Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo
22 września 2017
Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykorzystanie optycznej koherentnej tomografii lub OCT do szybkiego uzyskania dokładnej oceny grubości siatkówki. OCT może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny okulistyki, takie jak neuropatia nerwu wzrokowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to nieinwazyjna metoda wykrywania zmian strukturalnych w komórkach zwojowych siatkówki myszy.
Ta technika jest naprawdę interesująca, ponieważ jest to nieinwazyjna, bezpieczna i renomowana metoda testowania efektu leczenia w neuropatii nerwu wzrokowego. Aby rozpocząć, najpierw dostosuj ustawienia ramienia referencyjnego odpowiednie dla obiektywu. Następnie włącz zasilacz i komputer.
Gdy komputer będzie gotowy, uruchom program do obrazowania. Utwórz nowe badanie kliniczne i dodaj żądane protokoły. Przejdź do sekcji badania pacjenta i ustaw domyślne ustawienia egzaminu.
Kliknij przycisk Dodaj pacjenta w sekcji badania pacjenta, aby dodać nowego pacjenta i wprowadzić odpowiednie informacje o pacjencie. Następnie kliknij, dodaj badanie, rozpocznij egzamin i dodaj wstępnie ustawione skany z listy, aby wybrać żądany protokół, zaczynając od oka, które zostanie zmierzone jako pierwsze. Co najmniej 15 minut przed pozyskaniem danych wlej krople 10% fenylefryny o temperaturze pokojowej do każdego oka wszystkich myszy, które będą badane.
Następnie usuń nadmiar odczynnika i wlej krople 0,5% tropikamidu o temperaturze pokojowej. Na około pięć minut przed pobraniem należy wywołać znieczulenie ogólne. Natychmiast po tym należy podać 0,4% chlorowodorek oksybuprokainy do każdego oka, pozostawiając roztwór na miejscu na trzy sekundy w celu znieczulenia i unieruchomienia oczu.
Następnie usuń krople i powtórz instalację 10% fenylefryny i 0,5% tropikamidu. Gdy oczy są wystarczająco rozszerzone do obrazowania, nasmaruj je lepkimi kroplami do oczu na bazie glikolu, aby zapewnić nawilżenie rogówki i owiń mysz w arkusz gazy chirurgicznej, aby utrzymać ją w cieple. Za pomocą gąbki lub bawełnianego nałóż cienką warstwę żelu okulistycznego uzupełnionego 0,3% hypromelozą na każde oko.
Robiąc to, odłóż rzęsy i wąsy na bok. Umieść mysz w kasecie z głową wyprostowaną i skierowaną do przodu i ostrożnie umieść pręt gryzący w pysku. Umieść bawełnianą rolkę pod bokiem zwierzęcia na badane oko.
Następnie, trzymając klips na końcówce celowniczej na soczewce specyficznej dla myszy, obróć translatora z w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zbliżyć soczewkę do oka. Ustaw pozycję myszy, obracając i obracając kasetę oraz obracając belkę gryzącą i x-translatora, aż eksperymentalne oko zostanie ustawione tak, aby patrzeć bezpośrednio w obiektyw. Gdy oś optyczna oczu i soczewka są wyrównane, wybierz pierwszy skan w badaniu.
Kliknij rozpocznij celowanie i użyj z-translator, aby przesunąć siatkówkę w pionie w lewym panelu i poziomo w prawym panelu. Obracając kasetę, przesuń głowicę nerwu wzrokowego w górę lub w dół, aby znalazła się na środku prawego panelu. Użyj paska gryzowego, aby wyprostować siatkówkę w prawym panelu i obróć kasetę, aby ustawić głowę nerwu wzrokowego na środku lewego panelu.
Następnie użyj x-translator, aby wypoziomować siatkówkę w lewym panelu i mając na uwadze główną funkcję każdego modulatora, dostosuj położenie siatkówki, aby uzyskać idealną centralizację na głowie nerwu wzrokowego. Gdy siatkówka znajdzie się na swoim miejscu, kliknij przycisk rozpocznij migawkę, aby rozpocząć skanowanie optycznej tomografii koherentnej w domenie spektralnej. Nie zapomnij zapisać skanu i raportu.
W razie potrzeby dostosuj centralizację. Po zakończeniu skanowania schowaj obiektyw i ustaw drugie oko, jak pokazano poniżej. Po zeskanowaniu drugiego oka wyjmij mysz z kasety, nałóż żel okulistyczny z 0,3% hypromelozą na każde oko i umieść mysz na płycie grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia.
Aby skupić się na komórkach zwojowych siatkówki, użyj makra narzędzia MRI retina tool utworzonego dla obrazu J.Otwórz narzędzie MRI retina and modify polygon selection tool i załaduj interesujący Cię obraz. Kliknij M, aby rozpocząć pomiar, a następnie kliknij E, aby dostosować położenie poziome. Wybierz pierwszą kasetę w nowo otwartym oknie menedżera obszarów zainteresowania.
Kliknij niebieski wielokąt i kliknij obramowania mierzonej warstwy na obrazku, aby dostosować położenie pierwszej kasety. Wybierz drugą kasetę w oknie menedżera obszaru zainteresowania i dostosuj drugą kasetę. Następnie kliknij R, aby ponownie zmierzyć siatkówkę i wyświetlić wyniki w oknie pomiarów.
Mimo że jakość skanu OCT w domenie spektralnej nie jest tak dobra, jak w przypadku obrazu przekroju poprzecznego siatkówki, OCT pozwala na wizualizację większej liczby warstw. Warstwy siatkówki można łatwo zmierzyć w skanowaniu OCT i obejmują włókno nerwowe siatkówki w warstwach komórek zwojowych, wewnętrzną warstwę jądrową, zewnętrzną warstwę splotowatą, zewnętrzną warstwę jądrową, wewnętrzne i zewnętrzne warstwy segmentów, nabłonek barwnikowy siatkówki i naczyniówkę, umożliwiając kompleksowe badanie całej siatkówki. Właśnie wykazano, że pomiar grubości siatkówki OCT wskazuje, że niedowidzące, genetycznie zmutowane samice myszy OPA1 wykazują postępujące pogrubienie kompleksu komórek zwojowych i warstw włókien nerwowych siatkówki okołobrodawkowatej.
Porównanie grubości warstwy komórek nerwowych siatkówki w siatkówce przy użyciu standardowych i domowych suwmiarek pokazuje, że standardowe suwmiarki mają znacznie mniejszą grubość niż suwmiarki domowej roboty, ponieważ standardowe suwmiarki są znacznie grubsze i trudniejsze do umieszczenia na cienkiej warstwie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jego opracowaniu, OCT utorował drogę naukowcom w dziedzinie okulistyki do analizy zmian strukturalnych w siatkówce myszy.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać i analizować obrazowanie OCT dla komórek zwojowych siatkówki u myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy z wykorzystaniem wysokorozdzielczej optycznej koherentnej tomografii w dziedzinie spektralnej (SD-OCT). Koncentrując się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w obszarze okołopawilarnym, zastosowano w nim różnorodne podejścia do skanowania i kwantyfikacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Okulistyka
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Optyczna koherentna tomografia (OCT) jest nieinwazyjną techniką obrazowania.
- Pozwala ona na ocenę grubości siatkówki oraz zmian strukturalnych.
- Komórki zwojowe siatkówki mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia neuropatii optycznej.
- Metoda ta jest bezpieczna i uznana w badaniu efektów leczenia.
Cel badania
- Aby przedstawić protokół obrazowania komórek zwojowych siatkówki myszy.
- Aby dokładnie i szybko ocenić grubość siatkówki.
- Aby zbadać znaczenie tych metod dla badań nad neuropatią nerwu wzrokowego.
Zastosowane metody
- Regulacja ustawień ramienia referencyjnego dla soczewki.
- Wykorzystanie wysokorozdzielczej optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej.
- Skanowanie obszaru okołopapilarnego siatkówki.
- Kwantyfikacja charakterystyki komórek zwojowych siatkówki.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie komórek zwojowych siatkówki in vivo.
- Wykazanie skuteczności SD-OCT w ocenie grubości siatkówki.
- Dostarczenie informacji na temat zmian strukturalnych związanych z neuropatią nerwu wzrokowego.
- Potwierdzenie nieinwazyjnego charakteru tej techniki.
Wnioski
- Protokół oferuje niezawodną metodę obrazowania siatkówki.
- Usprawnia on zrozumienie stanu zdrowia komórek zwojowych siatkówki.
- Technika ta może pomóc w ocenie metod leczenia neuropatii nerwu wzrokowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Optyczna koherentna tomografia (OCT) zapewnia nieinwazyjną, wysokorozdzielczą metodę podłużnej oceny integralności komórek zwojowych siatkówki (RGC) in vivo, umożliwiając wczesne wykrywanie zmian strukturalnych w modelach neuropatii nerwu wzrokowego. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przedklinicznych programach okulistycznych, pozwalając na powtarzalne, ilościowe monitorowanie interwencji terapeutycznych bez konieczności przeprowadzania histologii końcowej. Technika ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu, dostarczając przekładalnych, opartych na obrazowaniu punktów końcowych, które korelują z przeżywalnością RGC i integralnością aksonalną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie grubości warstwy RGC oraz zmian w oko-tarczałowej warstwie włókien nerwowych w genetycznych modelach neuropatii optycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybkie, powtarzalne obrazowanie in vivo, co zmniejsza zależność od histologii końcowej i przyspiesza harmonogramy screeningu fenotypowego.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych dzięki obiektywnym, podłużnym pomiarom strukturalnej neurodegeneracji lub ochrony.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Generuje zestandaryzowane, ilościowe pomiary grubości siatkówki, odpowiednie do wysokoprzepustowego przesiewu związków ukierunkowanych na przeżywalność RGC.
- Powtarzalność: Ilościowa analiza z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego suwmiarki poprawia precyzję pomiaru cienkich warstw siatkówki, zwiększając czułość analizy oraz spójność między eksperymentami.
- Skalowalność: Krótki czas akwizycji (~15 minut na mysz) umożliwia przesiew o umiarkowanej przepustowości w procesach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia bezpośrednie porównanie punktów końcowych struktury między modelami przedklinicznymi a klinicznymi ocenami OCT w badaniach nad neuropatią nerwu wzrokowego.
- Dopasowanie biomarkerów: Grubość warstwy włókien nerwowych siatkówki oraz kompleksu komórek zwojowych służą jako mierzalne biomarkery stanu zdrowia RGC oparte na obrazowaniu.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Podłużne dane OCT informują decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), wykazując zaangażowanie celu i efekt biologiczny w czasie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Obrazowanie OCT wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od walidacji celu, przez identyfikację wiodących związków, aż po przedkliniczne badania skuteczności, zapewniając nieterminalny, ilościowy odczyt w badaniach nad neurodegeneracją i ochroną siatkówki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków przeżycia RGC poprzez umożliwienie fenotypowania strukturalnego in vivo modeli zmutowanych i leczonych.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników (grubość siatkówki, parametry specyficzne dla poszczególnych warstw), które ułatwiają porównywanie związków i walidację trafień.
- Analityka: Generuje mierzalne punkty końcowe o charakterze statystycznym (grubość warstw mierzona za pomocą standardowych lub wykonanych własnoręcznie suwmiark), co pozwala na porównania międzygrupowe i obliczenie wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Łączy przedkliniczne zmiany strukturalne z klinicznymi biomarkerami OCT, wspierając modelowanie prognostyczne skuteczności terapeutycznej.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: Stanowi wielokrotnego użytku platformę obrazową, którą można zastosować w wielu modelach chorób okulistycznych i różnych formach terapii.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniej, podłużnej wizualizacji integralności warstwy RGC.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację między laboratoriami dzięki zdefiniowanym protokołom skanowania i mierzalnym metodom analizy.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego zakończenia badań nad nieskutecznymi kandydatami na podstawie punktów końcowych o charakterze strukturalnym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając obiektywnych danych na temat modyfikacji choroby lub neuroprotekcji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obrazowania okulistycznego, pracy z zwierzętami oraz obsługi systemu OCT.
- Zależność od aparatury OCT w domenie widmowej z odpowiednimi soczewkami kompatybilnymi z myszami oraz oprogramowaniem.
- Konieczność standaryzacji procedur znieczulenia, rozszerzania źrenic i przygotowania oka dla wszystkich użytkowników.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują dostosowanie protokołów skanowania i metod ilościowych dla różnych obszarów siatkówki lub warstw komórkowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują proces nauki precyzyjnej segmentacji siatkówki oraz potrzebę dokładnej kalibracji podczas analizy cienkich struktur, takich jak warstwa włókien nerwowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Pre-imaging Preparation
7:35
Conclusion
1:51
Mouse Preparation
4:43
Spectral Domain-optical Coherence Tomography (SD-OCT) Optical Nerve Head (ONH) and Retina Imaging
5:31
Analysis
6:25
Results: Representative Retinal Scanning and Analysis
2:40
Mouse Surgical Preparation
