Name: Indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj metodę indukcji różnicowania komórkowego u Vibrio parahaemolyticus i tworzenia populacji komórek swarmer do analizy mikroskopowej pojedynczych komórek. Technika ta umożliwia badanie organizacji wewnątrzkomórkowej podczas różnicowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Towarzystwo Maxa Plancka.

1. Przygotowanie elektrokompetentnych komórek V. parahaemolyticus i elektroporacja plazmidowego DNA do komórek pływaka
UWAGA: Poniższa sekcja protokołu pozwala na przygotowanie elektrokompetentnych komórek i późniejsze elektroportowanie plazmidowego DNA do komórek pływaka. Ten krok jest ważny, jeśli białka fluorescencyjne ulegają ektopowej ekspresji z plazmidu.
<ol>
	<li>Komórki V. parahaemolyticus należy rozsiać po wyrobisku glicerolu o temperaturze -80 °C na świeżą płytkę agarową LB zawierającą 100 μg/ml ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zaszczepić 200 ml pożywki LB pojedynczą kolonią V. parahaemolyticus i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach wstrząsania, aż do osiągnięcia OD600 wynoszącego 1,0. Zwykle potrzeba 5-6 godzin inkubacji, aby hodowla komórkowa osiągnęła pożądaną gęstość optyczną.</li>
	<li>Natychmiast przenieść komórki na lód i wykonać wszystkie dalsze czynności na lodzie i w wirówkach wstępnie schłodzonych o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbierać komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant przez dekantację i ponownie zawiesić osad komórkowy w 25 ml lodowatego roztworu sacharozy o stężeniu 273 mM (pH 7,4, buforowanego KOH).</li>
	<li>Ponownie zebrać komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 2000 x g. Powtórzyć jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić przemyty osad komórkowy w 400 μl lodowatego roztworu sacharozy o stężeniu 273 mM. Następnie dodać glicerol do końcowego stężenia 15% obj./obj. Ogniwa są teraz gotowe do elektroporacji, ale można je również zamrozić w porcjach 70 μl w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Do elektroporacji należy wymieszać 70 μl podwielokrotności elektrokompetentnych ogniw ze 100 - 1000 ng plazmidowego DNA i przenieść mieszaninę do lodowatej kuwety do elektroporacji (odstęp elektrody 0,2 cm). Wykonaj elektroporację z następującymi ustawieniami: 25 μF, 2400 V i 200 Ω.</li>
	<li>Zawiesić komórki w kuwecie do elektroporacji w 600 μl bulionu LB, przenieść do probówki o pojemności 2 ml i inkubować, wytrząsając w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Odwiruj komórki przy 2,000 x g przez 5 minut i ponownie zawieś granulkę w 100 μl bulionu LB. Rozprowadzić zawiesinę komórkową na selektywnych płytkach agarowych LB zawierających niezbędne antybiotyki i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia sprawdź płytki pod kątem tworzenia kolonii. Kolonie, które rosną, mają prawidłowy gen oporności na antybiotyki zakodowany w plazmidzie i mogą być teraz wykorzystywane do dalszych eksperymentów.</li>
</ol>
2. Indukcja różnicowania komórek roju
UWAGA: Poniższe kroki opisują, jak wywołać różnicowanie V. parahaemolyticus w cyklu życia komórki roju i jak stymulować proliferację na powierzchniach stałych.
<ol>
	<li>Zawiesić 4 g agaru do naparu sercowego (HI) w 100 ml ddH2O w celu przygotowania płytek rojowych.</li>
	<li>Ostrożnie zagotuj roztwór agaru HI w kuchence mikrofalowej i od czasu do czasu potrząsaj butelką, aż proszek się rozpuści. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min.</li>
	<li>Po sterylizacji w autoklawie schłodzić agar HI do temperatury 60-65 °C. Dodać 2,2'-bipirydyl do końcowego stężenia 50 μM (roztwór podstawowy 50 mM w 100% etanolu). Dodać CaCl2 do końcowego stężenia 4 mM (roztwór podstawowy 4 M w ddH2O). Jeśli to konieczne, dodaj antybiotyki do roztworu, aby utrzymać plazmidy. 
	UWAGA: Jeśli planujesz użyć indukowalnego plazmidu, dodaj środek indukujący do jego końcowego stężenia. 
	UWAGA: 2,2'-Bipirydyl: Ostra toksyczność (doustna, skórna, wziewna). Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną należy używać rękawic i okularów ochronnych.</li>
	<li>Wlać 30 - 35 ml końcowego roztworu agaru HI do okrągłej szalki Petriego o średnicy 150 mm i pozwolić agarowi zastygnąć.</li>
	<li>Tuż przed wykryciem hodowli komórkowej suszyć płytkę agarową w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut (lub do momentu, gdy wszelkie pozostałości płynu znikną, ale nie dłużej) w pionie z otwartą pokrywką. 
	UWAGA: Czas suszenia w dużym stopniu zależy od używanego inkubatora, a mocno wysuszone płytki nie pozwolą na rojenie się V. parahaemolyticus. (Ten krok jest bardzo ważny!) Talerze muszą być świeże i nie powinny być starsze niż 2 - 3 godziny. Stare talerze będą zbyt suche, aby stymulować rojenie.</li>
	<li>Zaszczepij niewielką ilość komórek z krawędzi pojedynczej kolonii do 5 ml bulionu LB. Inkubować kulturę, wstrząsając w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia OD600 = 0,8, zwykle trwa to około 2-3 godzin. Następnie komórki są gotowe do nakrycia na płytkach agarowych roju HI.</li>
	<li>Umieścić 1 μl kultury komórkowej w środku płytki do roju agaru HI (ryc. 1A).</li>
	<li>Pozostaw miejsce do wyschnięcia (Rysunek 1B).</li>
	<li>Uszczelnij płytkę przezroczystą plastikową taśmą i upewnij się, że jest dobrze przymocowana, w przeciwnym razie może się odczepić podczas nocnej inkubacji (Rysunek 1C). 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby uszczelka była idealna. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza i fałd na taśmie podczas jej nakładania.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 24 °C przez noc. Spowoduje to powstanie kolonii roju V. parahaemolyticus z rozbłyskami roju rozciągającymi się od obrzeży kolonii roju (ryc. 2).</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek roju V. parahaemolyticus do mikroskopii fluorescencyjnej
UWAGA: Poniższy protokół opisuje, jak przygotować mikroskopowe preparaty agarozowe i następnie odciskać rozbłyski roju na podkładce agarozowej, aby uzyskać pojedyncze komórki roju do mikroskopii.
<ol>
	<li>Aby przygotować szkiełka agarozowe do mikroskopii, dodaj 1 g agarozy do 100 ml roztworu bulionu PBS o stężeniu 20% obj. / obj. i 10% obj. LB. Ostrożnie zagotuj roztwór w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę i pozwól jej ostygnąć do 65-70 °C, mieszając z mieszadłem magnetycznym.</li>
	<li>Umieść czyste szkiełko mikroskopowe na idealnie wypoziomowanej części stołu roboczego. Przykryj oba końce prowadnicy dwiema warstwami uniwersalnej laboratoryjnej taśmy etykietowej, mocując prowadnicę do stołu roboczego. Odległość między dwoma kawałkami taśmy powinna wynosić około 3 cm. 
	UWAGA: Dwie warstwy taśmy tworzą bardzo małą wysokość, która określi wysokość podkładki agarozowej. Ważne jest, aby przestrzeń robocza była wypoziomowana, aby upewnić się, że komórki będą znajdować się w tej samej płaszczyźnie do analizy mikroskopowej.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą ~ 250 μL uprzednio przygotowanego roztworu agarozy na niepokrytą powierzchnię szkła.</li>
	<li>Teraz umieść drugie szkiełko mikroskopowe w tej samej orientacji co dolne na górze i lekko dociśnij je, aby resztki agarozy mogły wypłynąć na boki.</li>
	<li>Pozwól agarozie zastygnąć przez 1-2 minuty, a następnie powoli ściągnij górną szklankę z dolnej w ruchu poziomym.</li>
	<li>Za pomocą skalpela odetnij wszelkie resztki agarozy, które są przymocowane do boków szkiełka mikroskopowego i powoli usuń taśmę z końców szkiełka mikroskopowego. 
	UWAGA: Szkiełko agarozowe jest teraz gotowe i należy je zużyć jak najszybciej, ponieważ zacznie powoli wysychać.</li>
	<li>Aby przeprowadzić mikroskopię na komórkach roju, wytnij kawałek agaru rojowego o wymiarach ~3 mm x 10 mm z najbardziej zewnętrznej krawędzi kolonii roju (ryc. 1D). Bardzo ważne jest, aby nie zerwać uszczelki taśmy na płytce roju aż do momentu bezpośrednio przed przeniesieniem komórek roju na szkiełko mikroskopowe. Po usunięciu taśmy rojące się komórki V. parahaemolyticus inicjują różnicowanie w komórki pływaka. 
	UWAGA: Upewnij się, że nacięcia są kierowane od zewnątrz krawędzi roju kolonii do wnętrza kolonii (Rysunek 1D). W ten sposób można zapobiec "zanieczyszczeniu pływaka" na krawędzi rojącej się kolonii.</li>
	<li>Przenieś kawałek agaru rojowego na szkiełko agarozowe mikroskopu z komórkami skierowanymi w stronę podkładki agarozowej (ryc. 1E). To odciska rojące się komórki na poduszce agarozy.</li>
	<li>Po odczekaniu ~30 s ostrożnie wyjmij kawałek agaru z podkładki agarozowej (Rysunek 1F).</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na podkładce agarozowej, w której odciśnięto komórki. Komórki są teraz gotowe do mikroskopii. 
	UWAGA: Ważne jest, aby natychmiast zobrazować komórki roju, ponieważ komórki roju powoli inicjują różnicowanie do stanu pływaka.</li>
</ol>
4. Przygotowanie kultur komórkowych V. parahaemolyticus pływaków do mikroskopii fluorescencyjnej
UWAGA: Ta sekcja protokołu opisuje, jak przygotować hodowlę V. parahaemolyticus do przeprowadzenia mikroskopii fluorescencyjnej na typie komórek pływaka.
<ol>
	<li>Zaszczepij niewielką ilość komórek z krawędzi pojedynczej kolonii do 5 ml bulionu LB. Inkubować kulturę, wstrząsając w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę lub do momentu, gdy widoczny stanie się niewielki wzrost komórek.</li>
	<li>Na tym etapie, jeśli to konieczne, dodać środek indukujący do ekspresji interesujących nas białek. W tym przykładzie L-arabinoza została dodana do końcowego stężenia 0,2% (w/vol) w celu wywołania ekspresji YFP-CheW9.</li>
	<li>Inkubować kulturę, wstrząsając przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wykonaj kroki 3.1-3.7, aby przygotować szkiełka agarozowe do mikroskopii.</li>
	<li>Umieść 1 μl kultury komórkowej na środku podkładki agarozowej i pozwól plamce inkubować, aż wyschnie.</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na podkładce agarozowej, na której wykryto komórki. Komórki są teraz gotowe do obrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
Ta część protokołu opisuje proces analizy obrazu, a w szczególności sposób ekstrakcji danych fluorescencyjnych pojedynczych komórek do analizy demograficznej.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem analizy obrazu upewnij się, że wszystkie obrazy mikroskopowe są zapisane w 16-bitowym formacie TIF.</li>
	<li>Załaduj do oprogramowania obraz DIC (lub kontrast fazowy) i odpowiadające mu obrazy kanałów fluorescencyjnych.</li>
	<li>Wygeneruj obraz nakładki obu kanałów, wybierając opcję "Wyświetlanie/Nakładanie obrazów". Ustaw liczbę obrazów ("# Images:") na dwa i wybierz obraz DIC w pierwszym kanale i obraz fluorescencyjny w drugim kanale.</li>
	<li>Wybierz narzędzie "Multi-Line" z paska narzędzi i zaznacz komórki od jednego bieguna do drugiego przez środek komórki. Aby uzyskać listę wszystkich wygenerowanych linii (obiektów linii), otwórz "Pomiary miary/regionu". Skonfiguruj pomiary regionu tak, aby wyświetlała tylko etykietę regionu, odległość i średnią intensywność.</li>
	<li>Dostosuj rozmiar piksela w sekcji "Zmierz/Kalibruj odległości" do rozmiaru piksela specyficznego dla konfiguracji mikroskopu i kliknij "Zastosuj do wszystkich otwartych obrazów".</li>
	<li>Przenieś wszystkie obszary (obiekty liniowe) na obraz kanału fluorescencyjnego. W sekcji "Regiony/Regiony transferu" wybierz obraz źródłowy (obraz nakładki) i obraz docelowy (obraz kanału fluorescencyjnego). Wybierz "Wszystkie regiony" i naciśnij "OK". 
	UWAGA: Aby móc później odtworzyć dokładne linie (obiekty linii, regiony, ROI), otwórz "Regiony/Zapisz regiony" i zapisz regiony.</li>
	<li>Wyeksportuj wszystkie pomiary regionów do arkusza kalkulacyjnego, otwierając "Pomiary miary/regionu" i naciskając "Otwórz dziennik". Potwierdź, aby otworzyć i wyeksportować dane. Po otwarciu arkusza kalkulacyjnego w tle na koniec wyeksportuj dane, naciskając "F9: Dane dziennika".</li>
	<li>Aby określić położenie ognisk fluorescencyjnych wzdłuż komórki, otwórz "Measure/Linescan". Ustaw "Szerokość skanowania linii" na wartość, aby cała szerokość komórki była pokryta przez wcześniej utworzony region. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres skanowania linii i wybierz "Pokaż dane wykresu". Klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając kursor myszy wzdłuż skanowania linii do interesującego punktu, w oknie "Dane wykresu" zostanie wyświetlony odpowiedni piksel/odległość między dwoma punktami. Zaznacz podświetlony na niebiesko wiersz, a następnie skopiuj zawartość. 
	UWAGA: Cały profil intensywności skanowania linii można zapisać w arkuszu kalkulacyjnym, naciskając "Dane dziennika" w oknie "Linescan". Wyodrębnione dane można teraz wykorzystać do wizualizacji na wykresach lub dalszej analizy statystycznej. Wzorce lokalizacji w cyklu komórkowym można łatwo zobrazować w demograficznej reprezentacji długości komórki i intensywności fluorescencji wzdłuż ciała komórki. Te reprezentacje można uzyskać przy użyciu tych samych wcześniej wybranych ROI. W poniższych krokach przedstawiono przykład generowania danych demograficznych podobnych do tych pokazanych na rysunkach 3C i 4C.
	<ol>
		<li>W Fiji/ImageJ załaduj oznaczenia regionu (.rgn) utworzone wcześniej w oprogramowaniu (krok 5.6) za pomocą "Importera plików Metamorph nd & ROI". Alternatywnie, obszary zainteresowania (ROI) komórek, które mają być analizowane, można utworzyć bezpośrednio w Fiji/ImageJ za pomocą wbudowanego narzędzia "Segmented Line".</li>
		<li>Otwórz "Analizuj/Narzędzia/Menedżer ROI" i zaznacz wszystkie aktywne wpisy listy".</li>
		<li>Następnie kliknij "Więcej/Wiele działek", a następnie wybierz "Lista" w nowym oknie "Wiele działek". Kliknij wpis w tabeli, a następnie wybierz i "skopiuj wszystko". Następnie wklej do nowego arkusza kalkulacyjnego. 
		UWAGA: Upewnij się, że dane najdłuższej komórki (dwie odpowiadające sobie kolumny X i Y z największą liczbą wierszy) znajdują się jako ostatnie po prawej stronie arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>Zapisz arkusz kalkulacyjny jako plik "CSV (rozdzielany przecinkami)" (*.csv)".</li>
		<li>Pobierz skrypty języka R z tego miejsca "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles"10. Skrypty sortują komórki według długości i normalizują profile intensywności fluorescencji wszystkich komórek jako średnią fluorescencji każdej komórki.</li>
		<li>Uruchom cały skrypt "funkcja profili komórek. R" w R [wersja 3.0.1;11].</li>
		<li>Edytuj "przykładowe wykresy. R" w wierszu 30 tak, że ścieżka pliku odnosi się do folderu, w którym zapisany jest wcześniej wygenerowany plik .csv. Ponadto zmień nazwę pliku "profile.csv" w wierszu 31 na nazwę pliku wybraną dla pliku wygenerowanego .csv kroku 5.9.4. Następnie uruchom "przykładowe wykresy". R" i postępuj zgodnie z dokumentacją z "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles", a także komentarzami z pliku skryptu, aby wygenerować analizę demograficzną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+dynamometer+controls+swarmer+cell+differentiation+of+V.+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li>
<li>Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sodium-driven+polar+flagellar+motor+of+marine+Vibrio+as+the+mechanosensor+that+regulates+lateral+flagellar+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression.</a> Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).</li>
<li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+swarming+in+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus.</a> Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).</li>
<li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature%2C+salts%2C+pH%2C+and+other+factors+on+the+development+of+peritrichous+flagella+in+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus.</a> Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).</li>
<li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+swarming+of+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus.</a> Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+iron+regulate+swarming+and+type+III+secretion+in+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).</li>
<li>McCarter, L., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+regulation+of+swarmer+cell+differentiation+of+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li>
<li>Heering, J., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Localization+of+Chemotactic+Signaling+Arrays+during+the+Lifecycle+of+Vibrio+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus.</a> Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).</li>
<li>Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+synthesis+machinery+in+Agrobacterium+tumefaciens+during+unipolar+growth+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li>
<li>Development Core Team, R. F. F. S. C. <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">R: A Language and Environment for Statistical Computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673(2008).</li>
<li>Ringgaard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ParP+prevents+dissociation+of+CheA+from+chemotactic+signaling+arrays+and+tethers+them+to+a+polar+anchor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).</li>
<li>Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+ParA-like+ATPases+promotes+cell+pole+maturation+by+facilitating+polar+localization+of+chemotaxis+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins.</a> Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).</li>
<li>Vischer, N. O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+age+dependent+concentration+of+Escherichia+coli+divisome+proteins+analyzed+with+ImageJ+and+ObjectJ%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ.</a> Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).</li>
<li>Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nat. Microbiol. 1, 16077(2016).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+Imaging%2C+and+Quantification+of+Bacterial+Surface+Motility+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays.</a> J. Vis. Exp. (98), e52338(2015).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+An+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+Automated+Time-lapse+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W artykule przedstawiono metodę obrazowania mikroskopowego komórek roju V. parahaemolyticus, a następnie dalsze analizy mające na celu rozwiązanie i ilościowe określenie lokalizacji subkomórkowej i innych cech badanych białek znakowanych fluorescencyjnie. Chociaż istnieje kilka narzędzi do przetwarzania i analizy obrazów mikroskopowych 14,15,16,17,18, analiza komórek roju V. parahaemolyticus pozostaje wyzwaniem, głównie dlatego, że zwykle występują one w gęstej społeczności<...

Bakterie nieustannie doświadczają zmian w swoim środowisku zewnętrznym i rozwinęły kilka technik, aby odpowiednio zmienić i dostosować swoje zachowanie. Jeden z takich mechanizmów polega na różnicowaniu się w odrębne typy komórek, które lepiej uzupełniają zmienione środowisko. Różnicowanie często wiąże się z poważnymi zmianami w regulacji cyklu komórkowego, morfologii komórek i czasoprzestrzennej organizacji komórek. Jednym z organizmów, który może ulegać różnicowaniu, jest Vibrio parahaemolyticus. V. parahaemolyticus należy do rodziny Vibrionaceae, która jest rodziną proteobakterii, które zwykle zamieszkują słodką lub słoną wodę. Vibrionaceae są szeroko rozpowszechnione w środowisku i obejmują kilka gatunków, które powodują infekcje przewodu pokarmowego u ludzi, w tym również Vibrio cholerae.V. parahaemolyticus jest organizmem dymorficznym i jest w stanie różnicować się w dwa odrębne typy komórek w odpowiedzi na zmiany w swoim środowisku zewnętrznym. W środowisku wodnym występuje jako krótka komórka pływaka w kształcie pręta z pojedynczą polarną wicią umieszczoną na starym biegunie komórki. Po kontakcie z powierzchnią wyzwalane jest różnicowanie się w komórkę roju. Różnicowanie komórek roju obejmuje dwie główne zmiany: morfogenezę komórek roju poprzez hamowanie podziału komórek oraz indukcję drugiego systemu wici. Powoduje to powstanie okołoskórej i bardzo wydłużonej komórki roju w kształcie pręcika, która może albo kontynuować styl życia roju, w którym zdarzenia podziału skutkują powstaniem komórek roju potomnego, albo alternatywnie różnicować się z powrotem w komórki pływaka.
Zgłoszono kilka czynników, które indukują lub wpływają na różnicowanie rojów. Wydaje się, że główny bodziec jest napędzany przez mechanosensing, w którym V. parahaemolyticus wykorzystuje wić polarną jako czujnik dotykowy, który wykrywa zahamowanie rotacji przy kontakcie z powierzchnią, ale w grę wchodzi również kilka innych czynników1. W laboratorium rotacja wici polarnej może być sztucznie zahamowana przez dodanie fenamilu, który blokuje rotację wiciowców napędzaną kanałem sodowym, indukując w ten sposób różnicowanie roju2. Co więcej, we wcześniejszym badaniu Vibrio alginolyticus został nakłoniony do rojenia się na pożywkach stałych, gdy komórki rozmnażano na pożywce wzrostowej na szalce Petriego zamkniętej przezroczystą plastikową taśmą. Bibuła filtracyjna nasycona alkaliami zapobiegała rojeniu się w tych warunkach, co sugeruje, że jeden lub więcej lotnych kwasów może być zaangażowanych w indukcję roju. Tak więc uszczelnienie szalki Petriego plastikową taśmą prawdopodobnie pozwoliło na gromadzenie się lotnych kwasów, powstałych jako produkty uboczne metabolizmu komórkowego, w przestrzeni nad głową płytki. Ten sam efekt osiągnięto, gdy H2O2 został dodany do pożywki wzrostowej na niezamkniętych szalkach Petriego w celu sztucznego wytworzenia lotnych kwasów poprzez hydrolizę składników pożywki3,4,5. Niemniej jednak tożsamość takich lotnych kwasów pozostaje nieznana. Co więcej, wykazano, że nadmierna dostępność wapnia6 i iron-limitation7 zwiększają różnicowanie roju i proliferację na powierzchniach stałych. Komórki mogą być pozbawione żelaza poprzez dodanie do pożywki 2,2'-bipirydylu, który, jak wykazano, wpływa na różnicowanie roju8. Czynniki, o których wiadomo, że regulują różnicowanie, są obecnie wdrażane w projektowaniu protokołu, który w powtarzalny sposób indukuje różnicowanie V. parahaemolyticus w komórki roju i ich proliferację na stałych powierzchniach agaru.
V. Różnicowanie parahaemolyticus obejmuje poważne zmiany w regulacji podziału komórek, morfologii komórek i pozycjonowaniu maszyn makromolekularnych, takich jak aparaty wici i chemotaksji - procesy, które wymagają specyficznej lokalizacji białek zgodnie z cyklem komórkowym. Tak więc możliwość badania wewnątrzkomórkowej lokalizacji takich białek jest niezbędna do zrozumienia wyżej wymienionych procesów komórkowych. Do wykonania takich badań niezbędna jest mikroskopia fluorescencyjna na pojedynczych komórkach. Może to być szczególnie trudne w przypadku obrazowania komórek, które istnieją w gęstych populacjach bakterii, jak ma to miejsce w przypadku komórek roju. Podjęto próby wywołania różnicowania roju w płynnych pożywkach, które mogłyby potencjalnie wygenerować pojedyncze komórki do badań mikroskopowych. I chociaż na poziomie transkrypcyjnym komórki te częściowo indukowały program różnicowania roju, nie przechodzą tych samych wyraźnych zmian morfologicznych, co w pełni zróżnicowane komórki roju hodowane na stałym podłożu8. W artykule tym przedstawiono solidny i powtarzalny protokół metody indukowania różnicowania komórek roju na powierzchni agaru. Protokół tworzy populację łatwo dostępnych komórek roju, które są łatwo dostępne do mikroskopii pojedynczej komórki i późniejszej analizy. Ponadto protokół umożliwia badania lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie zarówno w typach komórek pływaka, jak i roju (sekcje 1, 2, 3, 4). Dodatkowo w protokole opisano późniejszy proces przetwarzania i analizy danych generowanych z eksperymentów mikroskopii fluorescencyjnej, co pozwala na analizę demograficzną społeczeństw bakteryjnych (sekcja 5).

<table><tbody><tr><td>Składniki pożywki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X968.3</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulowany</td><td>BD</td><td>214510</td><td>Do przygotowania agaru LB z pożywką</td></tr><tr><td>LB Difco Heart Infusion Agar</td><td>BD</td><td>244400</td><td>Do przygotowania płytek rojowych HI agar</td></tr><tr><td>Agaroza NEEO, ultra jakości</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td>Do przygotowania mikroskopii pady agarozowe</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Dodatki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arabinoza</td><td>Roth</td><td>5118.3</td><td>Służy do indukcji pochodnych pBAD</td></tr><tr><td>2,2'-Bipirydyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305-25G</td><td>Do przygotowania płytek roju agaru HI</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Roth</td><td>5239.1</td><td>Do przygotowania płytek rojowych HI</td></tr><tr><td>agar Sól sodowa ampicyliny</td><td>Roth</td><td>K029.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>Bufor PBS</td> <td>-</td><td></td> <td>Standardowa receptura soli fizjologicznej</td></tr> <tr>buforowanej fosforanami<td>D(+) Sacharoza</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>Do przygotowania ogniw elektrokompetentnych</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth</td><td>3783.5</td><td>Do przygotowania ogniw elektrokompetentnych</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Hardware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 150 mm x 20 mm z krzywkami</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>Do przygotowania płytek rojowych HI</td></tr><tr><td>agar kelvitron t (B 6420)</td><td>Heraeus-Używany</td><td></td> <td>do suszenia płytek rojowych HI</td></tr><tr><td>agar Gene Pulser Xcell Microbial System</td><td>BioRad</td><td>1652662</td><td>Służy do elktroporacji plazmidowego DNA</td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Offline (wersja 7.7.5.0)</td><td>Urządzenia molekularne-Używane</td><td></td> <td>do analizy obrazu mikroskopowego</td></tr><tr><td>Excel</td> <td>Microsoft-Używany</td> <td>do analizy danych mikroskopowych</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek vibrio parahaemolyticus swimmer i swarmer

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Możliwość badania wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek jest niezbędna do zrozumienia wielu procesów komórkowych. To z kolei wymaga możliwości uzyskania pojedynczych komórek do mikroskopii fluorescencyjnej, co może być szczególnie trudne w przypadku obrazowania komórek istniejących w społecznościach bakteryjnych. Na przykład ludzki patogen Vibrio parahaemolyticus występuje w postaci krótkich komórek pływaka w kształcie pręta w warunkach płynnych, które w kontakcie powierzchniowym różnicują się w subpopulację wysoce wydłużonych komórek roju wyspecjalizowanych do wzrostu na powierzchniach stałych. W pracy przedstawiono metodę analizy mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek V. parahaemolyticus w jego dwóch stanach różnicowych. Protokół ten bardzo powtarzalnie indukuje różnicowanie V. parahaemolyticus w cyklu życiowym komórki roju i ułatwia ich proliferację na powierzchniach stałych. Metoda ta wytwarza rozbłyski zróżnicowanych komórek roju rozciągających się od krawędzi kolonii roju. Warto zauważyć, że na samym końcu rozbłysków roju komórki roju znajdują się w pojedynczej warstwie komórek, co pozwala na ich łatwe przeniesienie na szkiełko mikroskopowe, a następnie obrazowanie pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dodatkowo przedstawiono przebieg analizy obrazu na potrzeby reprezentacji demograficznej społeczeństw bakteryjnych. Jako dowód słuszności zasady opisano analizę wewnątrzkomórkowej lokalizacji układów sygnalizacyjnych chemotaksji w komórkach pływaka i roju V. parahaemolyticus.

Indukcja różnicowania i generowanie kolonii swarmingowych
Rysunek 1 przedstawia schemat kluczowych etapów otrzymywania kolonii swarmingowych V. parahaemolyticus (Rysunek 1A-C). Kulturę komórek swimmer naniesiono kropelkowo na agar do swarmingu i inkubowano w temperaturze 24 oC, co indukuje różnicowanie i proliferację komórek swarmer na powierzchni litego agaru. Reprezentatywny o...

Ten protokół umożliwia mikroskopię pojedynczych komórek różnie różniących się komórek pływaka i roju Vibrio parahaemolyticus. Metoda ta tworzy populację komórek roju łatwo dostępnych do analizy pojedynczej komórki i obejmuje przygotowanie kultur komórkowych, indukcję różnicowania roju, przygotowanie próbki i analizę obrazu.

Indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Ogólnym celem tej metody jest indukowanie różnicowania komórkowego bakterii Vibrio parahaemolyticus oraz tworzenie populacji zróżnicowanych komórek swarmer, które są łatwo dostępne do analizy pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta pomoże naukowcom zrozumieć, w jaki sposób bakterie regulują organizację wewnątrzkomórkową podczas różnicowania komórkowego i morfogenezy. Ponieważ obrazowanie komórek w obrębie społeczności bakteryjnych może być trudne, główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona uzyskać populację zróżnicowanych komórek swarmer występujących w pojedynczej warstwie komórek, gotowych do analizy mikroskopowej w skali pojedynczej komórki.Implikacje tej techniki prowadzą do lepszego zrozumienia tego, w jaki sposób bakterie regulują zmiany w cyklu komórkowym, morfologii komórek i organizacji wewnątrzkomórkowej podczas różnicowania komórkowego. Demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ niezawodna indukcja różnicowania komórkowego oraz uzyskanie komórek dostępnych do analizy pojedynczych komórek są trudne do osiągnięcia. Aby przygotować roztwór agaru do sporządzania płyt do swarmingu, zawiesić cztery gramy agaru z wyciągu z serca (H.I.agar) oraz 100 mililitrów wody dwukrotnie destylowanej.Ostrożnie zagotuj roztwór agaru H.I. w kuchence mikrofalowej, potrząsając butelką od czasu do czasu, aż proszek się rozpuści. Autoklawuj roztwór agaru w temperaturze 121 °C przez 20 minut, a następnie schłodź go do 60–65 °C przy ciągłym mieszaniu. Kolejny krok obejmuje pracę z 2,2'-bipyrydyną, która jest wysoce toksyczna, dlatego należy używać rękawic i okularów ochronnych.Dodaj 2, 2'Bipyridyl do stężenia końcowego 50 µM. Dodaj chlorek wapnia do stężenia końcowego 4 mM. Zaszczep niewielką ilość komórek V.parahaemolyticus z brzegu pojedynczej kolonii do 5 mL pożywki LB.Inkubować hodowlę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem, aż osiągnie gęstość optyczną przy 600 nm wynoszącą 0,8. Zazwyczaj zajmuje to od dwóch do trzech godzin. Podczas wzrostu hodowli komórkowej, pipetować od 30 do 35 ml końcowego roztworu agaru H.I. do okrągłej szalki Petriego o średnicy 150 mm i poczekać, aż agar stężeje.Bezpośrednio przed naniesieniem hodowli komórkowej, osusz płytkę z agarem w pozycji pionowej z otwartą pokrywką w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut, aż do całkowitego odparowania pozostałości cieczy, ale nie dłużej. Nanieś 1 µL hodowli komórkowej na środek płytki z agarem H.I. przeznaczonej do badania rojenia i poczekaj, aż plamka wyschnie. Uszczelnij płytkę przezroczystą taśmą plastikową, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza ani zagięcia taśmy.Inkubować płytkę w temperaturze 24°C przez noc. Doprowadzi to do powstania kolonii rojowej V.Parahaemolyticus z rozbłyskami roju rozchodzącymi się od centrum kolonii, co pokazano w tym przyspieszonym filmie. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest przygotowanie slajdów agarozowych do mikroskopii.Dodaj jeden gram agarozy do 100 mililitrów 20% PBS i 10% pożywki LB. Ostrożnie zagotuj roztwór w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę, a następnie pozwól mu ostygnąć do 65-70 stopni Celsjusza, mieszając go za pomocą magnetycznego mieszadła. Umieść czyste szkiełko przedmiotowe na idealnie wypoziomowanym fragmencie blatu roboczego.Przymocuj preparat do blatu, zaklejając oba końce szkiełka dwiema warstwami uniwersalnej laboratoryjnej taśmy etykietującej. Odległość między dwoma kawałkami taśmy powinna wynosić około trzech centymetrów. Nanieś pipetą około 250 µL wcześniej przygotowanego roztworu agarozy na niezakrytą szklaną powierzchnię.Umieść drugie szkiełko przedmiotowe na górze w tej samej orientacji co szkiełko dolne i lekko dociśnij, aby pozostały agarozą mogła wypłynąć na boki. Pozostaw agarozę do zestalenia na jedną lub dwie minuty. Za pomocą skalpela odetnij wszelką pozostałą agarozę przytwierdzoną do krawędzi szkiełka przedmiotowego.Po zestaleniu się agarozy powoli odsuń górne szkiełko od dolnego, wykonując ruch poziomy. Powoli usuń taśmę z końców szkiełka mikroskopowego. Szkiełko z agarozą należy wykorzystać jak najszybciej, ponieważ z czasem zacznie wysychać.Bezpośrednio przed przeniesieniem komórek swarmer na szkiełko mikroskopowe, należy użyć skalpela, aby odciąć plastikową taśmę od wcześniej przygotowanej płytki z komórkami swarmer. Podczas wycinania agaru z kolonii swarming kluczowe jest prowadzenie cięcia od zewnątrz do wewnątrz kolonii, aby uniknąć zanieczyszczenia obszarów swarming komórkami pochodzącymi ze środka kolonii. Używając nowego skalpela, należy wyciąć fragment agaru o wymiarach 3 mm na 10 mm z najbardziej zewnętrznej krawędzi kolonii swarming, upewniając się, że cięcia są prowadzone od zewnętrznej krawędzi kolonii swarming do jej wnętrza.Przenieś fragment agaru do swarming na szkiełko z agarozą pod mikroskop, kierując komórki w stronę podkładki agarozowej, aby odbić komórki swarmingowe na podkładce. Po odczekaniu około 30 s ostrożnie usuń fragment agaru z podkładki agarozowej. Na podkładce agarozowej w miejscu odbicia komórek umieść szkiełko nakrywki.Komórki są teraz gotowe do mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazowanie stereomikroskopowe kolonii rojącej V.parahaemolyticus przy zwiększeniu powiększenia pokazuje rozbłyski rojenia rozciągające się od obwodu kolonii rojącej. Komórki w rozbłyskach są zgrupowane tylko w jedną lub dwie warstwy, podczas gdy komórki w środku kolonii rojącej są ułożone w wielu warstwach.Obrazowanie za pomocą mikroskopii DIC wykazało, że rozbłyski składają się wyłącznie z w pełni zróżnicowanej populacji komórek swarmer, podczas gdy komórki ze środka kolonii swarmingowej są znacznie krótsze i prawdopodobnie stanowią mieszankę komórek swimmer i swarmer. Jako dowód koncepcyjny, obrazowanie za pomocą mikroskopii DIC i fluorescencyjnej przeprowadzono na komórkach swimmer i swarmer szczepu dzikiego V.Parahaemolyticus, ektopowo wykazujących ekspresję niezbędnego białka chemotaksji, YFP-CheW. W komórkach swimmer YFP-CheW lokalizuje się w sposób jednobiegunowy i dwubiegunowy, natomiast w komórkach swarmer YFP-CheW zawsze lokalizuje się dwubiegunowo i tworzy również skupiska rozmieszczone losowo wzdłuż długości komórki.Zmiany w wzorcu lokalizacji YFP-CheW podczas różnicowania się komórek pływaków (swimmer cells) w komórki rojące się (swarmer cells) zostały wykazane poprzez obrazowanie rozkładu ognisk oraz analizy demograficzne profili intensywności fluorescencji. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii komórki drobnoustrojów do zbadania, w jaki sposób bakterie Vibrio parahaemolyticus regulują swoją organizację wewnętrzną podczas odrębnych zróżnicowanych stanów komórek pływaków i komórek rojących się. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak indukować różnicowanie komórkowe bakterii Vibrio parahaemolyticus oraz jak przygotować populację zróżnicowanych komórek rojących się do analizy pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Należy pamiętać, że Vibrio parahaemolyticus jest patogenem ludzkim i należy stosować odpowiednie procedury oraz przepisy dotyczące obchodzenia się z patogenami poziomu BSL 2 obowiązujące w Twoim regionie.

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Heering, J., et al. Indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer cells. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje indukcję różnicowania komórek roju u Vibrio parahaemolyticus przy użyciu specjalnie przygotowanego podłoża agarowego. Manipulując sygnałami środowiskowymi, takimi jak wyczerpanie żelaza, suplementacja wapnia i kontakt powierzchniowy, bakterie są stymulowane do przejścia z formy pływaka w wydłużone komórki roju z...

Indukcja różnicowania Vibrio parahaemolyticus w komórki roju

Źródło: Heering, J. i wsp., indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer cells. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje przygotowanie komórek roju z kolonii Vibrio parahaemolyticus do obrazowania fluorescencyjnego. Bakterie są genetycznie modyfikowane w celu ekspresji białka znakowanego fluoroforem, które lokalizuje się jednobiegunowo w komórkach pływaka i dwubiegunowo w wydłużonych komórkach roju, umożliwiając ich wizualne...

Przygotowanie komórek roju Vibrio parahaemolyticus do obrazowania

Źródło: Morales-Soto, N. i wsp., Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia test roju z wykorzystaniem bakterii, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne, w celu obserwacji ruchliwości powierzchni na miękkim agarze. Obrazowanie poklatkowe rejestruje skoordynowaną ekspansję i tworzenie wąsów, podkreślając ruchliwość powierzchni bakterii.

Test roju do wizualizacji ruchliwości powierzchni bakterii

Na ruchliwość roju wpływają czynniki fizyczne i środowiskowe. Opisujemy dwufazowy protokół i wytyczne mające na celu obejście wyzwań powszechnie związanych z przygotowaniem testów roju i gromadzeniem danych. Technika obrazowania makroskopowego jest stosowana w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat zachowania roju, których nie zapewniają obecne techniki analizy.

Przygotowanie, obrazowanie i kwantyfikacja testów ruchliwości powierzchni bakterii

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Wiele bakterii wykorzystuje ruchliwość sterowaną wiciami do poruszania się po swoim środowisku i kolonizowania korzystnego otoczenia, zarówno indywidualnie, jak i zbiorowo. Zademonstrowano tutaj zastosowanie trzech uznanych metod, które wykorzystują ruchliwość jako narzędzie selekcyjne do identyfikacji składników/ścieżek przyczyniających się do pływania i ruchliwości roju.

Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Tutaj opisujemy użycie płytek gradientu induktora do oceny ruchliwości roju bakterii, jednocześnie uzyskując wiele odpowiedzi stężenia.

Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora

Salmonella atakuje i replikuje się wewnątrz komórek nabłonka jelitowego zarówno w wakuolach specyficznych dla Salmonelli, jak i w wolnych w cytozolu (hiperreplikacja). Opisano tutaj wysokoprzepustowy protokół oparty na mikroskopii fluorescencyjnej w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowych fenotypów Salmonelli za pomocą dwóch uzupełniających się analiz obrazu za pomocą ImageJ, osiągając rozdzielczość pojedynczej komórki i punktację.

Automatyczna analiza wewnątrzkomórkowych fenotypów salmonelli za pomocą ImageJ

Poznaj metodę indukcji różnicowania komórkowego u Vibrio parahaemolyticus i tworzenia populacji komórek swarmer do analizy mikroskopowej pojedynczych komórek. Technika ta umożliwia badanie organizacji wewnątrzkomórkowej podczas różnicowania.

Indukcja różnicowania komórkowego i obrazowanie pojedynczych komórek Vibrio parahaemolyticus Swimmer i Swarmer

Przeglądaj więcej filmów