Name: Analiza transferu miRNA zależnego od złącza szczelinowego za pomocą mikroskopii 3D-FRAP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Poznaj metodę 3D-FRAP do badania transferu miRNA zależnego od złączy szczelinowych w żywych kardiomiocytach. Technika umożliwia wizualizację i ilościową analizę wymiany międzykomórkowej z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych Niemcy (FKZ 0312138A i FKZ 316159), kraj związkowy Meklemburgia-Pomorze Przednie z funduszy strukturalnych UE (ESF/IVWM-B34-0030/10 i ESF/IVBM-B35-0010/12), DFG (DA1296-1) oraz Niemiecka Fundacja Kardiologiczna (F/01/12). Ponadto badania nad rozwojem są wspierane przez program FORUN Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku (889001), Fundację DAMP oraz BMBF (VIP+ 00240).

Wszystkie kroki w tym protokole z udziałem nowonarodzonych myszy zostały wykonane zgodnie z etycznymi wytycznymi Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Przygotowanie potraw z hodowli komórkowych i pożywki do hodowli kardiomiocytów
<ol>
	<li>Pokryć płytkę z hodowlą komórkową 0,1% żelatyny w PBS i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc. Usuń żelatynę i pozostaw do wyschnięcia pod sterylnym laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych składającą się z 50 ml DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S). Podgrzej go do 37 °C.</li>
</ol>
2. Izolacja kardiomiocytów noworodków
<ol>
	<li>Złóż w ofierze nowonarodzone myszy (w wieku 1-2 dni) przez ścięcie sterylnych nożyczek i otwórz klatkę piersiową wzdłuż mostka. Usuń serce za pomocą kleszczy, lekko ściskając klatkę piersiową i przenieś serce do 24-dołkowej płytki zawierającej lodowaty HBSS (bez Ca2+ i Mg2+).</li>
	<li>Usuń tkankę niesercową i większe naczynia za pomocą sterylnych kleszczy. Przenieś oczyszczone serca do 1,5 ml probówki zawierającej lodowaty HBSS. Użyj maksymalnie 5 serc w probówce do trawienia enzymatycznego.</li>
	<li>Zmiel serca małymi nożyczkami na kawałki o <0,5 do 1 mm³.</li>
	<li>Umyj zmielone serca HBSS dwa razy przez aspirację/dodanie HBSS za pomocą pipety o pojemności 1 ml w mikrolitrach. Całkowicie usuń HBSS przed dodaniem enzymów.</li>
	<li>Do trawienia enzymatycznego serc noworodków należy użyć dostępnego w handlu zestawu i postępować zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów). Wstrząsać probówką zawierającą rozdrobnione serca co 5 minut, inkubując z enzymami w temperaturze 37 °C przez 35 minut.</li>
	<li>Wysiewaj zawieszone komórki na niepowlekanych szalkach do hodowli komórkowych zawierających pożywkę do hodowli komórkowych przez 1,5-2 godziny, aby umożliwić przyleganie frakcji niekardiomiocytów. Powtórz ten krok, jeśli potrzebna jest wysoka czystość kardiomiocytów. W razie potrzeby dalsza hodowla frakcji niekardiomiocytów. 
	UWAGA: W przypadku zawiesiny komórek składającej się z 15 serc, etap wstępnego powlekania można przeprowadzić na kolbach do hodowli komórkowych o powierzchni 75 cm². Zwykle z jednego serca noworodka uzyskuje się ~5 x 105 komórek.</li>
	<li>Zebrać supernatant w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i wirować przez 10 minut przy 300 x g. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru z komorą Neubauera lub użyj równoważnej metody.</li>
	<li>Kardiomiocyty izolowane płytkowo na płytkach 6-dołkowych o gęstości 3 x 105 komórek/cm². Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Opcjonalnie w tym momencie można również transfekować komórki. Jednak zwiększoną żywotność zaobserwowano, gdy komórki były hodowane przez jeden dzień przed poddaniem ich elektroporacji.</li>
</ol>
3. Transfekcja z fluorescencyjnie znakowanym miRNA
<ol>
	<li>Wstępnie ogrzać pożywkę do hodowli komórkowych (patrz krok 1.2) do temperatury 37 °C w łaźni wodnej lub w równoważnym urządzeniu.</li>
	<li>Przygotować 20 μM roztwór podstawowy fluorescencyjnego miRNA w sterylnej wodzie wolnej od RNaz.</li>
	<li>Przygotować bufor do elektroporacji zawierający 90 mM Na2HPO4, 90 mM NaH2PO4, 5 mM KCl, 10 mM MgCl2 i 10 mM bursztynianu sodu i dostosować pH do 7,2; bufor do elektroporacji może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Odłącz komórki od naczynia hodowlanego, używając 0,05% trypsyny przez 5 minut. Dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru z komorą Neubauera lub użyj równoważnej metody. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić ogniwa w buforze do elektroporacji, aby uzyskać stężenie 4 x 105 ogniw na 100 μL.</li>
	<li>Wymieszać 100 μl zawiesiny komórek z fluorescencyjnym miRNA (końcowe stężenie: 0,25 μM) w probówce i załadować mieszaninę do kuwety do elektroporacji.
	<ol>
		<li>Empirycznie określ odpowiednią ilość miRNA, w zależności od typu komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać elektroporację za pomocą urządzenia do elektroporacji (patrz Tabela Materiałów), za pomocą programu "G-009".</li>
	<li>Dodać 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych i przenieść zawiesinę całej komórki (4 x 105 komórek) do studzienki z 4-dołkowym szkiełkiem podstawowym ze szklanym dnem. Hodować komórki przez 1 dzień w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2. 
	UWAGA: W przypadku analizy FRAP optymalna jest gęstość komórek ~80%. Transfekcja znakowanego miRNA powinna być wykonywana wyłącznie za pomocą elektroporacji. Ponieważ jednorodna dystrybucja znakowanych cząsteczek miRNA jest korzystna dla pomiaru FRAP, transfekcja na bazie odczynników nie jest zalecana.</li>
</ol>
4. Zastosowanie mikroskopii 3D-FRAP (Dzień 3)
<ol>
	<li>Rozgrzać inkubator mikroskopowy do temperatury 37 °C i włączyć system mikroskopu konfokalnego co najmniej 2 godziny przed pomiarem FRAP w celu ustalenia równowagi termicznej i zmniejszenia możliwości dryftu. Jeśli to możliwe, utrzymuj atmosferę na poziomie 5% CO2 .</li>
	<li>Włóż szkiełko komory do uchwytu na próbkę stolika.</li>
	<li>Znajdź skupisko transfekowanych kardiomiocytów za pomocą obiektywu olejowego 1,4 N.A. (powiększenie 400x) i światła wzbudzającego laser 561 nm przy niskiej mocy lasera, z zakresem wykrywania 570-680 nm. 
	UWAGA: Definicję ustawień FRAP, akwizycję obrazu i analizę wykonano za pomocą oprogramowania specyficznego dla mikroskopu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Aktywuj przyciski "Z-Stack", "Time Series", "Bleaching" i "Regions" w "Menedżerze ustawień".</li>
	<li>Zdefiniuj parametry FRAP.
	<ol>
		<li>Zdefiniuj ustawienia akwizycji obrazu w menu "Tryb akwizycji", ustawiając "rozmiar ramki" na 512 x 512, "krok linii" na 1, a "czas skanowania" na <1 s.</li>
		<li>W menu "Kanały" dostosuj ustawienia mocy lasera, przesunięcia i wzmocnienia, aby uzyskać maksymalną fluorescencję przy minimalnym wzbudzeniu lasera (np. moc lasera: 1-5%); dostosuj, aby uniknąć nasycenia intensywności. Ustaw "rozmiar otworka" na 2 μm.</li>
		<li>Następnie w menu "Regiony" wybierz "Narzędzie do rysowania ROI" i użyj kursora, aby zaznaczyć komórkę docelową, komórkę odniesienia i obszar tła. W razie potrzeby wybierz kilka komórek docelowych do fotowybielania.</li>
		<li>Dostosuj ustawienia fotowybielania w menu "Wybielanie" (np. iteracje: 9-14, moc lasera do fotowybielania: 100%, interwał akwizycji obrazu: 60 s, cykle: 15). Określ początek wybielania po 3 wstępnych skanach.</li>
		<li>W menu "z-Stack" zdefiniuj limity akwizycji z-stack, w zależności od grubości komórek. Dostosuj "liczbę warstw z" do 12 - 15.</li>
		<li>Rozpocznij eksperyment FRAP i zapisz odzysk fluorescencji. 
		UWAGA: Ponieważ ustawienia eksperymentu FRAP zależą od typu komórki, barwnika fluorescencyjnego i systemu mikroskopu, najlepiej jest przeprowadzić eksperymenty pilotażowe w celu określenia optymalnych parametrów FRAP. Wybielanie powinno wystarczyć do zmniejszenia początkowej intensywności fluorescencji o co najmniej 50%. Zazwyczaj odzysk fluorescencji powinien być rejestrowany co 30-60 s, aż do osiągnięcia fazy plateau.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Utwórz maksymalne projekcje uzyskanych stosów z i uzyskaj wartości intensywności fluorescencji bielonych komórek docelowych, komórki referencyjnej i tła. Korzystając z oprogramowania specyficznego dla mikroskopu, kliknij "Przetwarzanie" → "Projekcja maksymalnej intensywności" → wybierz plik → "Zastosuj".
	<ol>
		<li>Możesz też użyć równoważnego narzędzia do analizy obrazu (np. ImageJ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skopiuj dane o intensywności fluorescencji we wszystkich punktach czasu z komórki docelowej, tła i komórki odniesienia do arkusza kalkulacyjnego.
	<ol>
		<li>Odejmij intensywność tła i intensywność komórki odniesienia od wartości intensywności komórki docelowej, aby skorygować fotowybielanie spowodowane podczas procesu akwizycji. Wykonaj korekty tła i komórki odniesienia dla każdego punktu czasowego.</li>
		<li>Znormalizuj skorygowane dane FRAP do początkowej intensywności fluorescencji przed wybielaniem, dzieląc każdą wartość przez początkową fluorescencję.</li>
		<li>Aby uzyskać krzywe FRAP, ustaw linię bazową na intensywność fluorescencji bezpośrednio po wybielaczu, odejmując od wartości intensywności każdego punktu czasowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+state-of-the-art%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: state-of-the-art.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).</li>
<li>Raghunathan, S., Patel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+implications+of+small+interfering+RNA+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases.</a> Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).</li>
<li>Sluijter, J. P. G. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/isrn/2013/593517/">MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation.</a> ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).</li>
<li>Li, M., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNAs%3A+Potential+and+Emerging+Biomarkers+for+Diagnosis+of+Cardiovascular+and+Cerebrovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases.</a> Biomed Res Int. , 1-9 (2015).</li>
<li>Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+cardiovascular+disease%3A+an+introduction+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians.</a> Heart. 101 (12), 921-928 (2015).</li>
<li>Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+and+pannexin+signaling+in+gastrointestinal+and+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease.</a> Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).</li>
<li>Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connexin+43+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of connexin 43 in cardiovascular diseases.</a> Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).</li>
<li>Naus, C. C., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+and+challenges+of+connexin+connections+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Implications and challenges of connexin connections to cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).</li>
<li>Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+modulate+glioma+invasion+by+direct+transfer+of+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA.</a> Oncotarget. 6 (17), Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.impactjournals.com/oncotarget">http://www.impactjournals.com/oncotarget</a> 15566-15577 (2015).</li>
<li>Lee, H. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+deliver+synthetic+microRNA+mimics+to+glioma+cells+and+glioma+stem+cells+and+inhibit+their+cell+migration+and+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal.</a> Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).</li>
<li>Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+microRNA+is+transferred+between+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Functional microRNA is transferred between glioma cells.</a> Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).</li>
<li>Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+mediated+miRNA+intercellular+transfer+and+gene+regulation%3A+A+novel+mechanism+for+intercellular+genetic+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication.</a> Sci Rep. 6, 19884(2016).</li>
<li>Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+connexin26+mutants+associated+with+human+hearing+loss+have+trans-dominant+effects+on+connexin30%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30.</a> Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).</li>
<li>Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+gap+junctions+in+monolayer+and+three-dimensional+cultures+of+human+tendon+cells+using+fluorescence+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching.</a> J Biomed Opt. 19 (1), 15001(2013).</li>
<li>Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+requires+a+biphasic+modulation+of+gap+junctional+intercellular+communication+caused+by+dynamic+changes+of+connexin43+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).</li>
<li>Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+shuttling+of+miRNA+-+A+novel+pathway+of+intercellular+gene+regulation+and+its+prospects+in+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application.</a> Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).</li>
<li>Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+connexin43+in+the+EGF%2FEGFR+signalling+during+self-renewal+and+differentiation+of+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells.</a> Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).</li>
<li>Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).</li>
<li>Laupheimer, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/bmr/2014/182645/">Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient.</a> Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+enhance+the+antiproliferative+effect+of+microRNA-124-3p+in+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells.</a> J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).</li>
<li>Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mobility+to+crosstalk.+A+model+of+intracellular+miRNAs+motion+may+explain+the+RNAs+interaction+mechanism+on+the+basis+of+target+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Math+Biosci%22%5BJournal%5D)">From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization.</a> Math Biosci. 280, 50-61 (2016).</li>
<li>Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+single+molecule+microscopy+reveals+two+kinetically+distinct+pathways+for+microRNA+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly.</a> EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).</li>
<li>Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+photobleaching%2C+laser+illumination+unbinds+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins.</a> J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).</li>
<li>Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+generation+and+calcium+increase+induced+by+visible+light+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).</li>
<li>Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA%3A+Function%2C+detection%2C+and+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis.</a> Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).</li>
<li>Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNA+expression+profiles+in+normal+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues.</a> BMC Genomics. 8 (1), 166(2007).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat Commun. 2, 282(2011).</li>
<li>Squadrito, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+RNAs+Modulate+MicroRNA+Sorting+to+Exosomes+and+Transfer+to+Acceptor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells.</a> Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).</li>
<li>Zhang, B., Farwell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs%3A+a+new+emerging+class+of+players+for+disease+diagnostics+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).</li>
<li>Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+delivery+of+miRNAs+for+cancer+therapy%3A+Challenges+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

miRNA są kluczowymi graczami w fizjologii komórkowej i wykazano, że działają jako cząsteczki sygnałowe, wykorzystując - między innymi - GJ jako szlak wymiany międzykomórkowej 11,12,22. Obecny protokół przedstawia technikę obrazowania żywych komórek in vitro w celu scharakteryzowania tego zależnego od GJ transportu przy użyciu fluorescencyjnych miRNA w klastrach komórkowych.
Protokół został op...

Małe niekodujące RNA odgrywają ważną rolę w regulacji genów komórkowych. Cząsteczki te składają się z 20-25 nukleotydów, które wiążą się z określonym docelowym mRNA, prowadząc do zablokowania translacji lub degradacji mRNA1,2. Proces regulacji genów zamierzany przez małe RNA, takie jak miRNA i siRNA, jest wysoce konserwatywnym mechanizmem, który został znaleziony u wielu różnych gatunków3. W szczególności cząsteczki miRNA mają kluczowe znaczenie dla różnych procesów fizjologicznych, w tym proliferacji, różnicowania i regeneracji4,5. Ponadto rozregulowanie ekspresji miRNA przypisuje się wielu zaburzeniom patologicznym. W związku z tym wykazano, że miRNA są odpowiednie jako biomarkery do diagnozy i jako środki terapeutyczne w terapii genowej6,7.
Połączenia szczelinowe (GJ) to wyspecjalizowane struktury białkowe w błonie plazmatycznej dwóch sąsiednich komórek, które umożliwiają dyfuzyjną wymianę cząsteczek o masie cząsteczkowej do 1 kD. Wykazano, że są one ważne dla rozwoju tkanek, różnicowania, śmierci komórek i zaburzeń patologicznych, takich jak rak lub choroby układu krążenia8,9,10. Kilka cząsteczek zostało opisanych jako zdolne do przekraczania kanałów GJ, w tym jony, metabolity i nukleotydy. Co ciekawe, odkryto również, że GJ zapewniają ścieżkę dla ruchu międzykomórkowego małych RNA11,12. W ten sposób miRNA mogą działać nie tylko w komórce, w której są wytwarzane, ale także w komórkach biorcy. Podkreśla to rolę miRNA w systemie transdukcji sygnału międzykomórkowego. Jednocześnie dane pokazują, że komunikacja międzykomórkowa w szczelinie jest ściśle związana z funkcją miRNA. Ze względu na znaczący wpływ miRNA i GJ na homeostazę, patologię i diagnostykę tkanek, kompleksowe zrozumienie funkcji miRNA i związanej z nią dynamiki międzykomórkowej miRNA pomoże wyjaśnić mechanizmy chorób opartych na miRNA i opracować nowe strategie terapii miRNA.
W zależności od stopnia sprzężenia szczelinowego, transfer cząsteczek miRNA między komórkami może być bardzo szybkim procesem. Dlatego wymagana jest metodologia, która umożliwia wizualizację i kwantyfikację szybkiego ruchu międzykomórkowego tych regulatorowych cząsteczek sygnałowych. Powszechnie cytometria przepływowa i techniki biologii molekularnej były stosowane w celu zademonstrowania przenoszenia małych RNA11,12,13,14. Jednak w przeciwieństwie do mikroskopii FRAP, podejścia te nie mają wysokiej rozdzielczości czasowej, która jest obowiązkowa przy analizie wymiany miRNA za pośrednictwem GJ. Co więcej, mikroskopia FRAP jest mniej inwazyjna, a zatem stanowi potężną i nowatorską technikę obrazowania żywych komórek do oceny zależnej od GJ wymiany cząsteczek w kilku typach komórek15,16,17.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół opisujący zastosowanie 3D-FRAP do oceny przepływu miRNA między kardiomiocytami. W tym celu kardiomiocyty transfekowano fluorescencyjnie znakowanym miRNA. Komórka oznaczona tym miRNA została wybielona fotoblakiem, a ponowny napływ miRNA z sąsiednich komórek został zarejestrowany w sposób zależny od czasu. Wysoka rozdzielczość czasowa eksperymentów FRAP daje możliwość wykonywania badań kinetycznych w celu precyzyjnej oceny międzykomórkowego transferu miRNA i siRNA między żywymi komórkami. Co więcej, ponieważ małe RNA mogą być wymieniane za pomocą różnych mechanizmów o bardzo różnej kinetyce, mikroskopia FRAP może pomóc w wyjaśnieniu zakresu, w jakim GJ są zaangażowane w odpowiednie procesy przenoszenia18. Ponadto 3D-FRAP może być używany do badania fizjologicznych i patologicznych zmian przepuszczalności GJ i jej wpływu na transfer małego RNA15,19.

<table><tbody><tr><td>noworodki myszy NMRI Charles</td><td>River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>0,1% roztwór w PBS, sterylizowany</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s zmodyfikowana pożywka</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-03550</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100&mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Pan Biotech</td><td>P30-3306</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa hodowla komórkowa</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy zestaw do izolacji kardiomiocytów</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88281</td><td>zawarty w pierwotnym zestawie do izolacji kardiomiocytów</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN Dy547 znakowany mikroRNA Naśladuje</td><td>Dharmacon</td><td>CP-004500-01-05</td><td>rozpuszcza się w wodzie wolnej od RNAzy, roztwór podstawowy 20&mikro; M</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Carl Roth</td><td>T877.2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Serva</td><td>28305.01</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian sodu</td><td>Carl Roth</td><td>3195.1</td><td></td></tr><tr><td>0,05% roztwór trypsyny/EDTA</td><td>Merck</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>4-dołkowe szkiełka komorowe ze szklanym dnem</td><td>IBIDI</td><td>80827</td><td>powłoka z 0,1% roztworem żelatyny</td></tr><tr>Do elektroporacji zastosowano program<td>Amaxa Nucleofector II</td><td>Lonza</td><td></td><td>G-009&nbsp;</td></tr><tr><td>System LSM 780 ELYRA PS.1 Oprogramowanie</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel Przeciwciało</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alfa-aktynina</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało Connexin43</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9059</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mysie Alexa 594 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11005</td><td>rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-królicze Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>Connexin43 siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM16708 ID158724</td><td>stężenie końcowe 250 nM</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia żywych/martwych komórek w bliskiej podczerwieni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein Czerwono-pomarańczowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik jądrowy DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza transferu mirna zależnego od złącza szczelinowego za pomocą mikroskopii 3d-frap

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Małe antysensowne RNA, takie jak miRNA i siRNA, odgrywają ważną rolę w fizjologii i patologii komórkowej, a ponadto mogą być stosowane jako środki terapeutyczne w leczeniu wielu chorób. Opracowywanie nowych, innowacyjnych strategii terapii miRNA/siRNA opiera się na rozległej wiedzy na temat mechanizmów leżących u ich podstaw. Najnowsze dane sugerują, że małe RNA są wymieniane między komórkami w sposób zależny od połączenia szczelinowego, wywołując w ten sposób efekty regulacyjne genów w komórce biorcy. Techniki biologii molekularnej i analiza cytometrii przepływowej są powszechnie stosowane do badania międzykomórkowej wymiany miRNA. Jednak metody te nie zapewniają wysokiej rozdzielczości czasowej, która jest niezbędna przy badaniu strumienia połączeń szczelinowych cząsteczek. Dlatego, aby zbadać wpływ miRNA/siRNA jako międzykomórkowych cząsteczek sygnałowych, potrzebne są nowe narzędzia, które pozwolą na analizę tych małych RNA na poziomie komórkowym. Niniejszy protokół opisuje zastosowanie trójwymiarowego odzyskiwania fluorescencji po mikroskopii fotowybielania (3D-FRAP) w celu wyjaśnienia zależnej od połączenia szczelinowego wymiany cząsteczek miRNA między komórkami serca. Co ważne, to proste i nieinwazyjne podejście do obrazowania żywych komórek pozwala na wizualizację i kwantyfikację przenoszenia węzłów szczelinowych znakowanych fluorescencyjnie małych RNA w czasie rzeczywistym, z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Dane uzyskane za pomocą projektu 3D-FRAP potwierdzają nowy szlak międzykomórkowej regulacji genów, w którym małe RNA działają jako cząsteczki sygnałowe w sieci międzykomórkowej.

W niniejszej pracy przedstawiamy mikroskopię 3D-FRAP jako nieinwazyjną technikę badania transportu fluorescencyjnego miRNA przez połączenia szczelinowe w kardiomiocytach noworodków. Izolowane kardiomiocyty wykazywały typowy prążkowany wzorzec α-aktyniny i zawierały duże blaszki Cx43 wzdłuż granic międzykomórkowych (Rycyna 1A, białe groty strzałek), co umożliwiało wysoki międzyprzestronny przepływ cząsteczek. Czystość izolowanych kardiomiocytów oceniano poprze...

Tutaj opisujemy zastosowanie trójwymiarowego odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (3D-FRAP) do analizy zależnego od złącza szczelinowego przenoszenia miRNA. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod, 3D-FRAP pozwala na ilościowe określenie transferu międzykomórkowego małych RNA w czasie rzeczywistym, z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Analiza transferu miRNA zależnego od złącza szczelinowego za pomocą mikroskopii 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie zależnego od połączeń szczelinowych transferu mikroRNA w żywych kardiomiocytach. Metoda ta może pomóc w określeniu roli mikroRNA w międzykomórkowym systemie przekazywania sygnałów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji i kwantyfikacji wymiany mikroRNA przez połączenia szczelinowe w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.Po wyizolowaniu kardiomiocytów zgodnie z protokołem tekstowym, należy wysiać komórki na płytki sześciodołkowe z gęstością 3 × 10⁵ komórek/cm². Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia dodać do komórek 0,5 trypsyny i inkubować hodowle przez pięć minut, aby odkleić komórki.Zneutralizować trypsynę poprzez dodanie pożywki do hodowli komórkowej. Po policzeniu komórek odwirować je przy 300 ×g przez 10 minut. Następnie użyć buforu do elektroporacji, aby resuspenderć komórki w stężeniu 4 × 10⁵ komórek na 100 µL.Następnie wymieszaj 100 µL zawiesiny komórkowej z fluorescencyjnym mikro-RNA w probówce i przelej mieszaninę do kuwety do elektroporacji. Następnie przeprowadź elektroporację, korzystając z programu G009 w elektroporatorze. Dodaj 500 µL uprzedni

analysis-gap-junction-dependent-transfer-mirna-with-3d-frap

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Opisujemy tutaj, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby zobrazować komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach, i podajemy kilka przydatnych wskazówek. Oczekujemy, że ten artykuł pomoże każdemu ocenić stopień sprzężenia komórkowego z powodu funkcjonalnych połączeń szczelinowych. Wszystko, co tu opisano, można by w zasadzie zaadaptować do innych barwników fluorescencyjnych o masie cząsteczkowej poniżej 1000 daltonów.

Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii (FRET) Förstera jest potężnym narzędziem do badań biologii komórki w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono metodę obrazowania komórek FRET w fizjologicznych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach hydrożelowych z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. Opisano analizę dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji.

Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Tutaj opisujemy prosty protokół, który umożliwia in vitro ocenę obfitości znakowanych fluorescencyjnie mikroRNA w celu zbadania dynamiki pakowania mikroRNA i eksportu do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Śledzenie uwalniania miRNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę 3D-FRAP do badania transferu miRNA zależnego od złączy szczelinowych w żywych kardiomiocytach. Technika umożliwia wizualizację i ilościową analizę wymiany międzykomórkowej z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.

Analiza transferu miRNA zależnego od złącza szczelinowego za pomocą mikroskopii 3D-FRAP

Przeglądaj więcej filmów