Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM)
28 czerwca 2017
Ten protokół opisuje implementację systemu mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie do obrazowania pojedynczych komórek w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym oraz jego zastosowania w obrazowaniu cytometrii przepływowej.
Ogólnym celem tego protokołu jest przygotowanie i wykorzystanie systemu mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciągnięciem w czasie do bezznacznikowego obrazowania pojedynczych komórek o wysokim kontraście w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym. Główną zaletą ATOM jest to, że umożliwia ultraszybkie przechwytywanie obrazu z szybkością skanowania liniowego do kilkudziesięciu megaherców, jednocześnie zwiększając kontrast obrazu na nieoznakowanych komórkach. ATOM umożliwia złożoną analizę morfologiczną struktur komórkowych i subkomórkowych z niecentrycznymi testami komórkowymi z prędkością do 100 000 komórek na sekundę, co nie jest możliwe w przypadku standardowej cytometrii przepływowej.
Aby rozpocząć konfigurację systemu, użyj kolimatora światłowodowego, aby połączyć szerokopasmowy laser impulsowy femto lub pico sekundowy w bliskiej podczerwieni z jednomodowym światłowodem dyspersyjnym podłączonym do wzmacniacza optycznego. Oświetl gradację dyfrakcji transmisyjnej za pomocą lasera, aby uzyskać prysznic widmowy. Ustaw profilowanie blisko konfiguracji littrow, aby zmaksymalizować wydajność dyfrakcji.
Skonfiguruj teleskopowy zespół soczewki przekaźnikowej w systemie obrazowania 4f, aby skierować prysznic widmowy na tylną płaszczyznę ogniskową soczewki obiektywu poniżej platformy próbki. Upewnij się, że prysznic spektralny wypełnia tylny otwór soczewki obiektywu. Umieść kolejną soczewkę obiektywu z lustrem płaskim w jej tylnej aperturze nad platformą próbki.
Wyreguluj soczewki obiektywu, aż ich płaszczyzny ogniskowe będą się pokrywać. Sprawdź, czy prysznic widmowy dwukrotnie przechodzi przez płaszczyznę obrazu i podąża tą samą ścieżką z powrotem do gradacji. Umieść chip mikroprzepływowy na platformie próbki i upewnij się, że prysznic widmowy spada w poprzek kanału mikroprzepływowego.
Przekieruj powracające światło za pomocą rozdzielacza wiązki po przejściu przez profilowanie. Podziel odbite światło na dwie wiązki za pomocą innego rozdzielacza wiązki. Użyj kolimatorów światłowodowych, aby połączyć wiązki ze światłowodami jednomodowymi o różnych długościach, aby wprowadzić opóźnienie czasowe między wiązkami.
Podłącz włókna do oscyloskopu w czasie rzeczywistym za pomocą łącznika światłowodowego i fotodetektora. Dostosuj wzmacniacz optyczny wzmocnienie do momentu, aż stosunek sygnału do szumu sygnału optycznego będzie większy niż 10 decybeli. Następnie zablokuj około połowy każdej zwróconej belki blokami belki o krawędzi nożowej.
Dostosuj bloki wiązki, aż zmierzona moc optyczna w każdym włóknie będzie równa około połowie mocy przed blokiem. Sprawdź, czy szerokość pasma oscyloskopu i częstotliwość próbkowania są wystarczająco wysokie, aby nie wpływać na rozdzielczość obrazu. Aby rozpocząć eksperyment, rozcieńczyć próbki komórek do 10 do 5 i od 10 do 6 komórek na mililitr za pomocą buforowanej fosforanami soli fizjologicznej lub wody źródlanej.
Następnie załaduj roztwór komórkowy do 10-mililitrowej strzykawki. Podłączyć strzykawkę do wlotu kanału mikroprzepływowego. Skieruj wylot kanału mikroprzepływowego do probówki wirówkowej.
Zabezpieczyć strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustawić natężenie przepływu odpowiednio do szerokości kanału. Wybierz liczbę punktów danych, które mają zostać zapisane dla eksperymentu. Następnie pozyskaj i zapisz dane sygnału optycznego.
Digitalizacja i eksport danych z oscyloskopu do komputera. Przetwarzaj dane na obrazy 2D i wyodrębniaj bibliotekę parametrów z obrazów. Zaimportuj obrazy z biblioteki parametrów do programu do wizualizacji.
Przypisz interesujący Cię parametr do każdej osi i wybierz zestaw danych, który ma być wyświetlany jako wykres punktowy. Sprawdź obrazy komórek skojarzone z każdą grupą na wykresie, aby zidentyfikować trendy. W razie potrzeby użyj ręcznego bramkowania lub wyświetl dodatkowe zestawy danych do dalszej analizy.
ATOM wykorzystano do uzyskania obrazów pojedynczych komórek o wysokim kontraście komórek ludzkich i fitoplanktonu. Charakterystyczne struktury komórkowe, takie jak wakuole, pirenoidy i wici, są widoczne na obrazach fitoplanktonu. Parametry, takie jak wielkość komórki i okrągłość, zostały określone na podstawie obrazów ATOM w celu sklasyfikowania komórek do analizy cytometrycznej.
Wyniki klasyfikacji mogą być wyświetlane jako wykresy punktowe 2D. Tutaj objętość w funkcji kołowości została wykreślona dla MCF7 pokazanego na żółto i PBMC pokazanego na czerwono. Dla MCF7 zaobserwowano dwa klastry.
Identyfikując obrazy o wysokim kontraście odpowiadające poszczególnym punktom danych, stwierdzono, że dolne skupisko odpowiada fragmentom komórek i szczątkom. Po opanowaniu systemu obrazowania można skonfigurować w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Zabiegi obrazowania można wykonać w ciągu godziny.
Nie zapomnij zwrócić szczególnej uwagi na bezpieczeństwo oczu podczas pracy ze źródłem lasera i wyrównaniem wiązki laserowej. Podczas wykonywania tych procedur należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o monitorowaniu wyrównania wiązki optycznej podczas całego procesu konfiguracji systemu obrazowania, aby zapewnić optymalną jakość obrazowania.
Chociaż technika ta może dostarczyć informacji na temat wykrywania i kwantyfikacji rzadkich lub pozornych komórek podczas procesu chorobowego, może być również stosowana do klasyfikacji typów komórek w dużych i niejednorodnych populacjach komórek. Technika ta jest szczególnie korzystna, gdy chce się przezwyciężyć ograniczenie przepustowości cytometrii obrazowej, przy jednoczesnym zachowaniu jakości obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaimplementować ATOM od konfiguracji systemu do procedur obrazowania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje implementację systemu optycznej mikroskopii z rozciąganiem czasu i asymetryczną detekcją (ATOM) do bezznakowego obrazowania pojedynczych komórek o wysokim kontraście w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym. System ATOM umożliwia ultraszybką akwizycję obrazów i zwiększa kontrast obrazu nieznakowanych komórek, co pozwala na przeprowadzanie złożonych analiz morfologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia optyczna
- Obrazowanie pojedynczych komórek
- Mikroprzepływy
Wprowadzenie
- ATOM umożliwia obrazowanie przy częstotliwościach skanowania linii sięgających dziesiątek megaherców.
- Zwiększa kontrast obrazu dla nieoznaczonych komórek.
- Pozwala na analizę struktur komórkowych i podkomórkowych.
- Wspiera wysokoprzepustowe testy komórkowe bez konieczności centrowania komórek.
Cel badania
- Przygotowanie i wykorzystanie asymetrycznego systemu mikroskopii optycznej z rozciąganiem czasu detekcji (time-stretch).
- Uzyskanie bezznacznika obrazowania o wysokim kontraście pojedynczych komórek.
- Umożliwienie obrazowania w ultraszybkim przepływie mikrofluidycznym.
Zastosowane metody
- Układ obejmuje zastosowanie kolimatora światłowodowego oraz impulsowego lasera bliskiej podczerwieni (NIR).
- Sprzęganie lasera z dyspersyjnym światłowodem jednomodowym.
- Wykorzystanie wzmacniacza optycznego w celu wzmocnienia sygnału.
- Oświetlenie transmitującego siatki dyfrakcyjnej w celu wytworzenia pryzmatu widmowego.
Główne wyniki
- Osiągnięto obrazowanie do 100 000 komórek na sekundę.
- Wykazano zwiększony kontrast dla nieznakowanych komórek.
- Umożliwiono złożoną analizę morfologiczną, niemożliwą do przeprowadzenia przy użyciu standardowej cytometrii przepływowej.
- Zaproponowano nowe podejście do wysokoprzepustowego obrazowania.
Wnioski
- ATOM stanowi znaczący postęp w technologii obrazowania pojedynczych komórek.
- Umożliwia szybką i szczegółową analizę struktur komórkowych.
- Metoda ta może odmienić podejście w cytometrii przepływowej i dziedzinach pokrewnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
ATOM rozwiązuje problem ograniczonej przepustowości obrazowania w cytometrii przepływowej, umożliwiając szybkie, bezetykietowe obrazowanie pojedynczych komórek z prędkością do 100 000 komórek na sekundę, przy jednoczesnym zachowaniu rozdzielczości podkomórkowej i kontrastu obrazu. Możliwość ta wspiera wysoką wiarygodność analiz statystycznych dzięki wielowymiarowym danym morfologicznym, co bezpośrednio usprawnia walidację celów i screening fenotypowy we wczesnej fazie odkryć. Zapewniając bezetykietowe fenotypowanie biofizyczne, ATOM uzupełnia testy biochemiczne i zwiększa pewność prognostyczną w klasyfikacji komórkowej w obrębie heterogenicznych populacji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez analizę morfologiczną struktur komórkowych i podkomórkowych bez użycia znaczników.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ograniczanie niejednoznaczności mechanistycznej za pomocą wysokoprzepustowego fenotypowania biofizycznego.
- Wartość prognostyczna: Usprawnia selekcję portfolio poprzez generowanie ilościowych parametrów morfologicznych (np. rozmiaru, kolistości) służących do cytometrycznej klasyfikacji stanów i funkcji komórek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy, dostarczając obrazy o wysokim kontraście i rozdzielczości podkomórkowej bez konieczności stosowania znaczników lub barwień.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki ultraszybkim prędkościom skanowania liniowego oraz spójnemu przetwarzaniu sygnałów optycznych.
- Skalowalność: Podkreśla gotowość do wysokoprzepustowych przesiewów oraz możliwość ponownego wykorzystania platformy poprzez umożliwienie cytometrii przepływowej z obrazowaniem przy prędkości 100 000 komórek/s, co pozwala przełamać tradycyjne ograniczenia wydajności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera systemy istotne dla przebiegu chorób poprzez wykrywanie rzadkich lub aberracyjnych komórek w heterogenicznych populacjach, co wykazano na przykładzie ludzkich linii komórkowych oraz mikroalg.
- Zgodność przedkliniczna: Ułatwia przejście od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki obrazowaniu bezznakowemu, które uzupełnia testy oparte na biomarkerach.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia postępy oparte na danych poprzez powiązanie trendów morfologicznych z wynikami funkcjonalnymi za pomocą analizy wykresów rozrzutu i ręcznego bramkowania.
Integracja potoku i przepływu pracy
ATOM integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez we wczesnej fazie odkrywania, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, zapewniając obrazowanie bez znakowania, które wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz analitykę predykcyjną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie złożonej analizy morfologicznej struktur komórkowych w przepływie mikrofluidycznym.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analiz oraz powtarzalność dzięki szybkiemu obrazowaniu i ilościowemu wyodrębnianiu parametrów z obrazów pojedynczych komórek.
- Analityka: Dostarcza mierzalne wyniki, takie jak wielkość komórki, kolistość i tekstura, służące do analizy porównawczej i klasyfikacji na wykresach rozrzutu.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez umożliwienie obrazowania bez znakowania heterogenicznych populacji komórek, wspierając przesiewanie fenotypowe niezależne od biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma do obrazowania wysokoprzepustowego w różnych systemach modelowych, zmniejszając zależność od protokołów barwienia i przyspieszając cykle opracowywania testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej dzięki bezmarkerowej analizie morfologicznej ograniczającej ryzyko oraz redukcja niejednoznaczności w klasyfikacji komórkowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki ultraszybkiemu obrazowaniu oraz spójnej kontroli stosunku sygnału do szumu (>10 dB).
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zmniejszenie ryzyka biologicznego na późnych etapach dzięki możliwości wczesnego wykrywania rzadkich lub aberrantnych komórek.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, w oparciu o ilościowe dane morfologiczne z obrazowania wysokoprzepustowego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu mikroskopii optycznej, ultraszybkich systemów laserowych oraz kontroli przepływu w mikrofluidyce.
- Niezbędny jest szerokopasmowy laser impulsowy femto-/pikosekundowy z bliską podczerwienią (near-IR), wzmacniacz optyczny, siatka dyfrakcyjna oraz oscyloskop o wysokiej szerokości pasma.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie wyrównywania wiązki, blokowania krawędzią noża oraz kalibracji długości światłowodów w celu zachowania kontrastu obrazu i precyzji czasowej.
- Należy uwzględnić dostosowania dla różnych typów komórek i wymiarów kanałów mikrofluidycznych, aby zapewnić optymalny zakres pokrycia widmowego.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wymogi bezpieczeństwa laserowego oraz konieczność precyzyjnego wyrównania drogi optycznej w celu uniknięcia degradacji rozdzielczości.
