Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Ogólnym celem tej metodologii jest opracowanie modułowego podejścia chemoenzymatycznego do syntezy N-glikanów poprzez stworzenie nowej mikrotablicy glikanowej na szkiełku pokrytym tlenkiem glinu w celu wykrywania wiązania heteroglikanów przez przeciwciała przeciwko HIV. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie glikobiologii dotyczące identyfikacji specyficznych glikanów komórkowo-wirusowych w celu dalszego rozwoju. Główną zaletą tej metody jest możliwość wykrywania słabego wiązania oraz identyfikacji mieszaniny cukrów, które wiążą się z białkiem, takim jak przeciwciało pochodzące od pacjenta z HIV.

Zastosowania tej techniki obejmują diagnostykę infekcji grypą, ponieważ katabolity kwasu sialowego są powszechnie eksprymowane w komórkach nabłonka dróg oddechowych ludzi, a objawy tych infekcji są typowe. W związku z tym glikoarray stanowi idealne narzędzie do określania specyficzności dzikich podtypów. Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat specyficzności glikanów przeciwciał HIV, można ją również zastosować w innych układach, takich jak diagnostyka różnych nowotworów w oparciu o wzorzec wiązania przeciwciał z surowicy ludzkiej z ludzkimi antygenami surowiczymi naniesionymi na powierzchnię.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 2-5 µmol wcześniej przygotowanego glikanu do pięciomililitrowej kolby okrągłodennej. Do kolby należy wprowadzić magnetyczny mieszadło i zamknąć ją gumowym septem. Następnie do kolby należy dodać 400 µL świeżo osuszonego DMF oraz 10-25 µmol łącznika kwasu fosfonowego.

Następnie mieszaj mieszaninę reakcyjną przy 800 rpm przez pięć godzin. Po zakończeniu reakcji odparuj rozpuszczalnik za pomocą wirówki rotacyjnej przy ciśnieniu próżni od 5 do 10 millibar i temperaturze 40 °C. Następnie rozpuść wysuszoną mieszaninę reakcyjną w 0,5 ml wody i nanieś ją na żel poliakrylamidowy.

Produkty eluej wodą, zbierając frakcje o objętości od jednego do dwóch mililitrów. Aby sprawdzić zebrane frakcje metodą TLC, nanieś każdą z nich na płytkę TLC, a następnie zanurz płytkę w 0,25 M roztworze molibdanu ceru i amonu. Podgrzej zabarwioną płytkę na płycie grzewczej, aby zwizualizować produkt.

Po połączeniu frakcji zawierających produkt, zamrozić roztwór i poddać go liofilizacji w celu otrzymania pożądanego produktu w postaci białego proszku. Następnie rozpuścić wysuszony produkt w dwóch mililitrach wody i dodać wodorotlenek palladu. Do kolby przymocować balon wypełniony wodorem i mieszać mieszaninę reakcyjną przy 800 rpm przez 15 godzin w atmosferze wodoru.

Po zakończeniu reakcji przefiltruj mieszaninę przez złoże Celite i przemyj ją dwiema mililitrami metanolu oraz dwiema mililitrami destylowanej wody dejonizowanej. Następnie odparuj rozpuszczalnik za pomocą rotavapora przy ciśnieniu próżni 300 millibar i temperaturze 40 °C. Po tym etapie rozpuść surową mieszaninę w około jednym mililitrze wody i nałóż ją na złoże żelu poliakryloamidowego.

Eluuj produkt wodą, zbierając frakcje o objętości od jednego do dwóch mililitrów. Po połączeniu frakcji zawierających produkt i zamrożeniu roztworu, liofilizuj go w celu uzyskania pożądanego produktu w postaci białego proszku. Po wysuszeniu produktu przeprowadź jego charakterystykę za pomocą NMR i spektrometrii mas, stosując tlenek deuteru jako rozpuszczalnik.

W celu anodowania powierzchni ustaw inkubator z kontrolą temperatury na 4 °C. Następnie przelej wcześniej przygotowany 0,3 M wodny roztwór kwasu szczawiowego do zlewki o pojemności 500 ml zawierającej mieszadło magnetyczne. Jako katodę umieść w roztworze pręt platynowy o długości 10 cm.

Przez cały proces anodowania należy stale mieszać kwas szczawiowy z prędkością 300 rpm. W oprogramowaniu lab tracer należy kliknąć przycisk setup, a następnie wybrać funkcję Sweep Voltage. Ustaw napięcie początkowe i końcowe na 25,8 V.

Ustaw liczbę punktów na 100, podatność na jeden oraz opóźnienie sweep na 1200 ms. Następnie kliknij OK. Zamocuj za pomocą zacisku szkiełko przedmiotu powlekane aluminiumm, skierowane w stronę katody.

Kliknij przycisk uruchamiania testu i zaobserwuj bieżący pomiar. Po anodowaniu powierzchni dokładnie wypłucz szkiełko przedmiotowe wodą dwukrotnie destylowaną i osusz strumieniem azotu. Przechowuj szkiełko przedmiotowe w komorze o wilgotności względnej 30% do czasu dalszego użycia.

Do procesu wytwarzania należy przygotować 100 µL roztworów wszystkich glikanów jednowartościowych w glikolu etanolowym o stężeniu 10 mM. Roztwory glikanów należy rozcieńczyć buforem do drukowania, aby uzyskać roztwory o stężeniu 100 µM. W badaniu heteroligandów do 5 µL każdego roztworu glikanu należy dodać 5 µL glikanu MAN-5.

Przenieś przygotowane glikany do mikropłytki 384-dołkowej w celu przeprowadzenia etapu drukowania mikromacierzy. Po umieszczeniu mikropłytki w urządzeniu do drukowania macierzy, wydrukuj mikromacierze za pomocą robotic pin, nanosząc 0,6 nanolitrów roztworów glikanów na każdy szkiełko z powłoką aluminiową. Następnie przygotuj 70 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego PG-9 oraz bufor PTSB zawierający 3% BSA.

Następnie w ciemności należy przygotować 120 µL przeciwciała wtórnego z markerem fluorescencyjnym Donkey and Anti-human Immunoglobulin G oraz bufor PBST zawierający 3% BSA. Wymieszać PG9 i przeciwciało wtórne z markerem fluorescencyjnym w stosunku 1:1. Następnie inkubować zmieszane przeciwciała przez 30 minut w temperaturze 4 °C.

Po inkubacji umieść szkiełko przedmiotowe pokryte aluminium w komorze inkubacyjnej, która jest podzielona na 16 dołków. Przenieś 100 µL zmieszanych przeciwciał na macierz glikanową. Po inkubacji w temperaturze 4 °C przez 16 godzin usuń zmieszane przeciwciała z macierzy glikanowej za pomocą pipety, a następnie zdejmij komorę inkubacyjną.

Przemyj szkiełko w buforze PBST i wodzie dejonizowanej. Następnie osusz szkiełko w wirowarce przy 2000 ×g. W kolejnym kroku uruchom oprogramowanie do analizy obrazów mikromacierzy.

Włóż wysuszone szkiełko do skanera macierzy tak, aby elementy macierzy były skierowane w dół. Kliknij menu ustawień. Ustaw rozdzielczość obrazu na 5 µm na piksel.

Następnie ustaw długość fali na 635 nanometrów przy PMT 450 oraz moc na 100%. Kliknij przycisk skanowania, aby rozpocząć obrazowanie preparatu. Na koniec kliknij ikonę pliku, aby zapisać obraz skanu w formacie TIF do analizy obrazu. W niniejszym badaniu zsyntetyzowano szeroki wachlarz N-glikanów, stosując modularną strategię chemoenzymatyczną.

Aby zademonstrować skuteczność tej strategii, metodami chemoenzymatycznymi zsyntezowano izometryczną strukturę biantenową. Galaktozylacja enzymatyczna disacharydu 1, a następnie fukozylacja trisacharydu 2, doprowadziły do otrzymania pożądanego tetrasacharydu 3. Peracetylacja oraz modyfikacje końca redukującego bloków budulcowych dwa i trzy pozwoliły na otrzymanie pożądanych cząsteczek cztery i pięć.

Stereoselektywna trójkrotna O-glikozylacja modułu cztery trisacharydu sześć pozwoliła na otrzymanie heksasacharydu siedem. Odbezpieczenie i reakcja z modułem pięć doprowadziły do powstania dekasacharydu dziewięć. Całkowite odbezpieczenie dało glikan 10, który został scharakteryzowany za pomocą NMR i spektrometrii mas.

Glikany zawierające ogon pentyloaminowy na końcu redukującym zostały zmodyfikowane łącznikami kwasu fosfonowego i przytwierdzone do szklanej powierzchni powlekanej aluminium za pomocą chemii fosfinidów. Przeciwciało szeroko neutralizujące HIV-1 PG9 zostało poddane przesiewaniu w celu określenia jego specyficzności względem glikanów z wykorzystaniem macierzy homoglikanowych i heteroglikanowych, aby po raz pierwszy zademonstrować jego oddziaływanie z sąsiednimi heteroglikanami w pętli V1/V2 powierzchni HIV1 PG120. Po opanowaniu techniki, proces ten — od immobilizacji glikanów po analizę beta — może zostać przeprowadzony w ciągu 24 godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu świeżo anodyzowanych szkiełek przedmiotowych pokrytych aluminium dla Glikanu 10. Do tej procedury służą szkiełka dla techników medycznych. Można przeprowadzić oznaczenie stałej ciała w celu ilościowego określenia oddziaływań wiążących między węglowodanem a badanym białkiem.

Opracowanie tej techniki utorowało drogę badaczom do lepszego zrozumienia roli węglowodanów w chorobach zakaźnych w Kenii i pomogło w opracowaniu nowych terapii przeciwko tym schorzeniom. Należy pamiętać, że praca z toksycznymi odczynnikami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania eksperymentów należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odzieży ochronnej, okularów i masek.