Name: Nowatorska metoda izolacji klasy klinicznej okołonaczyniowych komórek zrębowych ludzkich nerek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj nowatorską metodę izolacji okołonaczyniowych komórek zrębowych nerek (kPSCs) z wykorzystaniem perfuzji całego narządu i wzbogacenia komórek NG2. Technika ta umożliwia uzyskanie wystarczającej liczby komórek do zastosowań terapeutycznych w chorobach nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant numer 305436 STELLAR.

Lokalna komisja etyki medycznej i rada doradcza ds. etyki europejskiego konsorcjum (STELLAR) zatwierdziły badania i zbieranie ludzkich nerek do przeszczepu, które zostały odrzucone głównie z powodów chirurgicznych. Zgodę na badania wydano dla wszystkich nerek.
1. Przygotowania do hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Przygotuj pulę lizatów płytek krwi.
	<ol>
		<li>Płytki krwi, które straciły ważność krócej niż 2 dni, należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (maksymalnie przez 1 rok). 
		UWAGA: Płytki krwi zostały pierwotnie pozyskane od komercyjnego dostawcy. Pozyskano materiał z demobilu szpitalnego dystrybuowany przez miejscowy bank krwi.</li>
		<li>Rozmrozić płytki krwi co najmniej 5 dawców (najlepiej 10) O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać płytki krwi w dużej sterylnej butelce, przenieść do stożkowych probówek wirówkowych i wirować przez 10 minut w temperaturze 1 960 x g w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Objętość płytek krwi zależy od liczby dawców i ilości nadmiaru materiału szpitalnego przypadającego na dawcę.</li>
		<li>Odpipetować szwadron do worków z krwią (50 ml/worek) przez cylinder strzykawki o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych.
	<ol>
		<li>Rozmrozić jedną torebkę lizatów płytek krwi w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 1 l (tj. 2 butelki) Minimum Essential Medium - alfa modification (alphaMEM), 5 ml 200 mM glutaminy i 20 ml penicyliny (5 000 U/ml)/streptomycyny (5 000 μg/ml) (wstrzykiwacz/paciorkowiec) do torebki.</li>
		<li>Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Potrząśnij workiem w celu odżelowania, delikatnie stukając w worek, gdy worek spoczywa na płaskiej powierzchni.</li>
		<li>Przefiltrować 5% pożywkę z lizatami płytkowymi, przeciągając lizaty przez filtr systemu do transfuzji za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Podzielić pożywkę na porcje do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Każda nowa partia lizatów płytek krwi jest testowana w hodowli komórkowej i porównywana z poprzednią partią poprzez hodowlę interesujących komórek (bmMSC lub kPSC) do konfluencji w obu partiach. Pod względem liczby komórek i żywotności kPSC lub bmMC wyhodowane w nowej partii nie powinny różnić się o więcej niż 10%, a ekspresja markerów CD73, CD90, CD105 i CD31, CD34 i CD45 analizowana za pomocą cytometrii przepływowej nie powinna się różnić. Metody hodowli komórkowej opisano w sekcji 6 protokołu (Hodowla kPSC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowania do pobierania komórek
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów.
	<ol>
		<li>Przygotować zwykłą pożywkę, dodając 10 ml wstrzykiwacza/paciorkowca do 500 ml (1 butelka) Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12.</li>
		<li>Przygotować pożywkę myjącą, dodając 50 ml normalnej ludzkiej surowicy (NHS) i 10 ml wstrzykiwacza/paciorkowca do 1 butelki DMEM-F12.</li>
		<li>Przygotować bufor enzymatyczny przez dodanie 2,9 ml 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1,2 ml NaHCO3 2,5% [w/v] i 160 μl CaCl2 (1 M) do 160 ml roztworu Uniwersytetu Wisconsin.</li>
		<li>Przygotować roztwór kolagenazy, powoli dodając 20 ml buforu enzymatycznego do butelki kolagenazy klasy GMP zawierającej kolagenazę o stężeniu >2000 j./butelkę. Rozpuścić w temperaturze 4 °C przez około 40 minut. Delikatnie wstrząśnij kilka razy w okresie rozpuszczania.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę do zamrażania, dodając 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do 45 ml NHS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie tacki perfuzyjnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Wyczyść kabinę przepływową i przykryj obłożeniami chirurgicznymi. Podgrzej łaźnię wodną do około 40 - 45 °C, aby podgrzać tackę perfuzyjną do 37 °C. Załóż fartuchy chirurgiczne i rękawice chirurgiczne.</li>
		<li>Podłącz wysterylizowaną tackę perfuzyjną do łaźni wodnej, aby wstępnie podgrzać tackę perfuzyjną ciepłą wodą. Upewnij się, że w tacce perfuzyjnej nie ma powietrza, zaczynając od tacki perfuzyjnej w pozycji pionowej. W razie potrzeby dodaj więcej wody do łaźni wodnej, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do tacki perfuzyjnej.</li>
		<li>Umieść rurkę LS25 w pompie. Pozostaw oba sterylne końce probówki w komorze przepływowej. Umieść kleszcze Kochera na jednym końcu rurki i pozostaw na dnie tacki perfuzyjnej. Umieść sterylną gazę na rurce, aby zapobiec niedrożności. Podłącz złącze Luer na drugim końcu rurki.</li>
		<li>Dodaj około 100 ml zwykłego podłoża do tacki perfuzyjnej i rozpocznij płukanie probówki z prędkością pompy 100 ml/min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja komórek nerkowych
<ol>
	<li>Przygotowanie nerki.
	<ol>
		<li>Wyjmij nerkę z podwójnych sterylnych worków i umieść na sterylnej tacce perfuzyjnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). Usuń okołonerkową tkankę tłuszczową i torebkę nerkową nożyczkami i delikatnym rozdarciem (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C) i zidentyfikuj tętnicę nerkową na plamie aortalnej, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D.</li>
		<li>Kankaniutować tętnicę nerkową za pomocą dodatkowego kolca, przymocować za pomocą wysterylizowanego natarcia i przymocować do końca rurki pompy za pomocą złącza Luer, gdy pompa jest włączona. Jeśli probówki nie są całkowicie napełnione, najpierw dodaj więcej pożywki do tacki i przepłucz rurki, uruchamiając pompę (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E - F). Przepłukać nerkę zwykłym podłożem za pomocą pompy o przepływie 100 ml/min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie kolagenazą i izolacja komórek nerkowych.
	<ol>
		<li>Dodaj kolagenazę (20 ml, >2,000 j.) i DNazę (2,5 ml, 1 mg / ml) do tacki perfuzyjnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G). Od czasu do czasu delikatnie obracaj nerkę ręką. Poczekaj, aż nerka stanie się miękka, a płyn perfuzyjny stanie się mniej przezroczysty (około 30 - 40 min).</li>
		<li>Delikatnie masuj nerkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H), aż do uzyskania zawiesiny komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I). Usunąć niestrawiony materiał i kolec w tętnicy nerkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie i pobieranie komórek nerkowych.
	<ol>
		<li>Dodaj 50 ml NHS do zawiesiny komórek. Opróżnij zawiesinę komórek z tacki perfuzyjnej, ustawiając pompę na niski przepływ i umieszczając rurkę najpierw podłączoną do nerki powyżej probówek o pojemności 50 ml (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1J).</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Umyć granulki środkiem myjącym zawierającym 10% NHS i ponownie odwirować przy 300 x g przez 7 minut. Powtórz pranie jeszcze raz. Zmierz objętość osadów komórkowych i dodaj równą objętość pożywki do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Albo kriokonserwować komórki stąd, dodając pożywkę zamrażającą 1:1 do zawiesiny komórek i przechowywać w fiolkach kriogenicznych zgodnie ze standardowymi protokołami, albo kontynuować hodowlę komórek (sekcja 4). 
		UWAGA: Zawiesina komórkowa zawiera grudki komórek i wymaga dodatkowych kroków w celu uzyskania pojedynczych komórek, co powoduje wzrost śmierci komórki. W związku z tym komórki są utrzymywane w zawiesinie i nie są liczone na tym etapie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa surowych komórek nerkowych
<ol>
	<li>Dodać około 1 ml zawiesiny komórkowej do 24 ml 5% lizatów płytek krwi alphaMEM (pożywka do hodowli komórkowych) w kolbie do hodowli komórkowych T175 (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1K) i hodować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 2 dniach usunąć pożywkę i resztki komórek z przylegających komórek i odświeżyć pożywkę za pomocą 25 ml pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Odświeżać pożywkę dwa razy w tygodniu, usuwając połowę pożywki (12,5 ml) i dodając świeżą pożywkę (12,5 ml) przy użyciu technik aseptycznych.</li>
	<li>Kultura aż do zlewu (zwykle 5 - 7 dni) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1L). Usunąć pożywkę, przemyć dwukrotnie PBS i trypsynizować komórki, dodając 5 ml trypsyny do każdej kolby T175 przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć w pożywce hodowlanej i odwirować przy 490 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
</ol>
5. Wzbogacanie komórek dla NG2 przez magnetyczną separację komórek (Rysunek 1M)
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do separacji komórek zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Ponownie zawiesić trypsynizowane kPSC w 10 ml buforze do separacji komórek. Wirować przy 490 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforze do separacji komórek.</li>
	<li>Dodać 100 μl reagenu blokującego FcR/5 x 107 komórek, dodać 100 μl kulek przeciwczerniakowych (NG2) na 5 x 107 komórek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Oddzielić frakcję NG2-dodatnią zgodnie z protokołem producenta. Dodać 10 ml pożywki i odwirowywać komórki przez 5 minut przy 490 x g.</li>
	<li>Policzyć ogniwa za pomocą komory liczącej Bürker zgodnie z protokołem producenta. Wysiać komórki w kolbie hodowlanej (około 4 x 103 komórki/cm2) i inkubować. 
	UWAGA: Wysiewaj komórki w następujących stężeniach: <250 000 w kolbie T25, 250 000 - 500 000 w kolbie T75 i 700 000 - 800 000 w kolbie T175. Po magnetycznym wzbogaceniu komórek izoluje się frakcję dodatnią około 1 - 2%. Ponieważ jednak ten etap polega na wzbogacaniu komórek, a nie sortowaniu komórek, w hodowli będą obecne inne typy komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1N). Po kilku przejściach (zwykle około 4 - 5) obecna jest tylko jednorodna populacja kPSC (<silna klasa="xfig">Rysunek 1P).</li>
</ol>
6. Kultura kPSC
<ol>
	<li>Odświeżaj pożywkę dwa razy w tygodniu, usuwając połowę pożywki i zastępując ją świeżo rozmrożoną pożywką hodowlaną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1N). 
	UWAGA: kPSC wydają się być bardziej żywotne i proliferacyjne, gdy odświeżana jest tylko połowa pożywki.</li>
	<li>Pasażowanie kPSCs. 
	UWAGA: Przejdź przez kPSC przy zbieganiu 90 - 100% lub gdy pojawią się struktury 3D (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1O), lub gdy nie było wzrostu komórek przez ponad tydzień. Dwa ostatnie mogą szczególnie wystąpić we wczesnych pasażach po wzbogaceniu komórek. W tym przypadku, po pasażowaniu, komórki zwykle zaczynają ponownie rosnąć w hodowli jednowarstwowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1P).
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę z 90 - 100% zlewających się komórek (zachowaj pożywkę do późniejszego użycia). Przemyć kolbę dwukrotnie PBS (1 ml w T25, 5 ml w T75, 10 ml w T175). Dodać trypsynę (0,5 ml w T25, 2 ml w T75, 5 ml w T175) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać starą pożywkę do kolby i delikatnie zawiesić.</li>
		<li>Przenieść do probówki o pojemności 15 lub 50 ml (w zależności od objętości) i odwirować przy 490 x g przez 5 minut. Policz żywe komórki i płytkę <250 000 w T25, 250 000 - 500 000 w T75 lub 700 000 - 800 000 w T175 (około 4 x 103 komórek/cm2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadać kPSC w pasażu 5 lub 6 (np. test zarysowania, sekcja 7). 
	UWAGA: Scharakteryzuj rozmnożone komórki za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu standardowych protokołów. Ekspresja markerów NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC powinna być dodatnia, a CD31, CD34, CD45 i HLA-DR powinna być ujemna. Test na obecność mykoplazmy, bakterii i grzybów w pożywce hodowlanej zgodnie ze standardowymi protokołami klinicznego laboratorium mikrobiologicznego. Przetestuj funkcjonalnie kPSC w teście zadrapania nabłonka nerki. Eksperymenty są zwykle przeprowadzane na sterylnych, potwierdzonych cytometrią przepływową jednorodnych populacjach kPSC o zdolności gojenia się ran między pasażem 6-8.</li>
	<li>Kriokonserwacja kPSC poprzez dodanie 0,5 ml pożywki do 0,5 ml zawiesiny komórek (2 miliony komórek na ml pożywki hodowlanej) przy użyciu standardowych protokołów. 
	UWAGA: Po rozmrożeniu zasiej kPSC o większej gęstości (106 komórek w T175).</li>
</ol>
7. Test funkcjonalny kPSC: Test zadrapań ran nabłonkowych nerek
<ol>
	<li>Hodować kPSC na 6-dołkowej płytce o gęstości 200 000 komórek/basenik w 2 ml pożywki hodowlanej. Po 48 godzinach hodowli w temperaturze 37 °C, 5% CO2 zebrać sklarowany osad. To jest podłoże kondycjonowane.</li>
	<li>Wysiewaj HK-2 (proksymalne komórki nabłonkowe kanalików kanalikowych)17 w 2 ml pożywki z bliższych komórek nabłonka kanalików kanalikowych (PTEC) składającej się ze stosunki 1:1 DMEM-F12 uzupełnionej insuliną (5 mg / ml), transferyną (5 mg / ml), selenem (5 ng / ml), hydrokortyzonem (36 ng / ml), trójjodotyryryną (40 pg / ml), naskórkowym czynnikiem wzrostu (10 ng / ml) i piórem / paciorkowcem, w gęstości 500 000 komórek na studzienkę na 6-dołkowej płytce do hodowli komórek.</li>
	<li>Hodowla przez 48 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z HK-2 i utworzyć ranę zadrapania w monowarstwie HK-2, wykonując rysę końcówką żółtego punktu pipety od góry do dołu studzienki. Przemyć HK-2 PBS i dodać kondycjonowaną pożywkę kPSC lub pożywkę kontrolną. Zaznacz na spodzie tabliczki obszar, który ma być sfotografowany. 
	UWAGA: HK-2 powinny być zlewne. Wyobraź sobie dwa obszary na studzienkę.</li>
	<li>Zobrazuj rysę po 4, 8, 12 i 24 godzinach w tym samym zaznaczonym miejscu za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola.</li>
	<li>Zmierz obszar rysy na obrazie J za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby określić procent zamknięcia.</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+for+fibroblasts+in+different+populations+of+hematopoietic+cells+as+detected+by+the+in+vitro+colony+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.</a> Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+translation+of+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation.</a> Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).</li>
<li>Reinders, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+allograft+rejection+after+renal+transplantation%3A+results+of+a+phase+I+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).</li>
<li>Perico, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stromal+cells+and+kidney+transplantation%3A+a+pilot+study+of+safety+and+clinical+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).</li>
<li>Perico, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+and+kidney+transplantation%3A+pretransplant+infusion+protects+from+graft+dysfunction+while+fostering+immunoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation.</a> Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Sacchetti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+Identical+%22Mesenchymal+Stem+Cells%22+at+Different+Times+and+Sites%3A+Human+Committed+Progenitors+of+Distinct+Origin+and+Differentiation+Potential+Are+Incorporated+as+Adventitial+Cells+in+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myocardial+pericytes%3A+multipotent+mesodermal+precursors+exhibiting+cardiac+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity.</a> Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).</li>
<li>Dekel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+nontubular+sca-1%2Blin-+multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+from+adult+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+duct-derived+cells+display+mesenchymal+stem+cell+properties+and+retain+selective+in+vitro+and+in+vivo+epithelial+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity.</a> J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).</li>
<li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-Grade+Isolated+Human+Kidney+Perivascular+Stromal+Cells+as+an+Organotypic+Cell+Source+for+Kidney+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+mesenchymal+stem+cells+in+human+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).</li>
<li>Ryan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HK-2%3A+an+immortalized+proximal+tubule+epithelial+cell+line+from+normal+adult+human+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney.</a> Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).</li>
<li>Nijhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycemic+Stability+Through+Islet-After-Kidney+Transplantation+Using+an+Alemtuzumab-Based+Induction+Regimen+and+Long-Term+Triple-Maintenance+Immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression.</a> Am J Transplant. , (2015).</li>
</ol>

D.G.L., M.A.E. i T.J.R. są związani ze zgłoszeniem patentowym dotyczącym tych badań. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Komórki okołonaczyniowe zostały wyizolowane z wielu różnych ludzkich narządów stałych, w tym trzustki, tłuszczu, chrząstki i nerek 9,15,16. Większość metod opiera się jednak na małych próbkach tkanek, które są preparowane, a następnie traktowane enzymami trawiennymi. Co więcej, zwykle nie jest to wykonywane w przypadku produktów klasy klinicznej. To sprawia, że strategie te są mniej odpowiednie do bezpośredniej translacji klinicznej, gdzie konieczne są duże ilości komórek klasy klinicznej.
Tutaj pokazujemy nowatorską metodę izolacji ludzkich kPSC dla całych narządów w oparciu o perfuzję z enzymami i materiałami klasy klinicznej. Protokół został zaadaptowany z klinicznych wysepek protokołu izolacji Langerhansa, który jest obecnie stosowany do zastosowań klinicznych w naszym centrum18.
Jest to pierwsza metoda klasy klinicznej, w której można uzyskać duże ilości kPSC. Zmienność wydajności komórek jest w dużej mierze zależna od dawcy. Jednakże, gdy ekstrapoluje się wydajność komórek, którą obecnie uzyskujemy z frakcji surowej zawiesiny komórek trzech różnych dawców, teoretycznie można osiągnąć średnią wydajność 2,7 x10 12 kPSC na dawcę. Ponieważ terapia MSC zazwyczaj składa się z 2 infuzji komórkowych o stężeniu 1-2 x 106 komórek/kg masy ciała4, liczba tych komórek jest wystarczająca do leczenia allogenicznego u kilku pacjentów.
Jednym z krytycznych etapów procedury izolacji jest czas trawienia kolagenazy. Gdy okres trawienia jest zbyt krótki, pozostaną duże grudki tkanki, które będą trudniejsze do wyhodowania. Gdy okres perfuzji jest zbyt długi, można zaobserwować zwiększoną śmierć komórek. Dlatego, gdy tylko nerka zacznie stawać się miękka, a płyny mniej przezroczyste, nerkę należy delikatnie masować i przerwać leczenie kolagenazą.
Kolejnym krytycznym krokiem jest hodowla komórek po wzbogaceniu komórek NG2. Czasami po wzbogaceniu komórek NG2 komórki okołonaczyniowe nie zaczynają się namnażać ani nie zaczynają rosnąć w strukturach 3D. W takim przypadku, gdy komórki są trypsynizowane i ponownie wysiewane, komórki zwykle zaczynają rosnąć w hodowli jednowarstwowej.
Jako materiał wyjściowy wykorzystano ludzkie nerki do przeszczepu, odrzucane głównie z przyczyn chirurgicznych. Są to funkcjonalne narządy bez większego zwłóknienia. Zdajemy sobie sprawę, że może to być ograniczenie, ponieważ jest to stosunkowo rzadkie i trudne do zdobycia źródło narządów. Innym źródłem mogą być wyeksplantowane nerki; Jednak w zależności od przyczyny eksplantacji nerek, nerki te mogą zawierać więcej zwłóknienia, a tym samym miofibroblastów, dlatego należy zachować ostrożność, ponieważ miofibroblasty mogą być izolowane i hodowane zamiast komórek okołonaczyniowych.
Ponieważ kPSC wyizolowane za pomocą tego protokołu wykazują właściwości organotypowe i zdolność gojenia się ran nabłonka nerek15, terapia komórkowa kPSC w chorobach nerek i transplantacji byłaby interesującym zastosowaniem w przyszłości. W tym celu istnieje kilka strategii dostarczania produktu komórkowego/komórkowego. Pierwszą strategią jest dożylna infuzja kPSC, stosowana obecnie w badaniach klinicznych bmMSC. Innym ciekawym zastosowaniem jest zastosowanie kPSC lub czynników wydalanych przez kPSC w perfuzji maszynowej przed przeszczepem. W ten sposób jakość eksplantowanej nerki może ulec poprawie, co może prowadzić do poprawy funkcji nerek po przeszczepie. W przypadku obu strategii kPSC są interesującym nowym źródłem komórek, które można dalej badać do celów klinicznych.

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to komórki modulujące układ odpornościowy, które pierwotnie zostały wyizolowane ze szpiku kostnego. Charakteryzują się morfologią w kształcie wrzeciona, zdolnością do różnicowania się w tłuszcz, kości i chrząstki oraz przyleganiem plastycznym. MSC wyrażają markery zrębowe CD73, CD90, CD105, podczas gdy są ujemne dla markerów CD31 i CD451,2,3. MSCs są obiecującym kandydatem do terapii komórkowej ze względu na ich zdolności homeostatyczne i immunomodulacyjne tkanek. bmMSC są obecnie badane w badaniach klinicznych dla kilku chorób, w tym chorób nerek i przeszczepów nerek, jak omówiono w innym miejscu4.
Poprzednio wykazano, że komórki okołonaczyniowe z kilku różnych organów stałych, w tym tkanki tłuszczowej, łożyska i mięśni szkieletowych, mają wspólne cechy z MSCs9. Jednak komórki te wykazują również funkcje specyficzne dla tkanki, które mogą prowadzić do naprawy organotypowej10. Na przykład ludzkie komórki okołonaczyniowe mięśnia sercowego stymulowały odpowiedzi angiogenne po niedotlenieniu i różnicowały się w kardiomiocyty, podczas gdy komórki okołonaczyniowe wyizolowane z innych tkanek nie wykazywały tych potencjałów11.
Komórki zrębu okołonaczyniowego mogą być również izolowane z myszy12,13,14 i ludzkiej nerki15,16. Szczegółowo scharakteryzowaliśmy kPSC i porównaliśmy je z bmMSC. Odkryliśmy, że kPSC, podobnie jak bmMSC, mają zdolności immunosupresyjne i mogą wspierać tworzenie splotów naczyniowych. Istnieją jednak specyficzne tkankowo różnice między typami komórek, ponieważ kPSC wykazywały organotypową sygnaturę ekspresji transkrypcyjnej, w tym nefrogenne czynniki transkrypcyjne HoxD10 i HoxD11. kPSC, w przeciwieństwie do bmMSC, nie ulegały transformacji miofibroblastów po stymulacji TGF-β i nie były w stanie różnicować się w adipocyty. Co więcej, kPSC przyspieszyły integralność nabłonka w teście zadrapania rany nabłonka kanalików nerkowych, zjawiska, którego nie zaobserwowano w przypadku bmMSC. To ulepszone gojenie się ran było pośredniczone przez uwalnianie czynnika wzrostu hepatocytów. Co więcej, kPSC złagodziły uszkodzenie nerek w mysim modelu ostrego uszkodzenia nerek15. Dlatego wydaje się, że kPSC mają lepsze zdolności naprawcze nerek i są interesującym nowym źródłem terapii komórkowej w chorobach nerek.
Aby móc używać kPSC do celów terapii komórkowej, kPSC powinny być izolowane w sposób kliniczny za pomocą enzymów i protokołów klasy klinicznej. Ponadto, aby móc leczyć kilku pacjentów z kPSC od 1 dawcy, należy uzyskać wystarczającą liczbę komórek. Tutaj szczegółowo pokazujemy procedurę izolacji kPSC w stopniu klinicznym z całych nerek do przeszczepu, uzyskując wystarczającą liczbę komórek do wykorzystania w klinicznej terapii komórkowej.

<table><tbody><tr><td>Worki Baxter</td><td>Fenwal</td><td>R4R-7004</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie płytki krwi</td><td>Nadwyżka materiału szpitalnego Sanquin</td><td></td><td>przeterminowana na mniej niż 2 dni używany</td></tr><tr><td>jest lizat</td><td></td><td></td> płytkowy <td>wykonane na zamówienie</td></tr><tr><td>Jednorazowe sterylne butelki</td><td>Corning</td><td>09-761-11</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe PP 500 ml</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM średni</td><td>Lonza</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>glutamax</td><td>thermo fisher</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>długopis/paciorkowiec&nbsp;</td>System transfuzji <td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Codan</td><td>455609</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>life technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica ludzka (NHS)</td><td>Sanquin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Lonza</td><td>BE-17-737E</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 7.5%</td><td>Lonza</td><td>BE17-613E</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>UW</td><td>Most do życia</td><td>32911</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Leo Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza NB1 GMP klasa</td><td>SERVA</td><td>17455.03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>serwety chirurgiczne</td><td>3M Nederland</td><td>DH999969404</td><td></td></tr><tr><td>pompa perfuzyjna</td><td>metrohm</td><td>x007528300</td><td></td></tr><tr><td>głowica pompy</td><td>metrohm</td><td>x077202600</td><td></td></tr><tr>taca <td></td><td></td><td>perfuzyjna</td><td>wykonana na zamówienie</td></tr><tr><td>rurki masterflex LS25 Kolec</td> akcesoriów <td>Masterflex</td><td>HV-96410-25</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gambro DASCO</td><td>6038020</td><td></td></tr><tr><td>pulmozyme</td> Kolby <td>hodowlane Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 cm2</td><td>greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>kolba hodowlana 75 cm2</td><td>greiner</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>kolba hodowlana 175 cm2</td><td>greiner</td><td>661160</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>sigma</td><td>t4174</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500g</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR</td><td>miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>kulki przeciw czerniakowi (NG2)</td> <td>miltenyi</td><td>130-090-452</td><td></td></tr><tr><td>sitko komórkowe 70 i mikro; m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnes MACS</td><td>miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555821</tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555485</tr><tr><td>CD146 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>550315</tr><tr><td>NG2 APC</td><td>R& D</td><td>FAB2585A</td><td></td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555596</tr><tr><td>HLA ABC APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555555</tr><tr><td>CD105 FITC</td><td>Ancell</td><td>326-040</td><td></td></tr><tr><td>HLA DR APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>559866</tr><tr><td>CD56 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555516</tr><tr><td>CD73 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>550257</tr><tr><td>CD31 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555445</tr><tr><td>CD133 PE</td><td>miltenyi</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-r&nbsp;</td><td>R& Mysz D</td><td>mab 1263</td><td></td></tr><tr><td>IgG1 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>345815 mysz IgG1 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>345816 mysz IgG1 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345818</tr><tr><td>IgG2b PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555743</tr><tr><td>koza przeciw myszy PE</td><td>Dako</td><td>R0480</td><td></td></tr><tr><td>azydek sodu</td><td>Merck</td><td>822335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Szynka ' s F12</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulina, transferyna, selen)</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>trójjodotyrynina</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Unieśmiertelnione ludzkie nerkowe PTEC (HK2)</td><td></td><td></td> <td>dzięki uprzejmości M. Ryana, kolegium uniwersyteckie w Dublinie</td></tr></tbody></table>

nowatorska metoda izolacji klasy klinicznej okołonaczyniowych komórek zrębowych ludzkich nerek

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to homeostatyczne i immunomodulujące komórki, które wykazały korzystne działanie w chorobach nerek i transplantacji. Komórki zrębu okołonaczyniowego (PSC) mają wspólne cechy z MSC szpiku kostnego (bmMSC). Posiadają one jednak również, najprawdopodobniej ze względu na miejscowe imprinting, właściwości specyficzne dla tkanek i odgrywają rolę w lokalnej homeostazie tkanek. Ta specyficzność tkankowa może powodować naprawę specyficzną dla tkanki, również w obrębie ludzkiej nerki. Wcześniej wykazaliśmy, że ludzkie PSC nerek (kPSC) przyspieszają gojenie się ran nabłonkowych nerek, podczas gdy bmMSC nie mają tego potencjału. Co więcej, kPSC mogą łagodzić uszkodzenia nerek in vivo. W związku z tym kPSC stanowią interesujące źródło w terapii komórkowej, szczególnie w chorobach nerek i transplantacji nerek. Tutaj pokazujemy szczegółową metodę izolacji i hodowli kPSC z ludzkich nerek do przeszczepu, opartą na perfuzji enzymów trawiennych w całym narządzie przez tętnicę nerkową i wzbogaceniu w marker okołonaczyniowy NG2. W ten sposób można uzyskać duże ilości komórek, które są odpowiednie do terapii komórkowej.

Metoda izolacji kPSC klasy klinicznej została przedstawiona w Rysunku 1. Surowe komórki nerek są izolowane z ludzkich nerek klasy transplantacyjnej poprzez perfuzję kolagenazą. Otrzymana zawiesina komórkowa jest hodowana w 5% lizatach płytek krwi aż do uzyskania konfluencji. Następnie frakcja peryvaskularnych komórek zrębowych jest izolowana na podstawie ekspresji NG2.
kPSC są adherentnymi do tworzywa sztucznego komórkami o wrzecionowatym kształcie (Rysunek 2A) i wykazują dodatnią ekspresję markerów stromalnych CD73, CD90, CD105 oraz markerów okołonaczyniowych NG2, PDGFR-B i CD146, natomiast są ujemne dla CD31, CD34, CD45 i HLA-DR (Rysunek 2B). Zazwyczaj jednorodna populacja kPSC jest uzyskiwana w 4. pasażu, a kPSC wchodzą w stan senescencji około 9. – 10. pasażu (Rysunek 2C). Dlatego zalecamy przeprowadzanie eksperymentów między 5. a 8. pasażem.
Aby ocenić zdolność funkcjonalną wyizolowanych kPSC, przeprowadzamy test gojenia rany in vitro komórek nabłonkowych nerek dla każdej nowej partii kPSC, ponieważ wcześniej wykazaliśmy, że medium warunkowane kPSC może przyspieszać gojenie rany nabłonkowej w tym teście15. Medium warunkowane kPSC przygotowuje się poprzez hodowlę kPSC przez 48 h w pożywce alphaMEM z 5% lizatami płytek krwi, a następnie poprzez zebranie nadsączu. Następnie uwiecznione ludzkie komórki nabłonkowe kanalików proksymalnych nerek (HK-2)17 są hodowane do momentu osiągnięcia konfluencji, po czym wykonuje się zadrapanie (ranę). Następnie do dołków dodaje się medium warunkowane kPSC lub medium kontrolne, a następnie mierzy się szybkość gojenia rany. Po dodaniu medium warunkowanego kPSC rana zamyka się znacznie szybciej (Rysunek 2D).
<img alt="Metody izolacji komórek nerek i hodowli kPSC, schematy, proces perfuzji, zawiesina komórkowa, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Metoda izolacji ludzkich kPSC w stopniu klinicznym. Nerki klasy transplantacyjnej są kaniulowane i poddawane perfuzji kolagenazą poprzez tętnicę nerkową (A - G), a otrzymana zawiesina komórkowa jest płukana i następnie krio konserwowana lub poddana hodowli (H - K). Po osiągnięciu przez komórki konfluencji (L) przeprowadzane jest wzbogacenie w komórki NG2 (M). Komórki są trypsynizowane, gdy osiągną konfluencję, przestaną proliferować lub gdy pojawią się struktury 3D (N - P). Kryteriami dopuszczenia kPSC są sterylność, ekspresja markerów oraz zdolność do wspomagania gojenia ran nabłonka cewkowego (Q). Strzałka: tętnica nerkowa. Pasek skali = 200 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Charakterystyka komórek macierzystych: obraz mikroskopowy, cytometria przepływowa, krzywa wzrostu, test gojenia ran." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Charakterystyka ludzkich kPSC. A) kPSC są komórkami wrzecionowatymi, przylegającymi do tworzywa sztucznego. B) kPSC wykazują pozytywną ekspresję markerów mezenchymalnych CD73, CD90, CD105 oraz markerów okołonaczyniowych NG2, PDGFR-β i CD146, natomiast są negatywne dla CD31, CD34 i CD45. kPSC wykazują ekspresję cząsteczek MHC klasy I (HLA-ABC), ale nie klasy II (HLA-DR). C) Charakterystyka wzrostu kPSC od trzech różnych dawców; cytometria przepływowa potwierdziła homogeniczne populacje NG2-dodatnie (w pasażu 4). kPSC osiągają stan starzenia około 9–10 pasażu. D) kPSC są w stanie wspomagać regenerację nabłonka nerek w teście zarysowania rany (wound scratch assay). Przedstawiono reprezentatywne obrazy dla pożywki kontrolnej oraz pożywki warunkowanej kPSC w czasie t=0, 4, 8 i 12 h. Pasek skali w A) = 200 µm, w D) = 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę izolacji i hodowli komórek zrębu okołonaczyniowego nerek (kPSC) opartą na perfuzji całego narządu za pomocą enzymów trawiennych i wzbogacaniu komórek NG2. Dzięki tej metodzie możliwe jest uzyskanie wystarczającej liczby komórek do terapii komórkowej.

Nowatorska metoda izolacji klasy klinicznej okołonaczyniowych komórek zrębowych ludzkich nerek

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

Ogólnym celem tej metody izolacji klasy klinicznej jest wyizolowanie ludzkich okołonaczyniowych komórek zrębowych nerek, lub kPSC, w celu zastosowania w terapii komórkowej różnych chorób nerek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak uzyskanie ludzkich kPSC odpowiednich do terapii komórkowej chorób nerek oraz transplantacji. Głównymi zaletami tej techniki są jej charakter kliniczny oraz możliwość wygenerowania wystarczającej liczby kPSC na potrzeby terapii komórkowej.Ellen Lievers, technik w naszym laboratorium, zaprezentuje testy funkcjonalne kPSC. Przed rozpoczęciem procedury izolacji komórek nerkowych, podłącz sterylną taczkę perfuzyjną do kąpieli wodnej w pozycji pionowej. Gdy taczką perfuzyjną zostanie rozgrzana przez wodę, zmień jej położenie na poziome, zachowując połączenie z kąpielą wodną, a następnie umieść rurkę L/S 25 w pompie.Umieść pęsetę do kultur na jednym końcu rurki i pozwól rurce spocząć na dnie tacki. Na górze rurki połóż jałową gazę, aby zapobiec zapchaniu, a do drugiego końca rurki przymocuj konektor luer; następnie wlej do tacki około 100 mililitrów pożywki i rozpocznij płukanie rurki L/S 25 przy prędkości pompy 100 mililitrów na minutę. Aby wyizolować komórki nerkowe, przenieś nerkę z podwójnych jałowych worków na jałową tackę perfuzyjną, a następnie za pomocą nożyczek i delikatnego rozdzierania usuń okołonerkową tkankę tłuszczową oraz torebkę nerkową.Po zlokalizowaniu tętnicy nerkowej na płacie aorty, należy użyć pomocniczego kolca do kaniulacji tętnicy nerkowej, a następnie zabezpieczyć kolca sterylną opaską zaciskową. Przy włączonej pompie należy podłączyć koniec rurki pompy do złącza Luer. Następnie należy przepłukać nerkę pożywką znajdującą się w kuwecie, stosując natężenie przepływu 100 mililitrów na minutę.Następnie do kuwety perfuzyjnej należy dodać 20 ml kolagenazy i 2,5 ml DNazy, a następnie pozostawić enzymy w celu strawienia nerki, delikatnie obracając organ ręcznie od czasu do czasu, aż stanie się on miękki, a płyn perfuzyjny zacznie mętnieć. Czas trwania trawienia kolagenazą jest krytyczny; zbyt krótki czas doprowadzi do powstania skupisk komórek, natomiast zbyt długi spowoduje obumarcie komórek. Po zakończeniu perfuzji enzymatycznej należy delikatnie masować nerkę do momentu uzyskania zawiesiny komórkowej, a następnie usunąć materiał niestrawiony oraz kolczaste fragmenty.Dodaj 50 mililitrów prawidłowej ludzkiej surowicy do zawiesiny komórkowej, a następnie, przy niskim natężeniu przepływu pompy, umieść probówkę podłączoną do nerki nad kilkoma probówkami zbiorczymi o pojemności 50 mililitrów, aby umożliwić spływ zawiesiny komórkowej z tacy perfuzyjnej do probówek zbiorczych. Po zebraniu wszystkich komórek odwiruj zawiesiny komórkowe i przemyj osady dwukrotnie medium piorącym uzupełnionym o 10% prawidłowej ludzkiej surowicy. Po drugim przemyciu ponownie zawieś osady w objętości pożywki do hodowli komórek równej objętości osadów komórkowych.Aby hodować surowe komórki nerkowe, należy dodać około 1 ml zawiesiny komórkowej do 24 ml pożywki do hodowli komórkowej alpha-MEM z 5% lizatem płytek krwi na każdą kolbę T 175, a następnie inkubować kolby w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po dwóch dniach należy usunąć supernatant oraz szczątki komórkowe i dostarczyć komórkom 25 ml świeżej pożywki do hodowli. Po osiągnięciu konfluencji komórek, frakcję pozytywną pod kątem NG2 należy wyizolować za pomocą magnetycznej separacji komórek zgodnie ze standardowymi protokołami.Następnie wysiej 4 × 10³ komórek NG2-dodatnich na centymetr kwadratowy w odpowiednio dobranej wielkości kolbie do hodowli komórkowej i umieść kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną 90–100% konfluencji, zbierz supernatant i dwukrotnie przemyj przylegające komórki w PBS. Odklej komórki, stosując odpowiednią objętość trypsyny w zależności od wielkości kolby, zatrzymując reakcję za pomocą zachowanego supernatantu po pięciu minutach.Delikatnie resuspender komórki, następnie przenieść zawiesinę komórkową do odpowiedniej wielkości probówki stożkowej do wirowania i ponownie wysiać komórki z gęstością 4 × 10³ komórek na cm². Czasami po wzbogaceniu o NG2 komórki przestają proliferować lub zaczynają tworzyć struktury 3D. Można to rozwiązać poprzez trypsynizację komórek i ich ponowne wysianie.Po czterech do pięciu pasażach wysiej kPSC na płytkę sześcio-dołkową w stężeniu 2 × 10⁵ komórek na 2 ml pożywki na dołek, a komórki nabłonka kikutów cewnych w liczbie 5 × 10⁵ wysiej na osobną płytkę sześcio-dołkową w 2 ml pożywki dla komórek nabłonka kikutów cewnych na dołek. Umieść obie płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 48 godzin; po zakończeniu inkubacji zbierz nadsącz z hodowli kPSC, następnie usuń nadsącz z komórek nabłonka kikutów cewnych i za pomocą żółtej końcówki do pipety wykonaj rysę w monowarstwie komórek na dnie każdego dołka. Przemyj porysowane komórki roztworem PBS i dodaj pożywkę warunkowaną z hodowli komórek zrębu naczyniowego nerek.Następnie należy wykonać obrazowanie zadrapania po 4, 8, 12 i 24 godzinach w tym samym zaznaczonym położeniu przy użyciu odwróconego mikroskopu w polu jasnym, aby ocenić procent zamknięcia rany w czasie. Nerkowe komórkit stromalne okołonaczyniowe to komórki przylegające do plastiku, o wrzecionowatym kształcie, wykazujące pozytywny wynik dla markerów komórek stromalnych i okołonaczyniowych oraz negatywny dla markerów CD31, CD34, CD45 i HLA-DR. Zazwyczaj jednorodną populację nerkowych komórek stromalnych okołonaczyniowych można uzyskać w czwartym pasażu, przy czym komórki osiągają stan senescencji około dziewiątego lub dziesiątego pasażu.W tym reprezentatywnym teście gojenia ran (wound scratch assay), przeprowadzonym w celu oceny wydolności funkcjonalnej kPSC, po dodaniu pożywki kondycjonowanej z hodowli peryvaskularnych komórek zrębowych nerki, rana zamknęła się znacznie szybciej niż w studzienkach hodowanych w pożywce kontrolnej. Po opanowaniu techniki izolacji pierwotnej, która zajmuje około dwóch godzin, uzyskanie homogennej populacji kPSC zajmie od jednego do dwóch miesięcy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przerwać traktowanie kolagenazą, gdy tylko nerka stanie się miękka, a płyny staną się mniej przezroczyste.Oprócz zaprezentowanych tutaj procedur, techniki te mogą być również wykorzystane do izolacji komórek zrębowych naczyniowych z innych narządów miąższowych. kPSC izolowane tą metodą mogą służyć do badania potencjału regeneracyjnego tych komórek w kilku różnych modelach chorób nerek i transplantacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie izolować i hodować kPSC w sposób zgodny ze standardami klinicznymi.Należy pamiętać, że praca z materiałem pochodzenia ludzkiego niesie ze sobą ryzyko przeniesienia wirusów; podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak testowanie w kierunku HIV, zapalenia wątroby typu B oraz zapalenia wątroby typu C.

a-novel-clinical-grade-isolation-method-for-human-kidney-perivascular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje metodę izolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych od nerek myszy. Otrzymane w ten sposób kapsułkowane i zdecapsulowane kłębuszki nerkowe mogą być dalej wykorzystywane do hodowli komórek nabłonka ciemieniowego z mysiej nerki.

Izolacja kłębuszków nerkowych: technika uzyskiwania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z mysiej nerki

W tym filmie pokazujemy kroki izolacji i oczyszczania komórek nabłonka kanalików nerkowych dla szerokiego zakresu badań biologii molekularnej i hodowli komórkowych.

Izolacja mysich komórek nerkowych: technika izolowania i generowania pierwotnej kultury komórek nabłonka kanalików nerkowych

Ten protokół opisuje decelularyzację nerek szczura Sprague Dawley poprzez wstępną perfuzję detergentów przez układ krwionośny, wytwarzając bezkomórkowe matryce zewnątrzkomórkowe nerek, które służą jako szablony do ponownego zasiedlenia ludzkimi komórkami nabłonka nerkowego. Recelularyzacja i zastosowanie testu perfuzji resazuryny do monitorowania wzrostu odbywa się w specjalnie zaprojektowanych bioreaktorach perfuzyjnych.

Repopulacja komórek nabłonkowych i przygotowanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej gryzoni do rozwoju tkanki nerkowej

Techniki, które są niezawodne i skuteczne w izolacji komórek odpornościowych nerek, są potrzebne do dalszych zastosowań. Wymaga to znakowania powierzchniowego przeciwciałami niewielkiej liczby komórek odpornościowych nerek. W niniejszym artykule opisujemy zwięzłą metodę izolacji komórek odpornościowych nerek, która pozornie osiąga ten cel.

Niezawodna i wysokowydajna izolacja komórek odpornościowych nerek

Inżynierskie konstrukty nerkowe dostarczają rozwiązania na niedobór narządów i szkodliwe skutki dializy. W tym miejscu opisujemy protokół mikropreparacji mysich nerek w celu izolacji segmentów korowo-rdzeniowych. Segmenty te są wszczepiane do konstruktów komórkowych wolnych od rusztowań, tworząc organoidy nerkowe.

Mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań

Głównym celem tego protokołu jest efektywne izolowanie żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków nerkowych z minimalnymi zanieczyszczeniami do wykorzystania w różnych dalszych zastosowaniach. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zachowują relacje strukturalne między typami komórek składowych i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.

Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

Prezentowany tutaj jest protokół do opracowania spersonalizowanego systemu organ-on-a-chip, który podsumowuje strukturę i funkcję bariery filtracyjnej kłębuszków nerkowych poprzez integrację genetycznie dopasowanych komórek nabłonka i śródbłonka naczyniowego, zróżnicowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Ten bioinżynieryjny system może przyczynić się do rozwoju medycyny precyzyjnej nerek i powiązanych zastosowań.

Izogeniczny chip kłębuszków nerkowych zaprojektowany z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Artykuł opisuje metodę izolowania warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych z nerek transgenicznych myszy wykazujących ekspresję termolabilnego wirusa małp 40 i fotoaktywowalnych mitochondriów,PhAM wyciętych. Opisujemy procedurę izolacji kłębuszków nerkowych z całych nerek za pomocą kulek, etapów trawienia, wysiewu i hodowli GECs-CD31 dodatnich.

Izolacja warunkowo unieśmiertelnionych komórek śródbłonka kłębuszków nerkowych myszy z fluorescencyjnymi mitochondriami

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Przedstawiamy zoptymalizowany protokół przetwarzania całych ludzkich nerek w celu izolacji i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych kanałów proksymalnych nerek oraz zastosowanie tych komórek w trójwymiarowej, mikrofluidycznej, mikrofizjologicznej platformie do ponownego odtworzenia kanału proksymalnego nerk.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka nabłonka proksymalnego ludzkiego i ich zastosowanie w tworzeniu mikrofizjologicznego modelu kanału bliższego nerki

To badanie opracowało zoptymalizowany protokół izolacji mysich komórek mezangialnych (MC) i ich hodowli komórkowej ex vivo. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek.

Optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych

Poznaj nowatorską metodę izolacji okołonaczyniowych komórek zrębowych nerek (kPSCs) z wykorzystaniem perfuzji całego narządu i wzbogacenia komórek NG2. Technika ta umożliwia uzyskanie wystarczającej liczby komórek do zastosowań terapeutycznych w chorobach nerek.

Nowatorska metoda izolacji klasy klinicznej okołonaczyniowych komórek zrębowych ludzkich nerek

Przeglądaj więcej filmów