Nowatorska metoda izolacji klasy klinicznej okołonaczyniowych komórek zrębowych ludzkich nerek

Ogólnym celem tej metody izolacji klasy klinicznej jest wyizolowanie ludzkich okołonaczyniowych komórek zrębowych nerek, lub kPSC, w celu zastosowania w terapii komórkowej różnych chorób nerek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak uzyskanie ludzkich kPSC odpowiednich do terapii komórkowej chorób nerek oraz transplantacji. Głównymi zaletami tej techniki są jej charakter kliniczny oraz możliwość wygenerowania wystarczającej liczby kPSC na potrzeby terapii komórkowej.

Ellen Lievers, technik w naszym laboratorium, zaprezentuje testy funkcjonalne kPSC. Przed rozpoczęciem procedury izolacji komórek nerkowych, podłącz sterylną taczkę perfuzyjną do kąpieli wodnej w pozycji pionowej. Gdy taczką perfuzyjną zostanie rozgrzana przez wodę, zmień jej położenie na poziome, zachowując połączenie z kąpielą wodną, a następnie umieść rurkę L/S 25 w pompie.

Umieść pęsetę do kultur na jednym końcu rurki i pozwól rurce spocząć na dnie tacki. Na górze rurki połóż jałową gazę, aby zapobiec zapchaniu, a do drugiego końca rurki przymocuj konektor luer; następnie wlej do tacki około 100 mililitrów pożywki i rozpocznij płukanie rurki L/S 25 przy prędkości pompy 100 mililitrów na minutę. Aby wyizolować komórki nerkowe, przenieś nerkę z podwójnych jałowych worków na jałową tackę perfuzyjną, a następnie za pomocą nożyczek i delikatnego rozdzierania usuń okołonerkową tkankę tłuszczową oraz torebkę nerkową.

Po zlokalizowaniu tętnicy nerkowej na płacie aorty, należy użyć pomocniczego kolca do kaniulacji tętnicy nerkowej, a następnie zabezpieczyć kolca sterylną opaską zaciskową. Przy włączonej pompie należy podłączyć koniec rurki pompy do złącza Luer. Następnie należy przepłukać nerkę pożywką znajdującą się w kuwecie, stosując natężenie przepływu 100 mililitrów na minutę.

Następnie do kuwety perfuzyjnej należy dodać 20 ml kolagenazy i 2,5 ml DNazy, a następnie pozostawić enzymy w celu strawienia nerki, delikatnie obracając organ ręcznie od czasu do czasu, aż stanie się on miękki, a płyn perfuzyjny zacznie mętnieć. Czas trwania trawienia kolagenazą jest krytyczny; zbyt krótki czas doprowadzi do powstania skupisk komórek, natomiast zbyt długi spowoduje obumarcie komórek. Po zakończeniu perfuzji enzymatycznej należy delikatnie masować nerkę do momentu uzyskania zawiesiny komórkowej, a następnie usunąć materiał niestrawiony oraz kolczaste fragmenty.

Dodaj 50 mililitrów prawidłowej ludzkiej surowicy do zawiesiny komórkowej, a następnie, przy niskim natężeniu przepływu pompy, umieść probówkę podłączoną do nerki nad kilkoma probówkami zbiorczymi o pojemności 50 mililitrów, aby umożliwić spływ zawiesiny komórkowej z tacy perfuzyjnej do probówek zbiorczych. Po zebraniu wszystkich komórek odwiruj zawiesiny komórkowe i przemyj osady dwukrotnie medium piorącym uzupełnionym o 10% prawidłowej ludzkiej surowicy. Po drugim przemyciu ponownie zawieś osady w objętości pożywki do hodowli komórek równej objętości osadów komórkowych.

Aby hodować surowe komórki nerkowe, należy dodać około 1 ml zawiesiny komórkowej do 24 ml pożywki do hodowli komórkowej alpha-MEM z 5% lizatem płytek krwi na każdą kolbę T 175, a następnie inkubować kolby w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po dwóch dniach należy usunąć supernatant oraz szczątki komórkowe i dostarczyć komórkom 25 ml świeżej pożywki do hodowli. Po osiągnięciu konfluencji komórek, frakcję pozytywną pod kątem NG2 należy wyizolować za pomocą magnetycznej separacji komórek zgodnie ze standardowymi protokołami.

Następnie wysiej 4 × 10³ komórek NG2-dodatnich na centymetr kwadratowy w odpowiednio dobranej wielkości kolbie do hodowli komórkowej i umieść kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną 90–100% konfluencji, zbierz supernatant i dwukrotnie przemyj przylegające komórki w PBS. Odklej komórki, stosując odpowiednią objętość trypsyny w zależności od wielkości kolby, zatrzymując reakcję za pomocą zachowanego supernatantu po pięciu minutach.

Delikatnie resuspender komórki, następnie przenieść zawiesinę komórkową do odpowiedniej wielkości probówki stożkowej do wirowania i ponownie wysiać komórki z gęstością 4 × 10³ komórek na cm². Czasami po wzbogaceniu o NG2 komórki przestają proliferować lub zaczynają tworzyć struktury 3D. Można to rozwiązać poprzez trypsynizację komórek i ich ponowne wysianie.

Po czterech do pięciu pasażach wysiej kPSC na płytkę sześcio-dołkową w stężeniu 2 × 10⁵ komórek na 2 ml pożywki na dołek, a komórki nabłonka kikutów cewnych w liczbie 5 × 10⁵ wysiej na osobną płytkę sześcio-dołkową w 2 ml pożywki dla komórek nabłonka kikutów cewnych na dołek. Umieść obie płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 48 godzin; po zakończeniu inkubacji zbierz nadsącz z hodowli kPSC, następnie usuń nadsącz z komórek nabłonka kikutów cewnych i za pomocą żółtej końcówki do pipety wykonaj rysę w monowarstwie komórek na dnie każdego dołka. Przemyj porysowane komórki roztworem PBS i dodaj pożywkę warunkowaną z hodowli komórek zrębu naczyniowego nerek.

Następnie należy wykonać obrazowanie zadrapania po 4, 8, 12 i 24 godzinach w tym samym zaznaczonym położeniu przy użyciu odwróconego mikroskopu w polu jasnym, aby ocenić procent zamknięcia rany w czasie. Nerkowe komórkit stromalne okołonaczyniowe to komórki przylegające do plastiku, o wrzecionowatym kształcie, wykazujące pozytywny wynik dla markerów komórek stromalnych i okołonaczyniowych oraz negatywny dla markerów CD31, CD34, CD45 i HLA-DR. Zazwyczaj jednorodną populację nerkowych komórek stromalnych okołonaczyniowych można uzyskać w czwartym pasażu, przy czym komórki osiągają stan senescencji około dziewiątego lub dziesiątego pasażu.

W tym reprezentatywnym teście gojenia ran (wound scratch assay), przeprowadzonym w celu oceny wydolności funkcjonalnej kPSC, po dodaniu pożywki kondycjonowanej z hodowli peryvaskularnych komórek zrębowych nerki, rana zamknęła się znacznie szybciej niż w studzienkach hodowanych w pożywce kontrolnej. Po opanowaniu techniki izolacji pierwotnej, która zajmuje około dwóch godzin, uzyskanie homogennej populacji kPSC zajmie od jednego do dwóch miesięcy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przerwać traktowanie kolagenazą, gdy tylko nerka stanie się miękka, a płyny staną się mniej przezroczyste.

Oprócz zaprezentowanych tutaj procedur, techniki te mogą być również wykorzystane do izolacji komórek zrębowych naczyniowych z innych narządów miąższowych. kPSC izolowane tą metodą mogą służyć do badania potencjału regeneracyjnego tych komórek w kilku różnych modelach chorób nerek i transplantacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie izolować i hodować kPSC w sposób zgodny ze standardami klinicznymi.

Należy pamiętać, że praca z materiałem pochodzenia ludzkiego niesie ze sobą ryzyko przeniesienia wirusów; podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak testowanie w kierunku HIV, zapalenia wątroby typu B oraz zapalenia wątroby typu C.