Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM)
June 28th, 2017
Ten protokół opisuje implementację systemu mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie do obrazowania pojedynczych komórek w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym oraz jego zastosowania w obrazowaniu cytometrii przepływowej.
Ogólnym celem tego protokołu jest przygotowanie i wykorzystanie systemu mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciągnięciem w czasie do bezznacznikowego obrazowania pojedynczych komórek o wysokim kontraście w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym. Główną zaletą ATOM jest to, że umożliwia ultraszybkie przechwytywanie obrazu z szybkością skanowania liniowego do kilkudziesięciu megaherców, jednocześnie zwiększając kontrast obrazu na nieoznakowanych komórkach. ATOM umożliwia złożoną analizę morfologiczną struktur komórkowych i subkomórkowych z niecentrycznymi testami komórkowymi z prędkością do 100 000 komórek na sekundę, co nie jest możliwe w przypadku standardowej cytometrii przepływowej.
Aby rozpocząć konfigurację systemu, użyj kolimatora światłowodowego, aby połączyć szerokopasmowy laser impulsowy femto lub pico sekundowy w bliskiej podczerwieni z jednomodowym światłowodem dyspersyjnym podłączonym do wzmacniacza optycznego. Oświetl gradację dyfrakcji transmisyjnej za pomocą lasera, aby uzyskać prysznic widmowy. Ustaw profilowanie blisko konfiguracji littrow, aby zmaksymalizować wydajność dyfrakcji.
Skonfiguruj teleskopowy zespół soczewki przekaźnikowej w systemie obrazowania 4f, aby skierować prysznic widmowy na tylną płaszczyznę ogniskową soczewki obiektywu poniżej platformy próbki. Upewnij się, że prysznic spektralny wypełnia tylny otwór soczewki obiektywu. Umieść kolejną soczewkę obiektywu z lustrem płaskim w jej tylnej aperturze nad platformą próbki.
Wyreguluj soczewki obiektywu, aż ich płaszczyzny ogniskowe będą się pokrywać. Sprawdź, czy prysznic widmowy dwukrotnie przechodzi przez płaszczyznę obrazu i podąża tą samą ścieżką z powrotem do gradacji. Umieść chip mikroprzepływowy na platformie próbki i upewnij się, że prysznic widmowy spada w poprzek kanału mikroprzepływowego.
Przekieruj powracające światło za pomocą rozdzielacza wiązki po przejściu przez profilowanie. Podziel odbite światło na dwie wiązki za pomocą innego rozdzielacza wiązki. Użyj kolimatorów światłowodowych, aby połączyć wiązki ze światłowodami jednomodowymi o różnych długościach, aby wprowadzić opóźnienie czasowe między wiązkami.
Podłącz włókna do oscyloskopu w czasie rzeczywistym za pomocą łącznika światłowodowego i fotodetektora. Dostosuj wzmacniacz optyczny wzmocnienie do momentu, aż stosunek sygnału do szumu sygnału optycznego będzie większy niż 10 decybeli. Następnie zablokuj około połowy każdej zwróconej belki blokami belki o krawędzi nożowej.
Dostosuj bloki wiązki, aż zmierzona moc optyczna w każdym włóknie będzie równa około połowie mocy przed blokiem. Sprawdź, czy szerokość pasma oscyloskopu i częstotliwość próbkowania są wystarczająco wysokie, aby nie wpływać na rozdzielczość obrazu. Aby rozpocząć eksperyment, rozcieńczyć próbki komórek do 10 do 5 i od 10 do 6 komórek na mililitr za pomocą buforowanej fosforanami soli fizjologicznej lub wody źródlanej.
Następnie załaduj roztwór komórkowy do 10-mililitrowej strzykawki. Podłączyć strzykawkę do wlotu kanału mikroprzepływowego. Skieruj wylot kanału mikroprzepływowego do probówki wirówkowej.
Zabezpieczyć strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustawić natężenie przepływu odpowiednio do szerokości kanału. Wybierz liczbę punktów danych, które mają zostać zapisane dla eksperymentu. Następnie pozyskaj i zapisz dane sygnału optycznego.
Digitalizacja i eksport danych z oscyloskopu do komputera. Przetwarzaj dane na obrazy 2D i wyodrębniaj bibliotekę parametrów z obrazów. Zaimportuj obrazy z biblioteki parametrów do programu do wizualizacji.
Przypisz interesujący Cię parametr do każdej osi i wybierz zestaw danych, który ma być wyświetlany jako wykres punktowy. Sprawdź obrazy komórek skojarzone z każdą grupą na wykresie, aby zidentyfikować trendy. W razie potrzeby użyj ręcznego bramkowania lub wyświetl dodatkowe zestawy danych do dalszej analizy.
ATOM wykorzystano do uzyskania obrazów pojedynczych komórek o wysokim kontraście komórek ludzkich i fitoplanktonu. Charakterystyczne struktury komórkowe, takie jak wakuole, pirenoidy i wici, są widoczne na obrazach fitoplanktonu. Parametry, takie jak wielkość komórki i okrągłość, zostały określone na podstawie obrazów ATOM w celu sklasyfikowania komórek do analizy cytometrycznej.
Wyniki klasyfikacji mogą być wyświetlane jako wykresy punktowe 2D. Tutaj objętość w funkcji kołowości została wykreślona dla MCF7 pokazanego na żółto i PBMC pokazanego na czerwono. Dla MCF7 zaobserwowano dwa klastry.
Identyfikując obrazy o wysokim kontraście odpowiadające poszczególnym punktom danych, stwierdzono, że dolne skupisko odpowiada fragmentom komórek i szczątkom. Po opanowaniu systemu obrazowania można skonfigurować w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Zabiegi obrazowania można wykonać w ciągu godziny.
Nie zapomnij zwrócić szczególnej uwagi na bezpieczeństwo oczu podczas pracy ze źródłem lasera i wyrównaniem wiązki laserowej. Podczas wykonywania tych procedur należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o monitorowaniu wyrównania wiązki optycznej podczas całego procesu konfiguracji systemu obrazowania, aby zapewnić optymalną jakość obrazowania.
Chociaż technika ta może dostarczyć informacji na temat wykrywania i kwantyfikacji rzadkich lub pozornych komórek podczas procesu chorobowego, może być również stosowana do klasyfikacji typów komórek w dużych i niejednorodnych populacjach komórek. Technika ta jest szczególnie korzystna, gdy chce się przezwyciężyć ograniczenie przepustowości cytometrii obrazowej, przy jednoczesnym zachowaniu jakości obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaimplementować ATOM od konfiguracji systemu do procedur obrazowania.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje implementację systemu mikroskopii optycznej z asymetryczną detekcją i rozciągnięciem czasowym dla obrazu o wysokim kontraście komórek pojedynczych bez użycia znaczników w ultraszybkim przepływie mikrofluidycznym. System ATOM umożliwia ultraszybkie rejestrowanie obrazów i zwiększa kontrast obrazów na nieoznakowanych komórkach, umożliwiając złożoną analizę morfologiczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia optyczna
- Obrazowanie pojedynczych komórek
- Mikrofluidyka
Tło
- ATOM umożliwia obrazy na szybkości skanowania liniowego do kilkudziesięciu megaherców.
- Zwiększa kontrast obrazu dla nieoznakowanych komórek.
- Umożliwia analizę struktur komórkowych i subkomórkowych.
- Obsługuje testy komórkowe o wysokim przepływie.
Cel badania
- Przygotować i użyć systemu mikroskopii optycznej z asymetryczną detekcją i rozciągnięciem czasowym.
- Osiągnąć obrazy bez znaczników o wysokim kontraście pojedynczych komórek.
- Ułatwić obrazy w ultraszybkim przepływie mikrofluidycznym.
Zastosowanie metod
- Ustawienia obejmują użycie kolimatora światłowodowego i bliskiego lasera impulsowego w podczerwieni.
- Połączenie lasera z jednomodowym światłowodem dyspersyjnym.
- Użycie wzmacniacza optycznego do zwiększenia sygnału.
- Oświetlenie siatki dyfrakcyjnej transmisyjnej w celu uzyskania deszczu spektralnego.
Główne wyniki
- Osiągnięto obrazy do 100 000 komórek na sekundę.
- Wykazano zwiększony kontrast dla nieoznakowanych komórek.
- Umożliwiono złożoną analizę morfologiczną, która nie była możliwa z użyciem standardowej cytometrii przepływowej.
- Zapewniono nowe podejście do obrazowań o wysokim przepływie.
Wnioski
- ATOM reprezentuje znaczący postęp w technologii obrazowań pojedynczych komórek.
- Umożliwia szybką i szczegółową analizę struktur komórkowych.
- Ta metoda może zmienić podejście w cytometrii przepływowej i pokrewnych dziedzinach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
ATOM addresses the throughput limitation of imaging flow cytometry by enabling high-speed, label-free single-cell imaging at up to 100,000 cells per second while preserving sub-cellular resolution and image contrast. This capability supports high-confidence statistical analysis through multidimensional morphological data, directly enhancing target validation and phenotypic screening in early discovery. By providing label-free biophysical phenotyping, ATOM complements biochemical assays and improves predictive confidence in cellular classification within heterogeneous populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through label-free morphological analysis of cellular and subcellular structures.
- Operational Value: Supports functional target validation by de-risking mechanistic ambiguity via high-throughput biophysical phenotyping.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating quantitative morphological parameters (e.g., size, circularity) for cytometric classification of cell states and functions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering high-contrast, sub-cellular resolution images without labels or stains.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through ultrafast line scan rates and consistent optical signal processing.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse by enabling imaging flow cytometry at 100,000 cells/s, overcoming traditional throughput bottlenecks.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by detecting rare or aberrant cells in heterogeneous populations, as demonstrated with human cell lines and micro-algae.
- Preclinical Alignment: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through label-free imaging that complements biomarker-based assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement by linking morphological trends to functional outcomes via scatter plot analysis and manual gating.
Pipeline & Workflow Integration
ATOM integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, providing label-free imaging that supports mechanistic de-risking and predictive analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling complex morphological analysis of cellular structures in microfluidic flow.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through high-speed image capture and quantitative parameter extraction from single-cell images.
- Analytics: Provides measurable outputs such as cell size, circularity, and texture for comparative analysis and classification in scatter plots.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling label-free imaging of heterogeneous cell populations, supporting biomarker-independent phenotypic screening.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for high-throughput imaging across model systems, reducing dependency on staining protocols and accelerating assay development cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free morphological de-risking and reduction of ambiguity in cellular classification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via ultrafast imaging and consistent signal-to-noise ratio control (>10 dB).
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of rare or aberrant cells.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative morphological data from high-throughput imaging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical microscopy, ultrafast laser systems, and microfluidic flow control.
- Needs broadband femtosecond/picosecond near-IR pulsed laser, optical amplifier, diffraction grating, and high-bandwidth oscilloscope.
- Demands cross-team standardization for beam alignment, knife-edge blocking, and fiber length calibration to maintain image contrast and timing.
- Involves adaptation considerations for varying cell types and microfluidic channel dimensions to ensure optimal spectral shower coverage.
- Includes practical limitations such as laser safety requirements and the need for precise optical path alignment to avoid resolution degradation.
