Analiza transferu miRNA zależnego od złącza szczelinowego za pomocą mikroskopii 3D-FRAP
19 czerwca 2017
Tutaj opisujemy zastosowanie trójwymiarowego odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (3D-FRAP) do analizy zależnego od złącza szczelinowego przenoszenia miRNA. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod, 3D-FRAP pozwala na ilościowe określenie transferu międzykomórkowego małych RNA w czasie rzeczywistym, z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie zależnego od połączenia szczelinowego transferu mikro RNA w żywych kardiomiocytach. Metoda ta może pomóc w określeniu roli mikro RNA w międzykomórkowym systemie transakcji sygnałowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymiana złączy szczelinowych mikro RNA może być wizualizowana i określana ilościowo w żywych komórkach z wysoką przestrzenną rozdzielczością czasową.
Po wyizolowaniu kardiomiocytów zgodnie z protokołem tekstowym, umieść komórki na sześciu płytkach dołkowych o gęstości trzy razy 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia dodaj 0,5 trypzyny do komórek i inkubuj kultury przez pięć minut, aby odłączyć komórki.
Dezaktywuj trypzynę, dodając pożywkę do hodowli komórkowych. Po policzeniu komórek odwiruj je 300 razy g przez 10 minut. Następnie użyj buforu do elektroporacji, aby ponownie zawiesić ogniwa w ilości od czterech razy 10 do piątych ogniw na 100 mikrolitrów.
Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek z fluorescencyjnym mikro RNA w probówce i załaduj mieszaninę do kuwety do elektroporacji. Następnie należy przeprowadzić elektroporację za pomocą programu G009 na elektroporatorze. Dodać 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych i przenieść całą objętość zawiesiny komórek do studzienki z czterodołkowym szkiełkiem w komorze dolnej.
Hoduj komórki przez jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Po wstępnym podgrzaniu inkubatora mikroskopowego i włączeniu systemu konfukulnego, włóż szkiełko komory do uchwytu na próbkę stolika. Użyj obiektywu olejowego 1,4 na i światła wzbudzającego laser 561 nanometrów, przy niskiej mocy lasera, z zakresem wykrywania od 570 do 680 nanometrów, aby znaleźć skupisko transwekowanych kardiomiocytów.
Następnie w menedżerze ustawień aktywuj przyciski z-stack, szeregi czasowe, wybielanie i regiony. Następnie, aby zdefiniować parametry frap, w menu trybu akwizycji ustaw rozmiar klatki na 512 na 512, krok linii na jeden, a czas skanowania na mniej niż jedną sekundę. W menu kanałów dostosuj ustawienia mocy lasera, przesunięcia i wzmocnienia, aby uzyskać maksymalną fluorescencję przy minimalnym wzbudzeniu lasera, aby uniknąć nasycenia intensywności.
Następnie ustaw rozmiar otworu na dwa mikrometry. Następnie w menu regionów wybierz narzędzie do rysowania roy i użyj kursora, aby zaznaczyć komórkę docelową, komórkę odniesienia i obszar tła. W razie potrzeby wybierz kilka komórek docelowych do wybielania fotograficznego.
W menu wybielania dostosuj ustawienia wybielania zdjęć. Następnie w menu z-stack zdefiniuj limity akwizycji z-stack, w zależności od grubości komórek. Dostosuj liczbę warstw z do 12 tp 15, a następnie rozpocznij eksperyment z frapem i zarejestruj odzysk fluorescencji.
Aby przeanalizować dane, utwórz maksymalną projekcję uzyskanych stosów z za pomocą specjalnego oprogramowania mikroskopowego, kliknij przetwarzanie, projekcję maksymalnej intensywności, wybierz plik, zastosuj. Na koniec skopiuj dane dotyczące intensywności fluorescencji we wszystkich punktach czasowych z celu, tła i komórki referencyjnej do arkusza kalkulacyjnego i przeprowadź analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym. Pokazane tutaj są izolowane kardiomiocyty z typowym prążkowanym wzorem alfa aktyniny i dużymi blaszkami koneksyny43, wzdłuż granic między komórkami.
Niektóre niekardiomiocyty były obecne w hodowli. Jak widać tutaj, za pomocą cytometrii przepływowej osiągnięto 45% wydajność transwekcji. Ponadto esej dotyczący żywych ciał wykazał, że większość komórek wykazywała wysoką żywotność, co jest ważne przy analizie komunikacji ze złączami szczelinowymi.
Do analizy frap komórki docelowe są wybierane w klastrze komórkowym i są wybielane fotobieleniem ze 100% mocą lasera, co prowadzi do zmniejszenia fluorescencji mikro RNA w wybranych komórkach. Analiza ilościowa i normalizacja uzyskanych danych wykazały średni odzysk na poziomie 20%W tym eksperymencie nokaut koneksyny43 za pośrednictwem siRNA doprowadził do zmniejszenia ekspresji białka i zahamowania komunikacji łączącej lukę. Odzysk fluorescencji został zmniejszony o ponad 50%, co wskazuje, że skuteczność transferu miro RNA jest silnie zależna od sprzężenia węzłów szczelinowych między komórkami.
Na tym rysunku przedstawiono renderowanie powierzchni 3D w eksperymencie z frapem. W porównaniu z projekcjami maksymalnymi, akwizycja stosów z może być wykorzystana do tworzenia rekonstrukcji 3D w celu zbadania lokalizacji i mobilności mikroRNA w komórkach. Po opanowaniu pomiary frap można wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby wybrać komórki docelowe, które mają podobną liczbę sąsiednich komórek. Ponadto moje parametry wybielania i warunki akwizycji obrazu powinny być tak dobrane, aby uniknąć efektów fototoksycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać mikroskopii frap, aby określić ilościowo i wizualizować ruch mikro RNA w klastrach komórkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie trójwymiarowego odzyskiwania fluorescencji po fotobleakingu (3D-FRAP) do badania zależnego od złączy szczelinowych transportu mikroRNA w żywych kardiomiocytach. Ta innowacyjna metoda umożliwia kwantyfikację międzykomórkowego transportu małych RNA w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania sercowo-naczyniowe
Wstęp
- MikroRNA odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji międzykomórkowej.
- Złącza szczelinowe ułatwiają transport małych RNA pomiędzy komórkami.
- Tradycyjne metody nie pozwalają na wizualizację tego transportu w czasie rzeczywistym.
- 3D-FRAP oferuje nowatorskie podejście do badania tej dynamiki.
Cel badania
- Zbadanie roli mikroRNA w międzykomórkowej transdukcji sygnałów.
- Wizualizacja i kwantyfikacja transferu mikroRNA poprzez połączenia szczelinowe.
- Pogłębienie zrozumienia komunikacji komórkowej w kardiomiocytach.
Zastosowane metody
- Izolacja kardiomiocytów zgodnie z określonym protokołem.
- Wysiewanie komórek na płytki sześcio-dołkowe z określoną gęstością.
- Inkubacja komórek w kontrolowanych warunkach.
- Zastosowanie techniki 3D-FRAP do monitorowania transferu mikroRNA.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja transferu mikroRNA w żywych komórkach.
- Kwantyfikacja wymiany międzykomórkowej poprzez połączenia szczelinowe.
- Wykazanie wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej w pomiarach.
- Wgląd w dynamikę sygnalizacji mikroRNA w kardiomiocytach.
Wnioski
- 3D-FRAP jest potężnym narzędziem do badania dynamiki microRNA.
- Zrozumienie transferu microRNA może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów komunikacji międzykomórkowej.
- Metoda ta może mieć szersze zastosowanie w badaniach z zakresu biologii komórki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Analiza wysokiej rozdzielczości transferu miRNA za pośrednictwem połączeń szczelinowych rozwiązuje kluczowy problem w zrozumieniu mechanizmów sygnalizacji międzykomórkowej istotnych dla modulacji chorób i celowania terapeutycznego. Procedura obrazowania 3D-FRAP umożliwia ilościowe określenie ruchu małych RNA w czasie rzeczywistym, co zwiększa pewność przewidywań w walidacji celów oraz minimalizuje ryzyko mechanistyczne w strategiach terapeutycznych opartych na RNA. Możliwość ta usprawnia podejmowanie decyzji na wczesnym etapie odkrywania leków i pomaga w priorytetyzacji portfela terapeutyków RNA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację transferu miRNA pomiędzy żywymi komórkami.
- Wyjaśnia mechaniczną rolę połączeń szczelinowych w międzykomórkowym sygnałowaniu RNA.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez powiązanie ekspresji koneksyny 43 z wydajnością transferu RNA.
- Dostarcza danych prognostycznych w celu minimalizacji ryzyka w odniesieniu do hipotez terapeutycznych opartych na RNA.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowany test na żywych komórkach do monitorowania przemieszczania się małych cząsteczek RNA z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.
- Umożliwia powtarzalną kwantyfikację powrotu fluorescencji jako wskaźnika funkcji połączeń szczelinowych.
- Umożliwia standaryzację parametrów testu dla późniejszego przesiewania modulatorów wpływających na transfer RNA.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy do oceny związków ukierunkowanych na komunikację międzykomórkową.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność z modelami istotnymi dla przebiegu chorób poprzez wykorzystanie pierwotnych kardiomiocytów do badania sygnalizacji RNA.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po przedkliniczną walidację interwencji celowanych w połączenia szczelinowe.
- Umożliwia dostosowanie postępów do poziomu ryzyka poprzez ilościowe określenie wpływu modulacji genetycznej lub farmakologicznej na transfer RNA.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Ta metoda mikroskopii 3D-FRAP wpisuje się w ciąg procesów badawczych, od wczesnych studiów mechanistycznych, przez opracowywanie testów, aż po walidację przedkliniczną terapeutyków RNA.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących transferu RNA za pośrednictwem połączeń szczelinowych oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Przesiewowanie: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki służące do oceny modulatorów międzykomórkowego transportu RNA.
- Analityka: Zapewnia znormalizowane dane dotyczące powrotu fluorescencji w celu porównania warunków doświadczalnych i interwencji.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne w kardiomiocytach z modelami przedklinicznymi istotnymi dla przebiegu chorób.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę do obrazowania żywych komórek w zróżnicowanych badaniach nad transferem RNA w różnych typach komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w sygnalizacji RNA.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zstandardizowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w obrazowaniu żywych komórek.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji do podejmowania decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez redukcję ryzyka we wczesnych etapach programów terapeutycznych opartych na RNA.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów odkrywczych opartych na RNA.
Kwestie implementacyjne
- Wymagana jest biegłość w obrazowaniu żywych komórek oraz w mikroskopii fluorescencyjnej.
- Konieczny jest dostęp do systemów mikroskopii konfokalnej z możliwością przeprowadzania 3D-FRAP.
- Wymagana jest standaryzacja parametrów fotowybielania i akwizycji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwe może być konieczne dostosowanie metody do różnych typów komórek lub modeli tkankowych.
- Kluczowe dla uniknięcia fototoksyczności i zapewnienia jakości danych są staranny wybór komórek docelowych oraz optymalizacja warunków fotowybielania.
