Name: Dostrajanie w paśmie theta hipokampa in vitro: metodologie nagrywania z izolowanego obwodu septohipokampa gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Poznaj metodę rejestracji oscylacji theta w izolowanym hipokampie gryzoni przy użyciu technik patch-clamp i stymulacji optogenetycznej. Ta technika umożliwia szczegółowe badanie mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw pamięci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem i Nauk Przyrodniczych.

<ol><li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+rhythm+of+navigation%3A+link+between+path+integration+and+landmark+navigation%2C+episodic+and+semantic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory.</a> Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).</li>
<li>Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grid+Cells+and+Place+Cells%3A+An+Integrated+View+of+their+Navigational+and+Memory+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function.</a> Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).</li>
<li>O'Keefe, J., Recce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+relationship+between+hippocampal+place+units+and+the+EEG+theta+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm.</a> Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).</li>
<li>Winson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+hippocampal+theta+rhythm+results+in+spatial+memory+deficit+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat.</a> Science. 201 (4351), 160-163 (1978).</li>
<li>M'Harzi, M., Jarrard, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+selection+in+a+task+with+spatial+and+nonspatial+components%3A+effects+of+fimbria-fornix+lesions+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neural+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats.</a> Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).</li>
<li>Osipova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+and+gamma+oscillations+predict+encoding+and+retrieval+of+declarative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory.</a> J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).</li>
<li>Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+the+rabbit%27s+septum+as+a+relay+station+between+the+midbrain+and+the+hippocampus.+II.+The+differential+influence+of+drugs+upon+both+the+septal+cell+firing+pattern+and+the+hippocampus+theta+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).</li>
<li>Mitchell, S. J., Ranck, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+theta+rhythm+in+medial+entorhinal+cortex+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats.</a> Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).</li>
<li>Alonso, A., Garcia-Austt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+sources+of+theta+rhythm+in+the+entorhinal+cortex+of+the+rat.+I.+Laminar+distribution+of+theta+field+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials.</a> Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).</li>
<li>Vertes, R. P., Kocsis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem-diencephalo-septohippocampal+systems+controlling+the+theta+rhythm+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus.</a> Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).</li>
<li>Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+records+of+carbachol-induced+theta+rhythm+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices.</a> Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).</li>
<li>Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+neuronal+activity+in+hippocampus+by+individual+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons.</a> Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).</li>
<li>Williams, J. H., Kauer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+carbachol-induced+oscillatory+activity+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus.</a> J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).</li>
<li>Chapman, C. A., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+induction+of+theta-frequency+oscillations+in+hippocampal+inhibitory+interneurons+and+pacing+of+pyramidal+cell+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing.</a> J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).</li>
<li>Strata, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+oscillations+in+CA3+hippocampal+pyramids%3A+physiological+relevance+to+theta+rhythm+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation.</a> Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).</li>
<li>Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+multiple+theta+generators+in+the+hippocampus%3A+a+partial+coherence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis.</a> J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).</li>
<li>Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+induction+of+oscillations+in+the+hippocampal+slice+in+the+slow+%280.5-2+Hz%29%2C+theta+%285-12+Hz%29%2C+and+gamma+%2835-70+Hz%29+bands%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands.</a> Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).</li>
<li>Gillies, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+atropine-resistant+theta+oscillations+in+rat+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1.</a> J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).</li>
<li>Gloveli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+arrangement+of+rhythm-generating+microcircuits+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).</li>
<li>Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+cell+repertoire+during+carbachol-induced+theta+rhythm+in+rat+hippocampal+formation+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices.</a> Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).</li>
<li>Hajos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
<li>Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocamposeptal+pathway+generates+rhythmic+firing+of+GABAergic+neurons+in+the+medial+septum+and+diagonal+bands%3A+an+investigation+using+a+complete+septohippocampal+preparation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro.</a> J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).</li>
<li>Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+theta+oscillations+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Self-generated theta oscillations in the hippocampus.</a> Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).</li>
<li>Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+gamma+rhythms+are+intrinsically+and+independently+generated+in+the+subiculum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum.</a> J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).</li>
<li>Amilhon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin+Interneurons+of+Hippocampus+Tune+Population+Activity+at+Theta+Frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency.</a> Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).</li>
<li>Huh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+Inputs+Determine+Phase-Locking+Strength+and+Spike-Timing+of+CA1+Stratum+Oriens%2FAlveus+Parvalbumin+and+Somatostatin+Interneurons+during+Intrinsically+Generated+Hippocampal+Theta+Rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm.</a> J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).</li>
<li>Gu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA-dependent+phase+synchronization+between+septal+and+temporal+CA3+hippocampal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks.</a> J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).</li>
<li>Jackson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+theta+rhythm+flow+through+intact+hippocampal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits.</a> Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+neurons+and+the+mechanisms+of+network+oscillations%3A+implications+for+understanding+cortical+dysfunction+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia.</a> Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów handlowych lub finansowych.

O ile zapisy elektrofizjologiczne z ostrych wycinków hipokampa stanowią standardową technikę in vitro , o tyle przedstawione tu metody znacznie różnią się od podejścia klasycznego. W przeciwieństwie do preparatów cienkowarstwowych, w których określone warstwy komórek są widoczne na powierzchni i można je badać bezpośrednio, nienaruszone preparaty hipokampa są bardziej zbliżone do konfiguracji in vivo , w których elektrody są opuszczane do docelowych obszarów mózgu podczas przechodzenia przez poszczególn...

Oscylacje theta w hipokampie (4 - 12 Hz) są jednymi z najbardziej dominujących form aktywności rytmicznej w mózgu ssaków i uważa się, że odgrywają kluczową rolę w funkcjach poznawczych, takich jak przetwarzanie informacji czasoprzestrzennych i tworzenie wspomnień epizodycznych1,2,3. Podczas gdy kilka badań in vivo, które podkreślają związek komórek miejsca modulowanych przez theta z nawigacją przestrzenną i badaniami nad zmianami chorobowymi, a także dowody kliniczne, wspierają pogląd, że oscylacje theta w hipokampie są zaangażowane w tworzenie pamięci4,5,6, mechanizmy związane z generowaniem oscylacji theta w hipokampie nadal nie są w pełni zrozumiałe. Wczesne badania in vivo sugerowały, że aktywność theta zależy głównie od zewnętrznych oscylatorów, w szczególności rytmicznego sygnału wejściowego z aferentnych struktur mózgu, takich jak przegroda i kora śródwęchowa7,8,9,10. Na podstawie obserwacji in vitro postulowano również rolę czynników wewnętrznych - wewnętrznej łączności sieci neuronowych hipokampa wraz z właściwościami neuronów hipokampa - 11,12,13,14,15,16,17,18. Jednakże, poza kilkoma przełomowymi badaniami19,20,21, trudności w opracowaniu podejść, które mogłyby odtworzyć fizjologicznie realistyczne działania populacji w prostych preparatach in vitro, na długi czas opóźniły bardziej szczegółowe badania eksperymentalne wewnętrznych zdolności hipokampa i pokrewnych obszarów do samodzielnego generowania theta. Drgań.
Ważną wadą standardowego eksperymentu in vitro z cienkimi plasterkami jest to, że komórkowa i synaptyczna organizacja struktur mózgu w 3D jest zwykle zagrożona. Oznacza to, że wiele form skoordynowanych działań sieciowych opartych na przestrzennie rozproszonych zespołach komórek, począwszy od zlokalizowanych grup (promień ≤1 mm) do populacji neuronów rozsianych po jednym lub więcej obszarach mózgu (>1 mm), nie może być obsługiwanych. Biorąc pod uwagę te rozważania, potrzebny był inny rodzaj podejścia, aby zbadać, w jaki sposób oscylacje theta pojawiają się w hipokampie i rozprzestrzeniają się do powiązanych korowych i podkorowych struktur wyjściowych.
W ostatnich latach, początkowy rozwój preparatu "kompletna septo-hipokamp" do badania dwukierunkowych interakcji dwóch struktur22, oraz wynikająca z tego ewolucja preparatu "izolowanego hipokampa", ujawniły, że wewnętrzne oscylacje theta występują spontanicznie w hipokampie bez zewnętrznego rytmicznego bodźca23. Wartość tych podejść opiera się na początkowym spostrzeżeniu, że cała struktura funkcjonalna tych regionów musiała zostać zachowana, aby funkcjonować jako generator rytmu theta in vitro22.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 - fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa </td><td>Firma<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-25</td><td>ekstrakcja mózgu</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela #4, 14 cm</td><td>WPI</td><td>500237</td><td>ekstrakcja mózgu</td></tr><tr><td>Filtr kleszcze, szczęki płaskie, proste (11 cm)</td><td></td><td>Ekstrakcja mózgu</td> <td>500456 WPI</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela ze stali nierdzewnej Paragon #20</td><td>Ultident</td><td>02-90010-20</td><td>ekstrakcja mózgu</td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki preparacyjne z cienkim punktem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>711999</td><td>ekstrakcja mózgu</td></tr><tr><td>Cienka szpatułka pokryta teflonem (PTFE)</td><td>VWR</td><td>82027-534</td><td>preparat</td></tr> <tr><td>hipokampaMikroszpatułka Hayman Style</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25A</td><td>preparat hipokampa</td></tr><tr><td>Łyżka laboratoryjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-20</td><td>preparat hipokampa</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>preparat hipokampa</td></tr><tr><td>Droper</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>preparat hipokampa</td></tr><tr><td>Żyletki Jednosieczne</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>Preparat hipokampa</td></tr><tr><td>Papier do soczewek (4 x 6")</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>Preparat hipokampa</td></tr><tr><td>Szklane szalki Petriego (100 x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>25354-080</td><td>Preparat hipokampa</td></tr><tr><td>Plastikowa taca na lód; Rozmiar 30 x 20 x 5 cm</td><td>Preparat n.a.n.a.hippokamp</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pojedynczy podgrzewacz roztworu w linii</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>System perfuzyjny</td>SH-27B</tr><tr><td>Kamienie napowietrzające do akwarium do bulgotania</td> <td>systemu perfuzyjnego</td><td>N.A.N.A.Rurka</td><td></td></tr> rurki <tr><td>Tygon E-3603 (ID 1/16 OD 1/8)</td> <td>System perfuzyjny</td> <td>Fisherbrand</td><td>14-171-129</td></tr><tr><td>Patelnia elektryczna</td><td>& System</td> <td>perfuzyjny</td>Decker <td>n.a.</td></tr> <tr><td>95% O2/5% CO2 mieszanina gazów (karbogen)&nbsp;</td><td>System perfuzyjny</td> <td>Vitalaire</td><td>SG466204A</td></tr><tr><td>Butelki/kolby szklane (4 x 1 L)</td><td>n.a.n.a.system</td><td></td> <td>perfuzyjny</td></tr><tr><td>Nagrywanie zanurzone</td><td>Komora o niestandardowej konstrukcji (FM)</td><td>n.d.Można</td> <td>zastosować alternatywę komercyjną</td></tr><tr><td>Pipety szklane (1,5/0,84 OD/ID (mm)) WPI</td><td></td> <td>1B150F-4</td><td>elektrofizjologia</td></tr><tr><td>Hum Bug 50/60 Hz Eliminator szumów</td><td>Quest Scientific</td><td>Elektrofizjologia</td> <td>Q-Humbug</td></tr><tr><td>Wzmacniacz patch-clamp Multiclamp 700B</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>MULTICLAMP</td><td>elektrofizjologia</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Commander Program Urządzenia</td><td>molekularne</td><td>MULTICLAMP</td><td>elektrofizjologia</td></tr><tr><td>Przetwornik cyfrowo-analogowy</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Elektrofizjologia</td><td>DDI440</td></tr><tr><td>PCLAMP10</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>PCLAMP10</td><td>elektrofizjologia</td></tr><tr><td>Tabela wibroizolacji&nbsp;</td><td>Newport</td><td>n.a.electrophysiology</td><td></td></tr> <tr><td>Mikromanipulatory (obsługiwane ręcznie )</td><td>Siskiyou&nbsp;</td><td>Elektrofizjologia</td> <td>MX130</td> (LFP)</tr><tr><td>Mikromanipulatory (zautomatyzowane)</td><td>Siskiyou&nbsp;</td><td>MC1000e</td><td>elektrofizjologia (łatka)</td></tr><tr><td>Monitor audio&nbsp;</td><td>A-M Systems</td><td>Model 3300</td><td>elektrofizjologia Ściągacz</td></tr><tr><td>do mikropipet/pipet krosowych</td><td>Elektrofizjologia</td><td>Sutter</td><td>P-97</td></tr><tr><td>Niestandardowy pionowy mikroskop fluorescencyjny</td><td>Siskiyou</td><td>n.a.Obrazowanie</td><td></td></tr> <tr><td>Analogowa kamera wideo</td><td>COHU</td><td>4912-2000/0000</td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>Cyfrowy frame grabber z oprogramowaniem do obrazowania</td><td>EPIX, Inc</td><td>PIXCI-SV7</td><td>Obiektyw</td></tr><tr><td>Olympus 2.5X</td><td>Olympus</td><td>MPLFLN</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Olympus 40X Obiektyw do zanurzenia w wodzie</td><td>Olympus</td><td>UIS2 LUMPLFLN</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Wykonany na zamówienie system diod elektroluminescencyjnych (LED)&nbsp;</td><td>niestandardowa</td><td></td> <td>stymulacja optogenetyczna (Amhilon i in., 2015)</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PV::Cre (KI) myszy</td><td>Jackson Laboratory</td><td>numer magazynowy 008069</td><td>Zezwalaj&nbsp; Ekspresja genów ukierunkowana na Cre w interneuronach PV</td></tr><tr><td>Myszy z warunkowym uwarunkowaniem konstytutywnym Ai9 (R26-lox-stop-lox-tdPomidor (KI))</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>numer zapasowy 007905</td><td>Ekspresja TdTomato po rekombinacji Ai32 za pośrednictwem Cre</td></tr><tr><td>(R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock numer 012569</td><td>Wyrażaj ulepszone białko fuzyjne rodopsyny-2 / EYFP po ekspozycji na Cre rekombinaza</td></tr><tr><td>PVChY myszy</td><td>W hodowli domowej</td><td>nie dotyczyPotomstwo</td> <td>uzyskane z krzyżowania linii PV-Cre z myszami Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td></tr></tbody></table>

dostrajanie w paśmie theta hipokampa in vitro: metodologie nagrywania z izolowanego obwodu septohipokampa gryzoni

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Ten protokół przedstawia procedury przygotowania i rejestracji z izolowanego całego hipokampa myszy WT i transgenicznych, wraz z ostatnimi ulepszeniami w metodologiach i zastosowaniach do badania oscylacji theta. Przedstawiono prostą charakterystykę izolowanego preparatu hipokampa, w której badany jest związek między wewnętrznymi oscylatorami theta hipokampa wraz z aktywnością komórek piramidowych i interneuronów GABA-ergicznych z obszarów cornu ammonis-1 (CA1) i subiculum (SUB). Ogólnie rzecz biorąc, pokazujemy, że izolowany hipokamp jest zdolny do generowania wewnętrznych oscylacji theta in vitro i że rytmiczność generowana w hipokampie może być precyzyjnie manipulowana przez optogenetyczną stymulację interneuronów parwalbuminowo-dodatnich (PV). Izolowany preparat hipokampa in vitro oferuje wyjątkową możliwość wykorzystania jednoczesnych nagrań terenowych i wewnątrzkomórkowych z wizualnie zidentyfikowanych neuronów w celu lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw generowania rytmu theta.

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać badając oscylacje theta w izolowanym preparacie hipokampa mysiego in vitro. Procedura preparowania w celu wyizolowania hipokampa została przedstawiona na Ryc. 1. Z wykorzystaniem tego preparatu można badać wewnątrzpochodne oscylacje theta podczas umieszczenia wielu elektrod polowych, rejestrując ogólną aktywność oraz zsynchronizowane wejścia synaptyczne do populacji neuronalnych w różn...

Tutaj prezentujemy protokół rejestrowania rytmicznych oscylacji sieci neuronalnej theta i gamma z izolowanego całego preparatu hipokampa. Opisujemy etapy eksperymentalne od ekstrakcji hipokampa do szczegółów nagrań klamry polowej, unitarnej i całokomórkowej, a także optogenetycznej stymulacji rytmu theta.

Dostrajanie w paśmie theta hipokampa in vitro: metodologie nagrywania z izolowanego obwodu septohipokampa gryzoni

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie procedur wyodrębniania kompletnego preparatu hipokampa oraz badania generowania rytmicznej sieci neuronalnej z wykorzystaniem rejestracji potencjałów polowych, jednostkowych i techniki patch-clamp, a także stymulacji optogenetycznej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki dotyczące uczenia się i pamięci, znacząco ułatwiając badanie mechanizmów komórkowych i synaptycznych leżących u podstaw oscylacji rytmicznych w hipokampie. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie zoptymalizowanego preparatu do szczegółowego badania obwodów oscylacyjnych, które odgrywają kluczową rolę w procesach przetwarzania informacji w pamięci zależnej od hipokampa.Aby rozpocząć tę procedurę, umieść mózg w pozycji pionowej na szalce sekcyjnej, usuń móżdżek za pomocą żyletki, a następnie przetnij mózg na pół wzdłuż płaszczyzny pośrodkowej strzałkowej i przenieś dwie wyizolowane półkule z powrotem do komory przechowawczej. Następnie umieść jedną z przeciętych półkul mózgu w pozycji pionowej na szalce sekcyjnej. Obracaj szalkę do momentu, aż struktury pośrodkowej strzałkowej będą zwrócone w stronę eksperymentatora, a zarys kompleksu przegrody będzie widoczny jako cienka, gruszkowata warstwa tkanki znajdująca się wewnątrz wzgórza.Następnie wprowadź powleczoną szpatułkę pod przegrodę i przesuń jej końcówkę w dół, aż do osiągnięcia naczynia sekcyjnego, a następnie przetnij włókna łączące obszar przegrody w kierunku boczno-przyśrodkowym. Teraz powtórz tę samą czynność wzdłuż przedniej krawędzi przegrody i przetnij włókna łączące się z przednią częścią mózgu. Trzymając szpatułką wewnętrzną część kory tuż nad hipokampem w pozycji pionowej, użyj mikrospatułki, aby ostrożnie odciągnąć w dół wzgórze, podwzgórze oraz pozostałe jądra pnia mózgu.Następnie za pomocą szpatułki odetnij i usuń odciągniętą tkankę. Po tym wprowadź pokrytą szpatułkę do komory bocznej pod przednią część grzbietową hipokampa. Trzymając szpatułkę poziomo, zgodnie z płaszczyzną pośrodkową przekrojonego mózgu, przesuwaj ją wzdłuż gładkiego konturu ścian komory, aż jej końcówka pojawi się w części przedniej.Przymocuj szpatułkę pod hipokampem i lekko dociśnij ją do włókien łączących wzdłuż warstwy wewnętrznej, w miejscu połączenia hipokampa z nadkładającą go korą, następnie przyłóż mikrospatułkę do zewnętrznej strony tej warstwy i dociśnij ją do pierwszej szpatułki, aby przeciąć włókna łączące. Aby zakończyć ekstrakcję, obróć naczynie do sekcji i wprowadź szpatułkę pod brzuszna część hipokampa. Delikatnie przytrzymaj hipokamp szpatułką i przetnij połączenia hormonalne, wykonując ruch tnący w stronę szpatułki.Po zakończeniu izolacji pozostaw hipokamp na płytce i dodaj kroplę lodowatego roztworu sacharozy, aby utrzymać niską temperaturę. Ostrożnie odetnij pozostałą korę oraz włókna, a następnie oddziel hipokamp od przegrody, delikatnie nacinając wzgórze za pomocą żyletki. Następnie przenieś preparat do roztworu sacharozy o temperaturze pokojowej i pozostaw go na 15 do 30 minut w celu regeneracji przed przeniesieniem do komory rejestracyjnej.W tym kroku należy przygotować grawitacyjny system perfuzji, aby umożliwić ciągły szybki przepływ natlenionego ACSF. Następnie należy zatrzymać przepływ ACSF i przenieść hipokamp do komory rejestracyjnej, używając szerokiego końca pipety szklanej. Należy pozwolić, aby nasycony sacharozą preparat opadł i osiadł na dnie.Umieść preparat w centrum komory rejestracyjnej, tak aby gładka powierzchnia CA1 i subiculum znajdowała się na górze. Stabilizuj hipokamp za pomocą małych obciążników na końcach septalnym i temporalnym, a następnie wznowij przepływ ACSF. W tej procedurze opuść elektrodę LFP do powierzchni hipokampu.Przesuń elektrodę LFP przez warstwę parametrów i zaobserwuj wzrost aktywności impulsowej zewnątrzkomórkowej w miarę wykrywania wyładowań pojedynczych jednostek z poszczególnych neuronów. Obniż elektrodę dalej i zauważ, że aktywność impulsowa zaczyna ponownie zanikać, gdy końcówka wnika do radiatom. Zaobserwuj, że pojawia się wyraźnie widoczna oscylacja sieciowa w zakresie częstotliwości theta, która osiąga maksymalną amplitudę w miarę obniżania miejsca rejestracji przez radiatom.Aby przetestować właściwości przestrzenne spontanicznych oscylacji theta w obrębie obszaru CA1, umieść drugą elektrodę LFP w miejscu w CA1 i zaobserwuj, że oscylacje theta w CA1 synchronizują się na dużych odległościach. Aby zbadać właściwości oscylacji theta w różnych warstwach hipokampa, pozostaw referencyjną elektrodę LFP w miejscu w radiatum CA1. Zaczynając od poziomu tuż nad stratum oriens, opuść drugą elektrodę do warstwy komórek piramidowych, a następnie przez radiatum.Zaobserwuj stopniową inwersję sygnału LFP w obrębie warstwy piramidalnej. Aby zbadać oscylacje gamma oraz sprzężenie theta-gamma w nienaruszonym hipokampie, umieść elektrodę polową na granicy obszaru CA1 i subiculum, a następnie obniżaj ją, aż znajdzie się ona na styku warstwy piramidalnej i warstwy molekularnej. Na tym poziomie można zarejestrować potencjał polowy wykazujący wyraźne oscylacje gamma ze zmianami amplitudy zsynchronizowanymi fazowo z lokalnym rytmem theta.Następnie dostosuj skalowanie, aby zaobserwować powolną skalę czasową sprzężenia theta-gamma. Należy zauważyć, że serie gamma występują w dwóch odrębnych pasmach częstotliwości, które można wyodrębnić z bieżącego sygnału LFP w zakresie wolnej i szybkiej fali gamma. Do rejestracji metodą patch clamp z całej komórki podczas oscylacji theta w hipokampie in vitro zastosuj wideomikroskopię fluorescencyjną z niskim i wysokim powiększeniem, aby zwizualizować interneurony wykazujące ekspresję tdTomato, zlokalizowane w pobliżu powierzchni preparatu hipokampa myszy PV tom.Pod małym powiększeniem hipokampa umieść elektrodę LFP w podpodstawie CA1 (subiculum), aby monitorować oscylacje theta podczas przygotowań do eksperymentów patch clamp. Następnie przełącz na powiększenie 40x i zanurz obiektyw nad obszarem docelowym. Obniżaj go, aż staną się widoczne górne warstwy; w mikroskopii fluorescencyjnej wybierz fluorescencyjną komórkę PV i zbliż się do niej pipetą patch wypełnioną standardowym roztworem wewnątrzkomórkowym.Po przejściu w konfigurację whole-cell, zbadaj właściwości fizjologiczne zidentyfikowanej komórki PV podczas spontanicznych oscylacji hipokampa. Obserwuj zapis potencjału błony wewnątrzkomórkowej z komórek PV, które charakteryzują się szybkim tempem wyładowań (fast spiking) oraz seriami potencjałów czynnościowych zsynchronizowanych z trwającym rytmem theta w obszarze CA1 i subikulum. W tej procedurze umieść elektrodę LFP w obszarze CA1 i subikulum, a następnie wykonaj patch-clamp pobliskiej komórki parametrów w izolowanym hipokampie myszy wykazującej ekspresję światłoczułej opsyny pobudzającej CHR2 w interneuronach PV.Umieść światłowód nad preparatem hipokampa i wycentruj go nad rejestrowanym obszarem. Do stymulacji optogenetycznej użyj niebieskiego światła z diody LED, w postaci impulsów świetlnych o czasie trwania od 10 do 20 milisekund lub poleceń napięciowych w formie fali sinusoidalnej dostarczanych z częstotliwością theta. W trybie clamp prądowy (current clamp) scharakteryzuj aktywność rejestrowanej komórki podczas spontanicznych oscylacji theta.Następnie rozpocznij protokół stymulacji i zarejestruj odpowiedzi na światło. Zauważ, że oscylacje polowe oraz aktywność synaptyczna zarejestrowanego neuronu stają się coraz bardziej zsynchronizowane podczas stymulacji optogenetycznej, a rytmiczne tempo komórek PV skutkuje silną kontrolą zarówno częstotliwości, jak i mocy oscylacji theta. Przedstawiona tutaj aktywność elektrofizjologiczna została zarejestrowana z komórki parametru podczas oscylacji theta.Zapisy w trybie clamp prądowy wykazują spontaniczne, ale nierytmiczne wyładowania w spoczynku oraz potencjały postsynaptyczne hamujące, które nie były wyraźnie zsynchronizowane z powoli wyłaniającą się oscylacją LFP. Rejestracje w trybie clamp napięciowy pokazują, że odpowiadające im prądy postsynaptyczne hamujące mają potencjał odwracania wynoszący około -70 mV. A tutaj przedstawiono aktywność elektrofizjologiczną zarejestrowaną z fluorescencyjnego interneuronu PV o szybkiej częstotliwości wyładowań podczas oscylacji theta.W trybie clamp prądowy komórka ta wykazywała spontaniczną aktywność w spoczynku i była silnie stymulowana rytmicznymi pobudzającymi potencjałami postsynaptycznymi, które były zsynchronizowane fazowo ze stabilną oscylacją LFP. W rejestracjach w trybie clamp napięciowy potencjał odwrócenia pobudzającego prądu postsynaptycznego wynosił około zero milliwoltów. Po opanowaniu techniki tej, procedura może zostać wykonana w ciągu dwóch do trzech godzin; podczas jej przeprowadzania ważne jest, aby intensywnie napowietrzać roztwór i korzystać z systemu perfuzji zapewniającego szybki, lecz stabilny przepływ utlenionego ACSF nad preparatem podczas rejestracji elektrofizjologicznych.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak stymulacja optogenetyczna lub wyciszanie specyficznych populacji typów komórkowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. zidentyfikować podtypy komórkowe tworzące oscylatory theta w hipokampie. Po opracowaniu technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie neuronauki drogę do systematycznego badania dynamiki oscylacji theta wzdłuż osi czasowo-przegrodowej hipokampa in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak wypreparować cały hipokamp w celu zbadania funkcji rytmicznych sieci neuronalnych z wykorzystaniem rejestracji potencjałów polowych, jednostkowych i patch clamp, a także stymulacji optogenetycznej.

tuning-hippocampal-theta-band-vitro-methodologies-for-recording-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje protokół modulacji oscylacji theta w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z światłoczułymi kanałami jonowymi w neuronach przegrody przyśrodkowej GABA-ergiczne. Dostarczając impulsy świetlne do hipokampa, protokół ma na celu synchronizację aktywności neuronalnej i generowanie oscylacji theta, które są rejestrowane jako lokalne potencjały pola.

Selektywna manipulacja oscylacjami theta w modelu mysim

Ten film demonstruje metodę rejestrowania odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 w wycinku hipokampa szczura. Przedstawiono w nim kroki związane z umieszczeniem elektrod stymulujących i rejestrujących na wycinku hipokampa oraz pomiarem pobudzającego potencjału postsynaptycznego pola (fEPSP) w celu oceny siły odpowiedzi synaptycznej.

Rejestrowanie odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 w wycinku hipokampa szczura

Ten film demonstruje stereotaktyczne wszczepienie drutu elektrodowego i światłowodu w hipokampie modelu myszy.

Wszczepianie układu elektrod i światłowodu do hipokampa myszy

Ten film pokazuje rejestrację rytmicznej aktywności sieci neuronalnej, znanej również jako oscylacje theta, w izolowanym hipokampie. Elektrody są umieszczane w różnych warstwach i pozycjach przestrzennych w celu wykrywania i analizowania oscylacji theta. Pokazuje to unikalny skład neuronalny i łączność sieci neuronalnej w różnych warstwach hipokampa.

Zapis in vitro oscylacji theta w hipokampie myszy

Ten film pokazuje metodę wykorzystania optogenetyki do modulowania dynamiki sieci hipokampa poprzez aktywację genetycznie zmodyfikowanych światłoczułych interneuronów w wycinku mózgu myszy, poprawiając synchronizację oscylacji theta i badając zachowanie obwodów neuronalnych.

Optogenetyczna kontrola dynamiki sieci hipokampa

Aktywność theta w hipokampie jest związana z określonymi etapami poznawczymi i behawioralnymi. W tym miejscu opisujemy metodę analityczną wykrywania wysoce zorganizowanych oscylacji theta w hipokampie przy użyciu podejścia opartego na czasowo-częstotliwościowym (tj. analizie falkowej).

Automatyczne wykrywanie wysoce zorganizowanych oscylacji theta w mysim EEG

Opisujemy użycie optogenetyki i zapisów elektrofizjologicznych do selektywnych manipulacji oscylacjami theta hipokampa (5-10 Hz) u zachowujących się myszy. Skuteczność porywania rytmu jest monitorowana za pomocą lokalnego potencjału pola. Połączenie inhibicji opto- i farmakogenetycznej rozwiązuje eferentny odczyt synchronizacji hipokampa.

Optogenetyczne porywanie oscylacji theta hipokampa u zachowujących się myszy

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

Ten protokół opisuje użycie specjalnie zaprojektowanego urządzenia rejestrującego i elektrod do rejestrowania lokalnych potencjałów pola i badania przepływu informacji w hipokampie myszy i korze przedczołowej.

Podwójne nagrania zewnątrzkomórkowe w hipokampie myszy i korze przedczołowej myszy

Poznaj metodę rejestracji oscylacji theta w izolowanym hipokampie gryzoni przy użyciu technik patch-clamp i stymulacji optogenetycznej. Ta technika umożliwia szczegółowe badanie mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw pamięci.

Dostrajanie w paśmie theta hipokampa in vitro: metodologie nagrywania z izolowanego obwodu septohipokampa gryzoni

Przeglądaj więcej filmów