-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Ogólnym celem testu-on-a-chip jest ocena interakcji błon białkowych w sposób ilościowy bez znaczników. Interakcje błony białkowej są sercem tak wielu procesów zachodzących w komórce i jej patogenach, ale techniki badania tych interakcji są nieliczne. Zaletami tej techniki są mała objętość prosta, brak wymagań dotyczących znakowania ligandów lub receptorów w połączeniu z możliwością testowania interakcji błonowych w fizjologicznie istotny sposób.

Wiele celów terapeutycznych wirusów to białka błonowe, badania tych docelowych białek są często przeprowadzane w roztworze przy użyciu detergentów. Nasza technika zapewnia bardziej istotną biologicznie alternatywę. Chociaż zobaczysz, że ten test jest w stanie monitorować interakcje białek z błonami, w rzeczywistości jest to dość wszechstronny test i może być używany do monitorowania interakcji błony żelaza, błony drobnocząsteczkowej, a nawet błony peptydowej.

Na początek wymieszaj prepolimer polidimetylosiloksanu lub PDMS i utwardzacz w stosunku 10:1 w dużej plastikowej łodzi wagowej. Odgazowywać mieszaninę w próżni przez jedną godzinę przy natężeniu podciśnienia 500 torów lub mniejszym. Umieść silikonowy wzorzec, który zawiera wiele powtórzeń tego samego mikrowzoru SU8, w dużej plastikowej łodzi wagowej i wlej odgazowywacz PDMS, a następnie utwardź go w suchym piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia delikatnie oderwij PDMS od wzorca krzemowego za pomocą rąk. Zaznacz granice każdego mikrowzoru w prostokątach za pomocą skalpela chirurgicznego i linijki. Następnie pokrój PDMS na bloki, przebij 16 otworów na obu końcach każdego mikrokanału za pomocą stempla do biopsji, aby wykonać otwory o średnicy 1,0 milimetra.

Pipeta obliczyła objętości fosfatydylocholiny, fosfatydyloinozytolu 4, 5-bisfosforanu i wrażliwej na pH sondy fluorescencyjnej do jednej szklanej fiolki wentylacyjnej o pojemności 20 mililitrów. Suszyć mieszaninę w strumieniu azotu gazowego wewnątrz dygestorium chemicznego przez 10 minut lub do momentu, gdy rozpuszczalnik odparuje, a na dnie fiolki utworzy się cienki film lipidowy. Następnie wysuszyć mieszaninę w próżni przez co najmniej trzy godziny w sile podciśnienia 10 militorów, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika organicznego.

Ponownie uwodnić wysuszony film lipidowy za pomocą pięciu mililitrów buforu bieżącego, umieścić uwodniony lipid w kąpieli ultradźwiękowej z częstotliwością roboczą 35 kiloherców przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zamrozić, rozmrozić zawiesinę pęcherzyków ciekłym azotem i łaźnią wodną o temperaturze 40 stopni Celsjusza, aby uzyskać pęcherzyki jednoilaminarne. Powtórz rozmrażanie 10 razy, wytłacz zawiesinę pęcherzyków do membrany poliwęglanowej o grubości 0,1 mikrona, używając wytłaczarki lipidowej w celu wzbogacenia o małe pęcherzyki jednowarstwowe.

Powtórz wytłaczanie 10 razy. Przetestuj wloty i wyloty bloku PDMS pod kątem zablokowania, tryskając dejonizowaną wodą przez otwory za pomocą butelki do mycia wodą, a następnie osusz blok PDMS gazowym azotem. Następnie umieść blok PDMS i wstępnie oczyszczoną szkiełko nakrywkowe w komorze na próbki systemu plazmy tlenowej.

Wystaw blok PDMS i szkiełko nakrywkowe plazmą tlenową na 45 sekund z ustawieniami mocy na 75 watów, prędkością przepływu tlenu na 10 centymetrów sześciennych na minutę i siłą podciśnienia 200 militorów. Następnie, bezpośrednio po zabiegu plazmy tlenowej, umieść powierzchnię wzoru bloku PDMS w kontakcie ze szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie naciśnij, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza w miejscach kontaktu.

Umieść urządzenie na równej płycie grzejnej w temperaturze 100 stopni Celsjusza na trzy minuty, aby wzmocnić wiązanie. Użyj mokrej, niestrzępiącej się chusteczki ze 100% etanolem, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu z górnej i dolnej części urządzenia. Następnie przyklej urządzenie do szklanego szkiełka mikroskopowego.

Przenieś 100 mikrolitrów fosfatydyloinozytolu 4, 5-bisfosforanu zawierającego małe pęcherzyki jednowarstwowe do 0,65 mililitrowej probówki wirówkowej. Dostosuj pH roztworu do około 3/2, dodając 6,4 mikrolitra 0,2 normalnego kwasu solnego. Odpipetować 10 mikrolitrów roztworu małych pęcherzyków jednośladowych o dostosowanym pH do każdego kanału przez wlot i wywierać ciśnienie przez pipetę, aż roztwór dotrze do wylotu.

Odłącz końcówkę od pipety i pozostaw ją przymocowaną do urządzenia. Po powtórzeniu tego kroku dla każdego kanału, inkubować urządzenie przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wstrzykiwanie pęcherzyków do mikrokanalików powinno być wykonane natychmiast po zmontowaniu urządzenia. W międzyczasie odetnij zestawy rurek doprowadzających i wylotowych za pomocą pęsety, podłącz zestaw przewodów wylotowych do urządzenia, a następnie przyklej urządzenie do stolika mikroskopu.

Zanurz jeden koniec zestawu rurki wlotowej w 25 mililitrach bufora roboczego zawartego w stożkowej rurce i przyklej go taśmą, aby upewnić się, że przewód jest zabezpieczony. Za pomocą podnośnika laboratoryjnego umieść stożkową rurkę na wyższym podłożu niż urządzenie, aby przepchnąć roztwór przez mikrokanały za pomocą przepływu grawitacyjnego. Do każdej rurki wlotowej użyj strzykawki, aby pobrać jeden mililitr buforu z wolnego końca rurki.

Wyjmij końcówkę pipety z wlotu i włóż wolny koniec rurki wlotowej do urządzenia. Powtórz ten proces, aby podłączyć wszystkie elementy rurki dopływowej do urządzenia. Przepływający bufor przepływający przez kanały pomaga usunąć nadmiar niepękniętych pęcherzyków i zrównoważyć dwuwarstwę do warunków eksperymentalnych.

Następnie otwórz oprogramowanie sterujące mikroskopem. Na lewym panelu kliknij zakładkę mikroskopu i wybierz obiektyw 10x. Kliknij na żywo, a następnie ikony obrazu Alexa 568 na pasku narzędzi, za pomocą pokręteł precyzyjnej i zgrubnej regulacji skup się na mikrokanałach.

Przeskanuj urządzenie, aby sprawdzić jakość SLB i kanałów. Następnie kliknij ikonę obrazu zamkniętej migawki FL na pasku narzędzi, kliknij kartę akwizycji i w sekcji Podstawowe korekty wybierz czas ekspozycji. Ustaw czas ekspozycji na 200 milisekund.

W lewym panelu kliknij akwizycję wielowymiarową. W menu filtrów wybierz czerwony kanał. Następnie kliknij menu poklatkowe, ustaw interwał czasowy na pięć minut, czas trwania na 30 minut i menu poklatkowe.

Wybierz narzędzie okrąg na karcie miary i narysuj okrąg w dowolnym kanale. Kliknij prawym przyciskiem myszy, gdy okrąg jest zaznaczony, i wybierz właściwości. Na karcie profilu zaznacz wszystkie T, aby wyświetlić intensywność fluorescencji w funkcji czasu.

Upewnij się, że ta krzywa osiągnie plateau, które wskazuje równowagę, zanim przejdziesz do następnego kroku, opuść roztwór buforowy do równego gruntu co urządzenie, aby zatrzymać przepływ. Pojedynczo odłącz każdą rurkę wylotową i nałóż 200 mikrolitrów każdego rozcieńczenia białka do kanału wylotowego za pomocą pipety. Nie wywieraj żadnego nacisku, pozwól, aby grawitacja wykonała pracę.

Odłącz końcówkę od pipety i pozostaw ją przymocowaną do urządzenia mikroprzepływowego. Powtórz ten proces dla każdego kanału i upewnij się, że podczas tego procesu do kanałów nie zostaną wprowadzone pęcherzyki powietrza. Następnie opuść rurkę wlotową na ziemię poniżej urządzenia mikroprzepływowego, aby rozpocząć przepływ białka przez mikrokanały.

Przyklej wolny koniec rurki do pojemnika na odpady. Przepływać rozcieńczenia domeny homologii pleckstrin przez 30 minut. W lewym panelu oprogramowania, w zakładce timelapse, kliknij Start, aby ponownie rozpocząć obrazowanie.

Pokazany tutaj jest reprezentatywny widok fosfatydyloinozytolu 4, 5-bisfosforanu zawierającego SLB w mikrokanałach. Przed i po, dodając domenę homologii pleckstrin we wskazanych stężeniach. Intensywności fluorescencji z linii skanowanej przez mikrokanały są wykreślane jako funkcja odległości i pikseli dla eksperymentów wiązania fosfatydylocholiny, fosforanu fosfatydyloinozytolu 4 i fosfatydyloinozytolu 4, 5-bisfosforanu.

Następnie, normalizując dane wiązania z poszczególnych eksperymentów, wykreśla się je jako funkcję stężenia domeny homologii fosfolipazy C delta 1 pleckstrin i dopasowuje do izoterm wiążących, aby wyodrębnić pozorne stałe asocjacyjne. Porównanie pozornych stałych asocjacyjnych pokazuje, że domena homologii fosfolipazy C Delta 1 pleckstrin oddziałuje z fosfatydyloinozytolem 4, 5-bisfosforanem specyficznie, zgodnie z oczekiwaniami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć małe pęcherzyki jednopłynowe, tworzyć urządzenia mikroprzepływowe, formować obsługiwane dwuwarstwy lipidowe wewnątrz tych urządzeń mikroprzepływowych, jako interakcje wiążące błonę białkową, używając tego testu z naszym podejściem-on-a-chip.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak odzyskiwanie fluorescencji po wybielaniu fotograficznym, w celu oceny wpływu wiązania błony białkowej na dyfuzję boczną lipidów. Technika ta toruje drogę do badania interakcji błon białkowych z gromadzeniem się lipidów znajdujących się w komórkach zamiast pojedynczo, podejście to będzie zatem miało szeroki wpływ na biochemię i biologię komórki interakcji błon białkowych.