Analiza transferu miRNA zależnego od złącza szczelinowego za pomocą mikroskopii 3D-FRAP
19 czerwca 2017
Tutaj opisujemy zastosowanie trójwymiarowego odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (3D-FRAP) do analizy zależnego od złącza szczelinowego przenoszenia miRNA. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod, 3D-FRAP pozwala na ilościowe określenie transferu międzykomórkowego małych RNA w czasie rzeczywistym, z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie zależnego od połączenia szczelinowego transferu mikro RNA w żywych kardiomiocytach. Metoda ta może pomóc w określeniu roli mikro RNA w międzykomórkowym systemie transakcji sygnałowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymiana złączy szczelinowych mikro RNA może być wizualizowana i określana ilościowo w żywych komórkach z wysoką przestrzenną rozdzielczością czasową.
Po wyizolowaniu kardiomiocytów zgodnie z protokołem tekstowym, umieść komórki na sześciu płytkach dołkowych o gęstości trzy razy 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia dodaj 0,5 trypzyny do komórek i inkubuj kultury przez pięć minut, aby odłączyć komórki.
Dezaktywuj trypzynę, dodając pożywkę do hodowli komórkowych. Po policzeniu komórek odwiruj je 300 razy g przez 10 minut. Następnie użyj buforu do elektroporacji, aby ponownie zawiesić ogniwa w ilości od czterech razy 10 do piątych ogniw na 100 mikrolitrów.
Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek z fluorescencyjnym mikro RNA w probówce i załaduj mieszaninę do kuwety do elektroporacji. Następnie należy przeprowadzić elektroporację za pomocą programu G009 na elektroporatorze. Dodać 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych i przenieść całą objętość zawiesiny komórek do studzienki z czterodołkowym szkiełkiem w komorze dolnej.
Hoduj komórki przez jeden dzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Po wstępnym podgrzaniu inkubatora mikroskopowego i włączeniu systemu konfukulnego, włóż szkiełko komory do uchwytu na próbkę stolika. Użyj obiektywu olejowego 1,4 na i światła wzbudzającego laser 561 nanometrów, przy niskiej mocy lasera, z zakresem wykrywania od 570 do 680 nanometrów, aby znaleźć skupisko transwekowanych kardiomiocytów.
Następnie w menedżerze ustawień aktywuj przyciski z-stack, szeregi czasowe, wybielanie i regiony. Następnie, aby zdefiniować parametry frap, w menu trybu akwizycji ustaw rozmiar klatki na 512 na 512, krok linii na jeden, a czas skanowania na mniej niż jedną sekundę. W menu kanałów dostosuj ustawienia mocy lasera, przesunięcia i wzmocnienia, aby uzyskać maksymalną fluorescencję przy minimalnym wzbudzeniu lasera, aby uniknąć nasycenia intensywności.
Następnie ustaw rozmiar otworu na dwa mikrometry. Następnie w menu regionów wybierz narzędzie do rysowania roy i użyj kursora, aby zaznaczyć komórkę docelową, komórkę odniesienia i obszar tła. W razie potrzeby wybierz kilka komórek docelowych do wybielania fotograficznego.
W menu wybielania dostosuj ustawienia wybielania zdjęć. Następnie w menu z-stack zdefiniuj limity akwizycji z-stack, w zależności od grubości komórek. Dostosuj liczbę warstw z do 12 tp 15, a następnie rozpocznij eksperyment z frapem i zarejestruj odzysk fluorescencji.
Aby przeanalizować dane, utwórz maksymalną projekcję uzyskanych stosów z za pomocą specjalnego oprogramowania mikroskopowego, kliknij przetwarzanie, projekcję maksymalnej intensywności, wybierz plik, zastosuj. Na koniec skopiuj dane dotyczące intensywności fluorescencji we wszystkich punktach czasowych z celu, tła i komórki referencyjnej do arkusza kalkulacyjnego i przeprowadź analizę danych zgodnie z protokołem tekstowym. Pokazane tutaj są izolowane kardiomiocyty z typowym prążkowanym wzorem alfa aktyniny i dużymi blaszkami koneksyny43, wzdłuż granic między komórkami.
Niektóre niekardiomiocyty były obecne w hodowli. Jak widać tutaj, za pomocą cytometrii przepływowej osiągnięto 45% wydajność transwekcji. Ponadto esej dotyczący żywych ciał wykazał, że większość komórek wykazywała wysoką żywotność, co jest ważne przy analizie komunikacji ze złączami szczelinowymi.
Do analizy frap komórki docelowe są wybierane w klastrze komórkowym i są wybielane fotobieleniem ze 100% mocą lasera, co prowadzi do zmniejszenia fluorescencji mikro RNA w wybranych komórkach. Analiza ilościowa i normalizacja uzyskanych danych wykazały średni odzysk na poziomie 20%W tym eksperymencie nokaut koneksyny43 za pośrednictwem siRNA doprowadził do zmniejszenia ekspresji białka i zahamowania komunikacji łączącej lukę. Odzysk fluorescencji został zmniejszony o ponad 50%, co wskazuje, że skuteczność transferu miro RNA jest silnie zależna od sprzężenia węzłów szczelinowych między komórkami.
Na tym rysunku przedstawiono renderowanie powierzchni 3D w eksperymencie z frapem. W porównaniu z projekcjami maksymalnymi, akwizycja stosów z może być wykorzystana do tworzenia rekonstrukcji 3D w celu zbadania lokalizacji i mobilności mikroRNA w komórkach. Po opanowaniu pomiary frap można wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby wybrać komórki docelowe, które mają podobną liczbę sąsiednich komórek. Ponadto moje parametry wybielania i warunki akwizycji obrazu powinny być tak dobrane, aby uniknąć efektów fototoksycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać mikroskopii frap, aby określić ilościowo i wizualizować ruch mikro RNA w klastrach komórkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie trójwymiarowego odzyskiwania fluorescencji po fotoblaknięciu (3D-FRAP) do badania zależnego od złączy szczelinowych transferu microRNA w żywych kardiomiocytach. Ta innowacyjna metoda umożliwia ilościowe określenie międzykomórkowego transferu małych RNA w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad układem sercowo-naczyniowym
Wstęp
- MikroRNA odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji międzykomórkowej.
- Złącza szczelinowe ułatwiają transport małych RNA między komórkami.
- Tradycyjne metody nie pozwalają na wizualizację tego transportu w czasie rzeczywistym.
- Technika 3D-FRAP oferuje nowatorskie podejście do badania tej dynamiki.
Cel badania
- Zbadanie roli mikroRNA w międzykomórkowej transdukcji sygnałów.
- Wizualizacja i kwantyfikacja transferu mikroRNA poprzez połączenia szczelinowe.
- Pogłębienie wiedzy na temat komunikacji komórkowej w kardiomiocytach.
Zastosowane metody
- Izolacja kardiomiocytów zgodnie ze specyficznym protokołem.
- Wysiew komórek na płytki sześciodołkowe z określoną gęstością.
- Inkubacja komórek w kontrolowanych warunkach.
- Zastosowanie techniki 3D-FRAP w celu monitorowania transferu microRNA.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja transferu mikroRNA w żywych komórkach.
- Ilościowe oznaczenie wymiany międzykomórkowej poprzez połączenia szczelinowe.
- Wykazanie wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej w pomiarach.
- Wnioski dotyczące dynamiki sygnalizacji mikroRNA w kardiomiocytach.
Wnioski
- 3D-FRAP jest potężnym narzędziem do badania dynamiki microRNA.
- Zrozumienie transferu microRNA może dostarczyć informacji na temat mechanizmów komunikacji międzykomórkowej.
- Metoda ta może mieć szersze zastosowania w badaniach z zakresu biologii komórki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza o wysokiej rozdzielczości transferu miRNA zapśredniczonego przez połączenia szczelinowe rozwiązuje kluczowy problem w zrozumieniu mechanizmów sygnalizacji międzykomórkowej istotnych dla modulacji chorób i celowania terapeutycznego. Procedura mikroskopii 3D-FRAP umożliwia kwantyfikację ruchu małych RNA w czasie rzeczywistym, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz redukuje ryzyko mechanistyczne w przypadku strategii terapeutycznych opartych na RNA. Możliwość ta usprawnia decyzje na wczesnym etapie odkrywania leków i pozwala na lepszą priorytetyzację portfela terapii RNA.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację transferu miRNA pomiędzy żywymi komórkami.
- Wyjaśnia mechaniczną rolę połączeń szczelinowych w międzykomórkowej sygnalizacji RNA.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez powiązanie ekspresji koneksyny 43 z wydajnością transferu RNA.
- Dostarcza danych prognostycznych służących do minimalizacji ryzyka w hipotezach dotyczących terapii opartych na RNA.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowany test na żywych komórkach do monitorowania przemieszczania się małych RNA z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.
- Ułatwia powtarzalną kwantyfikację powrotu fluorescencji jako wskaźnika funkcji złączy szczelinowych.
- Umożliwia standaryzację parametrów testu dla późniejszego przesiewania modulatorów wpływających na transfer RNA.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy do oceny związków ukierunkowanych na komunikację międzykomórkową.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność z modelami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez wykorzystanie pierwotnych kardiomiocytów do badania sygnalizacji RNA.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po przedkliniczną walidację interwencji ukierunkowanych na połączenia szczelinowe.
- Umożliwia postęp z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez ilościowe określenie wpływu modulacji genetycznej lub farmakologicznej na transfer RNA.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda mikroskopii 3D-FRAP integruje się z kontinuum odkryć, od wczesnych badań mechanistycznych, poprzez rozwój testów, aż po walidację przedkliniczną terapeutyków RNA.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących transferu RNA za pośrednictwem połączeń szczelinowych oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych odczytów służących do oceny modulatorów międzykomórkowego przemieszczania się RNA.
- Analityka: Zapewnia znormalizowane dane dotyczące powrotu fluorescencji w celu porównania warunków eksperymentalnych i interwencji.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne w kardiomiocytach z modelami przedklinicznymi istotnymi dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę obrazowania żywych komórek do wielokrotnego wykorzystania w różnorodnych badaniach nad transferem RNA w różnych typach komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w sygnalizacji RNA.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w obrazowaniu żywych komórek.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez redukcję ryzyka w wczesnych etapach programów terapeutycznych opartych na RNA.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów badawczych opartych na RNA.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obrazowania żywych komórek oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Niezbędny jest dostęp do systemów mikroskopii konfokalnej z możliwością przeprowadzania 3D-FRAP.
- Wymagana jest standaryzacja parametrów wybielania i akwizycji między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Można potrzebować adaptacji metody dla różnych typów komórek lub modeli tkankowych.
- Kluczowe dla uniknięcia fototoksyczności i zapewnienia jakości danych są staranny dobór komórek docelowych oraz optymalizacja warunków fotowybielania.
