Dostrajanie w paśmie theta hipokampa in vitro: metodologie nagrywania z izolowanego obwodu septohipokampa gryzoni

Tutaj prezentujemy protokół rejestrowania rytmicznych oscylacji sieci neuronalnej theta i gamma z izolowanego całego preparatu hipokampa. Opisujemy etapy eksperymentalne od ekstrakcji hipokampa do szczegółów nagrań klamry polowej, unitarnej i całokomórkowej, a także optogenetycznej stymulacji rytmu theta.

Ogólnym celem tego protokołu jest przedstawienie procedur ekstrakcji całego preparatu hipokampa i zbadania generowania rytmicznej sieci neuronalnej za pomocą nagrań polowych, unitarnych i patch-clamp, a także stymulacji optogenetycznej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki uczenia się i pamięci, znacznie ułatwiając badanie mechanizmów komórkowych i synaptycznych, które leżą u podstaw rytmicznych oscylacji w hipokampie. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje zoptymalizowany preparat do badania obwodów w szczegółowych oscylacjach, które odgrywają kluczową rolę w informacjach o pamięci zależnej od hipokampa.

Aby rozpocząć tę procedurę, umieść mózg na naczyniu separacyjnym w pozycji pionowej, usuń móżdżek żyletką, a następnie przetnij mózg na pół wzdłuż środkowej płaszczyzny strzałkowej i wróć dwie izolowane półkule do komory trzymania. Następnie umieść pojedynczy mózg podany w półsekcji pionowo na naczyniu separacyjnym. Obracaj szalkę, aż środkowe struktury strzałkowe będą skierowane w stronę eksperymentatora, a osadzony zarys kompleksu przegrody będzie widoczny jako cienka warstwa tkanki w kształcie gruszki wewnątrz wzgórza.

Następnie włóż powlekaną szpatułkę pod przegrodę i przesuń końcówkę w dół, aż dojdziesz do naczynia preparacyjnego, odetnij serdecznie włókna łączące obszar przegrody. Teraz powtórz tę samą operację wzdłuż przedniej krawędzi przegrody i przetnij włókna łączące się z przednią częścią mózgu. Trzymając szpatułkę lekko przytrzymując wewnętrzną część kory tuż nad hipokampem w pozycji pionowej, użyj mikroszpatułki, aby ostrożnie pociągnąć w dół jądra wzgórza, podwzgórza i pozostałe jądra pnia mózgu.

Następnie za pomocą szpatułki odetnij i usuń odciągniętą tkankę. Następnie włóż powlekaną szpatułkę do komory bocznej pod rostralnym końcem grzbietowego hipokampa. Trzymaj szpatułkę poziomo, wyrównaną z płaszczyzną środkową strzałkową półwyciętego mózgu i przesuwaj ją po gładkim konturze ścian komór, aż końcówka wyłoni się serdecznie.

Przytrzymaj szpatułkę pod hipokampem i lekko dociśnij ją do włókien łączących wzdłuż wewnętrznej warstwy, w miejscu, w którym hipokamp łączy się z leżącą nad nią korą, a następnie nałóż mikroszpatułkę na zewnętrzną stronę tej warstwy i dociśnij ją do powlekanej szpatułki, aby przeciąć włókna łączące. Aby zakończyć ekstrakcję, obróć naczynie preparacyjne i włóż powlekaną szpatułkę pod brzuszny hipokamp. Lekko przytrzymaj hipokamp szpatułką i przetnij połączenia dokrewne, wykonując ruch tnący na szpatułce.

Po zakończeniu izolacji utrzymuj hipokamp oparty na naczyniu i dodaj kroplę lodowatego roztworu sacharozy, aby był chłodny. Ostrożnie odetnij pozostałą korę i włókna i oddziel hipokamp od przegrody, delikatnie przykładając żyletkę do sklepienia. Następnie przenieść preparat do roztworu sacharozy o temperaturze pokojowej i pozostawić go do odzyskania przez 15 do 30 minut przed przeniesieniem do komory rejestrującej.

Na tym etapie należy skonfigurować grawitacyjny system perfuzyjny, aby umożliwić ciągły przepływ natlenionego ACSF z dużą prędkością. Następnie zatrzymaj przepływ ACSF i przenieś hipokamp do komory nagrywającej, używając szerokiego końca szklanej pipety. Pozwól, aby preparat nasycony sacharozą opadł i osiadł na dnie.

Umieść preparat na środku komory nagrywającej, z gładką powierzchnią CA1 i subiculum na górze. Ustabilizuj hipokamp za pomocą małych ciężarów kończyn przegrody i skroniowej i ponownie uruchom przepływ ACSF. W tej procedurze opuść elektrodę LFP na powierzchnię hipokampa.

Przełóż elektrodę LFP przez warstwę parametrów i obserwuj wzrost zewnątrzkomórkowej aktywności impulsowej w miarę wykrywania pojedynczego wyładowania jednostkowego z poszczególnych neuronów. Obniż elektrodę jeszcze bardziej i zwróć uwagę, że wybicie zaczyna ponownie zanikać, gdy końcówka przechodzi w radioatom. Zauważ, że wyraźnie widoczna oscylacja sieci w zakresie częstotliwości theta staje się widoczna i osiąga maksymalną amplitudę, gdy miejsce zapisu jest obniżane przez radiatom.

Aby przetestować właściwości przestrzenne spontanicznych oscylacji theta w regionie CA1, umieść drugą elektrodę LFP w miejscu CA1 i obserwuj, że oscylacje CA1 theta synchronizują się na duże odległości. Aby przetestować właściwości oscylacji theta w warstwach hipokampa, pozostaw referencyjną elektrodę LFP w miejscu radiatomu CA1. Zaczynając tuż nad warstwą oriens, opuść drugą elektrodę do warstwy ogniwa parametru i przez radioatom.

Obserwuj stopniowe odwrócenie sygnału LFP w poprzek warstwy parametrów. Aby przetestować oscylacje gamma i sprzężenie theta gamma w nienaruszonym hipokampie, umieść elektrodę polową na granicy subiculum CA1 i opuść ją, aż znajdzie się na granicy parametrów i warstw molekularnych. Na tym poziomie można zarejestrować potencjał pola wykazujący wyraźne oscylacje gamma ze zmianami amplitudy, które to fazy są zablokowane w lokalnym rytmie theta.

Następnie dostosuj skalowanie, aby obserwować powolną skalę czasową sprzężenia gamma theta. Należy zauważyć, że rozbłyski gamma występują w dwóch odrębnych pasmach częstotliwości, które mogą być ujawniane przez pasmo podczas trwającego sygnału LFP, w zakresie wolnego i szybkiego pasma gamma. Do nagrywania klamer krosowych całych komórek podczas oscylacji theta hipokampa in vitro, użyj fluorescencyjnej mikroskopii wideo z małym i dużym powiększeniem, aby uwidocznić interneurony tdTomato dodatnie zlokalizowane w pobliżu powierzchni preparatu hipokampa z myszy PV.

W widoku hipokampa w małym powiększeniu umieść elektrodę LFP w subiculum CA1, aby monitorować oscylacje theta, przygotowując się do eksperymentów z zaciskiem krosowym. Następnie przełącz się na 40-krotne powiększenie i zanurz obiektyw w obszarze docelowym. Obniż go, aż górne warstwy staną się widoczne, pod mikroskopią fluorescencyjną wybierz fluorescencyjną komórkę tomową PV i zbliż się do pipety płatkowej wypełnionej standardowym roztworem międzykomórkowym.

Po skonfigurowaniu całej komórki zbadaj właściwości fizjologiczne zidentyfikowanej komórki PV podczas spontanicznych oscylacji hipokampa. Obserwuj zapis potencjału błony wewnątrzkomórkowej z ogniw PV, które charakteryzują się szybkim zachowaniem impulsowym i wybuchami potencjałów czynnościowych zsynchronizowanych z trwającym rytmem CA1 subiculum theta. W tej procedurze umieść elektrodę LFP w obszarze subiculum CA1 i załataj pobliską komórkę parametru w izolowanym hipokampie myszy, wyrażając wrażliwą na niebieskie światło, pobudzającą ofcynę CHR2 w interneuronach PV.

Umieść światłowód światłowodowy nad preparacją hipokampa i wyśrodkuj go na zarejestrowanym obszarze. Użyj niebieskiego światła ze źródła LED do optycznej stymulacji genetycznej, która składa się z 10 do 20 milisekundowych impulsów świetlnych lub poleceń napięcia fali sinusoidalnej dostarczanych na częstotliwościach theta. W cęgach prądowych scharakteryzuj aktywność zarejestrowanej komórki podczas spontanicznych oscylacji theta.

Następnie uruchom protokół stymulacji i zarejestruj reakcje świetlne. Obserwuj, że oscylacje pola i aktywność synaptyczna oraz zarejestrowany neuron stają się coraz bardziej zsynchronizowane podczas stymulacji optogenetycznej i że rytmiczne stymulacja ogniw PV skutkuje solidną kontrolą zarówno częstotliwości, jak i mocy oscylacji theta. Pokazana tutaj jest aktywność elektrofizjologiczna zarejestrowana z komórki parametru podczas oscylacji theta.

Ślady cęgów prądowych pokazują spontaniczne, ale nie rytmiczne wystrzeliwanie w spoczynku i hamujące potencjały postsynaptyczne, które nie były wyraźnie zsynchronizowane z powoli pojawiającymi się oscylacjami LFP. Zapisy cęgów napięciowych pokazują, że odpowiednie hamujące prądy postsynaptyczne mają potencjał odwrócenia na poziomie około minus 70 miliwoltów. A oto aktywność elektrofizjologiczna zarejestrowana przez szybko wystrzeliwujący fluorescencyjny interneuron PV podczas oscylacji theta.

W cęgach prądowych komórka ta spontanicznie odpalała się w spoczynku i była silnie napędzana przez rytmiczne pobudzające potencjały postsynaptyczne, które były fazowo zablokowane ze stabilną oscylacją LFP. W zapisach cęgów napięciowych wzbudzający potencjał odwrócenia prądu posynaptycznego wynosił w przybliżeniu zero miliwoltów. Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu dwóch do trzech godzin, podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać o energicznym natlenieniu roztworu i użyciu systemu perfuzyjnego umożliwiającego szybki, ale stały przepływ uzbrojonego ACSF przez preparat podczas zapisów elektrofizjologicznych.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak stymulacja optogenetyczna lub wyciszanie określonych populacji typów komórek, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja podtypów komórkowych, które tworzą oscylatory theta w hipokampie. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do systematycznego badania dynamiki oscylacji theta na osi skroniowej przegrody hipokampa in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić cały preparat hipokampa, aby zbadać funkcję rytmicznych sieci neuronalnych za pomocą nagrań pola, jednostek i klamer łatowych, a także stymulacji optogenetycznej.