Name: Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj chemoenzymatyczną syntezę N-glikanów do tworzenia mikromacierzy na szkłach powlekanych tlenkiem glinu oraz profilowanie przeciwciał HIV. Ta metoda umożliwia wykrywanie słabych wiązań i analizę specyficzności glikanów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Wydziałowi Technologii Cienkowarstwowej, Centrum Badań nad Technologią Instrumentów (ITRC) oraz Narodowym Laboratoriom Badań Stosowanych, Park Naukowy Hsinchu, Tajwan. Prace te były wspierane przez Krajową Radę Nauki (grant nr 1). MOST 105-0210-01-13-01) oraz Academia Sinica.

<ol><li>Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centralized+modularity+of+N-linked+glycosylation+pathways+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells.</a> PloS one. 4, e7317(2009).</li>
<li>Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Role+of+an+N-Linked+Glycan+on+the+Surface+Antigen+of+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Modulating+Virus+Sensitivity+to+Broadly+Neutralizing+Antibodies+Against+the+Receptor+and+Coreceptor+Binding+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.virol%22%5BJournal%5D)">Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites.</a> J.virol. 90, 829-841 (2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+Strategy+for+the+Chemoenzymatic+Synthesis+of+Asymmetrically+Branched+N-Glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans.</a> Science. 341, 379-383 (2013).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Chemoenzymatic+Synthesis+of+an+N-glycan+Isomer+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library.</a> Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).</li>
<li>Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+Protein-Directed+Glycosylation+of+Native+Cleaved+HIV-1+Envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.Virol%22%5BJournal%5D)">Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope.</a> J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).</li>
<li>Behrens, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+Antigenic+Effects+of+Individual+Glycan+Sites+of+a+Trimeric+HIV-1+Envelope+Glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein.</a> Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).</li>
<li>Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+development+of+an+HIV-1+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Challenges in the development of an HIV-1 vaccine.</a> Nature. 455, 613-619 (2008).</li>
<li>Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Strategies+Targeting+HIV+Glycans+in+Vaccine+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Bio%22%5BJournal%5D)">Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design.</a> Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).</li>
<li>Wang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+carbohydrate+Antigens+for+HIV+Vaccine+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).</li>
<li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Glycosylation+on+an+Immunodominant+Region+in+the+V1V2+Variable+Domain+of+the+HIV-1+Envelope+gp120+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein.</a> PLoS Comput Biol. 12, e1005094(2016).</li>
<li>Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrates+of+human+Immunodeficiency+Virus.+Structures+of+Oligosaccharides+Linked+to+the+Envelope+Glycoprotein+120%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120.</a> The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).</li>
<li>Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+Structure+of+A+Native%2C+Fully+Glycosylated%2C+Cleaved+HIV-1+Envelope+Trimer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer.</a> Science. 351, 1043-1048 (2016).</li>
<li>Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+GlycanMicroarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Natural GlycanMicroarrays.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).</li>
<li>Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweet+Spots+in+Functional+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Bio%22%5BJournal%5D)">Sweet Spots in Functional Glycomics.</a> Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).</li>
<li>Dotsey, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Throughput+Protein+Microarray+Approach+to+Classify+HIV+Monoclonal+Antibodies+and+Variant+Antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens.</a> PLoS One. 10, e0125581(2015).</li>
<li>Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Development+of+Glycan+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">New Development of Glycan Arrays.</a> Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).</li>
<li>Scurr, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Characterization+of+Carbohydrate+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays.</a> Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+Covalent+Glycan+Array+for+Ligand+Profiling+of+Diverse+Glycan+Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).</li>
<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+Array+on+Aluminum+Oxide-Coated+Glass+Slides+Through+Phosphonate+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).</li>
<li>Tseng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsomega.6b00143">Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays.</a> ACS Omega. 1, 773-783 (2016).</li>
<li>Shivatare, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Convergent+Synthesis+of+Bi-%2C+Tri-%2C+and+Tetra-Antennary+Complex+Type+N-Glycans+and+Their+HIV-1+Antigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).</li>
<li>Shivatare, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+synthesis+of+N-Glycans+and+Arrays+for+the+Hetero-Ligand+Binding+Analysis+of+HIV+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies.</a> Nat Chem. 8, 338-346 (2016).</li>
<li>McLellan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Hiv-1+gp120+V1%2FV2+Domain+with+Broadly+Neutralizing+Antibody+PG9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9.</a> Nature. 480, 336-343 (2011).</li>
<li>Julien, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Recognition+of+the+HIV-1+Trimer+by+Broadly+Neutralizing+Antibody+PG9%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).</li>
<li>Willis, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Antibody+HCDR3s+from+HIV-Native+Donors+Presented+on+a+PG9+Neutralizing+Antibody+Background+Mediate+HIV+Neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5499/performing-1d-thin-layer-chromatography">Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>de Castro, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+useful+approach+to+the+automation+of+analytical+processes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Automat+Chem%22%5BJournal%5D)">A useful approach to the automation of analytical processes?</a> J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5634/introduction-to-mass-spectrometry">Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>Tseng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsomega.6b00143">Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays.</a> ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="https://classes.soe.ucsc.edu/bme210/Spring07/GenePix_Pro_6.0_Manual_RevL.pdf">GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial</a>. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).</li>
<li>GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/">http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/</a> (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Klasa bNAb HIV-1, w tym PG9, PG16 i PGTs 128, 141-145, okazała się bardzo skuteczna w neutralizowaniu 70-80% krążących izolatów HIV-1. Epitopy tych bNAb są wysoce konserwatywne wśród wariantów całej grupy M HIV-1, dlatego mogą kierować skutecznym projektem immunogenowym szczepionki przeciwko HIV w celu wywołania przeciwciał neutralizujących 23,24,25. W ramach naszych ciągłych wysiłków zmierzających do zidentyfikowania epitopów g...

N-glikany na glikoproteinach są kowalencyjnie połączone z resztą asparaginy (Asn) konsensusu Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, które wpływają na kilka procesów biologicznych, takich jak konformacja białka, antygenowość, rozpuszczalność i rozpoznawanie lektyn1,2. Synteza chemiczna oligosacharydów sprzężonych z N stanowi poważne wyzwanie syntetyczne ze względu na ich ogromną mikroniejednorodność strukturalną i wysoce rozgałęzioną architekturę. Staranny dobór grup ochronnych w celu dostrojenia reaktywności bloków budulcowych, osiągnięcie selektywności w centrach anomerycznych oraz właściwe użycie promotora/aktywatora (aktywatorów) są kluczowymi elementami syntezy złożonych oligosacharydów. Aby rozwiązać ten problem złożoności, niedawno zgłoszono ogromną ilość pracy nad postępem w syntezie N-glikanów3,4. Pomimo tych solidnych podejść, znalezienie skutecznej metody przygotowania szerokiej gamy N-glikanów (~20 000) pozostaje poważnym wyzwaniem.
Szybkie tempo mutacji HIV-1 w celu osiągnięcia rozległej różnorodności genetycznej i jego zdolności do ucieczki przed neutralizującą odpowiedzią przeciwciał, jest jednym z największych wyzwań dla opracowania bezpiecznej i profilaktycznej szczepionki przeciwko HIV-15,6,7. Jedną ze skutecznych taktyk stosowanych przez wirusa HIV w celu uniknięcia odpowiedzi immunologicznej gospodarza jest potranslacyjna glikozylacja glikoproteiny otoczki gp120 z różnorodnymi glikanami sprzężonymi z N pochodzącymi z maszynerii glikozylacji gospodarza8,9. Niedawny raport dotyczący dokładnej analizy rekombinowanej monomerycznej glikozylacji gp120 HIV-1 z ludzkich embrionalnych komórek nerki (HEK) 293T sugeruje występowanie mikroheterogeniczności strukturalnej z charakterystycznym wzorcem specyficznym dla komórki10,11,12. Dlatego zrozumienie specyficzności glikanowej bNAbs HIV-1 wymaga dobrze scharakteryzowanych struktur N-glikanów związanych z gp120 w ilości wystarczającej do analizy.
Odkrycie technologii mikromacierzy glikanowych umożliwiło wysokoprzepustową eksplorację specyficzności różnorodnych białek wiążących węglowodany, wirusów/adhezyn bakteryjnych, toksyn, przeciwciał i lektyn13,14. Systematyczne ułożenie glikanów w formacie opartym na układach scalonych może określić problematyczne interakcje białko-glikany o niskim powinowactwie poprzez wielowartościową prezentację15,16,17,18. Ten układ glikanów oparty na chipie wydaje się skutecznie naśladować interfejsy komórka-komórka. Aby wzbogacić technologię i przezwyciężyć nierówny problem związany z konwencjonalnymi formatami matryc, nasza grupa opracowała niedawno matrycę glikanów na szkiełku pokrytym tlenkiem glinu (ACG) przy użyciu glikanów zakończonych kwasem fosfonowym w celu zwiększenia intensywności sygnału, jednorodności i czułości19,20.
Aby poprawić obecną wiedzę na temat epitopów glikanowych nowo wyizolowanych przeciwciał neutralizujących HIV-1 (bNAbs), opracowaliśmy wysoce efektywną strategię modułową do przygotowania szerokiej gamy glikanów sprzężonych z N21,22 do wydrukowania na slajdzie ACG (zobacz Rysunek 1). Badania profilowania swoistości bNAb HIV-1 na matrycy ACG wykazały niezwykłe wykrycie hetero-glikanowego zachowania wiązania bardzo silnego bNAb PG9, który został wyizolowany od osób zakażonych wirusem HIV23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75058</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108247</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny siarczan magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7487889</td><td></td></tr><tr><td>Eterian etylowy trifluorku boru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109637</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048468</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P2 poliakryloamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1504118</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorek bis(cyklopentadienylo)hafnu(IV)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12116664</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-1,4 Galaktozylotransferazy z mleka krowiego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48279</td><td></td></tr><tr><td>BioDot Technologia kartezjanowa z robotycznym pinem SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)</td><td>Arrayit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molibdenian ceru amonu</td><td>TCI</td><td>C1794</td><td></td></tr><tr><td>Azotan ceru amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16774213</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko czyste&nbsp;</td><td>Schott&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytydyno-5&prime;-monofosfo-N-acetyloneuraminowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3063716</td><td></td></tr><tr><td>Deuterowany chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>865496</td><td></td></tr><tr><td>Osioł Anty-ludzka IgG (Alexa Fluor647 sprzężona</td><td>Jackson Immuno Research, USA</td><td>709605098</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75092</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorek dietyloaminosarki</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38078090</td><td></td></tr><tr><td>Dimetyloformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68122</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>141786</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Acros Organic</td><td>107211</td><td></td></tr><tr><td>FAST Szkiełka ramowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanozyna 5'- sól disodowa difosfo-b-L-fukozy&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Sigma Aldrich</td><td>15839700</td><td></td></tr><tr><td>Lab tracer 2.0&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Sekcja 4 protokołu</td></tr><tr><td>Czytnik GenePix Pro 4300A (analiza obrazu mikromacierzy)</td><td>urządzenia molekularne</td><td></td><td>www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism (przetwarzanie obrazu)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td>http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/</td></tr> <tr><td>Wodorotlenek litu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310652</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek manganu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7773015</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67561</td><td></td></tr><tr><td>N-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71363</td><td></td></tr><tr><td>Kwas szczawiowy</td><td>Acros Organiczny</td><td>144627</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek palladu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12135227</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>110861</td><td></td></tr><tr><td>Kwas P-toluenosulfonowy jednowodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>773476</td><td></td></tr><tr><td>Srebrna triflata</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2923286</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647145</td><td></td></tr><tr><td>Sód wodór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>Mettlenek sodu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>124414</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7757826</td><td></td></tr><tr><td>Toluen&nbsp;</td><td>Bufor Sigma Aldrich</td><td>108883</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>N/A</td><td>Ultra-czysty gatunek</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Amresco</td><td>9005645</td><td></td></tr><tr><td>galaktoza difosforanu urydyny (UDP-galaktoza)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>137868521</td><td></td></tr></tbody></table>

chemoenzymatyczna synteza n-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał hiv

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Prezentujemy wysoce efektywny sposób na szybkie przygotowanie szerokiej gamy oligosacharydów związanych z N (szacowanych na ponad 20 000 struktur), które są powszechnie spotykane na ludzkich glikoproteinach. Aby osiągnąć pożądaną różnorodność strukturalną, strategię rozpoczęto od chemoenzymatycznej syntezy trzech rodzajów modułów fluorku oligosacharylu, a następnie ich stopniowej α-selektywnej glikozylacji w pozycjach 3-O i 6-O reszty mannozy wspólnego rdzenia trisacharydu o kluczowym β wiązaniem mannozydowym. Następnie przymocowaliśmy N-glikany do powierzchni szkiełka ze szkła pokrytego tlenkiem glinu (ACG), aby stworzyć kowalencyjną mieszaną matrycę do analizy interakcji hetero-liganda z przeciwciałem HIV. W szczególności wiązanie nowo wyizolowanego przeciwciała neutralizującego HIV-1 (bNAb), PG9, z mieszaniną blisko rozmieszczonego Man5GlcNAc2 (Man5) i 2,6-di-sjalylowanego kompleksu dwuantenowego typu N-glikan (SCT) na matrycy ACG, otwiera nową drogę do kierowania skutecznym projektem immunogenu do opracowania szczepionki przeciwko HIV. Ponadto nasza matryca ACG stanowi potężne narzędzie do badania innych przeciwciał HIV pod kątem wiązania hetero-ligandów.

Modułowa strategia chemoenzymatyczna dla syntezy szerokiej gamy glikanów N- przedstawiona jest na Rysunku 1. Strategia ta opiera się na fakcie, że różnorodność można stworzyć na początku poprzez chemoenzymatyczną syntezę trzech istotnych modułów, a następnie poprzez $\alpha$-specyficzną mannozylację w pozycji 3-O i/lub 6-O reszty mannozy wspólnego rdzeniowego trisacharydu glikanów N. Biorąc pod uwagę różnorodność struktural...

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Ogólnym celem tej metodologii jest opracowanie modułowego podejścia chemoenzymatycznego do syntezy N-glikanów poprzez stworzenie nowej mikrotablicy glikanowej na szkiełku pokrytym tlenkiem glinu w celu wykrywania wiązania heteroglikanów przez przeciwciała przeciwko HIV. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie glikobiologii dotyczące identyfikacji specyficznych glikanów komórkowo-wirusowych w celu dalszego rozwoju. Główną zaletą tej metody jest możliwość wykrywania słabego wiązania oraz identyfikacji mieszaniny cukrów, które wiążą się z białkiem, takim jak przeciwciało pochodzące od pacjenta z HIV.Zastosowania tej techniki obejmują diagnostykę infekcji grypą, ponieważ katabolity kwasu sialowego są powszechnie eksprymowane w komórkach nabłonka dróg oddechowych ludzi, a objawy tych infekcji są typowe. W związku z tym glikoarray stanowi idealne narzędzie do określania specyficzności dzikich podtypów. Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat specyficzności glikanów przeciwciał HIV, można ją również zastosować w innych układach, takich jak diagnostyka różnych nowotworów w oparciu o wzorzec wiązania przeciwciał z surowicy ludzkiej z ludzkimi antygenami surowiczymi naniesionymi na powierzchnię.Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 2-5 µmol wcześniej przygotowanego glikanu do pięciomililitrowej kolby okrągłodennej. Do kolby należy wprowadzić magnetyczny mieszadło i zamknąć ją gumowym septem. Następnie do kolby należy dodać 400 µL świeżo osuszonego DMF oraz 10-25 µmol łącznika kwasu fosfonowego.Następnie mieszaj mieszaninę reakcyjną przy 800 rpm przez pięć godzin. Po zakończeniu reakcji odparuj rozpuszczalnik za pomocą wirówki rotacyjnej przy ciśnieniu próżni od 5 do 10 millibar i temperaturze 40 °C. Następnie rozpuść wysuszoną mieszaninę reakcyjną w 0,5 ml wody i nanieś ją na żel poliakrylamidowy.Produkty eluej wodą, zbierając frakcje o objętości od jednego do dwóch mililitrów. Aby sprawdzić zebrane frakcje metodą TLC, nanieś każdą z nich na płytkę TLC, a następnie zanurz płytkę w 0,25 M roztworze molibdanu ceru i amonu. Podgrzej zabarwioną płytkę na płycie grzewczej, aby zwizualizować produkt.Po połączeniu frakcji zawierających produkt, zamrozić roztwór i poddać go liofilizacji w celu otrzymania pożądanego produktu w postaci białego proszku. Następnie rozpuścić wysuszony produkt w dwóch mililitrach wody i dodać wodorotlenek palladu. Do kolby przymocować balon wypełniony wodorem i mieszać mieszaninę reakcyjną przy 800 rpm przez 15 godzin w atmosferze wodoru.Po zakończeniu reakcji przefiltruj mieszaninę przez złoże Celite i przemyj ją dwiema mililitrami metanolu oraz dwiema mililitrami destylowanej wody dejonizowanej. Następnie odparuj rozpuszczalnik za pomocą rotavapora przy ciśnieniu próżni 300 millibar i temperaturze 40 °C. Po tym etapie rozpuść surową mieszaninę w około jednym mililitrze wody i nałóż ją na złoże żelu poliakryloamidowego.Eluuj produkt wodą, zbierając frakcje o objętości od jednego do dwóch mililitrów. Po połączeniu frakcji zawierających produkt i zamrożeniu roztworu, liofilizuj go w celu uzyskania pożądanego produktu w postaci białego proszku. Po wysuszeniu produktu przeprowadź jego charakterystykę za pomocą NMR i spektrometrii mas, stosując tlenek deuteru jako rozpuszczalnik.W celu anodowania powierzchni ustaw inkubator z kontrolą temperatury na 4 °C. Następnie przelej wcześniej przygotowany 0,3 M wodny roztwór kwasu szczawiowego do zlewki o pojemności 500 ml zawierającej mieszadło magnetyczne. Jako katodę umieść w roztworze pręt platynowy o długości 10 cm.Przez cały proces anodowania należy stale mieszać kwas szczawiowy z prędkością 300 rpm. W oprogramowaniu lab tracer należy kliknąć przycisk setup, a następnie wybrać funkcję Sweep Voltage. Ustaw napięcie początkowe i końcowe na 25,8 V.Ustaw liczbę punktów na 100, podatność na jeden oraz opóźnienie sweep na 1200 ms. Następnie kliknij OK. Zamocuj za pomocą zacisku szkiełko przedmiotu powlekane aluminiumm, skierowane w stronę katody.Kliknij przycisk uruchamiania testu i zaobserwuj bieżący pomiar. Po anodowaniu powierzchni dokładnie wypłucz szkiełko przedmiotowe wodą dwukrotnie destylowaną i osusz strumieniem azotu. Przechowuj szkiełko przedmiotowe w komorze o wilgotności względnej 30% do czasu dalszego użycia.Do procesu wytwarzania należy przygotować 100 µL roztworów wszystkich glikanów jednowartościowych w glikolu etanolowym o stężeniu 10 mM. Roztwory glikanów należy rozcieńczyć buforem do drukowania, aby uzyskać roztwory o stężeniu 100 µM. W badaniu heteroligandów do 5 µL każdego roztworu glikanu należy dodać 5 µL glikanu MAN-5.Przenieś przygotowane glikany do mikropłytki 384-dołkowej w celu przeprowadzenia etapu drukowania mikromacierzy. Po umieszczeniu mikropłytki w urządzeniu do drukowania macierzy, wydrukuj mikromacierze za pomocą robotic pin, nanosząc 0,6 nanolitrów roztworów glikanów na każdy szkiełko z powłoką aluminiową. Następnie przygotuj 70 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego PG-9 oraz bufor PTSB zawierający 3% BSA.Następnie w ciemności należy przygotować 120 µL przeciwciała wtórnego z markerem fluorescencyjnym Donkey and Anti-human Immunoglobulin G oraz bufor PBST zawierający 3% BSA. Wymieszać PG9 i przeciwciało wtórne z markerem fluorescencyjnym w stosunku 1:1. Następnie inkubować zmieszane przeciwciała przez 30 minut w temperaturze 4 °C.Po inkubacji umieść szkiełko przedmiotowe pokryte aluminium w komorze inkubacyjnej, która jest podzielona na 16 dołków. Przenieś 100 µL zmieszanych przeciwciał na macierz glikanową. Po inkubacji w temperaturze 4 °C przez 16 godzin usuń zmieszane przeciwciała z macierzy glikanowej za pomocą pipety, a następnie zdejmij komorę inkubacyjną.Przemyj szkiełko w buforze PBST i wodzie dejonizowanej. Następnie osusz szkiełko w wirowarce przy 2000 ×g. W kolejnym kroku uruchom oprogramowanie do analizy obrazów mikromacierzy.Włóż wysuszone szkiełko do skanera macierzy tak, aby elementy macierzy były skierowane w dół. Kliknij menu ustawień. Ustaw rozdzielczość obrazu na 5 µm na piksel.Następnie ustaw długość fali na 635 nanometrów przy PMT 450 oraz moc na 100%. Kliknij przycisk skanowania, aby rozpocząć obrazowanie preparatu. Na koniec kliknij ikonę pliku, aby zapisać obraz skanu w formacie TIF do analizy obrazu. W niniejszym badaniu zsyntetyzowano szeroki wachlarz N-glikanów, stosując modularną strategię chemoenzymatyczną.Aby zademonstrować skuteczność tej strategii, metodami chemoenzymatycznymi zsyntezowano izometryczną strukturę biantenową. Galaktozylacja enzymatyczna disacharydu 1, a następnie fukozylacja trisacharydu 2, doprowadziły do otrzymania pożądanego tetrasacharydu 3. Peracetylacja oraz modyfikacje końca redukującego bloków budulcowych dwa i trzy pozwoliły na otrzymanie pożądanych cząsteczek cztery i pięć.Stereoselektywna trójkrotna O-glikozylacja modułu cztery trisacharydu sześć pozwoliła na otrzymanie heksasacharydu siedem. Odbezpieczenie i reakcja z modułem pięć doprowadziły do powstania dekasacharydu dziewięć. Całkowite odbezpieczenie dało glikan 10, który został scharakteryzowany za pomocą NMR i spektrometrii mas.Glikany zawierające ogon pentyloaminowy na końcu redukującym zostały zmodyfikowane łącznikami kwasu fosfonowego i przytwierdzone do szklanej powierzchni powlekanej aluminium za pomocą chemii fosfinidów. Przeciwciało szeroko neutralizujące HIV-1 PG9 zostało poddane przesiewaniu w celu określenia jego specyficzności względem glikanów z wykorzystaniem macierzy homoglikanowych i heteroglikanowych, aby po raz pierwszy zademonstrować jego oddziaływanie z sąsiednimi heteroglikanami w pętli V1/V2 powierzchni HIV1 PG120. Po opanowaniu techniki, proces ten — od immobilizacji glikanów po analizę beta — może zostać przeprowadzony w ciągu 24 godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu świeżo anodyzowanych szkiełek przedmiotowych pokrytych aluminium dla Glikanu 10. Do tej procedury służą szkiełka dla techników medycznych. Można przeprowadzić oznaczenie stałej ciała w celu ilościowego określenia oddziaływań wiążących między węglowodanem a badanym białkiem.Opracowanie tej techniki utorowało drogę badaczom do lepszego zrozumienia roli węglowodanów w chorobach zakaźnych w Kenii i pomogło w opracowaniu nowych terapii przeciwko tym schorzeniom. Należy pamiętać, że praca z toksycznymi odczynnikami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania eksperymentów należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odzieży ochronnej, okularów i masek.

chemo-enzymatic-synthesis-n-glycans-for-array-development-hiv

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Kilka aptamerów 2’-Fluoro RNA przeciwko HIV-1Ba-L gp120 o powinowactwie nanomolowym zostało wyizolowanych z biblioteki RNA za pomocą procedury in vitro SELEX. Stworzono nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji hamującej przeciwko gp120, która wykazuje znaczny potencjał w systemowej terapii przeciw HIV.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Ten film demonstruje technologię drukowanej macierzy glikanowej do analizy krążących przeciwciał anty-glikanowych w surowicy myszy. Przeciwciała w surowicy oddziałują ze specyficznymi glikanami na chipie, co potwierdza się za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie skanowania fluorescencyjnego.

Wykrywanie krążących przeciwciał anty-glikanowych za pomocą drukowanej matrycy glikanów

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Poznaj chemoenzymatyczną syntezę N-glikanów do tworzenia mikromacierzy na szkłach powlekanych tlenkiem glinu oraz profilowanie przeciwciał HIV. Ta metoda umożliwia wykrywanie słabych wiązań i analizę specyficzności glikanów.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Przeglądaj więcej filmów