Oceny neurobehawioralne w mysim modelu niedotlenionego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u noworodków
24 listopada 2017
Przeprowadziliśmy jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej w 7-10 dniu po urodzeniu mysich szczeniąt CD-1, aby stworzyć model niedotlenienia niedotlenienia (HI) noworodka i zbadaliśmy skutki uszkodzenia mózgu HI. Badaliśmy funkcje neurobehawioralne u tych myszy w porównaniu z normalnymi myszami, które nie były operowane.
Ogólnym celem operacji wywołania niedotlenienia i niedokrwienia mózgu noworodka, po której następują testy poznawcze i motoryczne, jest stworzenie modelu mysiego do badania takich urazów oraz związanych z nimi uszkodzeń mózgu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące niedotlenienia i niedokrwienia mózgu noworodka, takie jak wpływ tych urazów na funkcje motoryczne i poznawcze. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona dobrze znana i powszechnie stosowana.
Jest to również model przedkliniczny dla mózgowego porażenia dzieci oraz udarów noworodkowych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ jednostronna prawa tętnica szyjna jest trudna do zidentyfikowania. Procedurę będzie demonstrować wraz ze mną Yoon-Kyum Shin, doktorant z naszego laboratorium.
Po znieczuleniu co najmniej pięciu mysich piskląt w wieku P7, należy umieścić pisklę pod mikroskopem sekcyjnym brzuchem do góry. Następnie należy oczyścić szyję alkoholem. Aby rozpocząć zabieg, należy użyć nożyczek do wykonania nacięcia o długości 0,7 mm w obrębie szyi.
Następnie, używając pęsety, ostrożnie usuń tkankę tłuszczową, aż do odsłonięcia prawej tętnicy szyjnej. Następnie, używając nici chirurgicznej 5-0, podwiąż prawą tętnicę szyjną. Teraz zaszyj nacięcie na szyi nylonem 5-0 i zdezynfekuj miejsce nacięcia.
Następnie pozwolić szczeniętowi na regenerację w komorze hipoksyjnej o temperaturze 37°C z otwartą pokrywą przez około godzinę. Umieścić kolejną mysz po zabiegu chirurgicznym w komorze hipoksyjnej w celu regeneracji. Gdy wszystkie szczenięta będą w pełni rozbudzone, zamknąć pokrywę komory i obniżyć poziom gazów, aby ustanowić warunki hipoksji.
Po 90 minutach hipoksji należy przenieść młode szczury z uszkodzeniem mózgu z powrotem do klatek. Tydzień później przygotować młode szczury do operacji, w sposób opisany wcześniej, aby poszukać dowodów na wystąpienie uszkodzenia. Wykonać nacięcie skóry głowy, aby zidentyfikować zmianę w mózgu w tylno-bocznej części prawej półkuli.
Przez półprzezroczystą czaszkę sprawdź obecność obrażeń kory oraz hipokampa. Następnie podziel szczenięta na grupę z obrażeniami oraz grupę kontrolną nieuszkodzoną. Po sprawdzeniu zamknij skórę głowy szwem i zdezynfekuj miejsce nacięcia.
Gdy myszy osiągną wiek sześciu tygodni, należy ocenić ich pamięć w oparciu o proces uczenia się i unikania bodźca awersyjnego. Do tego zadania należy wykorzystać komercyjny, dwukomorowy aparat do testu pasywnego unikania (step-through). Na początek należy umieścić mysz w jasnej komorze pudełka na 30 sekund.
Następnie otwórz drzwi między komorami i zarejestruj czas latencji zwierzęcia do wejścia do ciemnej komory. Na wykonanie zadania przeznacz do 300 sekund. Gdy wszystkie cztery kończyny myszy znajdą się całkowicie w ciemnej komorze, zamknij drzwi.
Następnie podaj wstrząs elektryczny o natężeniu 1/2 mA w okolicy stopy przez dwie sekundy i zwróć mysz do klatki. Po 24 godzinach powtórz test. Tym razem pozwól myszy na pełne 300 sekund na wejście do ciemnej komory i nie podawaj wstrząsu.
Przeprowadź test chodzenia po drabinie u sześciotygodniowych myszy, aby odróżnić subtelne zaburzenia funkcji motorycznych, stosując analizy jakościowe i ilościowe. Najpierw przygotuj aparat w postaci drabiny, a następnie ustaw kamerę wideo w celu rejestracji ruchów kończyn myszy na aparacie. Następnie umieść mysz na panelu startowym i rozpocznij nagrywanie za pomocą kamery wideo.
Należy upewnić się, że kończyny są dobrze widoczne i w ostrości na nagraniu. Gdy mysz dotknie ostatniego panelu urządzenia w formie drabiny, należy zatrzymać nagrywanie. Następnie należy przenieść mysz z powrotem do panelu startowego i ponownie nagrać przejście myszy przez urządzenie.
Powtórz tę czynność łącznie cztery razy dla każdej myszy w każdym dniu próby. Następnie, podczas analizy nagrania wideo, ręcznie policz liczbę poślizgów każdej kończyny, odtwarzając wideo z prędkością 1/10. Poślizgiem określa się sytuację, w której kończyna ześlizguje się pomiędzy prętami.
Gdy myszy osiągną wiek sześciu tygodni, należy ocenić ich siłę chwytu. Należy użyć tensometru do pomiaru siły nacisku/rozciągania, wyposażonego w drut trójkątny o średnicy dwóch milimetrów, a całość przymocować do panelu. Myszą należy umieścić na panelu, trzymając ją za ogon.
Następnie pozwól myszy dotrzeć przednimi kończynami do metalowego drutu. Gdy tylko mysz chwyci drut, delikatnie pociągnij ją za ogon, aż go puści. Aparatura zarejestruje szczytową siłę nacisku na drut w gramach.
Powtórz ten test pięć razy przed zapewnieniem myszy odpoczynku. Podczas testu siły chwytu można zaobserwować wyraźne ruchy świadczące o prawidłowym wykonaniu próby. Postaraj się zarejestrować takie ruchy w ciągu pięciu prób przed odpoczynkiem myszy, który powinien trwać co najmniej jedną minutę, aby zmniejszyć zmęczenie mięśni.
Po odpoczynku myszy trwającym co najmniej jedną minutę, powtórz serię pięciu prób. Następnie zapewnij myszy kolejną przerwę i przeprowadź serię po raz ostatni w danym dniu testowym. Do analizy wykorzystaj średnią z trzech najwyższych wyników dla jednej przedniej kończyny lub dla obu przednich kończyn.
Po pobraniu mózgów od zwierząt z niedotlenieniem i niedokrwieniem w wieku 14 tygodni, dokonano oceny morfologicznej pod kątem braku uszkodzeń kory mózgowej, występowania uszkodzeń łagodnych lub ciężkich. Te same zwierzęta poddano badaniu MRI tydzień wcześniej, które okazało się również bardzo informacyjne. Nawet w mózgach prawidłowych morfologicznie stwierdzono łagodne uszkodzenia w obrębie hipokampa.
W szóstym tygodniu życia, pięć tygodni po urazie, u myszy przeprowadzono ocenę za pomocą różnych zadań behawioralnych. Myszy z urazem hipoksyczno- Niedokrwiennym wykazywały upośledzenie poznawcze w 24-godzinnym teście unikania pasywnego. Ponieważ uszkodzona była tylko prawa półkula, u myszy stwierdzono hemiplegiczne zaburzenia funkcji motorycznych.
Zostało to wykazane poprzez różnicę w procencie poślizgów na poprzecznych szczeblach drabiny dla każdej kończyny przedniej. Ponadto, ponieważ siła chwytu angażuje korę ruchową mózgu, grupy zwierząt zdrowych oraz z uszkodzeniem kory wykazały różnice w sile uścisku. Nie zaobserwowano różnic między grupą kontrolną a myszami bez uszkodzeń, natomiast u myszy z uszkodzeniami stwierdzono wyraźne upośledzenie funkcji.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić ligację prawej tętnicy szyjnej w celu wywołania niedotlenienia i niedokrwienia u noworodków myszy oraz jak wykonać późniejszą analizę behawioralną. Należy zauważyć, że nawet jeśli siedem dni po urazie nie widać widocznych uszkodzeń kory mózgu, badanie MRI może wykazać uszkodzenie hipokampa. Ważne jest również, aby pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z młodymi myszami i przeprowadzaniu zabiegu chirurgicznego tak szybko, jak to możliwe.
Młode szczury mają bardzo słabą i cienką skórę, dlatego należy zachować szczególną ostrożność.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje skutki noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia (HI) mózgu w modelu mysim. W celu stworzenia modelu HI u myszy szczepu CD-1 w wieku od 7 do 10 dni po urodzeniu przeprowadzono jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej, co umożliwiło ocenę funkcji neurobehawioralnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neonatalne uszkodzenie mózgu
- Ocena funkcji motorycznych i poznawczych
Wstęp
- Noworodkowe niedotleniająco- Niedokrwienne uszkodzenie mózgu stanowi istotny problem w dziedzinie zdrowia pediatrycznego.
- Model ten pomaga w zrozumieniu wpływu takich urazów na rozwój mózgu.
- Służy on jako model przedkliniczny dla schorzeń takich jak mózgowio paraliż oraz udary noworodkowe.
- Identyfikacja właściwej tętnicy szyjnej może być trudna dla osób rozpoczynających naukę tej techniki.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu mysiego do badania niedotlenienia i niedokrwienia (HI) mózgu u noworodków.
- Ocena wpływu HI na funkcje motoryczne i poznawcze u myszy.
- Dostarczenie informacji na temat potencjalnych podejść terapeutycznych w przypadku noworodkowych uszkodzeń mózgu.
Zastosowane metody
- Jednostronna operacja zamknięcia tętnicy szyjnej u mysich młodych.
- Ocena funkcji neurobehawioralnych po operacji.
- Porównanie myszy operowanych z nieoperowaną grupą kontrolną.
- Współpraca ze studentami studiów magisterskich w celu zaprezentowania procedury.
Główne wyniki
- Ustanowienie modelu niedotlenienia i niedokrwienia (HI) u noworodków myszy szczepu CD-1.
- Identyfikacja istotnych różnic w funkcjach neurobehawioralnych.
- Wgląd w wpływ HI na rozwój motoryczny i poznawczy.
- Walidacja modelu do przyszłych badań nad urazami mózgu noworodków.
Wnioski
- Jednostronne zamknięcie tętnicy szyjnej jest skuteczną metodą modelowania noworodkowego niedotlenienia i niedokrwienia (HI).
- Model ten może ułatwić dalsze badania nad strategiami terapeutycznymi.
- Zrozumienie neurobehawioralnych wyników jest kluczowe dla leczenia noworodkowych uszkodzeń mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten noworodkowy model mysi z niedotlenieniem i niedokrwieniem dostarcza systemu przedklinicznego do oceny deficytów motorycznych i poznawczych istotnych w kontekście porażenia mózgowego oraz udaru noworodkowego. Oceny behawioralne umożliwiają mechanistyczną weryfikację bezpieczeństwa i skuteczności kandydatów terapeutycznych poprzez powiązanie uszkodzenia prawej półkuli z efektami funkcjonalnymi. Model ten wspiera walidację celów oraz opracowywanie testów w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z hemiplegiczną dysfunkcją motoryczną i zaburzeniami poznawczymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia system istotny dla choroby do funkcjonalnej walidacji celów w szlakach uszkodzeń mózgu noworodków.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez korelację stopnia ciężkości uszkodzenia kory z wynikami testów motorycznych i poznawczych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane wyniki neurobehawioralne (czas utajenia w unikaniu pasywnym, liczba ześlizgnięć z drabiny, siła chwytu) do przesiewowego badania związków.
- Pomiar ilościowy: Dostarcza powtarzalne, mierzalne punkty końcowe odpowiednie dla wysokoprzepustowej analizy behawioralnej.
- Znaczenie dla badań przesiewowych: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszej oceny czynników neuroprotekcyjnych lub neurorestauracyjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje warunki niedotlenienia hipoksyczno- niedokrwiennego (HI) u noworodków, takie jak mózgowe porażenie dzieci i udar noworodkowy, wykazując trafność zewnętrzną w zakresie deficytów motorycznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez fenotypowanie poznawcze i motoryczne zgodne z obserwacjami klinicznymi.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dostarcza informacji do kryteriów go/no-go poprzez kwantyfikację stopnia ciężkości uszkodzenia za pomocą fenotypów behawioralnych skorelowanych z MRI.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po przedkliniczne badania skuteczności, umożliwiając podłużną ocenę powrotu funkcji neurobehawioralnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego w przypadku celów terapeutycznych zaangażowanych w kaskady niedotleniająco-niedokrwienne.
- Przesiewanie: Dostarcza fenotypów gotowych do analizy z ustandaryzowanymi odczytami funkcji motorycznych i poznawczych do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych (latencja, częstotliwość poślizgów, siła chwytu) w celu porównania międzygrupowego i obliczenia wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez stratyfikację urazów walidowaną za pomocą MRI oraz podłużne monitorowanie behawioralne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do przesiewania wielu modalności terapeutycznych w ramach programów dotyczących urazów rozwojowych i neurodegeneracyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie jednostronnego podwiązania tętnicy szyjnej z deficytami funkcjonalnymi specyficznymi dla danej półkuli.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom chirurgicznym i behawioralnym stosowanym w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wczesnych sygnałów prognostycznych dotyczących skuteczności motorycznej i poznawczej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o behawioralną poprawę stanu w kohortach o dopasowanym stopniu uszkodzenia.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie chirurgii noworodków gryzoni oraz mikrosurgicalnego podwiązywania naczyń.
- Metoda jest zależna od sprzętu komory hipoksycznej i precyzyjnej regulacji gazów w celu zapewnienia spójności indukowania urazu.
- Konieczne jest przeprowadzenie ślepych testów behawioralnych, aby uniknąć błędu obserwatora podczas liczenia poślizgów i pomiaru czasu latencji.
- Wymagana jest adaptacja aparatury behawioralnej do rozmiarów i możliwości motorycznych myszy w szóstym tygodniu życia.
- Ograniczeniem jest zmienność penetracji urazu, co wymaga przeprowadzenia pooperacyjnego badania MRI lub przesiewu morfologicznego w celu stratyfikacji kohort.
