Name: Elektrochemia filmu białkowego w podczerwieni wykazana w badaniu utlenianiaH2 przez hydrogenazę NiFe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj technikę PFIRE do badania aktywności hydrogenazy [NiFe] przy użyciu spektroskopii podczerwonej i kontroli elektrochemicznej. Metoda umożliwia analizę stanów redoks enzymu podczas katalitycznego utleniania wodoru.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca K.A.V. i P.A.A. była wspierana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), Engineering and Physical Sciences Research Council IB Catalyst award EP/N013514/1 oraz Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BB/L009722/1 i BB/N006321/1). R.H. był wspierany przez Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica i Lincoln College. Oxford. Autorzy dziękują Panom Charliemu Jonesowi, Panu Charliemu Evansowi oraz personelowi Warsztatu Mechanicznego (Wydział Chemii) za pomoc w projektowaniu i wytwarzaniu ogniw spektroelektrochemicznych wykorzystywanych w niniejszej pracy.

1. Odtworzenie wewnętrznej komory próbki spektrometru FTIR w beztlenowej, suchej komorze rękawicowej i ogólne wymagania eksperymentalne
<ol>
	<li>Użyj komercyjnego spektrometru FTIR wyposażonego w zewnętrzny detektor tellurku rtęciowo-kadmowego (MCT) i akcesorium ATR. Oczyścić korpus spektrometru suchym powietrzem lub diazotem lub alternatywnie użyć spektrometru z próżniowym stołem optycznym.</li>
	<li>Umieścić spektrometr na stabilnym, wolnym od wibracji stole na tej samej wysokości, co beztlenowa (<1 ppmO2), sucha (punkt rosy < -75 °C) komora rękawicowa. Przekieruj wiązkę podczerwieni ze spektrometru do schowka podręcznego przez przezroczyste okienko IR, które jest wystarczająco duże, aby pomieścić rozogniskowaną wiązkę. 
	UWAGA: Ważne jest, aby przestrzeń między komorą rękawicową a spektrometrem była również oczyszczana lub opróżniana, zwłaszcza jeśli używany jest higroskopijny materiał okienkowy, taki jak na przykład NaCl lub KBr.</li>
	<li>Odtworzyć wewnętrzną komorę na próbkę spektrometru znajdującą się wewnątrz komory rękawicowej.
	<ol>
		<li>Skierować wiązkę wewnątrz komory rękawicowej na zwierciadło elipsoidalne poza osią, najlepiej o tej samej ogniskowej, co wewnętrzne zwierciadło skupiające spektrometru. 
		UWAGA: Przydatne jest umieszczenie dwóch dodatkowych lusterek płaskich przed tym zwierciadłem skupiającym, aby umożliwić regulację zarówno wysokości, jak i kierunku wiązki podczerwieni wewnątrz schowka; Zrównoważy to wszelkie niedokładności w początkowym umieszczeniu spektrometru.</li>
		<li>Umieścić zewnętrzny detektor MCT, wraz z odpowiednią optyką skupiającą (taką jak soczewka ZnSe o krótkiej ogniskowej lub pozaosiowe zwierciadło paraboliczne o krótkiej ogniskowej) wewnątrz schowka podręcznego, w taki sposób, aby odtworzyć wymiary wewnętrznej komory próbki spektrometru.</li>
		<li>Dostosuj "ognisko" wiązki podczerwieni tak, aby znajdowało się w przybliżeniu w równej odległości między lustrem skupiającym a detektorem MCT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schłodzić dewara zewnętrznego detektora MCT ciekłym azotem.</li>
	<li>Zamontuj akcesorium ATR w komorze na próbki w schowku podręcznym. Wyrównaj wejściową i wyjściową optykę skupiającą oraz akcesorium ATR, aby osiągnąć maksymalną przepustowość detektora MCT. W razie potrzeby użyj przysłony lub innego odpowiedniego tłumienia (takiego jak siatka druciana), aby zapobiec przesyceniu sygnału detektora. 
	UWAGA: Do przedstawionych tutaj danych zastosowano akcesorium ATR o pięciu odbiciach ze wszystkimi optykami odblaskowymi i zdejmowanym trapezoidalnym wewnętrznym elementem odblaskowym Si (IRE) (Crystal GmbH, wymiary ok. 5 × 8 × 1 mm3, kąt czołowy 39,5°). IRE jest zamontowany w zdejmowanej płycie bazowej wykonanej z polieteroeteroketonu (PEEK).</li>
	<li>Użyj komory rękawicowej, aby umieścić odtworzoną komorę na próbki z odpowiednimi przepustami, aby umożliwić podłączenie do zewnętrznie umieszczonego potencjostatu (w tym celu przydatne są gazoszczelne połączenia BNC), dostęp do gazu i () do przesyłania sygnału z detektora MCT. Ważne jest, aby zachować wszelkie ekranowanie na detektora, aby uniknąć wprowadzania szumów lub zakłóceń do pomiarów.</li>
	<li>Umieścić pompę perystaltyczną o natężeniu przepływu większym niż 60 ml/min wewnątrz komory rękawicowej. Schematyczny widok spektrometru, akcesorium ATR, pompy perystaltycznej i potencjostatu pokazano na rysunku Rysunek 1.</li>
	<li>Zbuduj ogniwo spektroelektrochemiczne, takie jak pokazane schematycznie w Rysunek 2, które uszczelnia się na akcesorium ATR. Ogniwo powinno zawierać przeciwelektrodę o dużej powierzchni (drut Pt lub gazę), przyłącze elektrody roboczej (pręt węglowy) i miniaturową elektrodę referencyjną. Ogniwo powinno zawierać co najmniej dwa dodatkowe porty jako wlot i wylot dla szybkiego przepływu roztworów przez ogniwo. 
	UWAGA: Miniaturowa nasycona kalomelowa elektroda referencyjna jest idealna do tego celu. 36</li>
</ol>
2. Przygotowanie cząsteczek sadzy modyfikowanych E. coli Hydrogenaza 1
<ol>
	<li>W "mokrej" beztlenowej komorze rękawicowej wymieszać 20 mg cząstek sadzy o dużej powierzchni (>1 000 m3/g) z 1 ml wody o ultrawysokiej czystości (rezystywność >18 MΩ cm) w probówce do mikrowirówki. Rozproszyć cząstki za pomocą sonikacji o niskiej mocy (<100 W) przez co najmniej 15 minut lub do momentu, gdy dyspersja będzie jednolita i nie osiada w ciągu 1 godziny, aby uzyskać dyspersję sadzy o obciążeniu około 20 mg/ml.</li>
	<li>Weź podwielokrotność hydrogenazy E. coli 1 (Hyd1, około 50 μL, przygotowana zgodnie z opublikowaną procedurą55) o stężeniu ~7 mg białka/ml i zamień ją na bufor o niskiej sile jonowej o pH zbliżonym do punktu izoelektrycznego (na przykład fosforan potasu, 15 mM, pH 5,8, bez dodatkowej soli). Aby osiągnąć najlepsze rezultaty, należy stosować preparat enzymatyczny, który jest jak najbardziej aktywny. Przeprowadzić wymianę buforu przez zagęszczenie i rozcieńczenie w odśrodkowym urządzeniu filtrującym z odpowiednią granicą masy cząsteczkowej (50 kDa działa dobrze dla Hyd1).
	<ol>
		<li>Dodaj Hyd1 do urządzenia filtrującego.</li>
		<li>Rozcieńczyć około 450 μl buforu do wymiany.</li>
		<li>Ponownie zagęścić do objętości 50 μl za pomocą łagodnego wirowania (< ~2700 × g), aby zapobiec nieodwracalnemu wytrącaniu się.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 2.2.2 i 2.2.3, aż do zakończenia wymiany bufora (zwykle w ciągu ~5 cykli).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieszać 5 μl objętości 20 mg/ml dyspersji sadzy (przygotowanej w 2.1) z 50 μl podwielokrotności Hyd1 wymienianego buforem. Mieszaninę cząstek enzymu należy przechowywać w lodówce (w temperaturze 0 °C) przez noc, aby umożliwić adsorpcję enzymu. Od czasu do czasu może być konieczne potrząsanie mieszaniną, aby upewnić się, że cząstki pozostają rozproszone.</li>
	<li>Przepłukać cząstki zmodyfikowane Hyd1 buforem o niskiej sile jonowej (fosforan potasu, 15 mM, pH 5,8, bez dodatku soli) przez kolejne cykle sedymentacji i redyspersji w mikrowirówce (~2,700 × g). Powtórz ten proces 3-5 razy, aby usunąć niezaadsorbowany enzym. 
	UWAGA: Przed pierwszym myciem supernatant powinien być praktycznie bezbarwny, co wskazuje na dobrą adsorpcję enzymu.</li>
	<li>Zagęścić cząstki do końcowej objętości ~5 μl, aby uzyskać końcowe obciążenie ~20 mg/ml cząstek modyfikowanych enzymatycznie . 
	UWAGA: Cząstki modyfikowane Hyd1 mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni, jeśli pozostają uwodnione; Najlepiej osiągnąć to poprzez przechowywanie cząstek rozcieńczonych ~50 μl wody o ultrawysokiej czystości.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do pomiarów PFIRE na E. coli Hydrogenaza 1
<ol>
	<li>Wyczyść Si IRE za pomocą sonikacji o niskiej mocy (< 100 W), najpierw w H2SO4 (< 90 % w/w) przez ~15 min, a następnie w HNO3 (70 % w/w) przez maksymalnie 1 godzinę. Ta procedura czyszczenia powinna prowadzić do uzyskania hydrofilowej powierzchni IRE. Jeśli wymagane jest dalsze czyszczenie, IRE można umieścić w roztworze piranii (stosunek 1:3H2O,2:H2,SO4) w celu utlenienia pozostałego materiału organicznego. 
	UWAGA: Ostre metody czyszczenia kwasem mogą nie być odpowiednie do stosowania ze wszystkimi materiałami IRE. Roztwór piranii jest silnie i jest silnym utleniaczem, powierzchnie powinny być w miarę czyste przed użyciem roztworu piranii i należy zachować ostrożność podczas przygotowywania i stosowania roztworu piranii ze względu na egzotermiczny charakter procesu - zawsze dodawaj H2O2 powoli do H 2SO4 i zapoznaj się z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa dotyczącymi przygotowania, użytkowanie i utylizacja.</li>
	<li>Opłucz czysty IRE w wodzie o ultrawysokiej czystości i wysusz pod strumieniem suchego azotu. Wszelkie czynności związane z pryzmatem należy wykonywać za pomocą czystej pęsety, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Uszczelnij IRE w płycie podstawy akcesoriów ATR za pomocą cienkiego paska szczeliwa silikonowego klasy elektrycznej. Uważaj, aby ograniczyć szczeliwo do krawędzi IRE. Poczekaj, aż szczeliwo całkowicie wyschnie.</li>
	<li>Przenieś płytkę bazową akcesorium ATR do schowka podręcznego spektrometru i zamontuj ją na akcesorium ATR. Zmierz widmo referencyjne (tła) w zakresie 4000 - 1 000 cm-1 z rozdzielczością 4 cm-1, używając standardowego trybu szybkiego skanowania spektrometru i 1024 uśrednionych interferogramów (czas pomiaru ~3 - 5 min). Użyj tego widma jako danych wejściowych, aby umożliwić obliczenie widm absorbancji w dalszej części eksperymentu. 
	UWAGA: Ze względu na małą absorbancję oczekiwaną dla miejsca aktywnego Hyd1 konieczne jest zbieranie widm o wysokim stosunku sygnału do szumu.</li>
	<li>Przenieść płytkę bazową akcesorium ATR do "mokrej" komory rękawicowej, która zawiera wstępnie przygotowaną dyspersję cząstek zmodyfikowaną Hyd1 (sekcja 2). Odlać kroplowo 1 μl podwielokrotności dyspersji cząstek na dużą powierzchnię IRE i rozprowadzić je równomiernie po powierzchni. Uwaga: Nie pozwól, aby cząstki całkowicie wyschły na IRE.</li>
	<li>Wytnij kawałek kalki, takiej jak ta używana jako materiał warstwy dyfuzyjnej gazu w ogniwach paliwowych, do rozmiaru ~0,1 mm mniejszego niż wymiary powierzchni IRE (tj. ok. 8,2 × 4,9 mm2). Powierzchnia kalki powinna być wystarczająco duża, aby pokryć cząstki modyfikowane metodą kroplową Hyd1, ale nie tak duża, aby zachodzić na szczeliwo silikonowe używane do mocowania IRE. Namocz kalkę w wodzie i delikatnie umieść ją na wierzchu folii z cząstkami. Kalka maszynowa zapewni dobre połączenie elektryczne na całej błonie cząstek. 
	UWAGA: Korzystne jest wcześniejsze przygotowanie kilku kawałków kalki i przechowywanie jej wstępnie namoczonej w wodzie o bardzo wysokiej czystości w "mokrej" beztlenowej komorze rękawicowej.</li>
	<li>Zamontuj ogniwo spektroelektrochemiczne (opisane w 1.7 i pokazane schematycznie w Rysunek 2) nad IRE, przymocuj je do płyty bazowej za pomocą. Dodaj ~200 μL eksperymentalnego buforu, aby utrzymać enzym uwodniony. Mieszany system buforowy, zdolny do buforowania w szerokim zakresie pH, jest przydatny do badań nad wodorogenazami NiFe: <klasa sup = "xref">56 octan sodu, kwas 2-[N'-morfolino]etano-sulfonowy (MES), kwas N'-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[2-etanosulfonowy] (HEPES), kwas N'-tris[hydroksymetylo]metylo-3-amino-propan-sulfonowy (TAPS) i kwas 2-[NKwas '-cykloheksyloamino]etanosulfonowy (CHES), z każdym składnikiem w końcowym stężeniu 15 mM i zawierającym 0,1 M NaCl jako elektrolit pomocniczy, o pH dostosowanym do pH 6 przy użyciu stężonego NaOH i HCl. 
	UWAGA: Połączenie elektrody roboczej powinno wystawać nieco poniżej płaszczyzny górnej części ogniwa spektroelektrochemicznego (~0,1 mm), aby zapewnić dobre połączenie elektroniczne z kalką (<klasa mocna="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Podłączyć wlot i wylot roztworu z ogniwa spektroelektrochemicznego do układu przepływowego zawierającego rurki pompy perystaltycznej i fiolkę z buforem doświadczalnym. Przenieść zmontowaną komórkę do "suchej" komory rękawicowej zawierającej spektrometr.</li>
	<li>Zamontuj zespół ogniwa spektroelektrochemicznego na akcesorium ATR. Podłączyć elektrody roboczą, licznikową i referencyjną do potencjostatu. Podłączyć rurkę pompy perystaltycznej do pompy.</li>
	<li>Zapisz widmo absorbancji z 1024 uśrednionymi interferogramami o rozdzielczości 4 cm-1 w zakresie widmowym 4 000 - 1 000 cm-1, używając widma zebranego w 3,4 jako odniesienia/tła. W tym momencie widmo powinno zawierać znaczące (>100 mO.D.) pasma amidu II na ~1,540 cm-1, a pasma miejsca aktywnego Hyd1 powinny być widoczne w obszarze widmowym 1,850 - 2,150 cm-1, głównie w stanach utlenionych, nieaktywnych (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>
4. Aktywacja E. coli Hydrogenaza 1 i testowanie komórki spektroelektrochemicznej
<ol>
	<li>Zastosuj potencjał redukcyjny (-0,8 V w porównaniu z SCE) do warstwy cząstek modyfikowanej Hyd1. Nasycić bufor doświadczalnyH2 i powoli przepływać buforem przez ogniwo spektroelektrochemiczne. Pozostaw próbkę na noc, aby w pełni aktywować Hyd1. 
	UWAGA: Ważne jest, aby używać beztlenowegoH2, N2 itp., dlatego wszystkie gazy beztlenowe powinny być przepuszczane przez filtrO2.</li>
	<li>Zapisać widmo absorbancji próbki po aktywacji. Pasma νCO i vCN miejsca aktywnego powinny teraz wykazywać rozkład zredukowanych, "aktywnych" stanów. Najłatwiej to zaobserwować za pomocą widma różnicowego w stosunku do widma zapisanego w 3.10 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Sprawdzić połączenie elektryczne ogniwa spektroelektrochemicznego. Aby to zrobić, nasycić eksperymentalny bufor gazemN2. Zastosuj sekwencję potencjałów utleniających (0 V vs SCE) i redukujących (-0,8 V vs SCE) (o czasie trwania około 30 minut) do warstwy cząstek zmodyfikowanej Hyd1 i zapisz widmo absorbancji dla każdej z nich. Hyd1 powinien ulec szybkiemu utlenieniu i redukcji, a jeśli film cząstek jest dobrze połączony, 100 % próbki powinno reagować na zastosowany potencjał.</li>
	<li>Ustawić odpowiednie natężenie przepływu bufora eksperymentalnego. W tym celu należy zastosować potencjał redukcyjny (-0,8 V vs SCE) do próbki i nasycić bufor doświadczalnyH2. Rejestruj serię cyklicznych woltammogram w zakresie -0,707 - 0,039 V w porównaniu z SCE z szybkością skanowania 10 mV/s. Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu buforu nasyconegoH2 między woltamnogami, aż kształt fali katalitycznej będzie przypominał kształt fali na płaskiej elektrodzie z obracającą się tarczą55, a maksymalny prąd będzie niezależny od natężenia przepływu (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). 
	UWAGA: Granica rozpuszczalnościH2 w wodzie wynosi ~0,8 mM w temperaturze 293 K i 1 barze.</li>
	<li>Ponieważ próbka jest teraz gotowa do pomiarów PFIRE, należy zebrać widma o różnych potencjałach, w różnych warunkach roztworu (pH, temperatura, stężenieH2 itp.). Rejestruj wszystkie dane elektrochemiczne za pomocą oprogramowania potencjostatu, ponieważ ważne jest, aby móc skorelować dane spektroskopowe i elektrochemiczne, zwłaszcza podczas badania procesów elektrokatalitycznych, takich jak utlenianieH2 przez Hyd1.</li>
</ol>
5. Obsługa danych spektroskopowych
<ol>
	<li>Potwierdź, że miejsce aktywne nie zostało trwale zmienione w trakcie pomiarów, rejestrując widma przy 0 V i -0,8 V w porównaniu z SCE na końcu eksperymentu. Powinny one być identyczne z widmami zarejestrowanymi w 4.3 i nie powinno być obserwowane żadne ubytki miejsca aktywnego podczas pomiaru (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
	<li>Eksport widm absorpcji bezwzględnej z oprogramowania spektrometru w odpowiednim formacie (.csv, ASCII, 'matlab', Jcamp itp.) do przetwarzania za pomocą oprogramowania takiego jak Origin lub Matlab.</li>
	<li>Linia bazowa popraw dane, korzystając z procesu zilustrowanego na Rysunek 7.
	<ol>
		<li>Weźmy drugą pochodną każdego widma absorbancji w zakresie 1,800 - 2,150 cm-1, w celu zidentyfikowania małych (<1 mO.D.) pasm miejsc aktywnych na silnie zakrzywionym tle wody.</li>
		<li>Umieść punkty znacznika linii bazowej na pierwotnym widmie absorbancji i ustaw punkty tak, aby "przyciągały" się do widma eksperymentalnego.</li>
		<li>Dopasuj linię bazową do punktów za pomocą interpolowanej funkcji splajnu sześciennego lub funkcji wielomianu. Odejmij tę funkcję linii bazowej od danych eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

PFIRE jest szeroko stosowaną techniką spektroskopową IR do zwalczania unieruchomionych elektrodami białek redoks. W szczególności reakcje elektrokatalityczne enzymów redoks mogą być badane w warunkach szybkiej rotacji. Metoda PFIRE opiera się na bezpośredniej kontroli elektrochemicznej zapewnianej przez technikę PFE, która nie dostarcza bezpośrednich informacji strukturalnych i łączy ją ze spektroskopią IR na elektrodzie węglowej. Podejście opracowane w ramach projektu PFIRE wzbogaca zatem informacje dostępne wyłącznie w elektrochemii i doskonale nadaje się do badania białek i enzymów redoks zaangażowanych w wiązanie i aktywację małych cząsteczek. Ponadto PFIRE może dostarczyć informacji na temat zależnych od potencjału zmian strukturalnych w białkach przy braku obrotu katalitycznego. Takie zdarzenia nieobrotowego transferu elektronów są często trudne do wykrycia przy użyciu "standardowych" zastosowań PFE, chociaż rozszerzenie PFE na woltamperometrię prądu przemiennego z transformacją Fouriera było stosowane z dużym powodzeniem.Kategoria 45,46 TGL
Metoda PFIRE jest w zasadzie odpowiednia do badania dowolnego białka redoks, które można badać za pomocą PFE. Dlatego, podobnie jak w przypadku PFE, adsorpcja białek jest kluczowym krokiem dla udanego eksperymentu PFIRE. W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie techniki PFIRE z wykorzystaniem E. coli Hyd1 jako studium przypadku. 36,43 Jednak zastosowaliśmy również technikę PFIRE do cytoplazmatycznej hydrogenazy regulatorowej z R. eutropha,44 oraz do mononukleotydu flawinowego zaadsorbowanego na sadzy. 40 We wszystkich tych przypadkach prosta adsorpcja fizyczna sadzy o dużej powierzchni (opisana w niniejszym protokole) zapewnia pokrycie powierzchni białka wystarczająco wysokie, aby rejestrować dobrej jakości widma podczerwieni o wysokim stosunku sygnału do szumu. W przypadkach, gdy nie można osiągnąć tak wysokiego poziomu adsorpcji, może być konieczna modyfikacja powierzchni cząstek węgla, na przykład w celu umożliwienia kowalencyjnego przyłączenia białka do powierzchni elektrody. 60,61,62 Użycie komory rękawicowej do pomiarów PFIRE jest absolutnie konieczne tylko w przypadku badania próbek, które muszą być traktowane beztlenowo. Jednak w praktyce wyjątkowo stały i niski (< 80 °C) poziom pary wodnej dostarczany przez atmosferę komory rękawicowej zapewnia wysoki poziom sygnału do szumu, który pozwala na ekstrakcję bardzo małych absorbancji. 44 W wielu przypadkach środowisko beztlenowe, takie jak to, które zapewnia komora rękawicowa, jest również pożądane dla pomiarów elektrochemicznych (integralnie związanych z techniką PFIRE) w celu uniknięcia prądu spowodowanego redukcjąO2 na elektrodzie roboczej.
Absorpcje IR spowodowane objętością wody, doświadczalnymi i cząstkami węgla, na których próbka jest adsorbowana, mają znaczący wpływ na widma doświadczalne i mogą nakładać się na pasma zainteresowania, szczególnie w regionach amidu I, II i III widma. 63 Region amidowy zawiera również informacje o gatunkach organicznych, takich jak flawiny lub kofaktory nikotynamidu, a także o substratach i produktach wielu reakcji utleniania i redukcji. W przypadku hydrogenaz NiFe pasma νCO i νCN miejsca aktywnego mieszczą się w stosunkowo czystym obszarze widma, a zatem technika PFIRE bardzo dobrze nadaje się do badania tych enzymów. Jednak w innych przypadkach widma różnicowe w połączeniu z podejściami do znakowania izotopowego mogą być potrzebne do wyizolowania zmian spowodowanych unieruchomionym białkiem. Podobne podejścia zastosowano na przykład do identyfikacji zmian protonacji, rearanżacji strukturalnych oraz do badania kompleksów Michaelisa-Mentena za pomocą spektroskopii w podczerwieni. 64,65,66 PFIRE nie jest zatem ograniczony do badania hydrogenaz, ale może być stosowany do dowolnego białka redoks, które zawiera (lub którego substraty, produkty lub inhibitory zawierają) grupy z diagnostycznymi drganiami aktywnymi w podczerwieni; Na przykład dehydrogeany tlenku węgla67, nitrogenazy68,14 flawoproteiny40 i dehydrogenazy mrówczanowe.
Powiązana technika, SEIRA, bardzo dobrze nadaje się do badania białek związanych z błoną w środowisku biomimetycznym. 32 SEIRA jest adaptacją spektroskopii IR, która również wykorzystuje konfigurację ATR-IR i wykorzystuje efekt wzmocnienia powierzchni, który wzmacnia absorbancję IR cząsteczek znajdujących się blisko (w promieniu kilku nm) powierzchni pryzmatu ATR (IRE). SEIRA jest zatem wyjątkowo wrażliwa na zmiany spektralne zachodzące w architekturze zaadsorbowanego białka i błony i jest stosunkowo wolna od konkurencyjnych sygnałów z rozpuszczalnika i substratów/inhibitorów obecnych w roztworze. Jest to nieco sprzeczne z opisaną tutaj techniką PFIRE, która opiera się na znacznie większej głębokości penetracji nad powierzchnią IRE (~1 μm), co oznacza, że PFIRE jest bardziej wrażliwy na substraty, produkty lub inhibitory obecne w roztworze. Ta zwiększona wrażliwość na rozpuszczalnik "luzem" może być korzystna; jeśli podłoże lub produkt można obserwować bezpośrednio w podczerwieni, widma PFIRE informują zarówno o kinetyce długożyciowych związków czynnych, jak i o związanym z tym tworzeniu produktu podczas elektrokatalizy. 69 Możliwość obserwacji stężeń substratu i produktu w stanie ustalonym będzie szczególnie cenna w przypadku enzymów takich jak dehydrogenaza tlenku węgla (która katalizuje odwracalne utlenianie CO do CO2 , silny absorber IR) lub dehydrogenaza mrówczanu (która katalizuje odwracalne utlenianie mrówczanu do CO2 ).
Obecnie PFIRE ogranicza się do badań kinetycznych elektrokatalizy enzymatycznej w stanie ustalonym ze względu na makroskopowe elektrody węglowe używane do "koncentracji" enzymu na powierzchni IRE w celu gromadzenia danych w geometrii ATR-IR. Pod tym względem badania PFIRE hydrogenaz NiFe są komplementarne z pracami Dyera i współpracowników,49,50 którzy wykorzystują spektroskopię absorpcji w podczerwieni wyzwalaną światłem do badania kinetyki podobrotu. Trwają prace nad miniaturyzacją ogniwa spektroelektrochemicznego40, a przy zastosowaniu mikroelektrod rozdzielczość czasowa rzędu mikrosekund powinna być możliwa do osiągnięcia. Umożliwi to badanie kinetyki podobrotu dla enzymów o częstotliwościach obrotu do ok. 100 - 500 s-1 oraz umożliwi badanie zarówno procesów redukcyjnych, jak i oksydacyjnych.
Ogólnie rzecz biorąc, PFIRE jest techniką spektroskopową, która umożliwia charakterystykę chemiczną reakcji elektrokatalitycznych enzymów redoks w warunkach stanu ustalonego. Metoda PFIRE umożliwia przeprowadzenie wielu miareczkowania chemicznego i elektrochemicznego na tej samej próbce enzymu, ponieważ zastosowane elektrody o dużej powierzchni zapewniają solidną adsorpcję białka, a geometria ATR-IR umożliwia łatwą wymianę roztworu. Możliwość zbierania takich informacji strukturalnych in situ podczas funkcjonowania enzymu jest nieocenionym narzędziem dla szerszej społeczności bioelektrochemicznej.

Kluczowym wyzwaniem w badaniu funkcji białek jest opracowanie metod in situ, które pozwalają na bezpośrednią obserwację białek spełniających ich fizjologiczne role, zarówno in vivo, jak i przy użyciu izolowanych próbek białek. Wymaga to zintegrowania procesów kontrolnych lub wyzwalających z procedurami eksperymentalnymi oraz zastosowania technik łączonych, które pozwalają zarówno na ocenę reaktywności, jak i na jednoczesny pomiar poszczególnych etapów chemicznych podczas funkcji białka. W przypadku białek redoks często jest to równoznaczne z łączeniem technik elektrochemicznych, które precyzyjnie kontrolują zastosowany potencjał, ale nie dostarczają bezpośrednich informacji chemicznych, z technikami spektroskopowymi, które są wrażliwe na chemicznie specyficzne zmiany związane z funkcją białka. 1,2,3 Spektroelektrochemia to ogólny termin określający szereg sprzężonych metod elektrochemicznych i spektroskopowych, które obejmują różne techniki spektroskopowe i poziomy kontroli elektrochemicznej. Wiele białek może wymieniać elektrony ze sztucznymi, rozpuszczalnymi donorami i akceptorami elektronów, co zostało wykorzystane w badaniach, które wykorzystują małe cząsteczki do pośredniczenia w przenoszeniu elektronów, w tym sprzężenia z promieniowaniem UV,4,5,6,7 magnetyczny dichroizm kołowy8 i podczerwień5,9,10,11,12,13,14 (IR) spektroskopi. W niewielkiej liczbie przypadków okazało się, że możliwe jest wykorzystanie niezapośredniczonej, kontrolowanej dyfuzją wymiany elektronów między białkami a elektrodami. 15,16
Dla reakcji katalitycznych przeprowadzanych przez enzymy redoks, metody elektrochemii roztworów stanowią wyraźną wadę. Kontrolowany dyfuzją transfer elektronów za pośrednictwem mediatorów redoks w roztworze prawdopodobnie stanie się ograniczeniem szybkości. Kinetyczne i mechanistyczne informacje o enzymie mogą zostać utracone lub przynajmniej stać się trudne do oddzielenia od artefaktów dyfuzji powstałych w wyniku metody eksperymentalnej. Bezpośrednia, niezapośredniczona kontrola elektrochemiczna jest zatem ważnym narzędziem do badania białek i enzymów redoks. Technika elektrochemii filmu białkowego (PFE) wykorzystuje unieruchomione elektrodami białka redoks w taki sposób, że elektrony są przenoszone bezpośrednio do lub z kofaktorów redoks w białku, gdy elektroda jest spolaryzowana przy szeregu potencjałów. 17,18,19 PFE ma szczególną wartość dla badań nad reakcjami utleniania lub redukcji katalizowanymi przez enzymy redoks, ponieważ międzyfazowy transfer elektronów może być osiągnięty z bardzo dużą szybkością. Na przykład szybkość obrotu elektrokatalitycznego hydrogenazy niklowo-żelazowej ([NiFe]) z allochromatium vinosum została zmierzona przez PFE jako około 1 000 - 10 000 s−1 dla utleniania H2. 20 Potencjał elektrody działa jak wyzwalacz do włączania lub wyłączania katalizy, a prąd elektrokatalityczny informuje o aktywności enzymu. PFE jest zatem cenną metodą analizy reaktywności złożonych enzymów, które ściśle zależą od potencjału, takich jak reakcje miejsca aktywnego di-żelaza hydrogenaz [FeFe] z CO i O2,21 lub potencjalnie indukowane reakcje inaktywacji hydrogenaz,22 dehydrogenaza tlenku węgla,23 i inne złożone enzymy redoks. 24
Główną przeszkodą w łączeniu technik spektroskopowych z bezpośrednią kontrolą elektrochemiczną zapewnianą przez PFE jest niskie pokrycie powierzchni enzymów redoks, rzędu 1-2 pmol cm-2 dla hydrogenazy [NiFe] z A. vinosum,20 w stosunku do badań in situ nad powierzchnią adsorbatów małych cząsteczek na elektrodach metalowych luzem. Stanowi to wyzwanie dla czułości pomiarów spektroskopowych. Opisano kilka metod spektroelektrochemicznych do badania unieruchomionych białek redoks na wielu różnych elektrodach: spektroskopia w zakresie widzialnym UV na przezroczystych elektrodach z tlenku metalu; 25,26,27 spektroskopia fluorescencyjna na złotych elektrodach; 28,29 spektroskopia powierzchniowo wzmocnionej absorpcji w podczerwieni (SEIRA) na złotych elektrodach; 30,31,32,33 i powierzchniowo wzmocnione techniki spektroskopowe Ramana, głównie na elektrodach srebrnych. 34,35
Tutaj opisujemy metodę łączenia PFE ze spektroskopią IR, w technice znanej jako elektrochemia w podczerwieni filmu białkowego (PFIRE). 36 Metoda PFIRE bada enzymy redoks unieruchomione na elektrodzie roboczej z węgla o dużej powierzchni w połączeniu z geometrią IR ATR-IR (o całkowitym współczynniku odbicia), wykorzystując łatwość adsorpcji szeregu białek na powierzchniach węgla. Spektroskopia IR jest przydatna w badaniach enzymów i białek redoks, ponieważ wiele małych cząsteczek, ligandów i kofaktorów ma absorbancje diagnostyczne, które można wykorzystać do oceny reaktywności, wiązania, inhibicji i stanu redoks. Przykłady obejmują wiązanie NO z centrami żelazowo-siarkowymi,37 badanie flawoprotein,38,39,40 małe cząsteczki wiążące się z centrami hemowymi itp. 41 Geometria ATR-IR pozwala na budowę zoptymalizowanego trzyelektrodowego (spektro)ogniwa elektrochemicznego42 i dlatego zapewnia doskonałą kontrolę elektrochemiczną. Rezystancja roztworu i dryft potencjału są minimalizowane poprzez umieszczenie elektrody referencyjnej blisko elektrody roboczej. Stosowane są przeciwelektrody o dużej powierzchni, które są kompatybilne z wysokimi prądami elektrokatalitycznymi wytwarzanymi przez szybki obrót enzymów na elektrodzie roboczej. Przepływ roztworu przez komórkę spektroelektrochemiczną pozwala na łatwą kontrolę stężenia substratów, inhibitorów i pH. 36,43,44 Metoda PFIRE pozwala zatem na rejestrację widm IR in situ podczas długotrwałej elektrokatalizy enzymatycznej. 36,44 PFIRE jest również w stanie dostarczyć informacji chemicznej przy braku prądu katalitycznego,43 w przeciwieństwie do PFE, gdzie może być trudno wydobyć informacje z procesów niekatalitycznych w enzymach redoks. 45,46
Pokazaliśmy metodę PFIRE do badania elektrokatalitycznego utlenianiaH2 przez hydrogenazy [NiFe], które zawierają wewnętrzne ligandy CO i CN skoordynowane z Fe w bimetalicznym miejscu aktywnym. 36,43,44 [NiFe] hydrogenazy są zatem szczególnie odpowiednie do badania za pomocą PFIRE. Metoda PFIRE dostarcza informacji o gatunkach, które są obecne podczas obrotu w stanie ustalonym, a zatem dostarcza kluczowych informacji mechanistycznych, oprócz bogatej literatury na temat spektroskopii w podczerwieni hydrogenaz bez eksperymentalnej kontroli obrotu. 47,48 Dyer i współpracownicy zastosowali metody IR z rozdzielczością czasową do badania wodorogenaz NiFe,49,50,51 używając wyzwalacza świetlnego, aby zastosować mały krok o ujemnym potencjale (za pomocą mediatorów roztworu i "zamkniętego" źródła elektronów) lub fotolizować związany wodorek. Chociaż metoda PFIRE nie jest obecnie w stanie zapewnić rozdzielczości czasowej odpowiadającej tym pomiarom,40 pozwala ona na badanie zarówno redukcyjnych, jak i oksydacyjnych procesów katalitycznych, dostępnych przy zakresie dobrze zdefiniowanych potencjałów i wolnych od ograniczeń transportu masy.
Metoda PFIRE różni się od badań SEIRA białek redoks, które również wykorzystują geometrię ATR-IR i wykorzystują nanoskalową chropowatą metalową elektrodę w celu zwiększenia absorbancji IR cząsteczek zaadsorbowanych na powierzchni elektrody. 30 SEIRA jest niezwykle cenną techniką do badania białek błonowych, w szczególności adsorbowanych na lub w mimetycznych architekturach błonowych,32 ale potrzeba zastosowania elektrody metalowej może ograniczać zakres substratu i inhibitora ze względu na reaktywność nośnika elektrody w stosunku do małych cząsteczek, takich jak CO, CN, CO2 itp. Redukcja protonów i samoorganizująca się desorpcja monowarstwowa mogą być problematyczne na powierzchniach metalowych o bardzo ujemnych potencjałach,1,52 chociaż odnotowano przypadki elektrokatalizy enzymatycznej na niezabezpieczonych elektrodach metalowych. 53,54 Wadą PFIRE w stosunku do SEIRA jest względna trudność w integracji białek błonowych w natywnych lub mimetycznych architekturach błonowych. Jednak względna obojętność chemiczna elektrod węglowych w stosunku do konkurujących reakcji aktywacji małych cząsteczek sprawia, że PFIRE jest doskonałą techniką do badania elektrokatalizy enzymatycznej, szczególnie w dziedzinie niskiego potencjału istotnej dla biologicznych procesów redoks, takich jak redukcja protonów przez hydrogenazy. 1,43
Celem tego artykułu jest wprowadzenie metody PFIRE jako techniki badania unieruchomionych elektrodami białek redoks, na przykładzie hydrogenazy NiFe 1 (Hyd1) z Escherichia coli. Omówiono zagadnienia związane z przygotowaniem próbki, wymaganiami dotyczącymi dobrego przepływu substratu i obsługą danych. PFIRE jest techniką o szerokim zastosowaniu, dobrze nadającą się do badania dowolnego białka redoks (o charakterystycznych absorbancjach IR), które może być adsorbowane na elektrodach węglowych, bezpośrednio lub przy użyciu modyfikacji powierzchni, tak aby mogło wymieniać elektrony z elektrodą.

<table><tbody><tr><td>Spektrometr</td><td>Agilent</td><td>680-IR</td><td>z zewnętrznym detektorem MCT</td></tr><tr><td>Akcesorium ATR</td><td>Pike Technologies</td><td>GladiATR</td><td>Dostosowane do użytku z 5-refleksyjnym schowkiem Si IRE</td></tr><tr><td></td><td>Glovebox Glover Technology Ltd.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Specjalnie zaprojektowana "mokra" i "sucha" skrzynka do beztlenowej obsługi i pomiaru próbek</td></tr><tr><td>Okno KBr</td><td>Crystran</td><td>Custom</td><td>Aby umożliwić sprzężenie komory rękawicowej z zewnętrzną wiązką spektrometru FTIR</td></tr><tr><td>Dodatkowa optyka</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>Komponenty z akcesorium PM-IRRAS</td></tr><tr><td>Krzem IRE</td><td>Crystal GmbH</td><td>Niestandardowe</td><td>Trapezoidalny: 8,4 mm x 5 mm (duża powierzchnia), grubość 1 mm, kąt lica ok. 39 stopni</td></tr><tr><td>Potencjostat</td><td>Metrohm</td><td>Autolab PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Nova 10.1</td><td>Metrohm</td><td></td><td>Oprogramowanie do sterowania potencjostatem</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Williamson Manufacturing Company Ltd</td><td>QL-1000-024-300</td><td></td></tr><tr><td>Drut Pt</td><td>Surepure Chemetals</td><td>3272</td><td>99,95% czysty drut platynowy, Pręt węglowy o średnicy 0,014 cala</td></tr><tr><td></td><td>WH Smith 30729209</td><td></td><td>ołówek HB 0,7 mm Sadza</td></tr><tr><td></td><td>Cabot Corporation</td><td>Black Pearls 2000</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Ultrawave</td><td>U100</td><td>35 W</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5050BK</td><td>Amicon Ultra, 50 KDa MW odcięcie</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>MiniSpin (MiniSpin)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher</td><td>S/9240/PB17</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Fisher</td><td>N/2300/PB17</td><td></td></tr><tr><td>uszczelniacz silikonowy</td><td>Krowa Corning Toray Co., Ltd.</td><td>SE 4486</td><td></td></tr><tr><td>Kalka</td><td>maszynowa Toray</td><td>TGP-H-030</td><td></td></tr><tr><td>H2 gaz</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 gaz</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2015</td><td>Oprogramowanie do analizy danych/wykresów</td><td>OriginLab</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielczości Pro 4.0</td><td>Varian</td><td></td><td>Oprogramowanie do sterowania spektrometrem FTIR</td></tr></tbody></table>

elektrochemia filmu białkowego w podczerwieni wykazana w badaniu utlenianiah2 przez hydrogenazę [nife]

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Zrozumienie chemii białek redoks wymaga metod, które zapewniają precyzyjną kontrolę nad centrami redoks w białku. Technika elektrochemii filmu białkowego, w której białko jest unieruchomione na powierzchni elektrody w taki sposób, że elektroda zastępuje fizjologiczne donory lub akceptory elektronów, dostarczyła funkcjonalnego wglądu w reakcje redoks szeregu różnych białek. Pełne zrozumienie chemii wymaga połączenia kontroli elektrochemicznej z innymi technikami, które mogą dostarczyć dodatkowego wglądu strukturalnego i mechanistycznego. Tutaj demonstrujemy technikę, elektrochemię w podczerwieni filmu białkowego, która łączy elektrochemię filmu białkowego ze spektroskopowym próbkowaniem białek redoks w podczerwieni. Technika ta wykorzystuje geometrię całkowitego współczynnika odbicia o tłumieniu wielokrotnego odbicia do zbadania białka redoks unieruchomionego na elektrodzie sadzy o dużej powierzchni. Włączenie tej elektrody do celi przepływowej umożliwia zmianę pH roztworu lub stężenia substancji rozpuszczonej podczas pomiarów. Jest to szczególnie skuteczne w przypadku enzymów redoks, w przypadku których szybki obrót katalityczny może być podtrzymywany i kontrolowany na elektrodzie, co pozwala na spektroskopową obserwację długożyciowych związków pośrednich w mechanizmie katalitycznym. Demonstrujemy tę technikę za pomocą eksperymentów na hydrogenazie E. coli 1 w warunkach obrotu (utlenianieH2) i bez obrotu.

Tutaj opisujemy technikę, elektrochemię w podczerwieni filmu białkowego, która pozwala na spektroskopowe badanie unieruchomionych białek redoks pod bezpośrednią kontrolą elektrochemiczną na elektrodzie węglowej. Widma w podczerwieni pojedynczej próbki białka mogą być rejestrowane przy różnych potencjałach i w różnych warunkach roztworu.

Elektrochemia filmu białkowego w podczerwieni wykazana w badaniu utlenianiaH2 przez hydrogenazę [NiFe]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zbadanie chemii centrum aktywnego enzymu redoks hydrogenazy niklowo-żelazowej w warunkach braku obrotu oraz w warunkach stacjonarnego obrotu elektrokatalitycznego z wykorzystaniem podczerwonej elektrochemii filmu białkowego (PFIRE). Główną zaletą techniki PFIRE jest to, że umożliwia ona jednoczesną precyzyjną kontrolę elektrochemiczną i spektroskopowe próbkowanie w podczerwieni białek redoks unieruchomionych na elektrodzie węglowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biofizyki i bioelektrochemii dotyczące tego, jakie stany białka redoks występują podczas stacjonarnego obrotu katalitycznego.Aby rozpocząć procedurę, w wilgotnej beztlenowej komorze rękawicowej zawiesić 20 mg cząsteczek sadzy o wysokiej powierzchni właściwej w 1 ml wody ultrapure. Poddać zawiesinę sonikacji przy niskiej mocy przez co najmniej 15 minut lub do momentu, aż cząsteczki zostaną równomiernie zdyspergowane i przez jedną godzinę spoczynku nie powstanie osad. Następnie nanieść 15 µL roztworu hydrogenazy 1 z E.Coli o stężeniu około 7 mg/mL do jednostki filtra wirówkowego 50 kDa.Rozcieńczyć roztwór 450 µL buforu wymiany o niskiej sile jonowej o pH zbliżonym do punktu izoelektrycznego hydrogenazy. Skoncentrować mieszaninę do 50 µL poprzez wirowanie przy 27 000 ×g. Powtórzyć proces zagęszczania mieszaniny jeszcze cztery razy, aby całkowicie przeprowadzić wymianę buforu.Następnie połączyć 5 µL dyspersji sadzy węglowej o stężeniu 20 mg/mL z hydrogenazą po wymianie buforu. Mieszaninę przechowywać w temperaturze 0 °C przez noc, aby umożliwić adsorpcję hydrogenazy na cząsteczkach sadzy węglowej. Okresowo sprawdzać mieszaninę w celu utrzymania dyspersji cząstek.Odwiruj zmodyfikowane cząstki przy 27 000 ×g i sprawdź, czy nadsącz jest niemal bezbarwny, co wskazuje na dobrą adsorpcję hydrogenazy na cząstkach. Osiągnięcie wysokiego poziomu adsorpcji jest krytyczne dla powodzenia eksperymentu. Optymalizujemy bufor do adsorpcji, przyjmując za punkt wyjścia bufor o niskiej sile jonowej o pH zbliżonym do punktu izoelektrycznego białka.Przemyj cząstki, wykonując od trzech do pięciu cykli wirowania i resuspensji w świeżym buforze wymiany. Skoncentruj mieszaninę cząstek do objętości około 5 µl, aby uzyskać załadunek cząstek na poziomie 20 mg/ml. Aby rozpocząć przygotowania do pomiarów PFIRE, oczyść silikonowy element wewnętrznego odbicia, sonikując go przy niskiej mocy w kwasie siarkowym przez 15 minut.Następnie zastosowano kwas azotowy przez jedną godzinę. Po tym czasie element wypłukano w wodzie ultrapure i osuszono strumieniem suchego gazu azotowego. Do zamocowania IRE w płytce podstawy akcesorium ATR z pięcioma odbiciami użyto silikonowego uszczelniacza klasy elektrycznej, dbając o to, aby uszczelniacz znajdował się jedynie na krawędziach IRE.Pozostaw uszczelniacz do całkowitego wyschnięcia. Następnie przenieś płytkę podstawową do suchej anoksycznej komory rękawicowej z oknem przezroczystym dla podczerwieni, znajdującej się obok spektrofotometru FTIR. Zamocuj płytkę podstawową w akcesorium ATR.Należy zarejestrować widmo tła w trybie szybkiego skanowania. Następnie należy odłączyć płytkę podstawy akcesorium ATR i przenieść ją do mokrej beztlenowej komory rękawicowej. Jedną mikrolitr (1 µL) cząsteczek sadzy modyfikowanych enzymem należy równomiernie nanieść metodą dropcastingu na powierzchnię IRE, nie pozwalając na całkowite wyschnięcie cząsteczek.Ważne jest, aby mieszaninę cząsteczek modyfikowanych enzymatycznie skoncentrowano do poziomu ładunku jak najbliższego 20 mg/ml. W przeciwnym razie podczas nakładania kroplowego cząsteczek na tym etapie może być trudno uzyskać dobrze połączoną warstwę cząsteczek. Delikatnie połóż kawałek papieru węglowego nasączonego wodą ultrapure na powierzchni IRE, upewniając się, że warstwa cząsteczek jest przykryta, tak aby papier nie stykał się z uszczelnieniem silikonowym.Zamocuj specjalistyczną celę spektroelektrochemiczną nad IRE. Przez wlot roztworu dodaj 200 µL buforu eksperymentalnego, aby utrzymać enzym w stanie nawilżenia podczas przygotowania systemu. Podłącz wlot i wylot roztworu do fiolki z buforem eksperymentalnym za pomocą przewodów pompy perystaltycznej.Następnie przenieś zmontowaną celę do suchego boksu rękawiczkowego. Zamocuj zespół celi na akcesorium ATR i podłącz przewody do pompy perystaltycznej. Pozyskaj widmo absorbancji, wykorzystując wcześniej zarejestrowane widmo jako tło.Zweryfikuj, czy pasma MI2 są wyraźnie widoczne przy 1 540 cm⁻¹ oraz czy piki centrum aktywnego hydrogenazy są wykrywalne w regionie od 1 850 do 2 150 cm⁻¹. W celu przygotowania do eksperymentu przyłóż do filmu z cząsteczek potencjał redukcyjny wynoszący -0,8 V względem nasyconej elektrody kalomelowej. Nasyć bufor eksperymentalny beztlenowym wodorem.Następnie rozpocznij przepływ buforu przez ogniwo spektroelektrochemiczne z prędkością około 12 ml/min. Pozostaw próbkę w przepływie buforu eksperymentalnego nasyconego wodorem przez noc w celu aktywacji hydrogenazy. Zarejestruj widmo absorbancji aktywowanej próbki i zweryfikuj, czy pasma CO i CN centrum aktywnego wykazują wiele stanów zredukowanych.Następnie nasyć bufor eksperymentalny beztlenowym azotem i przepuść bufor przez ogniwo. Zastosuj potencjał utleniający wynoszący 0 V względem nasyconej elektrody kalomelowej przez 30 minut i zarejestruj widmo absorpcyjne. Następnie zastosuj potencjał redukujący przez 30 minut i zarejestruj kolejne widmo.Zweryfikuj, czy enzym został całkowicie utleniony, a następnie zredukowany. Jeśli nie, sprawdź połączenia elektryczne ogniwa. Używając beztlenowego buforu nasyconego wodorem, uzyskaj serię woltamperogramów cyklicznych przy zwiększających się prędkościach przepływu, aby określić optymalną prędkość przepływu dla eksperymentu.Przy zastosowaniu tej szybkości przepływu zarejestrowano widma dla zakresu potencjałów i różnych warunków roztworu. Pomiary PFIRE hydrogenazy I z E.coli przeprowadzono przy różnych potencjałach w atmosferze obojętnej oraz w obecności wodoru gazowego. Widma zarejestrowane w atmosferze wodoru reprezentowały rozkłady stanów stacjonarnych centrum aktywnego występujące podczas katalitycznego utleniania wodoru.Beztlenowe utlenianie i aktywacja hydrogenazy poprzez przejście stanu niklu-Si w stan niklu-B zostały następnie zbadane poprzez pozyskiwanie widm w różnych punktach czasowych podczas przyłożenia potencjału oraz przygotowanie różnych widm w odniesieniu do widma pierwszego. Obserwowana stopniowa konwersja niklu-Si do niklu-B była zgodna z monotonicznym spadkiem natężenia prądu. Widma pozyskano również w zakresie różnych wartości pH roztworu, aby zbadać etapy przeniesienia protonów w cyklu katalitycznym hydrogenazy.Przy niskim pH częściej występował stan nikiel-C, natomiast przy wysokim pH przeważał stan nikiel-L. Zależność względnych stężeń niklu-C i niklu-L od pH określono na podstawie maksymalnych wartości absorbancji dla odpowiednich pików przy każdym pH analizowanym w eksperymencie. Technika ta otwiera badaczom z zakresu bioelektrochemii drogę do badania kinetyki stanu stacjonarnego aktywacji wodoru w procesie hydrogenazy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat typowego eksperymentu PFIRE. Technika ta jest odpowiednia dla każdego białka redoks, które można badać za pomocą elektrochemii filmów białkowych, i dostarcza bezpośrednich informacji chemicznych uzupełniających pomiar elektrochemiczny.

protein-film-infrared-electrochemistry-demonstrated-for-study-h2

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym artykule opisano procedurę syntezy hydrofobowo modyfikowanej membrany Nafion do unieruchamiania enzymów, sposób unieruchamiania białek i/lub enzymów wewnątrz membrany oraz metodę testowania ich aktywności specyficznej.

Hydrofobowy Nafion modyfikowany solą do immobilizacji i stabilizacji enzymów

Prezentujemy unikalną platformę do charakteryzowania powierzchni elektrod w ogniwach paliwowych ze stałym tlenkiem (SOFC), która umożliwia jednoczesne wykonywanie wielu technik charakteryzacji (np. spektroskopia Ramana in situ i mikroskopia z sondą skaningową wraz z pomiarami elektrochemicznymi). Uzupełniające informacje uzyskane dzięki tym analizom mogą pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów reakcji i degradacji elektrod, dostarczając informacji na temat racjonalnego projektowania lepszych...

Sondowanie i mapowanie powierzchni elektrod w ogniwach paliwowych ze stałym tlenkiem

Badanie pokazuje wzrost cienkich warstw nanohybrydowych cienkich warstw z tlenku grafenu o obniżonej zawartości tlenku irydu (IrO 2-RGO) na nieregularnym i szorstkim podłożu węglowym drukowanym sitodrukiem poprzez zieloną syntezę elektrochemiczną oraz ich implementację jako czujnika pH z wzorzystą platformą papierowo-fluidyczną.

Tlenek grafenu o obniżonej zawartości tlenku irydu Nanohybrydowe cienkowarstwowe modyfikowane elektrody z sitodrukiem jako jednorazowe elektrochemiczne papierowe mikroprzepływowe czujniki pH

Ilustrujemy zastosowanie analizy rezonansowej reakcji jądrowej 1H(15N,αγ)12C (NRA) do ilościowej oceny gęstości atomów wodoru na powierzchni, objętości i w warstwie międzyfazowej materiałów stałych. Opisano przypowierzchniowy profil głębokości wodoru monokryształu Pd(110) i stosów SiO2/Si(100).

Kwantyfikacja stężeń wodoru w warstwach powierzchniowych i granicznych faz oraz materiałach sypkich poprzez profilowanie głębokości z analizą reakcji jądrowej

Mitochondria zawierają kilka enzymów zależnych od flawin, które mogą wytwarzać reaktywne formy tlenu (ROS). Monitorowanie uwalniania ROS z poszczególnych miejsc w mitochondriach jest trudne ze względu na niepożądane reakcje uboczne. Przedstawiamy łatwą i niedrogą metodę bezpośredniej oceny natywnych wskaźników uwalniania ROS przy użyciu oczyszczonych flawoenzymów i fluorometrii mikropłytek.

Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny

Tutaj prezentujemy protokół syntezy i testów elektrochemicznych pojedynczych atomów metali przejściowych skoordynowanych w wakatach grafenu jako aktywnych centrów selektywnej redukcji dwutlenku węgla do tlenku węgla w roztworach wodnych.

Charakterystyka syntezy i wydajności katalizatora jednoatomowego z metalu przejściowego do elektrochemicznej redukcji CO2

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania fotoelektronów gatunków anionowych. Aniony generowane w próżni i rozdzielane za pomocą spektrometrii mas są badane za pomocą obrazowania fotoelektronów z mapowaniem prędkości, dostarczając szczegółowych informacji na temat poziomów energii anionów i neutralnych, struktury anionów i neutralnych oraz natury stanu elektronowego anionów.

Fotoelektronowe obrazowanie anionów zilustrowane oderwaniem f− o długości fali 310 nm

Dynamiczne, rozciągające odkształcenie jest stosowane na cienkich warstwach TiO2 w celu zbadania wpływu naprężenia na elektrokatalizę, w szczególności redukcję protonów i utlenianie wody. Folie TiO2 są otrzymywane przez obróbkę termiczną pseudoelastycznego stopu NiTi (Nitinol).

Zastosowanie odkształcenia dynamicznego do cienkich warstw tlenków unieruchomionych na pseudoelastycznym stopie niklowo-tytanowym

Ten protokół pokazuje wygodną metodę porównywania właściwości katalitycznych obsługiwanych katalizatorów platynowych, syntetyzowanych przez osadzanie nanometrycznych koloidów lub przez impregnację. Uwodornienie cykloheksenu służy jako reakcja modelowa do określenia aktywności katalitycznej katalizatorów.

Reakcje katalityczne stabilizowanych aminami i wolnych od ligandów nanocząstek platyny na tytanie podczas uwodornienia alkenów i aldehydów

Ten protokół wprowadza projektowanie i ocenę innowacyjnych trójwymiarowych elektrod do ogniw paliwowych z nadtlenkiem wodoru, wykorzystujących tkaninę z włókna węglowego galwanizowanego Au i elektrody z pianki niklowej. Wyniki badań podkreślają potencjał nadtlenku wodoru jako obiecującego kandydata na zrównoważone technologie energetyczne.

Bezmembranowe ogniwa paliwowe z nadtlenkiem wodoru jako obiecujące źródło czystej energii

Poznaj technikę PFIRE do badania aktywności hydrogenazy [NiFe] przy użyciu spektroskopii podczerwonej i kontroli elektrochemicznej. Metoda umożliwia analizę stanów redoks enzymu podczas katalitycznego utleniania wodoru.

Elektrochemia filmu białkowego w podczerwieni wykazana w badaniu utleniania_H2 przez hydrogenazę [NiFe]

Przeglądaj więcej filmów