Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV
5 lutego 2018
Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.
Ogólnym celem tej metodologii jest opracowanie modułowego podejścia chemoenzymatycznego do syntezy N-glikanów poprzez skonstruowanie nowej mikromacierzy glikanów na szkiełku pokrytym tlenkiem glinu do wykrywania heteroglikanowego wiązania przeciwciał HIV. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w glikobiologii w celu identyfikacji glikanów specyficznych dla wirusa komórkowego dla wielu etapów rozwoju. Główną zaletą tej metody jest wykrycie słabego wiązania i zidentyfikowanie mieszaniny cukrów, które wiążą się z białkiem, takim jak przeciwciało od pacjenta z wirusem HIV.
Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę zakażeń grypą, ponieważ katabolizm sjalowy ulega ekspresji na ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych i problemy są powszechne, podczas gdy objawy. W związku z tym glikoarray będzie idealnym narzędziem do określania specyficzności dzikich podtypów. Chociaż metoda ta może zapewnić wewnątrz glikanów specyficzność przeciwciał HIV, może być również stosowana do innych systemów, takich jak diagnoza różnych nowotworów w oparciu o wzór wiązania ludzkich przeciwciał w surowicy w stosunku do ludzkich specyficznych antygenów surowicy wydrukowanych na powierzchni.
Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 2-5 mikromoli wcześniej przygotowanego glikanu i pięciomililitrową kolbę okrągłodenną. Dodaj mieszadło magnetyczne do kolby i przykryj ją gumową przegrodą. Dodać 400 mikrolitrów świeżo suszonego DMF i 10-25 mikromoli łącznika kwasu fosfonowego do kolby.
Następnie mieszaj mieszaninę reakcyjną z prędkością 800 obr./min przez pięć godzin. Po zakończeniu reakcji odparować rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej przy podciśnieniu od pięciu do 10 milibarów i temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie rozpuść wysuszoną mieszaninę reakcyjną i 0,5 mililitra wody i załaduj na wierzch złoża żelu poliakrylamidowego.
Eluuj produkty za pomocą wody i zbierz od jednej do dwóch frakcji mililitrowych. Aby sprawdzić zebrane frakcje za pomocą TLC, umieść każdą frakcję na płytce TLC i zanurz płytkę w 0,25 molowym molibdenianu ceru i amonu. Podgrzej poplamioną płytę za pomocą płyty grzejnej, aby uwidocznić produkt.
Po połączeniu produktu zawierającego frakcje i zamrożeniu roztworu należy wykonać biofoli, aby uzyskać pożądany produkt w postaci białego proszku. Następnie rozpuść wysuszony produkt w dwóch mililitrach wody i dodaj wodorotlenek palladu. Dołączyć balon zawierający wodór do kolby i mieszać mieszaninę reakcyjną z prędkością 800 obr./min przez 15 godzin w atmosferze wodoru.
Po zakończeniu reakcji przefiltrować mieszaninę przez złoże Celite i przemyć dwoma mililitrami metanolu i dwoma mililitrami destylowanej wody dejonizowanej. Następnie odparuj rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej przy podciśnieniu 300 milibarów i temperaturze 40 stopni Celsjusza. Następnie rozpuść mieszaninę crud w około jednym mililitrze wody i załaduj ją na złoże żelu poliakrylamidowego.
Eluować produkt wodą i zebrać od jednej do dwóch frakcji mililitrowych. Po połączeniu produktu zawierającego frakcje i zamrożeniu roztworu należy wykonać biofoli, aby uzyskać pożądany produkt w postaci białego proszku. Po wyschnięciu produktu należy go scharakteryzować za pomocą enimaru i spektroskopii mas przy użyciu tlenku deuteru jako rozpuszczalnika.
W przypadku anodowania powierzchniowego należy ustawić inkubator z kontrolowaną temperaturą na cztery stopnie Celsjusza. Następnie przenieść wcześniej przygotowany 0,3-molowy wodny roztwór kwasu szczawiowego do 500-mililitrowej zlewki zawierającej mieszadło magnetyczne. Umieść w roztworze platynowy pręt o długości 10 centymetrów jako katodę.
Mieszaj kwas szczawiowy z prędkością 300 obr./min przez cały proces anodowania. W oprogramowaniu do śledzenia laboratoryjnego kliknij przycisk konfiguracji, a następnie kliknij wybór funkcji Napięcie przemiatania. Ustaw napięcie start i stop na 25,8 V.
Liczba punktów do 100, zgodność z jednym i opóźnienie przemiatania do 1200 milisekund. Następnie kliknij OK. Zacisnąć szkiełko ze szkła pokrytego aluminium skierowane w stronę katody.
Kliknij przycisk uruchom test i obserwuj bieżący pomiar. Po anodowaniu powierzchniowym dokładnie umyj szkiełko wodą podwójnie destylowaną i osusz gazowym azotem. Przechowuj szkiełko w komorze o wilgotności względnej 30% do czasu dalszego użycia.
Do produkcji przygotuj 100 mikrolitrów roztworów wszystkich jednowartościowych glikanów w glikolu etanolowym o stężeniu 10 milimolowym. Rozcieńczyć roztwory glikanów buforem drukarskim, aby uzyskać 100 roztworów mikromolowych. W badaniu heteroligandowym dodaj pięć mikrolitrów glikanu MAN-5 do pięciu mikrolitrów każdego roztworu glikanu.
Przenieś przygotowane glikany na 384-dołkową mikropłytkę w celu wydrukowania mikromacierzy. Po włożeniu mikropłytki do technologii matrycy drukarki, wydrukuj mikrotablice za pomocą zrobotyzowanego pina, umieszczając 0,6 nanolitra roztworów glikanów na każdym szkiełku ze szkła pokrytego aluminium. Następnie przygotuj 70 mikrolitrów pierwszorzędowego buforu przeciwciała PG-9 i PTSB zawierającego 3% BSA.
Następnie przygotuj 120 mikrolitrów wtórnego przeciwciała fluorescencyjnego znacznika Donkey i anty-ludzkiej immunoglobuliny G oraz buforu PBST zawierającego 3% BSA w ciemności. Wymieszaj PG9 i przeciwciało z wtórnym znacznikiem fluorescencyjnym w stosunku 1:1. Następnie inkubować wstępnie zmieszane przeciwciała przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji załaduj szkiełko ze szkła pokrytego aluminium do komory inkubacji szkiełka, która jest podzielona na 16 dołków. Przenieść 100 mikrolitrów wstępnie zmieszanych przeciwciał do macierzy glikanów. Po inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin, należy usunąć wstępnie zmieszane przeciwciała z matrycy glikanowej za pomocą pipety, a następnie wyjąć komorę inkubacyjną szkiełka.
Umyj szkiełko w buforze PBST i wodzie dejonizowanej. Następnie odwiruj szkiełko przy 2000-krotności grawitacji. Następnie otwórz oprogramowanie do analizy obrazu mikromacierzy.
Włóż wysuszony szkiełko do skanera matrycowego elementami skierowanymi w dół. Kliknij menu ustawień. Ustaw rozdzielczość obrazu na pięć mikrometrów na piksel.
I ustaw długość fali na 635 nanometrów za pomocą PMT 450 i moc na 100%Kliknij przycisk skanowania, aby rozpocząć obrazowanie slajdu. Na koniec kliknij ikonę pliku, aby zapisać zeskanowany obraz w formacie TIF do analizy obrazu. W tym badaniu zsyntetyzowano szeroki wachlarz N-glikanów przy użyciu modułowej strategii chemoenzymatycznej.
Aby zademonstrować skuteczność strategii, zsyntetyzowano dwuantenową strukturę izometryczną metodami chemoenzymatycznymi. Galaktozylacja enzymatyczna disacharydu 1, a następnie fukozylacja trisacharydu 2 pozwoliła uzyskać pożądany tetrasacharyd 3. Na satylację i redukcyjne modyfikacje końcowe bloku budulcowego drugiego i trzeciego, pozwoliły na pożądanie cząsteczki czwartej i piątej.
Stereoselektywna trój-glikosalacja O-glikosalacji modułu czwartego trisacharydu szóstego dostarczyła heksasacharydu siódemki. Odbezpieczenie i reakcja przed modułem piątym dały dedekasacharyd dziewiąty. Globalna detekcja pozwoliła na uzyskanie glikanu 10, który został scharakteryzowany za pomocą enimaru i spektroskopii mas.
Glikany zawierające ogon pentyloaminy na końcu redukującym zmodyfikowano łącznikami kwasu fosfonowego i przytwierdzono do powierzchni pokrytej szkłem aluminiowym za pomocą chemii fosforynowej. Szeroko neutralizujące przeciwciało przeciwdziałające HIV-1 PG9 zostało przebadane pod kątem specyficzności glikanowej przy użyciu macierzy homo i heteroglikanów, aby po raz pierwszy wykazać, że jest ono ineteraction z sąsiednimi heteroglikanami w pętli V1 / V2 powierzchni HIV1 PG120. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 24 godzin od unieruchomienia glikanów do analizy beta, jeśli została wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o użyciu szkiełka ze szkła pokrytego świeżo anodyzowanym aluminium do Glycan 10. Do układania tej procedury służą szkiełka medyczne. Określenie stałej ciała można przeprowadzić w celu ilościowego określenia interakcji wiązania między węglowodanami a białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.
Opracowanie tej techniki utorowało naukowcom drogę do lepszego zrozumienia roli węglowodanów w chorobach zakaźnych w Kenii i pomocy w opracowaniu nowych terapii przeciwko chorobom. Nie zapominaj, że praca z czynnikami toksycznymi może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie ubrań, okularów i masek, powinny być zawsze podejmowane podczas przeprowadzania eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia modularne chemiczno-enzymatyczne podejście do syntezy N-glikanów na szklanych płytkach pokrytych tlenkiem glinu, ułatwiając zastosowania mikroarray glikanów. Metodologia jest demonstrowana poprzez profilowanie przeciwciała szeroko działającego na HIV, pokazując jego potencjał w glikobiologii.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Glikobiologia
- Immunologia
- Technologia mikroarray
Tło
- N-glikany odgrywają kluczową rolę w interakcjach komórka-wirus.
- Rozumienie wzorców wiązania glikanów może pomóc w diagnozowaniu infekcji wirusowych.
- Obecne metody mogą nie skutecznie wykrywać słabych interakcji wiązania.
- Mikroarray glikanów mogą zapewnić wgląd w specyficzność przeciwciał.
Cel badania
- Rozwój nowej metody syntezy N-glikanów.
- Stworzenie mikroarray glikanów do wykrywania interakcji przeciwciał HIV.
- Zbadanie implikacji dla diagnozowania innych infekcji wirusowych i nowotworów.
Zastosowane metody
- Chemiczno-enzymatyczna synteza N-glikanów.
- Konstrukcja mikroarray glikanów na ślizgach ACG.
- Profilowanie przeciwciał szeroko działających na HIV.
- Analiza wzorców wiązania glikanów.
Główne wyniki
- Udana synteza N-glikanów do zastosowań mikroarray.
- Wykazane wykrywanie słabych interakcji wiązania.
- Identyfikacja specyficznych wzorców glikanów związanych z przeciwciałami HIV.
- Potencjalne zastosowania w diagnostyce grypy i nowotworów.
Wnioski
- Modularne podejście poprawia syntezę N-glikanów.
- Ta technika może poprawić zrozumienie specyficzności glikanów.
- Ma potencjał dla szerszych zastosowań w diagnostyce.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This chemo-enzymatic N-glycan synthesis method enables rapid generation of diverse glycan libraries for microarray-based antibody profiling, addressing a critical gap in detecting weak and heterogeneous glycan-protein interactions relevant to HIV vaccine design. By facilitating the analysis of hetero-ligand binding behaviors of broadly neutralizing antibodies like PG9, the approach supports mechanistic de-risking in early immunogen discovery and improves predictive confidence in antigen selection. The modular strategy provides a scalable, reusable platform for epitope mapping and target validation across infectious disease and oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping glycan-specific antibody interactions that inform target relevance and mechanism of action.
- Operational Value: Supports biological de-risking through systematic profiling of hetero-ligand binding patterns on defined glycan arrays.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying glycan motifs associated with potent neutralizing activity, guiding immunogen design decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces covalently attached, structurally diverse N-glycans on aluminum oxide-coated glass slides, creating standardized microarrays for reliable compound and antibody screening.
- Quantitative Output: Enables detection of weak binding interactions through fluorescent readouts, providing measurable affinity and specificity data for hit validation.
- Platform Reuse: The modular synthesis strategy allows rapid regeneration of glycan libraries, supporting iterative screening campaigns and cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly supports translational biomarker discovery by linking specific glycan structures (e.g., Man5GlcNAc2 and di-sialylated bi-antennary N-glycans) to HIV antibody binding phenotypes.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a defined glycan system to assess antibody efficacy and specificity prior to in vivo testing.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing off-target or weak-binding glycan interactions that may indicate reduced therapeutic potential or safety concerns.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from early target validation through lead identification, enabling glycan-dependent antibody characterization that informs downstream preclinical development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by defining glycan epitopes recognized by HIV broadly neutralizing antibodies, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Screening: Delivers assay-ready glycan microarrays with high reproducibility and quantitative readouts, enabling reliable evaluation of antibody-glycan interactions across large libraries.
- Analytics: Generates binding signal data (e.g., fluorescence intensity) that allows comparative analysis of homo- and hetero-glycan binding, facilitating structure-activity relationship mapping.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying glycan-specific antibody profiles that can be correlated with functional neutralization and used to guide immunogen optimization.
- Enterprise Reuse: The chemo-enzymatic modular approach is adaptable across targets, allowing reuse of the synthesis and array fabrication workflow for multiple antibody discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycan-dependent antibody recognition.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through covalent glycan attachment and controlled array fabrication on ACG slides.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid glycan library generation and reducing reliance on external synthesis or fragmented screening efforts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycan-binding phenotypes linked to potent neutralization, informing advancement decisions in vaccine and therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate chemistry, enzymatic synthesis, and microarray handling to ensure proper glycan modification and array quality.
- Depends on instrumentation for rotary evaporation, polyacrylamide gel electrophoresis, and array scanning with specific wavelength and PMT settings.
- Necessitates cross-team standardization of glycan solution preparation, printing concentrations, and antibody incubation protocols to maintain inter-assay consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different glycan targets or antibody classes, particularly in linker chemistry and surface immobilization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for freshly anodized slides and careful handling of toxic reagents during phosphonate linker coupling and hydrogenation steps.
