Name: Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj mikroskopię ATOM do bezetykietowego obrazowania pojedynczych komórek w mikroprzepływie. System umożliwia analizę morfologiczną do 100 000 komórek na sekundę z wysokim kontrastem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Panu P. Yeungowi za przygotowanie dla nas MCF-7. Prace te były częściowo wspierane przez granty z Rady ds. Grantów Badawczych Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkongu w Chinach (projekt nr 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 i HKU 720112E), Programu Wsparcia Innowacji i Technologii (ITS/090/14) oraz Funduszu Rozwoju Uniwersytetów HKU.

<ol><li>Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLau%2C+AKS+%22Imaging+Flow+Cytometry%3A+Methods+and+Protocols%22">Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols</a>. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).</li>
<li>Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+time-encoded+amplified+imaging+for+real-time+observation+of+fast+dynamic+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena.</a> Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).</li>
<li>Goda, K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nphoton/journal/v7/n2/full/nphoton.2012.359.html">Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements.</a> Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).</li>
<li>Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optofluidic+time-stretch+imaging+-+an+emerging+tool+for+high-throughput+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry.</a> Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).</li>
<li>Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7368079/">Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales.</a> IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).</li>
<li>Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.4941050">Optical time-stretch imaging: Principles and applications.</a> Appl Phys Rev. 3 (1), 011102(2016).</li>
<li>Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/full/10.1063/1.4941050">Optical time-stretch imaging: Principles and applications.</a> Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).</li>
<li>Goda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-microparticle+imaging+flow+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).</li>
<li>Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://journals.aps.org/pra/abstract/10.1103/PhysRevA.80.043821">Theory of amplified dispersive Fourier transformation.</a> Physical Review A. 80 (4), 043821(2009).</li>
<li>Goda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-microparticle+imaging+flow+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).</li>
<li>Lai, Q. T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+time-stretch+imaging+flow+cytometry+for+multi-class+classification+of+phytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton.</a> Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).</li>
<li>Chen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Learning+in+Label-free+Cell+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Deep Learning in Label-free Cell Classification.</a> Sci Rep. 6, 21471(2016).</li>
<li>Fard, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomarski+serial+time-encoded+amplified+microscopy+for+high-speed+contrast-enhanced+imaging+of+transparent+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media.</a> Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).</li>
<li>Lau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+time-stretch+microscopy+for+ultrafast+quantitative+cellular+and+tissue+imaging+at+1+mum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum.</a> J Biomed Opt. 19 (7), 76001(2014).</li>
<li>Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+high-throughput+cell+screening+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Label-free high-throughput cell screening in flow.</a> Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).</li>
<li>Wong, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric-detection+time-stretch+optical+microscopy+%28ATOM%29+for+ultrafast+high-contrast+cellular+imaging+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow.</a> Sci Rep. 4, 3656(2014).</li>
<li>Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1364032109001646">Microalgae for biodiesel production and other applications: A review.</a> Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).</li>
<li>Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+biodiversity+patterns+of+marine+phytoplankton+and+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton.</a> Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/6722896/">Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breathing+laser+as+an+inertia-free+swept+source+for+high-quality+ultrafast+optical+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging.</a> Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).</li>
<li>Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+measurements+of+optical+spectral+coherence+by+single-shot+time-stretch+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry.</a> Sci Rep. 6, 27937(2016).</li>
<li>Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+serial+time-encoded+amplified+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Performance of serial time-encoded amplified microscope.</a> Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).</li>
<li>Alix-Panabières, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+circulating+tumour+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Challenges in circulating tumour cell research.</a> Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).</li>
<li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+counting+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Beyond counting tumor cells.</a> Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).</li>
<li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).</li>
<li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+focusing+for+tumor+antigen-dependent+and+-independent+sorting+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.</a> Sci Transl Med. 5 (179), (2013).</li>
<li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Scientific Reports. 3, 1259(2013).</li>
<li>Karabacak, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marker-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples.</a> Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).</li>
<li>Krebs, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+circulating+tumour+cells-biology+and+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.eee.hku.hk/optima/pub/journal/1701_LSA.pdf">Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths.</a> Light Sci Appl. , (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka szczegółów technicznych, które wymagają szczególnej uwagi podczas konfiguracji systemu ATOM. Po pierwsze, należy zauważyć, że asymetryczne/ukośne oświetlenie kodowane spektralnie może wprowadzać szczątkowe składowe gradientu fazowego (tj. efekt cieniowania) w kontraście absorpcyjnym i wpływać na wzmocnienie kontrastu gradientu fazowego w ATOM. Dlatego ten efekt ukośnego oświetlenia powinien być zminimalizowany. Po drugie, należy podkreślić, że schemat multipleksowania lub przeplotu czasowego obejm...

Obrazowanie optyczne stanowi potężne narzędzie i test oparty na komórkach, który pozwala (prawie) nieinwazyjnie wizualizować szczegółowy rozkład przestrzenny wielu komponentów komórkowych/subkomórkowych, odkrywając w ten sposób mnogość morfologicznych, biofizycznych i biomolekularnych sygnatur komórek. Jednak ta zdolność do wydobywania informacji o wysokiej zawartości z pojedynczych komórek była na ogół zagrożona, gdy trzeba było zbadać ogromną i niejednorodną populację komórek. Oznacza to powszechny kompromis w testach komórkowych między wydajnością pomiaru a zawartością. Godnym uwagi przykładem jest to, że dodanie możliwości obrazowania do cytometrii przepływowej spowodowało zmniejszenie przepustowości o co najmniej 1-2 rzędy wielkości w porównaniu z klasycznymi cytometrami przepływowymi bez obrazowania. Chociaż może zaoferować złożoną morfologiczną analizę pojedynczych komórek, która nie jest możliwa przy użyciu standardowych cytometrów przepływowych1, obrazowa cytometria przepływowa na ogół nie ma wystarczającej przepustowości, aby zidentyfikować heterogeniczność komórkową z dużą pewnością statystyczną. Jest to niezbędne do nowych odkryć w biologii i do zrozumienia patogenezy chorób. Kluczowym wyzwaniem technicznym jest nieodłączne ograniczenie prędkości narzucone przez powszechne strategie obrazowania optycznego: skanowanie wiązką laserową (np. za pomocą zwierciadeł galwanometrycznych) i/lub czujniki obrazu (np. urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) i komplementarny półprzewodnik metalowo-tlenkowy (CMOS)). Szybkość skanowania laserowego jest z natury ograniczona przez bezwładność mechaniczną luster skanujących, podczas gdy liczba klatek na sekundę CCD lub CMOS jest ograniczona przez podstawowy kompromis między szybkością obrazowania a czułością (tj. zwiększenie liczby klatek na sekundę prowadzi do zmniejszenia czułości wykrywania sygnału i odwrotnie).
Bazując na całkowicie optycznym, ultraszybkim mechanizmie kodowania obrazu, optyczne obrazowanie w czasie zostało uznane za atrakcyjną platformę dla wysokoprzepustowych cytometrów przepływowych do obrazowania, bez potrzeby stosowania konwencjonalnych czujników obrazu lub mechanicznego skanowania laserowego2,3. Szczegółowe opisy zasady działania obrazowania rozciągającego czas można znaleźć w references4,5,6,7. Krótko mówiąc, składa się z dwóch wymiennych etapów mapowania: (i) kodowania spektralnego (mapowanie długości fali i przestrzeni), w którym współrzędne przestrzenne obrazowanej próbki są odwzorowywane na różne długości fal w całym widmie wiązki impulsów świetlnych8,9, oraz (ii) dyspersyjna transformacja Fouriera (mapowanie długości fali-czasu)9, w którym składowe długości fal poszczególnych impulsów laserowych są przekształcane (rozciągane) za pomocą grupowej dyspersji prędkości (GVD) w przebiegi czasowe (przemiatane przez długość fali) (rysunek 1). Ważną cechą obrazowania rozciągliwego w czasie jest wzmocnienie optyczne, które odgrywa kluczową rolę w zwalczaniu utraty czułości spowodowanej ultraszybką fotodetekcją i utratą GVD, poprawiając w ten sposób stosunek sygnału do szumu obrazu (SNR) bez zanieczyszczenia szumem fotodetektora9. Ponieważ każdy impuls laserowy koduje skan liniowy obrazowanej próbki, który jest prostopadły do jednokierunkowego przepływu komórek, efektywna szybkość skanowania liniowego jest określana przez częstotliwość powtarzania lasera, która zwykle przekracza 10 MHz. Ta ultraszybka operacja umożliwia przechwytywanie obrazu pojedynczej komórki bez rozmycia z przepustowością 10 000-100 000 komórek/s (tj. 10-100 razy wyższą niż konwencjonalna obrazowa cytometria przepływowa). W rezultacie, obrazowanie rozciągnięte w czasie może znaleźć unikalne zastosowania w wysokoprzepustowych, jednokomórkowych badaniach przesiewowych opartych na obrazie, zwłaszcza gdy istnieje potrzeba identyfikacji nieznanej heterogeniczności lub rzadkich/nieprawidłowych komórek w dużej populacji (tysiące do milionów komórek), takich jak badania przesiewowe rzadkich komórek nowotworowych10 lub klasyfikacja mikroglonów11.
Obrazowanie rozciągające w czasie opiera się głównie na przechwytywaniu obrazu w jasnym polu (BF), z którego kontrast obrazu jest generowany przez rozpraszanie i absorpcję światła z komórek2,3,9,10,11. Takie bezznacznikowe możliwości obrazowania pojedynczych komórek mogą ominąć szkodliwe skutki związane ze znacznikami fluorescencyjnymi, takie jak cytotoksyczność i fotowybielanie, a jednocześnie dostarczyć cennych informacji do analizy pojedynczych komórek w oparciu o strukturę i morfologię komórkową i subkomórkową. Udowodniono, że te bezznacznikowe parametry są skuteczne w głębokiej klasyfikacji obrazów komórek, zwłaszcza gdy dostępna jest ogromna populacja komórek11,12. Jednak w wielu przypadkach obrazowanie BF nie zapewnia wystarczającego kontrastu, aby ujawnić szczegółową morfologię przezroczystych komórek bez znaczników. Opracowano różne metody obrazowania bez znaczników, kontrastu fazowego i rozciągnięcia w czasie w celu zwiększenia kontrastu obrazowania przy ultradużej liczbie klatek na sekundę13,14,15. Wśród tych technik opracowano mikroskopię optyczną z asymetryczną detekcją i rozciągnięciem w czasie (ATOM), aby ujawnić kontrast podobny do gradientu fazowego (różnicowo-interferencyjno-kontrastowego (DIC)) w oparciu o koncepcję podobną do fotografii Schlierena, umożliwiając bezznacznikowe, wysokokontrastowe obrazowanie pojedynczych komórek z ultrawysoką prędkością mikroprzepływową (do 10 m/s)16. Efekt ten można łatwo wygenerować poprzez detekcję ukośną lub oświetlenie poprzez częściowe zablokowanie ścieżki wiązki zakodowanej w obrazie lub przechylenie wiązki przed fotodetekcją. Kolejną zaletą ATOM jest jego zdolność do jednoczesnego uzyskiwania dwóch kontrastów gradientu fazowego wzdłuż przeciwnych orientacji. Odejmowanie intensywności i sumowanie dwóch obrazów o przeciwnym kontraście daje odpowiednio kontrast różnicowy gradientu fazowego i kontrast absorpcyjny z tego samego skanu liniowego. W pracy przedstawiono szczegółowy protokół opisujący implementację ATOM, w tym ustalenie układu optycznego, przygotowanie próbki oraz akwizycję i wizualizację danych. W szczególności praca ta demonstruje działanie ATOM z obrazowaniem pojedynczych komórek ludzkich komórek krwi, komórek rakowych i fitoplanktonu (mikroalg). Podkreśla to możliwość zastosowania ATOM w obrazowej cytometrii przepływowej, nie tylko w dziedzinie biomedycyny, ale także w badaniach morskich i biopaliwowych17,18.

<table><tbody><tr><td>Obiektywy Nikon Plan Fluorite Physiology 40X</td><td>Nikon</td><td>MRF07420</td><td>Obiektyw (Obj2)</td></tr><tr><td>Obiektyw fluorytowy Olympus Plan, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X Soczewka</td> obiektywowa <td>Olympus</td><td>RMS40X-PF</td><td>(Obj1)</td></tr><tr><td>N-BK7 Soczewki plano-wypukłe</td><td>Thorlabs</td><td>LA1145-C</td><td>Do przekazywania prysznica spektralnego</td></tr><tr><td>Pakiet kolimacyjny FC / APC Fiber</td><td>Thorlabs</td><td>F220APC-1064</td><td>Do wyprowadzania i zbierania impulsów laserowych</td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki Pellicle</td><td>Thorlabs</td><td>BP145B3</td><td>Do wykonania repliki belki</td></tr><tr><td>Zabezpieczone srebrne lustro</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Do odbijania światła</td></tr><tr><td>800-1650nm 12GHz jednomodowy odbiornik NIR sprzężony z prądem stałym</td><td>Newport</td><td>1544-B</td><td>Do konwersji światła na sygnał elektryczny</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td> <td>o wysokiej wydajności InfiniiumAgilent</td><td>DSOX91604A</td><td>Aby zapisać sygnały elektryczne przekształcone w światło</td></tr><tr><td>, światłowód HI1060</td><td>Corning</td><td>HI1060</td><td>Światłowód do rozciągania w czasie</td></tr><tr><td>WZMACNIACZ ŚWIATŁOWODOWY DOMIESZKOWANY ITERBEM</td><td>Keopsys</td><td>KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA</td><td>Optyczny wzmacniacz liniowy</td></tr><tr><td>Krata holograficzna</td><td>Wasatch Photonics</td><td>020305-6</td><td>Krata</td></tr><tr><td>Strzykawka do zaparzania/wycofywania Pompy</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td>Pompa strzykawkowa do ładowania próbek w kanałach mikroprzepływowych</td></tr></tbody></table>

obrazowanie mikroprzepływowe cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (atom)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Skalowanie liczby mierzalnych parametrów, co pozwala na wielowymiarową analizę danych, a tym samym na uzyskanie większej pewności wyników statystycznych, było głównym trendem w zaawansowanym rozwoju cytometrii przepływowej. Warto zauważyć, że dodanie możliwości obrazowania w wysokiej rozdzielczości pozwala na złożoną analizę morfologiczną struktur komórkowych/subkomórkowych. Nie jest to możliwe w przypadku standardowych cytometrów przepływowych. Jest jednak cenny dla pogłębiania naszej wiedzy na temat funkcji komórkowych i może przynieść korzyści badaniom z zakresu nauk przyrodniczych, diagnostyce klinicznej i monitorowaniu środowiska. Włączenie możliwości obrazowania do cytometrii przepływowej pogarsza przepustowość testu, głównie ze względu na ograniczenia szybkości i czułości technologii kamer. Aby sprostać temu wyzwaniu polegającemu na szybkości lub przepustowości, przed którym stoi obrazowa cytometria przepływowa, przy jednoczesnym zachowaniu jakości obrazu, wykazano, że mikroskopia optyczna z asymetrycznym wykrywaniem w czasie i rozciągnięciem w czasie (ATOM) umożliwia obrazowanie pojedynczych komórek o wysokim kontraście i rozdzielczości subkomórkowej przy przepustowości obrazowania wynoszącej nawet 100 000 komórek/s. Opierając się na koncepcji obrazowania konwencjonalnego obrazowania rozciągającego w czasie, która opiera się na całkowicie optycznym kodowaniu i odzyskiwaniu obrazu za pomocą ultraszybkich szerokopasmowych impulsów laserowych, ATOM jeszcze bardziej zwiększa wydajność obrazowania, zwiększając kontrast obrazu nieznakowanych/niebarwionych komórek. Osiąga się to poprzez dostęp do informacji o gradinie fazowym komórek, które są kodowane spektralnie w pojedynczych impulsach szerokopasmowych. W związku z tym ATOM jest szczególnie korzystny w wysokoprzepustowych pomiarach morfologii i tekstury pojedynczych komórek – informacji wskazujących na typy, stany, a nawet funkcje komórek. Ostatecznie może to stać się potężną platformą obrazowania cytometrii przepływowej do biofizycznego fenotypowania komórek, uzupełniając obecny stan wiedzy na temat biochemicznych testów komórkowych opartych na markerach. W pracy opisano protokół służący do ustanowienia kluczowych modułów systemu ATOM (od frontendu optycznego do zaplecza przetwarzania i wizualizacji danych), a także przebieg pracy obrazowania cytometrii przepływowej opartej na ATOM, na przykładzie komórek ludzkich i mikroalg.

Niniejsza praca przedstawia dwie demonstracje obrazowania pojedynczych komórek za pomocą techniki ATOM: jedną z wykorzystaniem komórek ssaków (ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowejs (PBMC) i komórki raka piersi (MCF-7)) oraz inny z fitoplanktonems (Scenedesmus i Chlamydomonas). Pierwszy eksperyment był motywowany rosnącym zainteresowaniem płynną biopsją w celu detekcji, zliczania i charakteryzacji krążących komórek nowotworowych (CTC) we krwi<su...

Ten protokół opisuje implementację systemu mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie do obrazowania pojedynczych komórek w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym oraz jego zastosowania w obrazowaniu cytometrii przepływowej.

Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

ogólnym celem niniejszego protokołu jest przygotowanie i wykorzystanie asymetrycznego systemu mikroskopii optycznej z rozciąganiem czasu detekcji (ATOM) do bezznacznikowego obrazowania pojedynczych komórek o wysokim kontraście w ultraszybkim przepływie mikrofluidycznym. Główną zaletą systemu ATOM jest możliwość ultraszybkiego przechwytywania obrazów przy częstotliwościach skanowania linii sięgających dziesiątek megaherców, przy jednoczesnym zwiększeniu kontrastu obrazu nieoznakowanych komórek. ATOM umożliwia złożoną analizę morfologiczną struktur komórkowych i podkomórkowych w niecentrowych analizach opartych na komórkach z przepływem do 100 000 komórek na sekundę, co nie jest możliwe w przypadku standardowej cytometrii przepływowej.Aby rozpocząć konfigurację układu, należy użyć kolimatora światłowodowego w celu sprzężenia szerokopasmowego femto- lub pikosekundowego impulsowego lasera bliskiej podczerwieni z jedrdzeniowym rozpraszającym światłowodem podłączonym do wzmacniacza optycznego. Laserem należy oświetlić transmisyjną siatkę dyfrakcyjną, aby uzyskać prysznic spektralny. Siatkę należy ustawić blisko konfiguracji Littrowa, aby zmaksymalizować wydajność dyfrakcji.Skonfiguruj zestaw teleskopowych soczewek przekaźnikowych w systemie obrazowania 4f, aby skierować kaskadę widmową na tylną płaszczyznę ogniskowej obiektywu znajdującego się poniżej platformy z próbką. Upewnij się, że kaskada widmowa wypełnia tylną aperturę obiektywu. Umieść drugi obiektyw z lustrem płaskim w jego tylnej aperturze powyżej platformy z próbką.Reguluj obiektywy, aż ich płaszczyzny ogniskowe się pokryją. Zweryfikuj, czy wiązka spektralna przechodzi dwukrotnie przez płaszczyznę obrazu i wraca tą samą drogą do siatki. Umieść chip mikrofluidyczny na platformie z próbką i upewnij się, że wiązka spektralna pada na kanał mikrofluidyczny.Przekieruj powracające światło za pomocą dzielnika wiązki po jego przejściu przez siatkę dyfrakcyjną. Rozdziel powracające światło na dwie wiązki za pomocą kolejnego dzielnika wiązki. Użyj kolimatorów światłowodowych, aby sprzęgnąć wiązki ze światłowodami jednomodowymi o różnych długościach w celu wprowadzenia opóźnienia czasowego między wiązkami.Podłącz włókna do oscyloskopu czasu rzeczywistego za pomocą sprzęga światłowodowego i fotodetektora. Dostrój wzmocnienie wzmacniacza optycznego, aż stosunek sygnału do szumu sygnału optycznego przekroczy 10 decibels. Następnie zablokuj około połowy każdego powracającego wiuki za pomocą nożowych blokad wiuki.Reguluj blokady wiązki, aż zmierzona moc optyczna w każdym włóknie wyniesie około połowy mocy przed blokadą. Zweryfikuj, czy pasmo przenoszenia oraz częstotliwość próbkowania oscyloskopu są wystarczająco wysokie, aby nie wpływać na rozdzielczość obrazu. Aby rozpocząć eksperyment, rozcieńcz próbki komórek do stężenia od 10⁵ do 10⁶ komórek na mililitr za pomocą soli fizjologicznej w buforze fosforanowym lub wody źródlanej.Następnie nabić zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 10 ml. Podłączyć strzykawkę do wlotu kanału mikroprzepływowego. Wylot kanału mikroprzepływowego skierować do probówki wirówkowej.Zabezpiecz strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustaw odpowiednią prędkość przepływu dla szerokości kanału. Wybierz liczbę punktów danych do zapisania dla danego eksperymentu. Następnie zarejestruj i zapisz dane sygnału optycznego.Zdigitalizuj i wyeksportuj dane z oscyloskopu do komputera. Przetwórz dane na obrazy 2D i wyodrębnij z nich bibliotekę parametrów. Zaimportuj obrazy oraz bibliotekę parametrów do programu do wizualizacji.Przypisz interesujący parametr do każdej z osi i wybierz zestaw danych, który ma zostać wyświetlony w formie wykresu punktowego. Sprawdź obrazy komórek powiązane z każdą grupą na wykresie, aby zidentyfikować trendy. W razie potrzeby zastosuj bramkowanie ręczne lub wyświetl dodatkowe zestawy danych w celu przeprowadzenia dalszej analizy.System ATOM został wykorzystany do pozyskania wysokokontrastowych obrazów pojedynczych komórek ludzkich oraz fitoplanktonu. Na obrazach fitoplanktonu widoczne są charakterystyczne struktury komórkowe, takie jak wakuole, pirenoidy i wici. Parametry takie jak wielkość i kolistość komórek zostały wyznaczone na podstawie obrazów z ATOM w celu klasyfikacji komórek do analizy cytometrycznej.Wyniki klasyfikacji można przedstawić w formie dwuwymiarowych wykresów rozrzutu. Przedstawiono tutaj zależność objętości od okrągłości dla komórek MCF7 (oznaczonych kolorem żółtym) oraz PBMC (oznaczonych kolorem czerwonym). W przypadku MCF7 zaobserwowano dwa skupiska.Poprzez identyfikację obrazów o wysokim kontraście odpowiadających poszczególnym punktom danych stwierdzono, że dolna grupa odpowiada fragmentom komórek i debrisowi. Po opanowaniu techniki system obrazowania można skonfigurować w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie to wykonane prawidłowo. Procedury obrazowania można przeprowadzić w ciągu godziny.Podczas pracy ze źródłem laserowym oraz podczas ustawiania wiązki laserowej należy zwrócić szczególną uwagę na bezpieczeństwo oczu. Podczas wykonywania tych procedur należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie okularów ochronnych. Podczas przeprowadzania tej procedury należy monitorować wyrównanie wiązki optycznej przez cały proces konfiguracji systemu obrazowania, aby zapewnić optymalną jakość obrazu.Choć technika ta może dostarczyć cennych informacji na temat wykrywania i ilościowego oznaczania rzadkich lub charakterystycznych komórek w przebiegu choroby, może być ona również zastosowana do klasyfikacji typów komórek w dużych i heterogenicznych populacjach komórkowych. Metoda ta jest szczególnie korzystna w sytuacjach, gdy dąży się do przełamania ograniczeń przepustowości cytometrii obrazowej przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej jakości obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wdrażania metody ATOM, od konfiguracji systemu po procedury obrazowania.

microfluidic-imaging-flow-cytometry-asymmetric-detection-time-stretch

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Przeglądamy nasze ostatnie wyniki dotyczące integracji mikroskopii fluorescencyjnej i narzędzi do obrazowania cytometrii przepływowej w telefonie komórkowym przy użyciu kompaktowych i opłacalnych przystawek opto-fluidycznych. Te urządzenia do mikroanalizy oparte na telefonach komórkowych mogą być przydatne do analizy cytometrycznej, takiej jak wykonywanie różnych zadań związanych z liczeniem komórek, a także do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, np. próbek wody w warunkach ograniczonych...

Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna i obrazowanie fluorescencyjne Cytometria przepływowa w telefonie komórkowym

Mikroskopia konfokalna służy do obrazowania spoczynkowych i przepływających mieszanin koloidowo-polimerowych, które są badane jako układy modelowe dla atrakcyjnych zawiesin. Algorytmy analizy obrazu służą do obliczania wskaźników strukturalnych i dynamicznych dla cząstek koloidalnych, które mierzą zmiany spowodowane ograniczeniem geometrycznym.

Obrazowanie konfokalne ograniczonych mieszanin koloidalno-polimerowych w stanie spoczynku i przepływu

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Test mikrojądrowy in vitro jest dobrze znaną metodą oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii manualnej jest pracochłonna i cierpi z powodu subiektywności i zmienności między punktorami. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Ten protokół opisuje ilościowe podejście do pomiaru autoagregacji drobnoustrojów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Poznaj mikroskopię ATOM do bezetykietowego obrazowania pojedynczych komórek w mikroprzepływie. System umożliwia analizę morfologiczną do 100 000 komórek na sekundę z wysokim kontrastem.

Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM) (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM)

Przeglądaj więcej filmów