Protokół pomiaru reaktywności sygnałów w szczurzym modelu zaburzeń związanych z używaniem kokainy
18 czerwca 2018
Reaktywność wskazówek jest rozumiana jako wrażliwość na sygnały związane z doświadczeniami związanymi z zażywaniem narkotyków, które przyczyniają się do głodu i nawrotów u abstynentów. Reaktywność sygnału jest modelowana u szczurów poprzez pomiar orientacji uwagi na sygnały związane z narkotykami, co skutkuje zachowaniem podejścia apetytywnego w teście reaktywności sygnału po samodzielnym podaniu i wymuszonej abstynencji.
W tym protokole reaktywność sygnału mierzy motywację zwierzęcia do poszukiwania kokainy po nieobecności w samodzielnym podawaniu kokainy. Reaktywność sygnałów występuje, gdy szczur jest ponownie wystawiony na kontekst i sygnały wcześniej związane z dożylnym podawaniem kokainy. Reaktywność sygnału jest miarą ryzyka nawrotu.
Opisany tutaj protokół reaktywności sygnału jest przedklinicznym sposobem testowania farmakoterapii modyfikujących nawrót, a także badania czynników genetycznych i środowiskowych, które przyczyniają się do ryzyka nawrotu. Jest to zadanie instrumentalne dla zachowań związanych z poszukiwaniem narkotyków, które jest zgodne z wieloma właściwościami zażywania narkotyków i nawrotów u ludzi. Dokonano optymalizacji kluczowych parametrów, takich jak dawka kokainy, objętość podawania i czas trwania infuzji, w celu ustalenia ważności fazy i translacyjnej mocy produkcyjnej.
Do tego protokołu należy użyć samców szczurów Sprague Dawley, które mają około ośmiu do dziewięciu tygodni, które były zaaklimatyzowane w pomieszczeniu kolonijnym przez co najmniej siedem dni. W okresie aklimatyzacji szczury należy trzymać w parach i zajmować się nimi codziennie przez cały czas trwania badania. Zapewnić nieograniczony dostęp do pożywienia w klatkach domowych na wszystkich etapach badania.
Wszczepić cewniki do żyły szyjnej metodą opisaną przez Kmiotka i współpracowników w filmie JoVE, a następnie losowo przypisać szczury do grup leczenia solą fizjologiczną lub kokainą. W przypadku treningu, harmonogramy programów samodzielnego podawania kokainy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wyposaż komory treningowe w dwie wysuwane dźwignie reakcji, lampkę stymulacyjną nad każdą dźwignią reakcji i lampkę domową naprzeciwko dźwigni.
Dostarczyć kokainę lub sól fizjologiczną z pomp infuzyjnych strzykawkowych na zewnątrz kabiny. Użyj igieł o rozmiarze 23 dołączonych do strzykawek i rurki polietylenowej zamkniętej w metalowej smyczy sprężynowej przymocowanej do cewników szczura. Kokaina lub sól fizjologiczna są dostarczane po aktywnym naciśnięciu dźwigni, ale nie po nieaktywnym naciśnięciu dźwigni.
Zmieniaj rozwiązania codziennie. Używaj świeżo przygotowanych rozcieńczeń kokainy w sterylnym 0,9% chlorku sodu dostosowanym do wagi każdego szczura. Załaduj co najmniej osiem mililitrów roztworu do strzykawki każdego szczura.
Rozpocznij od szkolenia szczurów zgodnie z harmonogramem wzmacniania FR1 i przejdź do schematu FR5 po trzech dniach z rzędu po siedem infuzji na godzinę z mniej niż 10% zmiennością całkowitej liczby infuzji na sesję. Konieczne jest codzienne analizowanie danych dotyczących zachowań związanych z samodzielnym podawaniem, aby określić, kiedy należy przesunąć zwierzę do FR5 i sprawdzić, czy nie ma utraty drożności cewnika. Jednym z najważniejszych kroków protokołu jest monitorowanie samodzielnego podawania w ciągu pierwszych 14 dni treningu, aby upewnić się, że zwierzę prawidłowo podaje się do samodzielnego podawania.
Jeśli samodzielne podawanie drastycznie się zmniejsza, cewnik szczura prawdopodobnie stracił drożność. Na początku sesji należy sprawdzić, czy w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. Podłączyć strzykawkę do rurki polietylenowej i włożyć ją do pompy infuzyjnej.
Ostrożnie wyregulować strzykawkę tak, aby roztwór był równomiernie i całkowicie rozprowadzony w rurkach polietylenowych. Następnie podłącz szczury do systemu dostarczania i umieść je w odpowiednich standardowych komorach kondycjonowania operacyjnego umieszczonych w wentylowanych kabinach tłumiących dźwięk z wentylatorami. Niezbędna jest konsekwencja w całym eksperymencie.
Zawsze umieszczaj szczura w tej samej komorze i trzymaj aktywną dźwignię po tej samej stronie w tej komorze. W ciągu 14 codziennych 180-minutowych sesji szczury mają swobodny dostęp do dźwigni i łatwo uczą się, która dźwignia zapewnia stymulację, pod warunkiem, że system działa. Każdy spust aktywnej dźwigni w ustalonym harmonogramie proporcji jeden uwalnia 0,1 mililitra roztworu w ciągu sześciu sekund i jednocześnie oświetla światło klatki i światło bodźca nad aktywną dźwignią.
Następuje jednosekundowe opóźnienie przed uwolnieniem roztworu. Po każdym podaniu kokainy lub soli fizjologicznej lampka bodźcowa i pompa infuzyjna są wyłączane na 20 sekund, podczas których światło w domu pozostaje włączone, a naciśnięcie dźwigni nie robi nic, ale jest rejestrowane. Gdy lampka zgaśnie, dźwignia zostanie ponownie aktywowana.
Każde naciśnięcie nieaktywnej dźwigni nie powoduje żadnych zaplanowanych konsekwencji. Pod koniec tej 180-minutowej sesji użyj powolnych, ostrożnych ruchów, aby usunąć potencjalnie agresywnego szczura z komory. Następnie przepłucz jego cewnik.
Pomiędzy sesjami dokładnie wyczyść komory. Przetrzyj każdą powierzchnię 70% roztworem etanolu. Pod koniec sesji treningowych poddaj szczury przymusowej abstynencji przez 30 dni bez dostępu do komory operacyjnej.
Kontynuuj codzienną pracę ze szczurami i monitoruj ogólny stan zdrowia. Po długim okresie abstynencji należy pozostawić szczury na 60 minut w komorze operacyjnej, a następnie natychmiast pobrać mózg. Dla tej sesji uruchom zaplanowany program reaktywności cue.
Rozłóż czas rozpoczęcia sesji, aby dać czas na zebranie mózgów między sesjami. Co ważne, pompę należy obsługiwać bez dołączonej strzykawki, tak aby sygnał dźwiękowy pompy był nadal częścią bodźca bez dostarczania substancji. Rozpocznij tę sesję jak zwykle ze szczurem w komorze do samodzielnego podawania, w której został wyszkolony.
W tym teście, gdy naciskana jest aktywna dźwignia, która wcześniej dostarczała kokainę lub sól fizjologiczną, tylko sygnały są dostarczane zgodnie z harmonogramem FR1. Nieaktywna dźwignia nadal nic nie robi. Nagrywaj wszystkie prezentacje cue, poprzednio aktywne naciśnięcia dźwigni i nieaktywne naciśnięcia dźwigni, a także opóźnienie do pierwszego naciśnięcia dźwigni.
Korzystając z opisanego protokołu, przeprowadzono badanie, w którym szczury zostały indywidualnie przeniesione z FR1 na FR5, ponieważ spełniały kryteria. W grupie podającej kokainę szczury stopniowo zwiększały liczbę wlewów, aż osiągnęły kryterium, a następnie przeszły z FR1 na FR5. Z testu reaktywności na sygnały kokainy pobrano wiele miar wyjściowych.
Na przykład, szczury, które wcześniej samodzielnie zażywały kokainę, naciskały uprzednio aktywną dźwignię znacznie bardziej niż szczury, które same podawały sól fizjologiczną. Inną ważną miarą wyjściową jest opóźnienie do naciśnięcia pierwszego poziomu. Kiedy obserwuje się zmianę w tym zakresie, zwierzę może być zestresowane fizycznie lub mieć zmniejszoną motywację do samodzielnego zażywania kokainy.
Zadania związane z zachowaniem lokomotorycznym mogą być wykorzystywane do oceny zmian w zdrowiu fizycznym i odróżniania upośledzenia motorycznego od zmian motywacyjnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak trenować szczury do samodzielnego podawania leku, utrzymywania drożności cewnika podczas samodzielnego podawania i oceny reaktywności na sygnały związane z lekiem po abstynencji jako miary ryzyka nawrotu. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o starannym zaprogramowaniu oprogramowania, prawidłowym obchodzeniu się ze zwierzętami i regularnym płukaniu cewników dożylnych.
Postępując zgodnie z tą procedurą, można ocenić mechanizmy komórkowe i molekularne, które napędzają reaktywność sygnałów kokainy, a także przetestować potencjalne farmakoterapeutyki, które modyfikują reaktywność sygnałów kokainy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Reaktywność na bodźce jest miarą motywacji zwierzęcia do poszukiwania kokainy po okresie abstynencji od samopodawania. Zachowanie to ocenia się poprzez ponowną ekspozycję szczurów na konteksty i bodźce związane z podawaniem kokainy, co służy jako model ryzyka nawrotu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Farmakologia behawioralna
- Badania przedkliniczne
Wstęp
- Reaktywność na sygnały odzwierciedla wrażliwość na bodźce związane z narkotykiem.
- Przyczynia się ona do zrozumienia mechanizmów głodu narkotykowego i nawrotów u ludzi.
- Protokół został opracowany w celu testowania farmakoterapii modyfikujących nawroty.
- Można badać czynniki genetyczne i środowiskowe wpływające na ryzyko nawrotu.
Cel badania
- Modelowanie zachowań poszukiwania leku u szczurów w odniesieniu do ludzi.
- Ocena skuteczności farmakoterapii w ograniczaniu ryzyka nawrotu.
- Optymalizacja parametrów w celu zapewnienia trafności translacyjnej.
Zastosowane metody
- Zadanie operacyjne dla zachowań poszukiwania narkotyku.
- Ponowna ekspozycja na konteksty i sygnały związane z narkotykiem.
- Pomiar orientacji uwagi w kierunku sygnałów.
- Optymalizacja dawki kokainy, objętości podania i czasu trwania infuzji.
Główne wyniki
- Ustanowienie ważności fazy w modelu reaktywności na wskazówki.
- Wykazanie zależności między ekspozycją na wskazówki a ryzykiem nawrotu.
- Wgląd w motywacyjne aspekty zachowań poszukiwania narkotyku.
- Potencjał w zakresie identyfikacji skutecznych strategii zapobiegania nawrotom.
Wnioski
- Reaktywność na bodźce stanowi wartościowe narzędzie przedkliniczne.
- Wyniki mogą dostarczyć informacji pomocnych w opracowywaniu metod leczenia uzależnień.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania wpływów genetycznych i środowiskowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar reaktywności na bodźce w modelach szczurzych stanowi istotne narzędzie translacyjne do oceny ryzyka nawrotu oraz interwencji farmakoterapeutycznych w zaburzeniach używania substancji. Niniejszy protokół umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka i zwiększenie pewności prognostycznej w przypadku terapii kandydackich celujących w nawroty wywołane bodźcami, co stanowi krytyczny punkt zwrotny w odkrywaniu leków neuropsychiatrycznych. Uzyskane wyniki służą do wczesnej selekcji projektów w portfolio oraz wspierają interdyscyplinarne podejmowanie decyzji w przedklinicznych badaniach nad uzależnieniami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów neurobiologicznych leżących u podłoża ryzyka nawrotu wywołanego bodźcami.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów dla farmakoterapii modyfikujących nawroty.
- Zapewnia wiarygodność prognostyczną dla dalszego rozwoju kandydackich interwencji w badaniach nad uzależnieniami.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane punkty końcowe behawioralne dla przesiewu związków w modelach nawrotów.
- Dostarcza danych ilościowych, takich jak liczba naciśnięć dźwigni i czas latencji, co wspiera powtarzalność testu.
- Ułatwia standaryzację operantnych testów behawioralnych w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica przedkliniczne wyniki behawioralne z ludzkimi fenotypami nawrotów w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój farmakoterapii celujących w głód wywołany wskazówkami.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów poprzez łączenie punktów końcowych behawioralnych z mechanizmami molekularnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, łącząc wczesne badania mechanistyczne z identyfikacją związków wiodących oraz walidacją translacyjną w badaniach nad uzależnieniami.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do testowania hipotez dotyczących mechanizmów nawrotów i wrażliwości na sygnały.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe odczyty behawioralne do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie efektów leczenia w odniesieniu do zachowań związanych z nawrotami.
- Badania translacyjne: Łączy przedklinową reaktywność na sygnały z ryzykiem nawrotu u ludzi, wspierając dostosowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje możliwość ponownego wykorzystania testu behawioralnego, który można dostosować do innych bodźców pozytywnie wzmacniających niż kokaina.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie ryzyka nawrotu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły behawioralne w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych badaniach.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową w portfelach neuropsychiatrycznych.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dla terapii kandydujących ukierunkowanych na nawroty indukowane wskazówkami.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie farmakologii behawioralnej warunkowania instrumentalnego oraz w obchodzeniu się ze zwierzętami.
- Wymaga specjalistycznych komór warunkowania instrumentalnego, systemów infuzyjnych oraz infrastruktury do akwizycji danych.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja parametrów treningu i testowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji do innych bodźców wzmacniających, lecz ograniczona ryzykiem wygaszenia przy wielokrotnej ekspozycji na sygnał.
- Czas trwania i częstotliwość sesji muszą być starannie kontrolowane, aby zachować ważność asocjacji z sygnałem.
