Name: Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj nieinwazyjną tomografię koherentną SD-OCT do obrazowania komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo. Ta metoda umożliwia szybką i precyzyjną ocenę grubości siatkówki w badaniach neuropatii wzrokowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Inserm, Université Montpellier, Retina France, Union National des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Association Syndrome de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France oraz program Laboratory of Excellence EpiGenMed.

Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, Francja), jest zgodny z dyrektywami europejskimi i jest zgodny z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych. Przeprowadzono je w ramach porozumienia z Komisją ds. Etyki w Doświadczeniach na Zwierzętach w Langwedocji Roussillon (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).
1. Konfiguracja sprzętu i przygotowanie do wstępnego obrazowania
UWAGA: W tym przypadku OCT przeprowadzono na siatkówkach myszy przy użyciu systemu obrazowania okulistycznego domeny spektralnej (SD) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Aparat SD-OCT składa się z podstawy i uchwytu do obrazowania zwierząt (AIM) ze stopniem wyrównania gryzoni (RAS) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Podstawa zawiera komputer, silnik OCT, sondę SD-OCT i obiektyw specyficzny dla myszy. Sonda jest zamontowana na AIM, który zawiera Z-translator. RAS służy do pozycjonowania myszy dzięki stolikowi z translatorem X i Y, kasecie, którą można obracać i obracać, oraz zdejmowanemu prętowi gryzowemu z opaską na nos. Oprogramowanie dostarczone przez producenta pozwala na pozyskiwanie i analizę plików OCT, choć ta ostatnia może być również wykonywana za pomocą programu do przetwarzania obrazu o otwartym kodzie źródłowym.
<ol>
	<li>Mocno umieść sondę w AIM.</li>
	<li>Podłącz soczewkę specyficzną dla myszy do sondy.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia ramienia referencyjnego dla konkretnego obiektywu (tutaj moc na 086 i pozycja na 964).</li>
	<li>Upewnij się, że soczewka specyficzna dla myszy znajduje się wystarczająco daleko od kasety, przymocuj belkę gryzącą z opaską na nos do kasety. 
	UWAGA: Odległość między obiektywem a kasetą można regulować za pomocą Z-translator, znajdującej się z tyłu AIM. Opaska na nos jest dostępną na rynku elastyczną opaską, a jej napięcie należy dostosować w zależności od wielkości myszy.</li>
	<li>Włącz zasilanie (prawy dolny róg wózka), a następnie komputer.</li>
	<li>Aby uruchomić program do obrazowania, kliknij dwukrotnie odpowiedni skrót na ekranie. 
	UWAGA: To zależy od typu obiektywu; tutaj, Mouse Retina.</li>
	<li>Utwórz nowe badanie kliniczne i dodaj żądane protokoły. W przeciwnym razie należy skorzystać z istniejącego badania klinicznego i/lub protokołów.
	<ol>
		<li>Dodaj nowe badanie, wybierając "Nazwę badania", "ID", "Specyfikacje ramienia leczenia" (w tym przypadku "Bez kategorii") i wstępnie zdefiniowane "Protokoły skanowania", jeśli takie istnieją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz "Egzaminatora" w sekcji "Badanie kliniczne". 
	UWAGA: Aby uzyskać nowego "Egzaminatora", przejdź do "Konfiguracja Egzaminatorów i Lekarzy", aby go zdefiniować.</li>
	<li>Dodaj nowego Pacjenta w sekcji Pacjent/Badanie, klikając Dodaj Pacjenta, wpisując "ID", "imię", "nazwisko", "płeć" i "datę urodzenia" (opcjonalnie). 
	UWAGA: Zrób to tuż przed przetestowaniem każdej myszy, jeśli jest to wygodniejsze. Upewnij się, że identyfikator nie jest dłuższy niż 10 znaków. W przypadku myszy wada refrakcji dla obu oczu wynosi 0, a długość osiowa wynosi 23,0.</li>
	<li>Kliknij "Dodaj egzamin" i wybierz żądany "Protokół", dodając z listy "Zaprogramowane skany", zaczynając od oka, które zostanie zmierzone jako pierwsze (tutaj prawe oko) lub dostosowując skany.</li>
	<li>Aby dostosować skan, użyj istniejącego skanu jako szablonu i edytuj go lub utwórz go od podstaw za pomocą opcji "Dodaj skanowanie niestandardowe". Po dodaniu wszystkich skanów do listy, zdefiniuj nowy protokół za pomocą opcji "Wprowadź nazwę nowego protokołu" (OS: oculus sinister, lewe oko; OD: oculus dexter, prawe oko). 
	UWAGA: W tym przypadku protokół obejmuje trzy skany: (i) skan promieniowy o średnicy 1,4 mm, przesunięciach poziomych i pionowych 0 mm, 1,000 linii skanów A/B-skan, 100 skanów B/objętość, 1 klatka/B-skan, 80 linii nieaktywnych skanów A/B-skan i 1 wolumin; (ii) skan prostokątny o długości i szerokości 1,4 mm, kącie 0°, przesunięciach poziomych i pionowych 0 mm, 1000 wierszy skanów A/B-skan, 100 skanów B, 1 klatka/B-skan, 80 linii nieaktywnych A-skanów/B-skan i 1 wolumin; oraz (iii) skan pierścieniowy o minimalnej średnicy 0,4 mm i maksymalnej 0,6 mm, przesunięciach poziomych i pionowych 0 mm, 1 000 wierszy skanów A/B-skan, 3 skany B/wolumin, 48 klatek/B-skan, 80 linii nieaktywnych A-skanów/B-skan i 1 wolumin</li>.
</ol>
2. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Rozszerzenie i unieruchomienie oczu
	<ol>
		<li>Co najmniej 15 minut przed pobraniem danych wkraplać 10% krople do oczu fenylefryny do oczu myszy, usunąć nadmiar i wkraplać 0,5% krople do oczu z tropikamidem. 
		UWAGA: Pierwsze rozszerzenie można wykonać od razu dla wszystkich myszy, które będą testowane podczas sesji. Upewnij się, że płyny mają temperaturę pokojową.</li>
		<li>Natychmiast po wywołaniu znieczulenia ogólnego (krok 2.2) należy podać 0,4% krople do oczu z chlorowodorkiem oksybuprokainy, utrzymując je na miejscu przez 3 sekundy w celu znieczulenia i unieruchomienia oczu. Następnie zetrzyj krople i powtórz wkraplanie 10% fenylefryny i 0,5% tropikamidu, aby upewnić się, że oczy są dobrze rozszerzone. 
		UWAGA: Upewnij się, że płyny mają temperaturę pokojową i że mysz nie połyka oksybuprokainy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie ogólne
	<ol>
		<li>Przygotować znieczulający roztwór ketaminy (20 mg/ml) i ksylazyny (1,17 mg/ml) w soli fizjologicznej. Przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie 2 tygodnie.</li>
		<li>Na około 5 minut przed badaniem wstrzyknąć dootrzewnowo 5 - 10 μl roztworu znieczulającego na 1 g masy ciała, w zależności od wieku i wielkości myszy. 
		UWAGA: Młode i/lub chude myszy potrzebują mniej środka znieczulającego, potrzebują mniej czasu na znieczulenie, ale także szybciej się budzą. Tutaj 8 μl/g (160 mg/kg ketaminy, 9,33 mg/kg ksylazyny).</li>
		<li>Opcjonalnie nasmaruj oczy lepkimi kroplami do oczu lub żelem okulistycznym, aby uniknąć wysuszenia rogówki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pozycjonowanie myszy
<ol>
	<li>Nasmaruj oczy lepkimi kroplami do oczu na bazie glikolu, aby zapewnić nawilżenie rogówki. 
	UWAGA: Jeśli oczy wydają się suche podczas badania, ponownie nałóż krople do oczu.</li>
	<li>Owiń mysz w arkusz gazy chirurgicznej, aby utrzymać ją w cieple.</li>
	<li>Za pomocą gąbki lub bawełnianego nałóż cienką warstwę żelu okulistycznego z 0,3% hypromelozą na każde oko, aby zminimalizować załamanie światła, uniknąć zmętnienia i zapewnić nawilżenie rogówki. Robiąc to, odsuń rzęsy i wąsy na bok.</li>
	<li>Umieść mysz w kasecie, z głową wyprostowaną i skierowaną do przodu.</li>
	<li>Delikatnie otwórz zacisk pręta do gryzienia i umieść pręt w ustach; użyj opaski na nos, aby zabezpieczyć pozycję. 
	UWAGA: Upewnij się, że belka gryząca znajduje się na środku kasety.</li>
	<li>Umieść bawełnianą rolkę pod prawą (lewą) stroną, jeśli badane jest prawe (lewe) oko.</li>
	<li>Trzymając przypinaną końcówkę celowniczą na soczewce specyficznej dla myszy, przyłóż ją do oka, obracając Z-translator w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.</li>
	<li>Obracając i obracając kasetę oraz obracając belkę zgryzową i X-translator, wstępnie ustaw pozycję myszy; celem jest, aby prawe oko patrzyło bezpośrednio w obiektyw, a tym samym wyrównało osie optyczne oczu i soczewki. 
	UWAGA: Jeśli mysz jest zbyt wysoko lub zbyt nisko, należy najpierw użyć Y-translator</li>.
	<li>Wybierz pierwszy skan w "Badaniu", kliknij "Rozpocznij celowanie" i dokonaj dalszych ręcznych korekt obrazowania siatkówki.
	<ol>
		<li>Za pomocą Z-translator przesuń siatkówkę w pionie na lewym panelu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, Poziome wyrównanie B-scan) i poziomo na prawym panelu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, Wyrównanie B-skanu w pionie).</li>
		<li>Obróć kasetę, aby przesunąć ONH na środek prawego panelu, przesuwając ONH w górę lub w dół. Użyj pręta gryzowego, aby wyprostować siatkówkę na prawym panelu. Obróć kasetę, aby ustawić ONH na środku lewego panelu.</li>
		<li>Użyj X-translator, aby wypoziomować siatkówkę na lewym panelu. Mając na uwadze główną funkcję każdego modulatora, dostosuj położenie siatkówki, aby scentralizować ONH. 
		UWAGA: W razie potrzeby użyj Y-translator, aby przesunąć ONH w górę iw dół na prawym panelu. Pozycja może zostać poprawiona w dowolnym momencie między skanowaniami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie SD-OCT ONH i siatkówki
<ol>
	<li>Po zapoznaniu się z regulacjami kliknij "Rozpocznij migawkę", aby rozpocząć skanowanie SD-OCT.
	<ol>
		<li>Jeśli obrazowanie 3D nie jest wymagane, odznacz opcję OCU.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz skan i raport.</li>
	<li>Kontynuuj kolejne skanowania.</li>
	<li>Aby zobrazować drugie oko, po schowaniu soczewki należy odpowiednio obrócić kasetę i powtórzyć kroki 3.6 - 4.3.</li>
</ol>
5. Zakończenie przejęcia
<ol>
	<li>Po zakończeniu akwizycji wyjmij mysz z kasety, nałóż żel okulistyczny z 0,3% hypromelozą na każde oko i umieść mysz na płycie grzewczej, aby się obudzić.</li>
	<li>Po ostatnim pobraniu zamknij oprogramowanie i wyłącz komputer oraz maszynę OCT (przycisk zasilania).</li>
	<li>Wyczyść kasetę środkiem dezynfekującym.</li>
</ol>
6. Analiza
<ol>
	<li>Do pomiaru grubości warstwy siatkówki należy skorzystać z oprogramowania do automatycznej segmentacji dostarczonego przez producenta.
	<ol>
		<li>Kliknij "Pacjent", wybierz żądany "Egzamin" z listy i kliknij opcję "Przegląd egzaminu".</li>
		<li>Załaduj żądane dane OCT do oprogramowania OCT, klikając prawym przyciskiem myszy ikonę folderu w żądanym skanowaniu.</li>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy B-scan; skonfiguruj suwmiarki, włączając do 10 suwmiarek pomiarowych; i wprowadź ich nazwy, kąty i kolory.</li>
		<li>Wybór żądanej suwmiarki poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy na B-scan; umieść ją odpowiednio na siatkówce w celu pomiaru. 
		UWAGA: W przypadku skanów wyśrodkowanych na ONH, ustaw 5 suwmiarki po każdej stronie, w równej odległości od siebie. W przypadku analizy obwodowo-brodawkowej upewnij się, że suwmiarka nie jest umieszczona zbyt daleko od ONH. W przypadku skanowania promieniowego przeanalizuj 10 zdjęć na skan, które zostały wybrane przez oprogramowanie OCT. Ich numery znajdują się w folderze "Raporty".</li>
		<li>Zapisz wyniki do analizy w arkuszu kalkulacyjnym, klikając prawym przyciskiem myszy B-scan i klikając "Zapisz wyniki". 
		UWAGA: Wyniki można znaleźć w tym samym folderze, w którym znajdują się dane skanowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie można użyć domowego makra suwmiarki "MRI Retina Tool", opracowanego dla programu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że makra "MRI Retina Tool" i "Modify Polygon Section Tool" są aktywne. Załaduj obraz. Kliknij przycisk m, aby rozpocząć pomiar. 
		UWAGA: Makro automatycznie tworzy jedną kasetę pomiarową o długości 0,2 mm po obu stronach ONH. Każda kaseta zawiera 5 punktów pomiarowych, które pełnią funkcję suwmiarki. Ich pozycja boczna jest niezmienna i jest dostosowana do okołobrodawki w skanach promieniowych. Pozycja pozioma kaset jest wstępnie zdefiniowana do pomiaru grubości RNFL/GCL, ale można ją łatwo zmodyfikować, aby zamiast tego zmierzyć warstwę zespoloną GC. Jeśli jakość skanowania jest niska, należy dostosować pozycję poziomą lub wykluczyć obraz z analizy.</li>
		<li>Aby dostosować się w poziomie, kliknij przycisk e. W nowo otwartym oknie "ROI Manager" wybierz pierwszą kasetę.</li>
		<li>Kliknij niebieski przycisk wielokąta i dostosuj położenie pierwszej kasety, klikając obramowania mierzonej warstwy na obrazie.</li>
		<li>Powtórz dla drugiej kasety, najpierw wybierając ją w oknie "Menedżer ROI", a następnie klikając odpowiedni obraz. Kliknij przycisk r, aby ponownie zmierzyć. Zobacz wyniki w oknie "Pomiary". 
		UWAGA: Wyniki można w dowolnym momencie skopiować do arkusza kalkulacyjnego. Zawierają one następujące wartości dla prawej kasety (r), lewej kasety (l) i sumy: Intden - gęstość zintegrowana w kasecie; Powierzchnia: obszar pomiaru, w mm2; Len: długość zacisku w kasecie, w mm; Średnia: średnie natężenie sygnału w kasecie; i Std: błąd standardowy średniego natężenia sygnału.</li>
		<li>Przejdź do następnego obrazu.</li>
		<li>Dalej analizuj dane w arkuszu kalkulacyjnym. 
		UWAGA: Aby znaleźć średnią grubość warstwy, weź dziesięć wartości Len.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Drexler, W., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+retinal+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art retinal optical coherence tomography.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).</li>
<li>Grenier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WFS1+in+Optic+Neuropathies%3A+Mutation+Findings+in+Nonsyndromic+Optic+Atrophy+and+Assessment+of+Clinical+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity.</a> Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).</li>
<li>Zmyslowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+thinning+as+a+marker+of+disease+progression+in+patients+with+Wolfram+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome.</a> Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).</li>
<li>Fischer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive%2C+in+vivo+assessment+of+mouse+retinal+structure+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography.</a> PLoS One. 4 (10), e7507(2009).</li>
<li>Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+the+Retina+With+Full-Field+Optical+Coherence+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).</li>
<li>Mustafa, S., Pandit, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+diagnosis+and+management+of+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+India%22%5BJournal%5D)">Approach to diagnosis and management of optic neuropathy.</a> Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).</li>
<li>Sarzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+OPA1delTTAG+mutation+induces+premature+age-related+systemic+neurodegeneration+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse.</a> Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).</li>
<li>Sarzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+steroidogenesis+promotes+early-onset+and+severe+vision+loss+in+females+with+OPA1+dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy.</a> Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).</li>
<li>Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., et al. Optic Atrophy Type 1. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1248/">Gene Reviews</a>. Pagon, R. A. 7 (2007), University of Washington. Seattle. (2007).</li>
<li>Lenaers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Dominant optic atrophy.</a> Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).</li>
<li>Delettre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+gene+OPA1%2C+encoding+a+mitochondrial+dynamin-related+protein%2C+is+mutated+in+dominant+optic+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy.</a> Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+retinal+morphologic+and+functional+changes+in+mice+following+optic+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

System OCT, nieinwazyjna metoda obrazowania in vivo , zapewnia skany przypominające przekrój siatkówki o wysokiej rozdzielczości. W związku z tym jego główną zaletą jest potencjał do szczegółowej analizy, ze wspaniałą możliwością transpozycji protokołów rutynowo stosowanych u ludzi do modeli mysich.
W przykładzie myszy z mutacjąOpa1 delTTAG wyniki SD-OCT wykazały wzrost grubości warstwy kompleksu RNFL i GC, co pozwoliło na dalsze badanie patofizjologii DOA<sup clas...

OCT to narzędzie diagnostyczne, które ułatwia badanie struktur siatkówki1, w tym głowy nerwu wzrokowego (ONH). Z biegiem lat stał się wiarygodnym wskaźnikiem postępu choroby u ludzi2,3, a także u gryzoni4,5. Wykorzystuje interferometrię do tworzenia przekrojowych obrazów warstw siatkówki w rozdzielczości osiowej 2 μm. Najbardziej wewnętrzną warstwą jest warstwa włókien nerwowych siatkówki (RNFL), zawierająca aksony RGC, po której następuje warstwa komórek zwojowych (GCL), zawierająca głównie ciała RGC. Następna jest wewnętrzna warstwa splotowata (IPL), w której dendryty RGC spotykają się z aksonami komórek bipolarnych, poziomych i amakrynowych. Te, wraz z komórkami poziomymi, tworzą wewnętrzną warstwę jądrową (INL), a ich występy łączą się z aksonami fotoreceptorów w zewnętrznej warstwie splotowatej (OPL). Następnie następuje zewnętrzna warstwa jądrowa (ONL) z ciałami komórek fotoreceptorowych i jest oddzielona od warstwy fotoreceptorów zewnętrzną błoną ograniczającą (OLM), zwaną również warstwą segmentu wewnętrznego / segmentu zewnętrznego (IS / OS). Wreszcie ostatnimi obserwowalnymi warstwami w siatkówce myszy są nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) i naczyniówka (C). Sam RNFL jest zwykle zbyt cienki, aby można go było zmierzyć u myszy; w związku z tym preferowana jest analiza RNFL/GCL4,5. Inną możliwością jest warstwa złożona GC, która zawiera tę ostatnią oprócz IPL, dzięki czemu jest grubsza, a tym samym jeszcze łatwiejsza do zmierzenia na skanach OCT4. W związku z tym OCT może zapewnić wgląd w patologiczny stan siatkówki, na przykład w OPN. 
Alternatywnie, grubość siatkówki myszy jest często analizowana za pomocą histologii pośmiertnej. Technika ta napotyka jednak ograniczenia związane z pobieraniem tkanek, utrwalaniem, cięciem, barwieniem, mocowaniem itp. W związku z tym nie można wykryć niektórych defektów, takich jak subtelne zmiany grubości. Wreszcie, ponieważ ta sama mysz nie może być testowana w kilku punktach czasowych, liczba zwierząt w badaniu znacznie wzrasta, w przeciwieństwie do OCT. Podsumowując, nieinwazyjność, wysoka rozdzielczość, możliwość powtarzania, monitorowanie czasu w czasie oraz łatwość użycia technologii OCT sprawiają, że jest to metoda z wyboru w badaniach nad chorobami siatkówki.
Modele mysie są używane do identyfikacji defektów genów i wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw retinopatii6. OPN jest formą retinopatii ze znacznym uszkodzeniem nerwu wzrokowego (ON), który składa się z około 1,2 miliona aksonów RGC. OPN może być skoncentrowany na ON lub może być wtórny do innych zaburzeń, wrodzonych lub nie7, co prowadzi do utraty pola widzenia, a później ślepoty. Charakterystycznymi cechami OPN są utrata RGC i uszkodzenia ON, które można zaobserwować u ludzi w OCT jako RNFL i GCL thininning2,3. Tymczasem patofizjologia OPN jest wciąż słabo poznana, a co za tym idzie, pozostaje potrzeba badania siatkówek myszy. 
Ten manuskrypt opisuje obrazowanie i kwantyfikację grubości warstwy siatkówki, na przykładzie linii myszy Opa1delTTAG8,9, model dominującego zaniku nerwu wzrokowego (DOA)10. Aby ocenić patofizjologię RGC, określono ilościowo skany promieniowe, prostokątne i pierścieniowe. Odbywało się to za pomocą standardowych suwmiarek dostarczonych przez oprogramowanie OCT lub za pomocą domowego makra opracowanego dla programu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym. Standardowe suwmiarki są trudne w obsłudze i często grubsze niż RNFL/GCL, podczas gdy suwmiarki domowej roboty są łatwe w użyciu, powtarzalne i bardziej precyzyjne. Makro wykonuje pomiar dla automatycznie wykrytej warstwy, w 5 punktach i w ustalonych pozycjach, po obu stronach ONH w obszarze okołobrodawkowym. Celem przedstawionego protokołu jest opisanie akwizycji skanu OCT w celu określenia położenia siatkówki, ze szczególnym uwzględnieniem RGC.

<table><tbody><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opa1delTTAG</td><td>mysz Institute for Neurosciences w Montpellier, INSERM UMR 1051,</td><td></td> <td>France-Opa1 knock-in myszy&nbsp; Mutacja OPA1 c.2708_2711delTTAG na tle C57Bl6/J</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System</td><td>Bioptigen, Leica Microsystems, Niemcy</td><td>-</td><td>System koherentnej koherentnej koherentności optycznej w domenie spektralnej</td></tr><tr><td>EnVisu R2200 SD-OCT Oprogramowanie systemu obrazowania</td><td>Bioptigen, Leica Microsystems,</td> <td>Niemcy-Oprogramowanie</td> <td>do akwizycji i analizy OCT</td></tr><tr><td>ImageJ 1.48v</td><td>Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA-Oprogramowanie</td><td></td> <td>do analizy, wymaga pobrania i zainstalowania dwóch domowych makr: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool</td></tr><tr><td>Samoregulująca płyta grzewcza</td><td>Bioseb, Francja</td><td>BIO-062</td><td>Ochrona przed hipotermią</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sheep Band</td><td>-</td><td>-</td><td>Elastyczna taśma</td></tr><tr><td>Gaziki 3" x 3"</td><td>Curad, USA</td><td>CUR20434ERB</td><td>Ochrona przed hipotermią</td></tr><tr><td>Aplikator z podwójną końcówką z bawełnianej końcówki</td><td>Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA-Aplikacja</td><td></td> <td>żelu</td></tr><tr><td>Bawełniane skręty</td><td>CentraVet, Francja</td><td>T.7979C.CS</td><td>Pozycjonowanie myszy</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</silny></td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Odczynniki i leki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N&eacute; osyn&eaostry; phrine Faure 10%</td><td>Laboratoires Europhtha,</td> <td>Monako-Rozszerzenie</td> <td>oczu</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0,5%</td><td>Laboratoires Th&eacute; a, Francja</td><td>3397908</td><td>Rozszerzenie oczu</td></tr><tr><td>Cebezyna 0,4%</td><td>Laboratoire Chauvin, Bausch& Lomb, Francja</td><td>3192342</td><td>Znieczulenie miejscowe</td></tr><tr><td>Imalgene 1000</td><td>Merial, Francja/CentraVet, Francja</td><td>IMA004</td><td>Znieczulenie ogólne</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer Healthcare, Niemcy/CentraVet, Francja</td><td>ROM001</td><td>Znieczulenie ogólne, analgezja, rozluźnienie mięśni</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Laboratoire Osalia, Francja&nbsp;</td><td>103697114</td><td>Serum fizjologiczne</td></tr><tr><td>Systene Ultra</td><td>Alcon, Novartis, USA-Nawilżenie</td><td></td> <td>oczu</td></tr><tr><td>GenTeal'Alcon</td><td>, Novartis, USA-Żel</td><td></td> <td>okulistyczny minimalizujący załamanie światła i zmętnienia</td></tr><tr><td>Aniospray Surf 29</td><td>Laboratoires Anios, Francja</td><td>59844</td><td>Środek dezynfekujący</td></tr></tbody></table>

optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Zmiany strukturalne w siatkówce są częstymi objawami chorób okulistycznych. Optyczna tomografia koherentna (OCT) umożliwia ich identyfikację in vivo – szybko, powtarzalnie i w wysokiej rozdzielczości. Protokół ten opisuje obrazowanie OCT w siatkówce myszy jako potężne narzędzie do badania neuropatii nerwu wzrokowego (OPN). System OCT jest opartą na interferometrii, nieinwazyjną alternatywą dla powszechnych pośmiertnych testów histologicznych. Zapewnia szybką i dokładną ocenę grubości siatkówki, dając możliwość śledzenia zmian, takich jak przerzedzenie lub pogrubienie siatkówki. Przedstawiamy proces obrazowania i analizy na przykładzie linii myszy Opa1delTTAG. Proponowane są trzy rodzaje skanów, z dwiema metodami kwantyfikacji: suwmiarkami standardowymi i domowej roboty. Ten ostatni najlepiej nadaje się do stosowania na siatkówce okołobrodawkowatej podczas skanów promieniowych; Będąc bardziej precyzyjnym, jest preferowany do analizy cieńszych struktur. Wszystkie opisane tutaj podejścia są przeznaczone dla komórek zwojowych siatkówki (RGC), ale można je łatwo dostosować do innych populacji komórek. Podsumowując, OCT jest skuteczny w fenotypowaniu modelu mysiego i ma potencjał, który można wykorzystać do wiarygodnej oceny interwencji terapeutycznych.

Technologia SD-OCT umożliwia obrazowanie siatkówki i analizę jej grubości porównywalną z histologią, lecz jest szybsza i bardziej szczegółowa (Rycina 3). Jak pokazano na przykładzie myszy szczepu C57Bl/6 typu dzikiego, mimo że jakość skanu SD-OCT (Rycina 3A, prawa strona) nie jest tak wysoka jak w przypadku obrazu przekroju poprzecznego siatkówki (Rycina 3A, lewa strona), pozwala on na wizualizację w...

Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wykorzystanie optycznej koherentnej tomografii (OCT) do szybkiego uzyskania dokładnej oceny grubości siatkówki. OCT może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, takie jak neuropatia nerwu wzrokowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona nieinwazyjną metodę wykrywania zmian strukturalnych w komórkach zwojowych siatkówki myszy.Ta technika jest niezwykle interesująca, ponieważ stanowi nieinwazyjną, bezpieczną i uznaną metodę badania efektów leczenia neuropatii nerwu wzrokowego. Na początek należy dostosować ustawienia ramienia referencyjnego do odpowiedniej soczewki. Następnie należy włączyć zasilacz oraz komputer.Po przygotowaniu komputera uruchom program do obrazowania. Utwórz nowe badanie kliniczne i dodaj żądane protokoły. Przejdź do sekcji badania pacjenta i ustaw wartości domyślne badania.W sekcji badań pacjentów kliknij „dodaj pacjenta”, aby dodać nowego pacjenta i wprowadzić odpowiednie informacje o nim. Następnie kliknij „dodaj badanie”, „rozpocznij badanie” i dodaj z listy zaprogramowane skany, aby wybrać pożądany protokół, zaczynając od oka, które zostanie zmierzone w pierwszej kolejności. Na co najmniej 15 minut przed akwizycją danych zakropl do każdego oka wszystkich badanych myszy krople 10% fenylefryny o temperaturze pokojowej.Następnie należy usunąć nadmiar odczynnika i zakroplić roztwór tropikamidu 0,5% o temperaturze pokojowej. Na około pięć minut przed akwizycją należy wprowadzić znieczulenie ogólne. Bezpośrednio po tym należy podać do każdego oka roztwór hydrochlorku oksybuprokainy 0,4%, pozostawiając go przez trzy sekundy w celu znieczulenia i unieruchomienia gałek ocznych.Następnie usunąć krople i powtórzyć podawanie 10% fenylefryny oraz 0,5% tropikamidu. Gdy oczy będą wystarczająco rozszerzone do obrazowania, nawilżyć je lepkimi kroplami do oczu na bazie glikolu w celu zapewnienia nawodnienia rogówki, a mysz zawinąć w arkusz gazy chirurgicznej, aby utrzymać jej ciepłotę. Za pomocą gąbki lub knotka bawełnianego nanieść cienką warstwę żelu oftalmologicznego z dodatkiem 0,3% hypromellose na każde oko.Podczas wykonywania tej czynności odsuń rzęsy i wibrysy. Umieść mysz w kasecie tak, aby głowa była wyprostowana i skierowana do przodu, a następnie ostrożnie włóż listwę do przytrzymania w pysk. Pod bok zwierzęcia, od strony badanego oka, włóż wałek bawełniany.Następnie, trzymając klips końcówki celowniczej na soczewce dedykowanej dla myszy, obracaj śrubę translatora z w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby przybliżyć soczewkę do oka. Ustaw pozycję myszy, obracając i obracając kasetę oraz kręcąc rurką gryzową i śrubami translatora x, aż badane oko zostanie ustawione tak, aby patrzyło bezpośrednio w soczewkę. Gdy oś optyczna oczu i soczewki zostaną wyrównane, wybierz pierwsze skanowanie w badaniu.Kliknij start aiming i użyj śruby translatora osi z, aby przemieścić siatkówkę w pionie w lewym panelu oraz w poziomie w prawym panelu. Poprzez obracanie kasety przesuń tarczę nerwu wzrokowego w górę lub w dół, aby umieścić ją na środku prawego panelu. Użyj śruby listwy zaciskowej, aby wyprostować siatkówkę w prawym panelu, a następnie obróć kasetę, aby ustawić tarczę nerwu wzrokowego na środku lewego panelu.Następnie należy użyć śruby translacyjnej x, aby wypoziomować siatkówkę w lewym panelu, a następnie – pamiętając o głównej funkcji każdego modulatora – dalej dostosować położenie siatkówki w celu idealnego wycentrowania na głowie nerwu wzrokowego. Gdy siatka znajdzie się w odpowiedniej pozycji, należy kliknąć „start snapshot”, aby rozpocząć skanowanie metodą optycznej koherentnej tomografii w dziedzinie widmowej. Należy pamiętać o zapisaniu skanu oraz raportu.W razie potrzeby skoryguj centrowanie. Po zakończeniu skanowania wycofaj soczewkę i ustaw drugie oko zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po zeskanowaniu drugiego oka wyjmij mysz z kasety, nałóż do każdego oka żel oftalmiczny z 0,3% hypromellose i umieść mysz na płycie grzewczej pod nadzorem aż do pełnego wybudzenia.Aby skupić się na komórkach zwojowych siatkówki, należy użyć makra MRI retina tool stworzonego dla programu Image J. Otwórz narzędzie MRI retina tool, zmodyfikuj narzędzie do zaznaczania wielokątów i załaduj interesujący obraz. Kliknij M, aby rozpocząć pomiar, a następnie kliknij E, aby dostosować pozycję poziomą. Wybierz pierwszą kasetkę w nowo otwartym oknie menedżera obszarów zainteresowania (region of interest manager).Kliknij niebieski wielokąt, a następnie klikaj krawędzie mierzonej warstwy na obrazie, aby dostosować położenie pierwszej kasety. Wybierz drugą kasetę w oknie menedżera obszarów zainteresowania i dostosuj jej położenie. Następnie kliknij R, aby ponownie zmierzyć siatkówkę i wyświetlić wyniki w oknie pomiarów.Mimo że jakość skanu OCT w dziedzinie widma nie jest tak wysoka jak w przypadku obrazu przekroju poprzecznego siatkówki, OCT pozwala na wizualizację większej liczby warstw. Warstwy siatkówki są łatwo mierzalne w skanie OCT i obejmują warstwę włókien nerwowych siatkówki i komórek zwojowych, warstwę jądrową wewnętrzną, warstwę splotowatą zewnętrzną, warstwę jądrową zewnętrzną, warstwy segmentów wewnętrznego i zewnętrznego, nabłonek barwnikowy siatkówki oraz naczyniówkę, co umożliwia kompleksowe badanie całej siatkówki. Przedstawiony pomiar grubości siatkówki za pomocą OCT wskazuje, że u samic myszy z genetyczną mutacją OPA1 z upośledzeniem widzenia występuje postępowe pogrubienie kompleksu komórek zwojowych oraz okołopapilarnych warstw włókien nerwowych siatkówki.Porównanie grubości włókien nerwowych siatkówki w warstwie komórek zwojowych przy użyciu standardowych i domowej roboty suwmiark, wykazuje, że suwmiarki standardowe mierzą znacznie mniejszą grubość niż suwmiarki domowej roboty, ponieważ są one znacznie grubsze i trudniej je ustawić na krawędzi cienkiej warstwy. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje 15 minut, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po opracowaniu, OCT utorowała drogę badaczom w dziedzinie okulistyki do analizy zmian strukturalnych w siatkówce myszy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadaćH dobrą wiedzę na temat przeprowadzania i analizy obrazowania OCT komórek zwojowych siatkówki u myszy.

optical-coherence-tomography-imaging-mouse-retinal-ganglion-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje technikę obrazowania in vivo do wykrywania i ilościowego określania stanu zapalnego oka w mysim modelu poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Technika ta, znana jako optyczna tomografia koherentna (OCT), generuje obrazy przekroju poprzecznego oka o wysokiej rozdzielczości w celu oceny postępu choroby.

Obrazowanie optycznej koherentnej tomografii do oceny zapalenia błony naczyniowej oka w modelu mysim

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy.  J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu...

Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Przedstawiono szczegółowy protokół oceny odczytów strukturalnych i wizualnych u gryzoni za pomocą optycznej koherentnej tomografii i odpowiedzi optokinetycznej. Wyniki dostarczają cennych informacji dla badań okulistycznych i neurologicznych.

Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Poznaj nieinwazyjną tomografię koherentną SD-OCT do obrazowania komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo. Ta metoda umożliwia szybką i precyzyjną ocenę grubości siatkówki w badaniach neuropatii wzrokowej.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Przeglądaj więcej filmów