Elektrochemia filmu białkowego w podczerwieni wykazana w badaniu utlenianiaH2 przez hydrogenazę [NiFe]

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie składu chemicznego strony aktywnej enzymu redoks hydrogenazy niklowo-żelazowej zarówno w warunkach obrotu elektrokatalitycznego, jak i w stanie ustalonym przy użyciu elektrochemii w podczerwieni filmu białkowego lub PFIRE. Główną zaletą techniki PFIRE jest to, że umożliwia ona jednocześnie precyzyjną kontrolę elektrochemiczną i spektroskopowe pobieranie próbek w podczerwieni białek redoks unieruchomionych na elektrodzie węglowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biofizyki i bioelektrochemii dotyczące tego, jakie stany białka redoks występują podczas obrotu katalitycznego w stanie ustalonym.

Aby rozpocząć procedurę, w mokrym beztlenowym komorze rękawicowej zawieś 20 miligramów cząstek sadzy o dużej powierzchni w jednym mililitrze ultraczystej wody. Sonikować zawiesinę przy niższej mocy przez co najmniej 15 minut lub do momentu, gdy cząstki zostaną równomiernie rozproszone i w ciągu jednej godziny w stanie spoczynku nie utworzy się osad. Następnie załaduj 15 mikrolitrów roztworu hydrogenazy E.Coli o stężeniu około siedmiu miligramów na mililitr do 50-kilodaltonowej jednostki filtra odśrodkowego.

Rozcieńczyć roztwór 450 mikrolitrami buforu wymiennego o niskiej sile jonowej o pH zbliżonym do punktu izoelektrycznego hydrogenazy. Stężyć mieszaninę do 50 mikrolitrów przez odwirowanie 27 000 razy g. Ponownie zagęścić mieszaninę jeszcze cztery razy, aby zakończyć wymianę buforu.

Następnie połącz pięć mikrolitrów dyspersji sadzy o stężeniu 20 miligramów na mililitr z wodorogenazą wymienioną buforem. Mieszaninę należy przechowywać przez noc w temperaturze zero stopni Celsjusza, aby hydrogenaza mogła wchłonąć się w cząsteczki sadzy. Okresowo sprawdzaj mieszaninę, aby utrzymać dyspersję cząstek.

Odwirować zmodyfikowane cząstki z prędkością 27 000 g i sprawdzić, czy supernatant jest prawie bezbarwny, co wskazuje na dobrą absorpcję hydrogenazy przez cząstki. Osiągnięcie wysokiego poziomu absorpcji ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Optymalizujemy bufor absorpcyjny, wykorzystując jako punkt wyjścia bufor o niskiej sile jonowej o pH zbliżonym do punktu izoelektrycznego białka.

Przemyć cząstki w trzech do pięciu cyklach wirowania i ponownego zawieszenia w świeżym buforze do wymiany. Skoncentrować mieszaninę cząstek do około pięciu mikrolitrów, aby uzyskać obciążenie cząstkami 20 miligramów na mililitr. Aby rozpocząć przygotowania do wykonania pomiarów PFIRE, wyczyść silikonowy wewnętrzny element odblaskowy za pomocą sonikacji o niskiej mocy w kwasie siarkowym przez 15 minut.

Następnie kwas azotowy przez godzinę. Następnie wypłucz element w ultraczystej wodzie i wysusz go pod strumieniem suchego azotu gazowego. Użyj szczeliwa silikonowego klasy elektrycznej, aby przymocować IRE do płyty podstawy akcesorium ATR z pięcioma odbiciami, uważając, aby szczeliwo przylegało do krawędzi IRE.

Poczekaj, aż szczeliwo całkowicie wyschnie. Następnie umieść płytkę bazową w suchym beztlenowym komorze rękawicowej z przezroczystym okienkiem IR obok spektrofotometru FTIR. Zamontuj płytkę bazową na akcesorium ATR.

Uzyskaj widmo tła w trybie szybkiego skanowania. Następnie odłącz płytkę podstawy akcesorium ATR i przenieś ją do mokrego beztlenowego schowka rękawicowego. Rzuć jeden mikrolitr cząstek sadzy modyfikowanej enzymatycznie równomiernie na powierzchnię IRE, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia cząstek.

Ważne jest, aby mieszanina cząstek modyfikowanych enzymatycznie została zagęszczona do obciążenia jak najbardziej zbliżonego do 20 miligramów na mililitr. W przeciwnym razie uzyskanie dobrze połączonej warstwy cząstek może być trudne podczas odlewania cząstek na tym etapie. Delikatnie umieść kawałek kalki nasączonej ultraczystą wodą na powierzchni IRE, upewniając się, że folia z cząstkami jest pokryta, nie pozwalając papierowi na kontakt z uszczelniaczem silikonowym.

Zamontuj niestandardowe ogniwo spektroelektrochemiczne na IRE. Dodać 200 mikrolitrów buforu eksperymentalnego przez wlot roztworu, aby utrzymać enzym uwodniony podczas przygotowywania systemu. Podłączyć wlot i wylot roztworu do fiolki z buforem eksperymentalnym za pomocą rurki pompy perystaltycznej.

Następnie przenieś zmontowaną komórkę do suchego schowka rękawicowego. Zamontuj zespół ogniwa na akcesorium ATR i podłącz rurkę do pompy perystaltycznej. Uzyskaj widmo absorpcyjne, używając wcześniej uzyskanego widma jako tła.

Sprawdź, czy pasma MI2 są silnie widoczne w odległości 1 540 przeciwstawnych centymetrów i czy piki miejsca aktywnego hydrogenazy są wykrywalne w obszarze od 1 850 do 2 150. Aby przygotować się do eksperymentu, należy zastosować potencjał redukcyjny ujemny 0,8 V w porównaniu z nasyconą elektrodą referencyjną kalomelu do warstwy cząstek. Nasycić bufor doświadczalny beztlenowym wodorem gazowym.

Następnie rozpocznij przepływ buforu przez ogniwo spektroelektrochemiczne z prędkością około 12 mililitrów na minutę. Pozostawić próbkę na noc pod przepływem buforu doświadczalnego nasyconego wodorem w celu aktywacji hydrogenazy. Uzyskać widmo absorpcyjne aktywowanej próbki i sprawdzić, czy pasma CO i CN miejsca aktywnego wykazują wiele stanów zredukowanych.

Następnie nasycić bufor doświadczalny beztlenowym azotem gazowym i przepuścić bufor przez komórkę. Zastosuj potencjał utleniający równy zero woltów w porównaniu z nasyconą kalomelową elektrodą odniesienia przez 30 minut i uzyskaj widmo absorpcyjne. Następnie zastosuj potencjał redukcyjny przez 30 minut i uzyskaj inne spektrum.

Sprawdź, czy enzym został całkowicie utleniony, a następnie zredukowany. Jeśli nie, sprawdź połączenia elektryczne ogniwa. Korzystając z beztlenowego buforu nasyconego wodorem, należy wykonać serię cyklicznych woltamnogram przy rosnących natężeniach przepływu, aby określić optymalne natężenie przepływu dla eksperymentu.

Korzystając z tego natężenia przepływu, uzyskaj widma w zakresie potencjałów i warunków roztworu. Pomiary PFIRE hydrogenazy E. coli uzyskano przy różnych potencjałach w atmosferze obojętnej i w obecności wodoru gazowego. Widma uzyskane w atmosferze wodoru reprezentowały rozkład stanów miejsca aktywnego obecnych podczas katalitycznego utleniania wodoru w stanie ustalonym.

Beztlenowe utlenianie i aktywacja hydrogenazy poprzez tworzenie stanu niklu-B z niklu-Si badano następnie poprzez pozyskiwanie widm w różnych punktach czasowych podczas potencjalnego zastosowania i przygotowanie różnych widm w stosunku do pierwszego widma. Zaobserwowana stopniowa przemiana niklu-Si w nikiel-B była zgodna z monotonicznym spadkiem prądu. Uzyskano również widma w zakresie pH roztworu, aby zbadać etapy przenoszenia protonów w cyklu katalitycznym hydrogenazy.

Przy niskim pH stan niklowo-C był bardziej rozpowszechniony, podczas gdy stan niklowo-L był bardziej rozpowszechniony przy wysokim pH. Zależność pH od względnych stężeń niklu-C i niklu-L określono na podstawie maksymalnych wartości absorbentów w odpowiednich pikach przy każdym pH ocenianym w doświadczeniu. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się bioelektrochemią do badania kinetyki aktywacji wodoru w stanie ustalonym przez hydrogenezę.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć typowy eksperyment PFIRE. Technika ta jest odpowiednia dla każdego białka redoks, które można badać za pomocą elektrochemii filmu białkowego i dodaje bezpośredni wgląd chemiczny do pomiaru elektrochemicznego.