Name: -on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metodę PIP-on-a-chip do bezetykietowego badania interakcji białko-fosfoinozytydowych na platformie mikroprzepływowej. Technika ta umożliwia ilościową analizę w fizjologicznie istotnych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.S. i C.E.C. były częściowo wspierane przez granty AI053531 (NIAID, NIH); S.S i P.S.C. otrzymały wsparcie w ramach grantu N00014-14-1-0792 (ONR).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Każdy wariant, choć w niskich stężeniach, jest obecny na powierzchni cytozolowej określonych organelli, gdzie przyczynia się do ustalenia unikalnego składu fizycznego i swoistości funkcjonalnej błony organellarnej1. Jednym z najważniejszych zastosowań jest swoista platforma dokująca dla wielu białek wymagających określonej lokalizacji subkomórkowej i/lub aktywacji 6,7. Ze względu na ich rolę w fizjologii i chorobie komórkowej ważna jest mo...

Niezliczone interakcje i procesy biochemiczne zachodzą na dwuwymiarowo płynnych powierzchniach membran. Organelle otoczone błoną w komórkach eukariotycznych są wyjątkowe nie tylko pod względem procesów biochemicznych i związanego z nimi proteomu, ale także pod względem składu lipidowego. Jedną z wyjątkowych klas fosfolipidów są fosfoinozytydy (). Mimo że stanowią one tylko 1% lipidomu komórkowego, odgrywają kluczową rolę m.in. w transdukcji sygnału, autofagii i transporcie błonowym1,2,3,4. Dynamiczna fosforylacja grupy głównej inozytolu przez komórkowe kinazy prowadzi do powstania siedmiu grup głównych, które są mono-, bis- lub tris-fosforylowane5. Ponadto definiują subkomórkową tożsamość błon i służą jako wyspecjalizowane miejsca dokowania błon dla białek/enzymów zawierających jedną lub więcej domen wiążących fosfoinozytyd, na przykład Homologia Pleckstrin (PH), Homologia Phox (PX) i Homologia N-końcowa epsyny (ENTH)6,7. Jedną z najlepiej zbadanych domen wiążących jest domena PH fosfolipazy C (PLC)-δ1, która specyficznie oddziałuje z 4,5-bisfosforanem fosfatydyloinozytolu (PI(4,5)P2) w zakresie wysokiego powinowactwa nanomolowego i niskiego mikromolowego8,9,10,11.
Różnorodne jakościowe i ilościowe metody in vitro zostały opracowane i wykorzystane do badania mechanizmu, termodynamiki i specyfiki tych oddziaływań. Do najczęściej stosowanych testów wiązania należą powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), kalorymetria izotermiczna (ITC), spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), test flotacji/sedymentacji liposomów oraz plamy lipidowe (Fat-blots/-strips)12,13. Mimo że są one szeroko stosowane, wszystkie mają wiele wad. Na przykład SPR, ITC i NMR wymagają dużych ilości próbek, drogiego oprzyrządowania i/lub przeszkolonego personelu12,13. Niektóre formaty testów, takie jak bloty lipidowe oparte na przeciwciałach, wykorzystują rozpuszczalne w wodzie formy i prezentują je w sposób niefizjologiczny12,14,15,16. Ponadto nie można wiarygodnie określić ilościowo pęcherzy lipidowych i często prowadzą one do obserwacji fałszywie dodatnich/negatywnych12,17,18. Aby sprostać tym wyzwaniom i ulepszyć obecny zestaw narzędzi, opracowano nową metodę bezznacznikową opartą na wspieranej dwuwarstwie lipidowej (SLB) w kontekście platformy mikroprzepływowej, która została z powodzeniem zastosowana do badania interakcji białko-(<silna klasa="xfig">Rysunek 1)<klasa sup="xref">19.
Strategia stosowana do wykrywania interakcji białko-opiera się na wykrywaniu modulacji pH. Obejmuje to barwnik wrażliwy na pH, który ma ortosulodaminę B (oSRB) bezpośrednio sprzężoną z lipidem fosfatydyloetanoloaminy head group20. Sonda SRB-POPE (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2A) jest wysoce fluorescencyjna przy niskim pH i wygaszona przy wysokim pH z pKa około 6,7 w granicach 7,5% mol% PI(4,5)P2-zawierających SLB (<klasa silna = "xfig">Rysunek 5B). Domena PH PLC-δ1 była szeroko stosowana do walidacji metodologii wiązania białka-ze względu na jej wysoką specyficzność w stosunku do PI(4,5)P2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A)21,22,23,24,25. W związku z tym doszliśmy do wniosku, że domena PH PLC-δ1 może być wykorzystana do przetestowania jej wiązania z PI(4,5)P2 za pomocą testu-on-a-chip. Konstrukt domeny PH użyty w tym badaniu ma dodatni ładunek netto (pI 8,4), a zatem przyciąga jony OH- (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C). Po związaniu się z SLB zawierającymi PI(4,5)P2, domena PH przenosi jony OH- na powierzchnię błony, co z kolei moduluje potencjał międzyfazowy i zmienia stan protonacji oSRB-POPE (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5C)26. W funkcji stężenia w domenie PH fluorescencja jest wygaszana (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A). Wreszcie, znormalizowane dane są dopasowane do izotermy wiążącej w celu określenia powinowactwa interakcji domeny PH-PI(4,5)P2 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6B, 6C).
W tym badaniu dostarczono szczegółowy protokół do wiązania białek z SLB zawierającymi w ramach platformy mikroprzepływowej. Protokół ten prowadzi czytelnika od złożenia urządzenia mikroprzepływowego i przygotowania pęcherzyków do tworzenia SLB i wiązania białek. Ponadto podano wskazówki dotyczące analizy danych w celu wyodrębnienia informacji o powinowactwie dla interakcji PLC-δ1 PH domain-PI(4,5)P2.

<table><tbody><tr><td><mocne>Szkiełko nakrywkowe</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szklane Szkiełka nakrywkowe: prostokątne</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544B</td><td>22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, nr 1 1/2; Szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>7X Roztwór czyszczący</td><td>MP Biomedicals</td><td>976670</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Naczynie krystalizujące PYREX</td><td>Corning</td><td>3140-190</td><td>Naczynie ze szkła borokrzemianowego z płaskim dnem; Średnica x wysokość (190 x 100 mm); Dystrybutor: VWR (89090-700)</td></tr><tr><td>Sentry Xpress 2.0</td><td>Paragon Industries</td><td>SC-2</td><td></td></tr> <tr><td>PiecNazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>polidimetylosiloksan (PDMS); Dystrybutor: Ellsworth Adhesives</td></tr><tr><td>PYREX Eksykator</td><td>VWR</td><td>89134-402</td><td>Próżniowy</td></tr><tr><td>dziurkacz do biopsji</td><td>Harris</td><td>15110-10</td><td>Harris Uni-Core; średnica 1,0 mm; Dziurkacz do biopsji Miltex z tłokiem (Kat. Nr 15110-10) może być stosowany jako alternatywa</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaning System</td><td>PlasmaEtch</td><td>PE25-JW</td><td>2-stopniowa pompa próżniowa oleju z napędem bezpośrednim, Usługa O2 (Krytox Charged)</td></tr><tr>Cyfrowy <td>test porównawczy</td> <td>płyty grzejnej</td><td>H3760-H</td><td>zakupiony za pośrednictwem Denville Scientific (Kat. Nr 1005640)</td></tr><tr><td>Matowe mikroprowadnice</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Matowe, wyselekcjonowane i wstępnie oczyszczone; Wykonany ze szwajcarskiego szkła; Grubość: 1 mm; Wymiary: 75 x 25 mm; GR 144</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD Autodesk</td><td></td><td>v.2016</td><td>Oprogramowanie kreślarskie do projektowania fotomaski</td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Art Services</td><td>N/A</td><td>Projekt z czarnym tłem i wyraźnymi elementami został wydrukowany w rozdzielczości 20k dpi na przezroczystej masce (5 x 7 cali) przez CAD/Art</td></tr><tr><td>Services Silicone Wafers</td><td>University Wafer</td><td>1575</td><td>Prime Grade, jednostronnie polerowany; Średnica 100 mm (4 cale); Grubość 525 um</td></tr><tr><td>SU-8 50</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Fotorezystor o tonie ujemnym; Penn State Nanofabrication Facility Property</td></tr><tr><td>SU-8 Deweloper</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Penn State Nanofabrication Facility Nieruchomość</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>SUV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydyloinozytol-4-fosforan</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840045X</td><td>PI4P</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydyloinozytol-4,5-bisfosforan</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td>PI(4,5)P2</td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td>POPE; Wymagane do syntezy oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Lissamine Rodamine B Sulfonyl Chloride (mieszane izomery)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-20</td><td>Wymagane do syntezy oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Fluorescencyjna sonda lipidowa wrażliwa na pH (oSRB-POPE)</td><td>Własna</td> synteza <td>n/A</td><td>we własnym zakresie (Huang D. i in. 2013)</td></tr><tr><td>Szklana fiolka scyntylacyjna</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td>Pojemność 20 ml</td></tr><tr><td>Aquasonic 250D</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>Ultradźwiękowe</td></tr><tr><td>membrany nukleporowe</td> w kąpieli wodnej <td>Whatman</td><td>110605</td><td>Membrana poliwęglanowa; Średnica: 25 mm; Wielkość porów: 0,1 μm; Dystrybutor: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>CX1054-6</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>grade LIPEX Extruder</td><td>Transferra Nanosciences</td><td>T.001</td><td>LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder</td></tr><tr><td>Viscotek 802 DLS</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td>Dynamiczne rozpraszanie światła; Zakład krystalografii rentgenowskiej w Penn State Właściwość</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Analiza danych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism GraphPad</td><td>Software</td><td>v.6</td><td>Oprogramowanie do dopasowywania krzywych do analizy danych</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Mikroskop epifluorescencyjny</td> Carl <td>Zeiss Mikroskopia</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop AxioCam MRm Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Nie dotyczy</td><td>Kamera</td></tr><tr><td>X-Cite 120</td><td>Excelitas Technologies</td><td>Nie dotyczy</td><td>Źródło światła</td></tr><tr><td>Alexa 568 Zestaw filtrów</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Ex/Em 576/603 nm</td></tr><tr><td>AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Oprogramowanie</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td> Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Inne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>VWR</td><td>10034-132</td><td>Końcówki do pipet 200 μL; Cienka i gładka końcówka do nakładania roztworu białkowego do kanału mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Końcówki</td><td>VWR</td><td>53509-070</td><td>10 μL; Cienka i gładka końcówka do nakładania roztworu pęcherzykowego do kanału mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Miernik pH Orion Star A321</td><td>Termo Scientific</td><td>STARA3210</td><td>pH-metr</td></tr><tr><td>Mikrosonda pH Orion Termo</td><td>Scientific</td><td>8220BNWP</td><td>mikrosonda pH</td></tr><tr><td>N-(2-hydroksyetylo)-piperazyno-N'-(kwas 2-etanosulfonowy)</td><td>VWR</td><td>VWRB30487</td><td>HEPES, Wolny kwas</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>VWR</td><td>BDH8014-2,5 KGR</td><td></td></tr><tr><td>Rurki</td> NaCl <td>Drut pokrewny i </td><td>TFT-200-24 N</td><td>Średnica wewnętrzna: 0,020-0,026 cala (0,051-0,066 cm); Grubość ścianki: 0,010 cala (0,025 cm); Elastyczne cienkościenne rurki z politetrafluoroetylenu; Naturalny kolor</td></tr><tr><td>Azot Gaz - Przemysłowy</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Lokalny dostawca</td></tr><tr><td>Tlen Gaz - Przemysłowy</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Lokalny dostawca</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Lokalny dostawca</td></tr></tbody></table>

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Liczne białka komórkowe oddziałują z powierzchniami błony, wpływając na podstawowe procesy komórkowe. Interakcje te mogą być skierowane na określony składnik lipidowy w błonie, jak w przypadku fosfoinozytydów (), aby zapewnić określoną lokalizację subkomórkową i/lub aktywację. i komórkowe domeny wiążące zostały szeroko przebadane, aby lepiej zrozumieć ich rolę w fizjologii komórki. Zastosowaliśmy test modulacji pH na obsługiwanych dwuwarstwach lipidowych (SLB) jako narzędzie do badania interakcji białko-. W tych badaniach do wykrywania interakcji białko-stosuje się wrażliwą na pH fosfatydyloodaminę B sprzężoną z fosfatydyloetanoloaminą. Po związaniu białka z powierzchnią błony zawierającej, potencjał międzyfazowy jest modulowany (tj. zmiana lokalnego pH), przesuwając stan protonacji sondy. Studium przypadku udanego zastosowania testu modulacji pH przedstawiono na przykładzie domeny fosfolipazy C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-δ1 PH) i interakcji fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu (PI(4,5)P2) jako przykładu. Pozorna stała dysocjacji (Kd,app) dla tej interakcji wynosiła 0,39 ± 0,05 μM, podobnie jak wartości Kd,app uzyskane przez inne. Jak wcześniej zaobserwowano, domena PH PLC-δ1 jest specyficzna dla PI(4,5)P2, wykazuje słabsze wiązanie z 4-fosforanem fosfatydyloinozytolu i brak wiązania z czystymi SLB fosfatydylocholiny. Test-on-a-chip ma przewagę nad tradycyjnymi testami wiążącymi, w tym między innymi małą objętość próbki i brak wymagań dotyczących znakowania ligandów/receptorów, możliwość testowania interakcji błonowych o wysokim i niskim powinowactwie zarówno z małymi, jak i dużymi cząsteczkami oraz lepszy stosunek sygnału do szumu. W związku z tym zastosowanie podejścia-on-a-chip ułatwi wyjaśnienie mechanizmów szerokiego zakresu oddziaływań błonowych. Co więcej, metoda ta może być potencjalnie wykorzystana do identyfikacji środków terapeutycznych, które modulują zdolność białka do interakcji z błonami.

Wykorzystaliśmy test modulacji pH do zbadania oddziaływania domeny PH białka PLC-δ1 z PI(4,5)P2 w mikro urządzeniu PIP-on-a-chip (Rysunek 1). Poprzez szczegółowy protokół zademonstrowaliśmy sposób przygotowania i montażu komponentów urządzenia mikroprzepływowego, wytwarzania małych jednowarstwowych pęcherzyków (SUVs) (Rysunek 2), tworzenia SLB wewnątrz urządzenia (Rysunek 3) oraz testowani...

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Ogólnym celem testu-on-a-chip jest ocena interakcji błon białkowych w sposób ilościowy bez znaczników. Interakcje błony białkowej są sercem tak wielu procesów zachodzących w komórce i jej patogenach, ale techniki badania tych interakcji są nieliczne. Zaletami tej techniki są mała objętość prosta, brak wymagań dotyczących znakowania ligandów lub receptorów w połączeniu z możliwością testowania interakcji błonowych w fizjologicznie istotny sposób.Wiele celów terapeutycznych wirusów to białka błonowe, badania tych docelowych białek są często przeprowadzane w roztworze przy użyciu detergentów. Nasza technika zapewnia bardziej istotną biologicznie alternatywę. Chociaż zobaczysz, że ten test jest w stanie monitorować interakcje białek z błonami, w rzeczywistości jest to dość wszechstronny test i może być używany do monitorowania interakcji błony żelaza, błony drobnocząsteczkowej, a nawet błony peptydowej.Na początek wymieszaj prepolimer polidimetylosiloksanu lub PDMS i utwardzacz w stosunku 10:1 w dużej plastikowej łodzi wagowej. Odgazowywać mieszaninę w próżni przez jedną godzinę przy natężeniu podciśnienia 500 torów lub mniejszym. Umieść silikonowy wzorzec, który zawiera wiele powtórzeń tego samego mikrowzoru SU8, w dużej plastikowej łodzi wagowej i wlej odgazowywacz PDMS, a następnie utwardź go w suchym piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia delikatnie oderwij PDMS od wzorca krzemowego za pomocą rąk. Zaznacz granice każdego mikrowzoru w prostokątach za pomocą skalpela chirurgicznego i linijki. Następnie pokrój PDMS na bloki, przebij 16 otworów na obu końcach każdego mikrokanału za pomocą stempla do biopsji, aby wykonać otwory o średnicy 1,0 milimetra.Pipeta obliczyła objętości fosfatydylocholiny, fosfatydyloinozytolu 4, 5-bisfosforanu i wrażliwej na pH sondy fluorescencyjnej do jednej szklanej fiolki wentylacyjnej o pojemności 20 mililitrów. Suszyć mieszaninę w strumieniu azotu gazowego wewnątrz dygestorium chemicznego przez 10 minut lub do momentu, gdy rozpuszczalnik odparuje, a na dnie fiolki utworzy się cienki film lipidowy. Następnie wysuszyć mieszaninę w próżni przez co najmniej trzy godziny w sile podciśnienia 10 militorów, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika organicznego.Ponownie uwodnić wysuszony film lipidowy za pomocą pięciu mililitrów buforu bieżącego, umieścić uwodniony lipid w kąpieli ultradźwiękowej z częstotliwością roboczą 35 kiloherców przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zamrozić, rozmrozić zawiesinę pęcherzyków ciekłym azotem i łaźnią wodną o temperaturze 40 stopni Celsjusza, aby uzyskać pęcherzyki jednoilaminarne. Powtórz rozmrażanie 10 razy, wytłacz zawiesinę pęcherzyków do membrany poliwęglanowej o grubości 0,1 mikrona, używając wytłaczarki lipidowej w celu wzbogacenia o małe pęcherzyki jednowarstwowe.Powtórz wytłaczanie 10 razy. Przetestuj wloty i wyloty bloku PDMS pod kątem zablokowania, tryskając dejonizowaną wodą przez otwory za pomocą butelki do mycia wodą, a następnie osusz blok PDMS gazowym azotem. Następnie umieść blok PDMS i wstępnie oczyszczoną szkiełko nakrywkowe w komorze na próbki systemu plazmy tlenowej.Wystaw blok PDMS i szkiełko nakrywkowe plazmą tlenową na 45 sekund z ustawieniami mocy na 75 watów, prędkością przepływu tlenu na 10 centymetrów sześciennych na minutę i siłą podciśnienia 200 militorów. Następnie, bezpośrednio po zabiegu plazmy tlenowej, umieść powierzchnię wzoru bloku PDMS w kontakcie ze szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie naciśnij, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza w miejscach kontaktu.Umieść urządzenie na równej płycie grzejnej w temperaturze 100 stopni Celsjusza na trzy minuty, aby wzmocnić wiązanie. Użyj mokrej, niestrzępiącej się chusteczki ze 100% etanolem, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu z górnej i dolnej części urządzenia. Następnie przyklej urządzenie do szklanego szkiełka mikroskopowego.Przenieś 100 mikrolitrów fosfatydyloinozytolu 4, 5-bisfosforanu zawierającego małe pęcherzyki jednowarstwowe do 0,65 mililitrowej probówki wirówkowej. Dostosuj pH roztworu do około 3/2, dodając 6,4 mikrolitra 0,2 normalnego kwasu solnego. Odpipetować 10 mikrolitrów roztworu małych pęcherzyków jednośladowych o dostosowanym pH do każdego kanału przez wlot i wywierać ciśnienie przez pipetę, aż roztwór dotrze do wylotu.Odłącz końcówkę od pipety i pozostaw ją przymocowaną do urządzenia. Po powtórzeniu tego kroku dla każdego kanału, inkubować urządzenie przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wstrzykiwanie pęcherzyków do mikrokanalików powinno być wykonane natychmiast po zmontowaniu urządzenia. W międzyczasie odetnij zestawy rurek doprowadzających i wylotowych za pomocą pęsety, podłącz zestaw przewodów wylotowych do urządzenia, a następnie przyklej urządzenie do stolika mikroskopu.Zanurz jeden koniec zestawu rurki wlotowej w 25 mililitrach bufora roboczego zawartego w stożkowej rurce i przyklej go taśmą, aby upewnić się, że przewód jest zabezpieczony. Za pomocą podnośnika laboratoryjnego umieść stożkową rurkę na wyższym podłożu niż urządzenie, aby przepchnąć roztwór przez mikrokanały za pomocą przepływu grawitacyjnego. Do każdej rurki wlotowej użyj strzykawki, aby pobrać jeden mililitr buforu z wolnego końca rurki.Wyjmij końcówkę pipety z wlotu i włóż wolny koniec rurki wlotowej do urządzenia. Powtórz ten proces, aby podłączyć wszystkie elementy rurki dopływowej do urządzenia. Przepływający bufor przepływający przez kanały pomaga usunąć nadmiar niepękniętych pęcherzyków i zrównoważyć dwuwarstwę do warunków eksperymentalnych.Następnie otwórz oprogramowanie sterujące mikroskopem. Na lewym panelu kliknij zakładkę mikroskopu i wybierz obiektyw 10x. Kliknij na żywo, a następnie ikony obrazu Alexa 568 na pasku narzędzi, za pomocą pokręteł precyzyjnej i zgrubnej regulacji skup się na mikrokanałach.Przeskanuj urządzenie, aby sprawdzić jakość SLB i kanałów. Następnie kliknij ikonę obrazu zamkniętej migawki FL na pasku narzędzi, kliknij kartę akwizycji i w sekcji Podstawowe korekty wybierz czas ekspozycji. Ustaw czas ekspozycji na 200 milisekund.W lewym panelu kliknij akwizycję wielowymiarową. W menu filtrów wybierz czerwony kanał. Następnie kliknij menu poklatkowe, ustaw interwał czasowy na pięć minut, czas trwania na 30 minut i menu poklatkowe.Wybierz narzędzie okrąg na karcie miary i narysuj okrąg w dowolnym kanale. Kliknij prawym przyciskiem myszy, gdy okrąg jest zaznaczony, i wybierz właściwości. Na karcie profilu zaznacz wszystkie T, aby wyświetlić intensywność fluorescencji w funkcji czasu.Upewnij się, że ta krzywa osiągnie plateau, które wskazuje równowagę, zanim przejdziesz do następnego kroku, opuść roztwór buforowy do równego gruntu co urządzenie, aby zatrzymać przepływ. Pojedynczo odłącz każdą rurkę wylotową i nałóż 200 mikrolitrów każdego rozcieńczenia białka do kanału wylotowego za pomocą pipety. Nie wywieraj żadnego nacisku, pozwól, aby grawitacja wykonała pracę.Odłącz końcówkę od pipety i pozostaw ją przymocowaną do urządzenia mikroprzepływowego. Powtórz ten proces dla każdego kanału i upewnij się, że podczas tego procesu do kanałów nie zostaną wprowadzone pęcherzyki powietrza. Następnie opuść rurkę wlotową na ziemię poniżej urządzenia mikroprzepływowego, aby rozpocząć przepływ białka przez mikrokanały.Przyklej wolny koniec rurki do pojemnika na odpady. Przepływać rozcieńczenia domeny homologii pleckstrin przez 30 minut. W lewym panelu oprogramowania, w zakładce timelapse, kliknij Start, aby ponownie rozpocząć obrazowanie.Pokazany tutaj jest reprezentatywny widok fosfatydyloinozytolu 4, 5-bisfosforanu zawierającego SLB w mikrokanałach. Przed i po, dodając domenę homologii pleckstrin we wskazanych stężeniach. Intensywności fluorescencji z linii skanowanej przez mikrokanały są wykreślane jako funkcja odległości i pikseli dla eksperymentów wiązania fosfatydylocholiny, fosforanu fosfatydyloinozytolu 4 i fosfatydyloinozytolu 4, 5-bisfosforanu.Następnie, normalizując dane wiązania z poszczególnych eksperymentów, wykreśla się je jako funkcję stężenia domeny homologii fosfolipazy C delta 1 pleckstrin i dopasowuje do izoterm wiążących, aby wyodrębnić pozorne stałe asocjacyjne. Porównanie pozornych stałych asocjacyjnych pokazuje, że domena homologii fosfolipazy C Delta 1 pleckstrin oddziałuje z fosfatydyloinozytolem 4, 5-bisfosforanem specyficznie, zgodnie z oczekiwaniami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć małe pęcherzyki jednopłynowe, tworzyć urządzenia mikroprzepływowe, formować obsługiwane dwuwarstwy lipidowe wewnątrz tych urządzeń mikroprzepływowych, jako interakcje wiążące błonę białkową, używając tego testu z naszym podejściem-on-a-chip.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak odzyskiwanie fluorescencji po wybielaniu fotograficznym, w celu oceny wpływu wiązania błony białkowej na dyfuzję boczną lipidów. Technika ta toruje drogę do badania interakcji błon białkowych z gromadzeniem się lipidów znajdujących się w komórkach zamiast pojedynczo, podejście to będzie zatem miało szeroki wpływ na biochemię i biologię komórki interakcji błon białkowych.

pip-on-chip-label-free-study-protein-phosphoinositide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.

Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Protokół tutaj opisuje interakcje oczyszczonego białka kanału jonowego hEAG1 z małocząsteczkowym ligandem lipidowym fosfatydyloinozytolem 4,5-bisfosforanem (2). Pomiar pokazuje, że BLI może być potencjalną metodą badań przesiewowych ligandów kanałów jonowych małych cząsteczek.

Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

Ten protokół skupia się na identyfikacji białek, które wiążą się z fosforanami inozytolu lub fosfonozytydami. Wykorzystuje chromatografię powinowactwa z biotynylowanymi fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami, które są unieruchamiane przez streptawidynę do agarozy lub kulek magnetycznych. Fosforan inozytolu lub białka wiążące fosfoinozytol są identyfikowane za pomocą Western blot lub spektrometrii mas.

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Opisano nowatorskie podejście umożliwiające analizę wysokiej rozdzielczości interakcji komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym (HA). Powierzchnie wzorowane są wytwarzane poprzez połączenie chemii karbodiimidowej i mikrodruku kontaktowego.

Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Spektroskopia Ramana jest odpowiednią techniką do bezkontaktowej, bezetykietowej analizy żywych komórek, konstruktów inżynierii tkankowej oraz tkanek natywnych. Specyficzne dla źródła sygnatury spektralne mogą być generowane i analizowane przy użyciu analizy wielowariancyjnej.

Bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii Ramanowskiej

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Poznaj metodę PIP-on-a-chip do bezetykietowego badania interakcji białko-fosfoinozytydowych na platformie mikroprzepływowej. Technika ta umożliwia ilościową analizę w fizjologicznie istotnych warunkach.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Przeglądaj więcej filmów