworodka, po której następują testy poznawcze i motoryczne, jest stworzenie modelu mysiego do badania takich urazów oraz związanych z nimi uszkodzeń mózgu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące niedotlenienia i niedokrwienia mózgu noworodka, takie jak wpływ tych urazów na funkcje motoryczne i poznawcze. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona dobrze znana i powszechnie stosowana.Jest to również model przedkliniczny dla mózgowego porażenia dzieci oraz udarów noworodkowych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ jednostronna prawa tętnica szyjna jest trudna do zidentyfikowania. Procedurę będzie demonstrować wraz ze mną Yoon-Kyum Shin, doktorant z naszego laboratorium.Po znieczuleniu co najmniej pięciu mysich piskląt w wieku P7, należy umieścić pisklę pod mikroskopem sekcyjnym brzuchem do góry. Następnie należy oczyścić szyję alkoholem. Aby rozpocząć zabieg, należy użyć nożyczek do wykonania nacięcia o długości 0,7 mm w obrębie szyi.Następnie, używając pęsety, ostrożnie usuń tkankę tłuszczową, aż do odsłonięcia prawej tętnicy szyjnej. Następnie, używając nici chirurgicznej 5-0, podwiąż prawą tętnicę szyjną. Teraz zaszyj nacięcie na szyi nylonem 5-0 i zdezynfekuj miejsce nacięcia.Następnie pozwolić szczeniętowi na regenerację w komorze hipoksyjnej o temperaturze 37°C z otwartą pokrywą przez około godzinę. Umieścić kolejną mysz po zabiegu chirurgicznym w komorze hipoksyjnej w celu regeneracji. Gdy wszystkie szczenięta będą w pełni rozbudzone, zamknąć pokrywę komory i obniżyć poziom gazów, aby ustanowić warunki hipoksji.Po 90 minutach hipoksji należy przenieść młode szczury z uszkodzeniem mózgu z powrotem do klatek. Tydzień później przygotować młode szczury do operacji, w sposób opisany wcześniej, aby poszukać dowodów na wystąpienie uszkodzenia. Wykonać nacięcie skóry głowy, aby zidentyfikować zmianę w mózgu w tylno-bocznej części prawej półkuli.Przez półprzezroczystą czaszkę sprawdź obecność obrażeń kory oraz hipokampa. Następnie podziel szczenięta na grupę z obrażeniami oraz grupę kontrolną nieuszkodzoną. Po sprawdzeniu zamknij skórę głowy szwem i zdezynfekuj miejsce nacięcia.Gdy myszy osiągną wiek sześciu tygodni, należy ocenić ich pamięć w oparciu o proces uczenia się i unikania bodźca awersyjnego. Do tego zadania należy wykorzystać komercyjny, dwukomorowy aparat do testu pasywnego unikania (step-through). Na początek należy umieścić mysz w jasnej komorze pudełka na 30 sekund.Następnie otwórz drzwi między komorami i zarejestruj czas latencji zwierzęcia do wejścia do ciemnej komory. Na wykonanie zadania przeznacz do 300 sekund. Gdy wszystkie cztery kończyny myszy znajdą się całkowicie w ciemnej komorze, zamknij drzwi.Następnie podaj wstrząs elektryczny o natężeniu 1/2 mA w okolicy stopy przez dwie sekundy i zwróć mysz do klatki. Po 24 godzinach powtórz test. Tym razem pozwól myszy na pełne 300 sekund na wejście do ciemnej komory i nie podawaj wstrząsu.Przeprowadź test chodzenia po drabinie u sześciotygodniowych myszy, aby odróżnić subtelne zaburzenia funkcji motorycznych, stosując analizy jakościowe i ilościowe. Najpierw przygotuj aparat w postaci drabiny, a następnie ustaw kamerę wideo w celu rejestracji ruchów kończyn myszy na aparacie. Następnie umieść mysz na panelu startowym i rozpocznij nagrywanie za pomocą kamery wideo.Należy upewnić się, że kończyny są dobrze widoczne i w ostrości na nagraniu. Gdy mysz dotknie ostatniego panelu urządzenia w formie drabiny, należy zatrzymać nagrywanie. Następnie należy przenieść mysz z powrotem do panelu startowego i ponownie nagrać przejście myszy przez urządzenie.Powtórz tę czynność łącznie cztery razy dla każdej myszy w każdym dniu próby. Następnie, podczas analizy nagrania wideo, ręcznie policz liczbę poślizgów każdej kończyny, odtwarzając wideo z prędkością 1/10. Poślizgiem określa się sytuację, w której kończyna ześlizguje się pomiędzy prętami.Gdy myszy osiągną wiek sześciu tygodni, należy ocenić ich siłę chwytu. Należy użyć tensometru do pomiaru siły nacisku/rozciągania, wyposażonego w drut trójkątny o średnicy dwóch milimetrów, a całość przymocować do panelu. Myszą należy umieścić na panelu, trzymając ją za ogon.Następnie pozwól myszy dotrzeć przednimi kończynami do metalowego drutu. Gdy tylko mysz chwyci drut, delikatnie pociągnij ją za ogon, aż go puści. Aparatura zarejestruje szczytową siłę nacisku na drut w gramach.Powtórz ten test pięć razy przed zapewnieniem myszy odpoczynku. Podczas testu siły chwytu można zaobserwować wyraźne ruchy świadczące o prawidłowym wykonaniu próby. Postaraj się zarejestrować takie ruchy w ciągu pięciu prób przed odpoczynkiem myszy, który powinien trwać co najmniej jedną minutę, aby zmniejszyć zmęczenie mięśni.Po odpoczynku myszy trwającym co najmniej jedną minutę, powtórz serię pięciu prób. Następnie zapewnij myszy kolejną przerwę i przeprowadź serię po raz ostatni w danym dniu testowym. Do analizy wykorzystaj średnią z trzech najwyższych wyników dla jednej przedniej kończyny lub dla obu przednich kończyn.Po pobraniu mózgów od zwierząt z niedotlenieniem i niedokrwieniem w wieku 14 tygodni, dokonano oceny morfologicznej pod kątem braku uszkodzeń kory mózgowej, występowania uszkodzeń łagodnych lub ciężkich. Te same zwierzęta poddano badaniu MRI tydzień wcześniej, które okazało się również bardzo informacyjne. Nawet w mózgach prawidłowych morfologicznie stwierdzono łagodne uszkodzenia w obrębie hipokampa.W szóstym tygodniu życia, pięć tygodni po urazie, u myszy przeprowadzono ocenę za pomocą różnych zadań behawioralnych. Myszy z urazem hipoksyczno- Niedokrwiennym wykazywały upośledzenie poznawcze w 24-godzinnym teście unikania pasywnego. Ponieważ uszkodzona była tylko prawa półkula, u myszy stwierdzono hemiplegiczne zaburzenia funkcji motorycznych.Zostało to wykazane poprzez różnicę w procencie poślizgów na poprzecznych szczeblach drabiny dla każdej kończyny przedniej. Ponadto, ponieważ siła chwytu angażuje korę ruchową mózgu, grupy zwierząt zdrowych oraz z uszkodzeniem kory wykazały różnice w sile uścisku. Nie zaobserwowano różnic między grupą kontrolną a myszami bez uszkodzeń, natomiast u myszy z uszkodzeniami stwierdzono wyraźne upośledzenie funkcji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić ligację prawej tętnicy szyjnej w celu wywołania niedotlenienia i niedokrwienia u noworodków myszy oraz jak wykonać późniejszą analizę behawioralną. Należy zauważyć, że nawet jeśli siedem dni po urazie nie widać widocznych uszkodzeń kory mózgu, badanie MRI może wykazać uszkodzenie hipokampa. Ważne jest również, aby pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z młodymi myszami i przeprowadzaniu zabiegu chirurgicznego tak szybko, jak to możliwe.Młode szczury mają bardzo słabą i cienką skórę, dlatego należy zachować szczególną ostrożność.

neurobehavioral-assessments-mouse-model-neonatal-hypoxic-ischemic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Postnatalny model niedotlenienia i niedokrwienia mózgu u szczura jest uznanym modelem ludzkiej noworodkowej encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej (HIE). W niniejszym artykule opisujemy model HIE u postnatalnych szczurząt.

Model niedotlenienia i niedokrwienia mózgu w perinatalnym niedokrwieniu

Opracowaliśmy mysie modele leukomalacji okołokomorowej (PVL), która jest dominującym uszkodzeniem mózgu u wcześniaków, charakteryzującym się zmianami w istocie białej wokół komór. Głównymi przyczynami PVL są niedotlenienie i niedokrwienie, z towarzyszącą lub bez towarzyszącej infekcji systemowej. Jednostronne podwiązanie tętnicy szyjnej oraz ekspozycja na hipoksję, z wstrzyknięciem lipopolisacharydu lub bez, wywołują zmiany przypominające PVL u myszy w 6. dniu po urodzeniu (P6).

Modele mysie leukomalacji okołodomowej

Film demonstruje procedurę tworzenia modelu myszy do badania niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków. Przedstawia kroki chirurgicznego wywoływania niedokrwienia i poddawania zwierzęcia hipoksji w celu pogłębienia uszkodzenia mózgu. Na koniec pokazano, w jaki sposób można ocenić powstałe uszkodzenia mózgu, upewniając się, że model mysi jest przygotowany do dalszych badań naukowych.

Ustalenie mysiego modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków

Źródło: Ouyang, Y., i wsp. Jednoczesne obrazowanie PET/MRI podczas niedotlenienia mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia technikę oceny uszkodzenia niedotlenienia mózgu za pomocą jednoczesnej pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) i rezonansu magnetycznego (MRI). Znieczulona mysz przechodzi podwiązanie wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), zmniejszając przepływ krwi do jednej półkuli mózgu i predysponując ją do uszkodzenia wywołanego niedotlenieniem. Obrazowanie PET i MRI ocenia...

Obrazowanie uszkodzenia mózgu wywołanego niedotlenieniem-niedokrwieniem mózgu w modelu mysim

encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna po uduszeniu okołoporodowym może być badana na modelach zwierzęcych. Przedstawiono procedury niezbędne do ustalenia modelu encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków u prosiąt.

Model prosięcia encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków

Prezentowany jest zwięzły zestaw testów motorycznych noworodków na myszach. Za pomocą tych testów można wykazać deficyty motoryczne noworodków w różnych zaburzeniach motorycznych noworodków. Dysponując ustandaryzowanym zestawem testów, można porównywać wyniki różnych badań, co pozwala na lepsze i dokładniejsze raportowanie między grupami.

Zestaw testów motorycznych w mysim modelu mózgowego porażenia dziecięcego u noworodków

Opisujemy mysi model udaru wywołanego przez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej za pomocą szwu pokrytego silikonem. Protokół może być stosowany w celu wywołania trwałej okluzji lub tymczasowego niedokrwienia, a następnie reperfuzji.

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Ten manuskrypt opisuje metodę ciągłych zapisów wideo EEG przy użyciu wielu elektrod głębokościowych u noworodków myszy poddawanych niedotlenieniu-niedokrwieniu.

Ciągły elektroencefalogram wideo podczas niedotlenienia-niedokrwienia u nowonarodzonych myszy

Wstrząsy mózgu u dzieci mogą powodować długotrwałe następstwa z fizjologicznymi i psychologicznymi zaburzeniami. Ten pediatryczny model myszy ze wstrząsem mózgu powoduje długotrwałe zapalenie nerwów, zmiany istoty białej i modyfikacje neuronów z dysfunkcją behawioralną. Model można dostosować do różnych miejsc uderzeń lub powtarzających się wstrząsów mózgu w celu oceny zmian w całym okresie użytkowania.

Model wstrząsu mózgu u dzieci: zamknięty uraz głowy z długotrwałymi zaburzeniami (CHILD)

Przedstawiamy tutaj protokół indukujący hipoksję u noworodkowych myszy poprzez podawanie ich w kontrolowanych warunkach z różnym stężeniem tlenu. Modele mysie poddane zmianom tlenu przy urodzeniu trwało zmieniały ekspresję miRNA zaangażowanych w indukcję zmian behawioralnych fenotypowych, takich jak autyzm.

Hipoksja zmienia poziomy miRNA zaangażowane w dziedziczenie niemendelowskie zaburzeń ze spektrum autyzmu u myszy

Poznaj metodę oceny neurobehawioralnej w mysim modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków. Technika ta umożliwia badanie funkcji motorycznych i poznawczych po zabiegu okluzji tętnicy szyjnej.

Oceny neurobehawioralne w mysim modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków

Przeglądaj więcej filmów