Indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer

Ogólnym celem tej metody jest wywołanie różnicowania komórkowego bakterii Vibrio parahaemolyticus i utworzenie populacji zróżnicowanych komórek roju, łatwo dostępnych do analizy pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta pomoże naukowcom zrozumieć, w jaki sposób bakterie regulują organizację wewnątrzkomórkową podczas różnicowania i morfogenezy komórek. Ponieważ obrazowanie komórek w społecznościach bakteryjnych może być trudne, główną zaletą tej techniki jest to, że tworzy ona populację zróżnicowanych komórek roju, które istnieją w pojedynczej warstwie komórkowej łatwo dostępnej do analizy mikroskopowej pojedynczych komórek.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku lepszego zrozumienia, w jaki sposób bakterie regulują zmiany w cyklu komórkowym, morfologii komórki i organizacji wewnątrzkomórkowej podczas różnicowania komórkowego. Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niezawodna indukcja różnicowania komórkowego i tworzenie komórek dostępnych do analizy pojedynczych komórek jest trudne do osiągnięcia. Aby przygotować roztwór agaru do przygotowania płytek rojowych, zawiesić cztery gramy naparu z serca lub proszku H.I.agar i 100 mililitrów podwójnie destylowanej wody.

Ostrożnie zagotuj roztwór H.I.agar w kuchence mikrofalowej, potrząsając butelką od czasu do czasu, aż proszek się rozpuści. Autoklawować roztwór agaru w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut, schłodzić roztwór agaru do 60 t0 65 stopni Celsjusza przy ciągłym mieszaniu. Następnym krokiem jest obchodzenie się z 2,2'Bipyridylem, który jest wysoce toksyczny, dlatego należy nosić rękawice i okulary ochronne.

Dodać 2,2'Bipirydyl do końcowego stężenia 50 mikromolowych. Dodać chlorek wapnia do końcowego stężenia czterech młynów. Zaszczepij niewielką ilość komórek V.parahaemolyticus z krawędzi pojedynczej kolonii do 5 mililitrów bulionu LB.

Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsarką, aż osiągnie gęstość optyczną przy 600 nanometrach 0,8. Zwykle zajmuje to około dwóch do trzech godzin. Podczas gdy hodowla komórkowa rośnie, odpipetuj od 30 do 35 mililitrów końcowego roztworu H.I.agar na okrągłą 150-milimetrową szalkę Petriego i pozwól agarowi zastygnąć.

Tuż przed zauważeniem hodowli komórkowej osusz płytkę agarową pionowo z otwartą pokrywką w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 10 minut lub do momentu, gdy wszelkie pozostałości płynu znikną, ale nie dłużej. Umieść jeden mikrolitr kultury komórkowej na środku płytki roju H.I.agar i pozwól plamie wyschnąć. Uszczelnij płytkę przezroczystą taśmą z tworzywa sztucznego, uważając, aby nie tworzyć się pęcherzyków powietrza i zagięć na taśmie.

Inkubuj płytkę w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez noc. Spowoduje to powstanie kolonii roju V.Parahaemolyticus z rozbłyskami roju rozciągającymi się od środka kolonii, jak pokazano na tym klipie wideo poklatkowym. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest przygotowanie szkiełek agarozowych do mikroskopii.

Dodaj jeden gram agarozy do 100 mililitrów 20% PBS i 10% roztworu bulionu. Ostrożnie zagotuj roztwór w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę, a następnie pozwól mu ostygnąć do 65 do 70 stopni Celsjusza, mieszając z mieszadłem magnetycznym. Umieść czysty szkiełko mikroskopowe na idealnie wypoziomowanej części stołu roboczego.

Przymocuj szkiełko do stołu, zakrywając oba końce szkiełka dwiema warstwami taśmy do etykietowania laboratoryjnego ogólnego przeznaczenia. Odległość między dwoma kawałkami taśmy powinna wynosić około trzech centymetrów. Odpipetować około 250 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu agarozy na niepokrytą szklaną powierzchnię.

Umieść drugi szkiełko mikroskopowe w tej samej orientacji, co dolny szkiełko na górze i lekko dociśnij, aby resztki agarozy mogły wypłynąć na boki. Niech agaroza zestali się na jedną do dwóch minut. Użyj skalpela, aby odciąć wszelkie resztki agarozy, które są przymocowane do boków szkiełka mikroskopowego.

Gdy agaroza zastygnie, powoli ściągnij górną szkiełko z dolnej ruchem poziomym. Powoli usuń taśmę z końców szkiełka mikroskopowego. Szkiełko agarozowe należy zużyć tak szybko, jak to możliwe, ponieważ powoli zacznie wysychać.

Bezpośrednio przed przeniesieniem komórek roju na szkiełko mikroskopowe należy za pomocą skalpela odciąć plastikową taśmę od wcześniej przygotowanej płytki roju. Podczas wycinania agaru rojowego ważne jest, aby skierować cięcie od zewnątrz do wnętrza roju kolonii, aby uniknąć zanieczyszczenia rozbłysków roju komórkami pochodzącymi ze środka kolonii. Użyj świeżego skalpela, aby wyciąć kawałek agaru rojowego o wymiarach trzy milimetry na 10 milimetrów od najbardziej zewnętrznej krawędzi rojącej się kolonii, upewniając się, że nacięcia są skierowane od zewnątrz krawędzi roju do wnętrza kolonii.

Przenieś kawałek agaru rojowego na szkiełko agarozowe mikroskopu z komórkami skierowanymi w stronę podkładki agarozowej, aby odcisnąć komórki roju na podkładce agarozowej. Po odczekaniu około 30 sekund ostrożnie wyjmij kawałek agaru z podkładki agarozowej. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na podkładce agarozowej w miejscu, w którym odciśnięto komórki.

Komórki są teraz gotowe do mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazowanie stereomikroskopowe kolonii roju V.parahaemolyticus w rosnącym powiększeniu pokazuje rozbłyski roju rozciągające się od obrzeży kolonii roju. Komórki w rozbłyskach są pogrupowane tylko w mono lub dwuwarstwy, podczas gdy komórki w środku kolonii roju są ułożone w wielu warstwach.

Obrazowanie mikroskopowe DIC ujawniło, że rozbłyski składają się tylko z w pełni zróżnicowanej populacji komórek roju, podczas gdy komórki ze środka kolonii roju są znacznie krótsze i prawdopodobnie reprezentują mieszaninę komórek pływaka i roju. Jako dowód tej zasady, obrazowanie DIC i mikroskopia fluorescencyjna przeprowadzono na dzikich komórkach pływaka i roju V.Parahaemolyticus, eksprymujących ektopowo niezbędne białko chemotaksji, YFP-CheW. W komórkach pływaka YFP-CheW lokalizuje się w sposób jednobiegunowy i dwubiegunowy, ale w komórkach roju YFP-CheW jest zawsze zlokalizowany dwubiegunowo i tworzy również klastry rozmieszczone losowo na całej długości komórki.

Zmiany we wzorcu lokalizacji YFP-CheW podczas różnicowania komórek od pływaka do roju wykazano również za pomocą pokazów rozkładu ognisk i analiz demograficznych profili intensywności fluorescencji. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek drobnoustrojów do zbadania, w jaki sposób bakteria Vibrio parahaemolyticus reguluje swoją wewnętrzną organizację podczas odrębnych zróżnicowanych stanów komórek pływaka i roju. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować różnicowanie komórkowe bakterii Vibrio parahaemolyticus i jak przygotować populację zróżnicowanych komórek roju do analizy pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Nie zapominaj, że Vibrio parahaemolyticus jest ludzkim patogenem i należy stosować odpowiednie procedury i przepisy dotyczące postępowania z patogenami BSL 2 w Twoim regionie.