Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wykorzystanie optycznej koherentnej tomografii (OCT) do szybkiego uzyskania dokładnej oceny grubości siatkówki. OCT może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, takie jak neuropatia nerwu wzrokowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona nieinwazyjną metodę wykrywania zmian strukturalnych w komórkach zwojowych siatkówki myszy.

Ta technika jest niezwykle interesująca, ponieważ stanowi nieinwazyjną, bezpieczną i uznaną metodę badania efektów leczenia neuropatii nerwu wzrokowego. Na początek należy dostosować ustawienia ramienia referencyjnego do odpowiedniej soczewki. Następnie należy włączyć zasilacz oraz komputer.

Po przygotowaniu komputera uruchom program do obrazowania. Utwórz nowe badanie kliniczne i dodaj żądane protokoły. Przejdź do sekcji badania pacjenta i ustaw wartości domyślne badania.

W sekcji badań pacjentów kliknij „dodaj pacjenta”, aby dodać nowego pacjenta i wprowadzić odpowiednie informacje o nim. Następnie kliknij „dodaj badanie”, „rozpocznij badanie” i dodaj z listy zaprogramowane skany, aby wybrać pożądany protokół, zaczynając od oka, które zostanie zmierzone w pierwszej kolejności. Na co najmniej 15 minut przed akwizycją danych zakropl do każdego oka wszystkich badanych myszy krople 10% fenylefryny o temperaturze pokojowej.

Następnie należy usunąć nadmiar odczynnika i zakroplić roztwór tropikamidu 0,5% o temperaturze pokojowej. Na około pięć minut przed akwizycją należy wprowadzić znieczulenie ogólne. Bezpośrednio po tym należy podać do każdego oka roztwór hydrochlorku oksybuprokainy 0,4%, pozostawiając go przez trzy sekundy w celu znieczulenia i unieruchomienia gałek ocznych.

Następnie usunąć krople i powtórzyć podawanie 10% fenylefryny oraz 0,5% tropikamidu. Gdy oczy będą wystarczająco rozszerzone do obrazowania, nawilżyć je lepkimi kroplami do oczu na bazie glikolu w celu zapewnienia nawodnienia rogówki, a mysz zawinąć w arkusz gazy chirurgicznej, aby utrzymać jej ciepłotę. Za pomocą gąbki lub knotka bawełnianego nanieść cienką warstwę żelu oftalmologicznego z dodatkiem 0,3% hypromellose na każde oko.

Podczas wykonywania tej czynności odsuń rzęsy i wibrysy. Umieść mysz w kasecie tak, aby głowa była wyprostowana i skierowana do przodu, a następnie ostrożnie włóż listwę do przytrzymania w pysk. Pod bok zwierzęcia, od strony badanego oka, włóż wałek bawełniany.

Następnie, trzymając klips końcówki celowniczej na soczewce dedykowanej dla myszy, obracaj śrubę translatora z w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby przybliżyć soczewkę do oka. Ustaw pozycję myszy, obracając i obracając kasetę oraz kręcąc rurką gryzową i śrubami translatora x, aż badane oko zostanie ustawione tak, aby patrzyło bezpośrednio w soczewkę. Gdy oś optyczna oczu i soczewki zostaną wyrównane, wybierz pierwsze skanowanie w badaniu.

Kliknij start aiming i użyj śruby translatora osi z, aby przemieścić siatkówkę w pionie w lewym panelu oraz w poziomie w prawym panelu. Poprzez obracanie kasety przesuń tarczę nerwu wzrokowego w górę lub w dół, aby umieścić ją na środku prawego panelu. Użyj śruby listwy zaciskowej, aby wyprostować siatkówkę w prawym panelu, a następnie obróć kasetę, aby ustawić tarczę nerwu wzrokowego na środku lewego panelu.

Następnie należy użyć śruby translacyjnej x, aby wypoziomować siatkówkę w lewym panelu, a następnie – pamiętając o głównej funkcji każdego modulatora – dalej dostosować położenie siatkówki w celu idealnego wycentrowania na głowie nerwu wzrokowego. Gdy siatka znajdzie się w odpowiedniej pozycji, należy kliknąć „start snapshot”, aby rozpocząć skanowanie metodą optycznej koherentnej tomografii w dziedzinie widmowej. Należy pamiętać o zapisaniu skanu oraz raportu.

W razie potrzeby skoryguj centrowanie. Po zakończeniu skanowania wycofaj soczewkę i ustaw drugie oko zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po zeskanowaniu drugiego oka wyjmij mysz z kasety, nałóż do każdego oka żel oftalmiczny z 0,3% hypromellose i umieść mysz na płycie grzewczej pod nadzorem aż do pełnego wybudzenia.

Aby skupić się na komórkach zwojowych siatkówki, należy użyć makra MRI retina tool stworzonego dla programu Image J. Otwórz narzędzie MRI retina tool, zmodyfikuj narzędzie do zaznaczania wielokątów i załaduj interesujący obraz. Kliknij M, aby rozpocząć pomiar, a następnie kliknij E, aby dostosować pozycję poziomą. Wybierz pierwszą kasetkę w nowo otwartym oknie menedżera obszarów zainteresowania (region of interest manager).

Kliknij niebieski wielokąt, a następnie klikaj krawędzie mierzonej warstwy na obrazie, aby dostosować położenie pierwszej kasety. Wybierz drugą kasetę w oknie menedżera obszarów zainteresowania i dostosuj jej położenie. Następnie kliknij R, aby ponownie zmierzyć siatkówkę i wyświetlić wyniki w oknie pomiarów.

Mimo że jakość skanu OCT w dziedzinie widma nie jest tak wysoka jak w przypadku obrazu przekroju poprzecznego siatkówki, OCT pozwala na wizualizację większej liczby warstw. Warstwy siatkówki są łatwo mierzalne w skanie OCT i obejmują warstwę włókien nerwowych siatkówki i komórek zwojowych, warstwę jądrową wewnętrzną, warstwę splotowatą zewnętrzną, warstwę jądrową zewnętrzną, warstwy segmentów wewnętrznego i zewnętrznego, nabłonek barwnikowy siatkówki oraz naczyniówkę, co umożliwia kompleksowe badanie całej siatkówki. Przedstawiony pomiar grubości siatkówki za pomocą OCT wskazuje, że u samic myszy z genetyczną mutacją OPA1 z upośledzeniem widzenia występuje postępowe pogrubienie kompleksu komórek zwojowych oraz okołopapilarnych warstw włókien nerwowych siatkówki.

Porównanie grubości włókien nerwowych siatkówki w warstwie komórek zwojowych przy użyciu standardowych i domowej roboty suwmiark, wykazuje, że suwmiarki standardowe mierzą znacznie mniejszą grubość niż suwmiarki domowej roboty, ponieważ są one znacznie grubsze i trudniej je ustawić na krawędzi cienkiej warstwy. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje 15 minut, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po opracowaniu, OCT utorowała drogę badaczom w dziedzinie okulistyki do analizy zmian strukturalnych w siatkówce myszy.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadaćH dobrą wiedzę na temat przeprowadzania i analizy obrazowania OCT komórek zwojowych siatkówki u myszy.