Oceny neurobehawioralne w mysim modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków
24 listopada 2017
Przeprowadziliśmy jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej w 7-10 dniu po urodzeniu mysich szczeniąt CD-1, aby stworzyć model niedotlenienia niedotlenienia (HI) noworodka i zbadaliśmy skutki uszkodzenia mózgu HI. Badaliśmy funkcje neurobehawioralne u tych myszy w porównaniu z normalnymi myszami, które nie były operowane.
Ogólnym celem operacji niedotlenieniowo-niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków, po której następują testy poznawcze i motoryczne, jest posiadanie modelu mysiego do badania takich urazów i związanych z nimi uszkodzeń mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące niedotlenienia i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków, takie jak wpływ takich urazów na funkcje motoryczne i poznawcze. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest dobrze znana i powszechnie stosowana.
Jest to również model przedkliniczny dla porażenia mózgowego i udarów noworodków. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ jednostronna prawa tętnica szyjna jest trudna do zidentyfikowania. Procedurę, wraz ze mną, zademonstruje Yoon-Kyum Shin, doktorant z naszego laboratorium.
Po znieczuleniu co najmniej pięciu szczeniąt myszy P-seven, umieść szczenię pod mikroskopem preparacyjnym z brzuchem do góry. Następnie oczyść szyję alkoholem. Aby rozpocząć operację, użyj nożyczek, aby wykonać 0,7-milimetrowe nacięcie w szyi.
Następnie należy ostrożnie usunąć tkankę tłuszczową za pomocą kleszczy, aż do odsłonięcia jednostronnej prawej tętnicy szyjnej. Następnie, za pomocą szwu 5-0, podwiązać jednostronną prawą tętnicę szyjną. Teraz zszyj nacięcie na szyi nylonem 5-0 i wysterylizuj nacięcie.
Następnie pozwól szczeniakowi dojść do siebie w komorze hipoksyjnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z otwartą pokrywą przez około godzinę. Umieść kolejną chirurgicznie manipulowaną mysz w komorze niedotlenienia, aby wyzdrowiała. Gdy wszystkie szczenięta są w pełni wybudzone, zamknij pokrywę komory i zmniejsz poziom gazu, aby ustalić warunki niedotlenienia.
Po 90 minutach niedotlenienia wróć szczenięta z uszkodzonym mózgiem do klatek. Tydzień później przygotuj szczenięta do operacji, tak jak poprzednio, aby poszukać dowodów urazu. Wykonaj nacięcie w skórze głowy, aby zidentyfikować uszkodzenie mózgu w tylno-bocznej części prawej półkuli.
Spójrz przez półprzezroczystą czaszkę w poszukiwaniu śladów urazu kory mózgowej i urazu hipokampa. W ten sposób kategoryzuj szczenięta jako zranione lub nieuszkodzone kontrole. Po sprawdzeniu zamknij skórę głowy szwem i wysterylizuj nacięcie.
Kiedy myszy mają sześć tygodni, oceń ich pamięć na podstawie uczenia się i unikania niepożądanych bodźców. Do tego zadania należy użyć komercyjnego dwukomorowego, krokowego aparatu do pasywnego unikania. Aby rozpocząć, umieść mysz w jasnej komorze pudełka na 30 sekund.
Następnie otwórz drzwi między przedziałami i zarejestruj opóźnienie zwierzęcia przed wejściem do ciemnego przedziału. Odczekaj do 300 sekund na wykonanie zadania. Gdy wszystkie cztery kończyny myszy znajdą się całkowicie w ciemnym pomieszczeniu, zamknij drzwiczki.
Następnie przez dwie sekundy poddawaj się wstrząsowi elektrycznemu stopy o natężeniu 1/2 miliampera i umieść mysz z powrotem w klatce. 24 godziny później powtórz test. Tym razem pozwól myszy na pełne 300 sekund na przejście do ciemnej komory i nie szokuj myszy.
Wykonaj test chodzenia po drabinie na sześciotygodniowych myszach, aby rozróżnić subtelne zaburzenia funkcji motorycznych, stosując zarówno analizy jakościowe, jak i ilościowe. Najpierw ustaw aparat drabinkowy, a następnie ustaw kamerę wideo, aby rejestrować ruchy kończyn myszy na aparacie. Następnie umieść mysz na panelu startowym i rozpocznij nagrywanie za pomocą kamery wideo.
Upewnij się, że film pokazuje nogi w dobrej ostrości. Gdy mysz dotknie ostatniego panelu aparatu drabinkowego, zatrzymaj nagrywanie. Następnie przesuń mysz z powrotem do panelu startowego i ponownie nagraj mysz przechodzącą przez urządzenie.
Zrób to w sumie cztery razy na mysz w każdym dniu próby. Później, podczas analizy wideo, ręcznie policz liczbę poślizgnięć wykonanych przez każdą kończynę podczas odtwarzania filmu z prędkością 1/10. Kiedy kończyna wślizguje się między pręty, jest to poślizgnięcie.
Kiedy myszy osiągną wiek sześciu tygodni, oceń ich siłę chwytu. Użyj tensometru pchającego/ciągnącego, wyposażonego w trójkątny drut o średnicy dwóch milimetrów, wszystkie przymocowane do panelu. Umieść mysz na panelu, trzymając go za ogon.
Następnie pozwól myszy po prostu dosięgnąć metalowego drutu przednimi kończynami. Gdy tylko myszy złapią drut, delikatnie pociągnij go za ogon, aż zwolni uścisk. Aparat zarejestruje siłę szczytową działającą na drut w gramach.
Powtórz ten test pięć razy, zanim dasz myszy odpocząć. Podczas testu siły chwytu zauważalne są ruchy o dokładnych wykonaniach. Spróbuj znaleźć te ruchy w ciągu pięciu wysiłków, zanim odpoczniesz myszy, przez co najmniej jedną minutę, aby zmniejszyć zmęczenie mięśni.
Po tym, jak mysz odpocznie przez co najmniej minutę, powtórz ponownie serię pięciu prób. Następnie daj myszy jeszcze jeden odpoczynek i wykonaj serię po raz ostatni w tym dniu testowym. Na podstawie danych użyj średniej z trzech największych wyników dla jednej kończyny przedniej lub dla obu kończyn przednich do analizy.
Po pobraniu mózgów 14-tygodniowych zwierząt z uszkodzeniem niedotlenienia i niedokrwienia, mózgi zostały ocenione morfologicznie jako bez uszkodzenia kory mózgowej, łagodne uszkodzenie lub poważne uszkodzenie. Te same zwierzęta zostały przeskanowane za pomocą rezonansu magnetycznego tydzień wcześniej, co również było bardzo odkrywcze. Nawet morfologicznie prawidłowy mózg wykazywał łagodne uszkodzenia hipokampa.
W wieku sześciu tygodni, pięć tygodni po urazie, myszy były oceniane za pomocą różnych zadań behawioralnych. Myszy zranione niedotlenieniem i niedokrwieniem były upośledzone poznawczo podczas 24-godzinnego zadania pasywnego unikania. Ponieważ uszkodzona była tylko prawa półkula, myszy wykazywały połowicze funkcje motoryczne.
Świadczyła o tym różnica w procentowym odsetku poślizgnięć na poprzecznych szczeblach drabiny dla każdej kończyny przedniej. Co więcej, ponieważ siła chwytu obejmuje korę ruchową w mózgu, grupy z prawidłowym i korowym urazem wykazywały różnice w sile chwytu. Nie zaobserwowano różnicy między normalnymi myszami kontrolnymi a kategorycznie nieuszkodzonymi, ale uszkodzone myszy były wyraźnie upośledzone.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak podwiązywać jednostronną prawą tętnicę szyjną w celu wygenerowania noworodków myszy niedotlenionych i niedokrwiennych oraz jak przeprowadzić dalszą analizę behawioralną. Ważne jest, aby pamiętać, że nawet jeśli siedem dni po urazie nie widać widocznych uszkodzeń w korze mózgowej, rezonans magnetyczny może ujawnić uraz hipokampa. Ważne jest również, aby pamiętać o delikatnym traktowaniu szczeniąt i jak najszybszym zakończeniu operacji.
Szczenięta mają bardzo słabą i cienką skórę, więc bądź bardzo ostrożny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje skutki noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia (HI) mózgu w modelu mysim. W celu stworzenia modelu HI u myszy szczepu CD-1 w wieku od 7 do 10 dni po urodzeniu przeprowadzono jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej, co umożliwiło ocenę funkcji neurobehawioralnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neonatalne uszkodzenie mózgu
- Ocena funkcji motorycznych i poznawczych
Wstęp
- Noworodkowe niedotleniająco- Niedokrwienne uszkodzenie mózgu stanowi istotny problem w dziedzinie zdrowia pediatrycznego.
- Model ten pomaga w zrozumieniu wpływu takich urazów na rozwój mózgu.
- Służy on jako model przedkliniczny dla schorzeń takich jak mózgowio paraliż oraz udary noworodkowe.
- Identyfikacja właściwej tętnicy szyjnej może być trudna dla osób rozpoczynających naukę tej techniki.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu mysiego do badania niedotlenienia i niedokrwienia (HI) mózgu u noworodków.
- Ocena wpływu HI na funkcje motoryczne i poznawcze u myszy.
- Dostarczenie informacji na temat potencjalnych podejść terapeutycznych w przypadku noworodkowych uszkodzeń mózgu.
Zastosowane metody
- Jednostronna operacja zamknięcia tętnicy szyjnej u mysich młodych.
- Ocena funkcji neurobehawioralnych po operacji.
- Porównanie myszy operowanych z nieoperowaną grupą kontrolną.
- Współpraca ze studentami studiów magisterskich w celu zaprezentowania procedury.
Główne wyniki
- Ustanowienie modelu niedotlenienia i niedokrwienia (HI) u noworodków myszy szczepu CD-1.
- Identyfikacja istotnych różnic w funkcjach neurobehawioralnych.
- Wgląd w wpływ HI na rozwój motoryczny i poznawczy.
- Walidacja modelu do przyszłych badań nad urazami mózgu noworodków.
Wnioski
- Jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej jest skuteczną metodą modelowania noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia (HI).
- Model ten może ułatwić dalsze badania nad strategiami terapeutycznymi.
- Zrozumienie neurobehawioralnych wyników jest kluczowe dla leczenia noworodkowych uszkodzeń mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten noworodkowy model mysi z niedotlenieniem i niedokrwieniem dostarcza systemu przedklinicznego do oceny deficytów motorycznych i poznawczych istotnych w kontekście porażenia mózgowego oraz udaru noworodkowego. Oceny behawioralne umożliwiają mechanistyczną weryfikację bezpieczeństwa i skuteczności kandydatów terapeutycznych poprzez powiązanie uszkodzenia prawej półkuli z efektami funkcjonalnymi. Model ten wspiera walidację celów oraz opracowywanie testów w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z hemiplegiczną dysfunkcją motoryczną i zaburzeniami poznawczymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia system istotny dla choroby do funkcjonalnej walidacji celów w szlakach uszkodzeń mózgu noworodków.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez korelację stopnia ciężkości uszkodzenia kory z wynikami testów motorycznych i poznawczych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane wyniki neurobehawioralne (czas utajenia w unikaniu pasywnym, liczba ześlizgnięć z drabiny, siła chwytu) do przesiewowego badania związków.
- Pomiar ilościowy: Dostarcza powtarzalne, mierzalne punkty końcowe odpowiednie dla wysokoprzepustowej analizy behawioralnej.
- Znaczenie dla badań przesiewowych: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszej oceny czynników neuroprotekcyjnych lub neurorestauracyjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje warunki niedotlenienia hipoksyczno- niedokrwiennego (HI) u noworodków, takie jak mózgowe porażenie dzieci i udar noworodkowy, wykazując trafność zewnętrzną w zakresie deficytów motorycznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez fenotypowanie poznawcze i motoryczne zgodne z obserwacjami klinicznymi.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dostarcza informacji do kryteriów go/no-go poprzez kwantyfikację stopnia ciężkości uszkodzenia za pomocą fenotypów behawioralnych skorelowanych z MRI.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po przedkliniczne badania skuteczności, umożliwiając podłużną ocenę powrotu funkcji neurobehawioralnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego w przypadku celów terapeutycznych zaangażowanych w kaskady niedotleniająco-niedokrwienne.
- Przesiewanie: Dostarcza fenotypów gotowych do analizy z ustandaryzowanymi odczytami funkcji motorycznych i poznawczych do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych (latencja, częstotliwość poślizgów, siła chwytu) w celu porównania międzygrupowego i obliczenia wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez stratyfikację urazów walidowaną za pomocą MRI oraz podłużne monitorowanie behawioralne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do przesiewania wielu modalności terapeutycznych w ramach programów dotyczących urazów rozwojowych i neurodegeneracyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie jednostronnego podwiązania tętnicy szyjnej z deficytami funkcjonalnymi specyficznymi dla danej półkuli.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom chirurgicznym i behawioralnym stosowanym w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wczesnych sygnałów prognostycznych dotyczących skuteczności motorycznej i poznawczej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o behawioralną poprawę stanu w kohortach o dopasowanym stopniu uszkodzenia.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie chirurgii noworodków gryzoni oraz mikrosurgicalnego podwiązywania naczyń.
- Metoda jest zależna od sprzętu komory hipoksycznej i precyzyjnej regulacji gazów w celu zapewnienia spójności indukowania urazu.
- Konieczne jest przeprowadzenie ślepych testów behawioralnych, aby uniknąć błędu obserwatora podczas liczenia poślizgów i pomiaru czasu latencji.
- Wymagana jest adaptacja aparatury behawioralnej do rozmiarów i możliwości motorycznych myszy w szóstym tygodniu życia.
- Ograniczeniem jest zmienność penetracji urazu, co wymaga przeprowadzenia pooperacyjnego badania MRI lub przesiewu morfologicznego w celu stratyfikacji kohort.
