Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS
10 sierpnia 2017
Obecna metoda służy do identyfikacji specyficznych dla izoform inhibitorów deacetylaz histonowych (HDAC) w komórkach HeLa za pomocą analizy UHPLC-MS wielu substratów. Jest to metoda wolna od przeciwciał opracowana w celu odzwierciedlenia aktywności HDAC1 i HDAC6 w środowisku żywych komórek, w przeciwieństwie do testów bezkomórkowych z pojedynczymi izoformami.
Ogólnym celem tej metody jest określenie potencjału hamującego HDAC związków i określenie selektywności w stosunku do HDAC6 lub HDAC1 w komórkach za pomocą pojedynczego testu spektrometrii mas ultra wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania leków, takie jak ustalenie, czy inhibitor HDAC jest selektywny dla HDAC6 w porównaniu z HDAC klasy I w żywych komórkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga ona pojedynczego etapu inkubacji z komórkami, inhibitorami i selektywnymi substratami w celu określenia siły działania przeciwko dwóm izoformom HDAC jednocześnie.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku wczesnego odkrywania selektywnych inhibitorów HDAC, ponieważ wykrywa, czy selektywność HDAC6 jest utrzymywana w żywych komórkach, unikając testów endogennej acetylacji białek. Chociaż metoda ta ocenia selektywność inhibitorów HDAC w komórkach HeLa, można ją również zastosować do innych linii komórkowych, takich jak pierwotne i inne komórki nowotworowe, w tym próbki kliniczne. Hodowla komórek HeLa do 80% konfluencji w kolbie do hodowli komórek T75 w minimalnej ilości niezbędnych pożywek uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą, penicyliną G i streptomycyną.
Umyj komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco. Następnie odessać bufor i dodać jeden mililitr odczynnika do dysocjacji komórek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby oderwać komórki.
Po pięciu minutach dodaj dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej MEM do komórek i dokładnie ponownie zawieś zawiesinę komórek. Przenieś komórki do nowej 15-mililitrowej probówki, a następnie policz komórki za pomocą hemocytometru. Dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 60 000 komórek na mililitr w MEM.
Następnie dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do studzienek kontrolnych i testowych sterylnej, płaskiej płytki z kulturą tkankową poddanej działaniu 96 dołków. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej MEM do ślepych studzienek płytki 96-dołkowej. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Zassać pożywkę z dołków płytki 96-dołkowej. Podczas zasysania pożywki należy unikać odłączania i wyjmowania komórek ze studzienki. Można to osiągnąć, stosując niską szybkość aspiracji i ostrożnie umieszczając zasysające końcówki w dolnym rogu powierzchni studzienki.
Następnie dodaj 25 mikrolitrów dwukrotnie testowanych związków w MEM do studzienek testowych, w tym trichostatyny A, MS275 i tubastatyny A. Dodaj 25 mikrolitrów MEM do studzienek kontrolnych i ślepych. Następnie dodaj 25 mikrolitrów mieszaniny substratów do studzienek kontrolnych i testowych. Następnie dodaj 25 mikrolitrów MEM do ślepych studzienek.
Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem godzin w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Aby przeprowadzić lizę komórek, najpierw dodaj 10 mikrolitrów sześciokrotnego buforu RIPA uzupełnionego inhibitorem proteazy do każdej studzienki 96-dołkowej płytki. Zatrzymaj reakcję, dodając 160 mikrolitrów zimnego acetonitrylu do każdej studzienki i mieszaj, pipetując w górę iw dół.
Umieść talerz w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 10 minut. Wyjmij płytkę z zamrażarki i przenieś 220 mikrolitrów zawartości każdej studzienki na niesterylną, stożkową płytkę 96-dołkową z dnem. Odwirować płytkę w temperaturze 5 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.
Po odwirowaniu przenieść 200 mikrolitrów supernatantu na 96-dołkową płytkę kompatybilną z systemem UHPLC. Następnie należy uszczelnić płytkę zrywalną folią termozgrzewalną za pomocą zgrzewarki do płyt. Przygotuj system spektrometrii mas ultra wysokosprawnej chromatografii cieczowej, wypełniając go systemem fazy ruchomej.
Umieścić płytkę 96-dołkową w menedżerze próbek zawierającym uchwyt na płytki. Uruchom próbki zgodnie z warunkami UHPLC ESI MS/MS znajdującymi się w tekście. Aby przeprowadzić analizę danych, należy zintegrować powierzchnię piku każdego substratu i jego zdeacetylowany produkt z odpowiednim oprogramowaniem integracyjnym UHPLC.
Dla każdego substratu obliczyć stosunek powierzchni piku deacetylowanego do acetylowanego w każdym chromatogramie. Uwzględnij próbki testowe i kontrolne. Na koniec oblicz procentowe zahamowanie HDAC w każdej badanej próbce zgodnie z równaniem w protokole tekstowym.
Chromatogram UHPLC-MS próbki przedstawiono tutaj. Piki odpowiadające substratom dodanym do komórek są wykrywane zgodnie z ich przejściami masy, jak opisano w tabeli pierwszej pisemnego protokołu. MOCPAC jest deacetylowany przez HDAC1 w celu zapewnienia zdeacetylowanego piku MOCPAC.
Podobnie, BATCP jest deacetylowany przez HDAC6 w celu zapewnienia zdeacetylowanego piku BATCP. Wreszcie, MAL zapewnia zdeacetylowany pik MAL, który niespecyficznie odzwierciedla deacetylację kilku endogennych HDAC. Pokazany tutaj rysunek z chromatogramem uzyskanym przy różnych stężeniach inhibitora HDAC Trichostatyny A.A oceniono odpowiedź na dawkę standardowych inhibitorów HDAC.
Zintegrowane wartości uzyskane z MOCPAC i dMOCPAC wykorzystano do obliczenia siły działania standardowych inhibitorów przeciwko HDAC1. Po obliczeniach IC 50, MS275, selektywny inhibitor HDAC klasy I, wykazał niższe wartości IC 50 dla HDAC1 niż tubastatyna A, znany inhibitor HDAC6. Z drugiej strony, wyizolowane wartości z BATCP i dBATCP wykorzystano do obliczenia siły działania wzorców w stosunku do HDAC6.
Tym razem tubastatyna A zapewniła niższą wartość IC 50 niż MS275, potwierdzając ich profil selektywności izoformowej. Trichostatyna A jest silnym, nieselektywnym inhibitorem. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu 72 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, w tym czas leczenia komórkami i analiza płytki 96-dołkowej.
Próbując tej procedury, należy pamiętać, że wskazane tutaj czasy inkubacji dotyczą komórek HeLa. Jeśli używana jest inna linia komórkowa, należy ją zoptymalizować. Zgodnie z tą procedurą, selektywna aktywność hamująca HDAC innych izoform może być mierzona, o ile istnieją określone substraty.
Nie zapominaj, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi i innymi chemikaliami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Metoda ta służy do identyfikacji inhibitorów specyficznych dla izoform deacetylaz histonowych (HDAC) w komórkach HeLa z wykorzystaniem analizy UHPLC-MS. Odzwierciedla ona aktywność HDAC1 i HDAC6 w żywych komórkach, co stanowi kontrast w stosunku do tradycyjnych testów bezkomórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Odkrywanie leków
Wprowadzenie
- Deacetylazy histonowe odgrywają kluczową rolę w regulacji genów.
- Selektywne inhibitory HDAC są istotne w zastosowaniach terapeutycznych.
- Tradycyjne metody mogą nie odzwierciedlać dokładnie środowisk komórkowych.
- Komórki HeLa są powszechnie stosowane w badaniach biologicznych.
Cel badania
- Określenie potencjału hamującego HDAC przez badane związki.
- Identyfikacja selektywności wobec HDAC6 lub HDAC1 w żywych komórkach.
- Usprawnienie oceny inhibitorów HDAC w procesie odkrywania leków.
Zastosowane metody
- Szybka cieczowa chromatografia wysokosprawna sprzężona ze spektrometrią mas (UHPLC-MS).
- Pojedynczy etap inkubacji z komórkami, inhibitorami i substratami selektywnymi.
- Ocena aktywności HDAC w komórkach HeLa.
- Potencjał zastosowania w innych liniach komórkowych i próbkach klinicznych.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie rozróżnia aktywność HDAC1 i HDAC6.
- Wykazuje ona selektywność inhibitorów HDAC w żywych komórkach.
- Wyniki wspierają wczesne etapy poszukiwania leków będących selektywnymi inhibitorami HDAC.
- Może być dostosowana do zastosowania w różnych typach komórek poza komórkami HeLa.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia wiarygodne podejście do oceny selektywności inhibitorów HDAC.
- Zwiększa ona zrozumienie funkcji HDAC w kontekście komórkowym.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć kliniczny rozwój leków.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w żywych komórkach, zapewniając fizjologicznie istotną ocenę selektywności izoform, która jest kluczowa na wczesnym etapie poszukiwania inhibitorów HDAC. Dzięki zastosowaniu UHPLC-MS do ilościowego oznaczenia deacetylowanych substratów syntetycznych, metoda ta pozwala uniknąć zależności od detekcji opartej na przeciwciałach i odzwierciedla endogenną aktywność enzymu w kontekście komórkowym. Podejście to wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzenie wiązania z celem oraz selektywności w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej przed przekazaniem związków do oceny przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar inhibicji HDAC specyficznej dla poszczególnych izoform w żywych komórkach HeLa.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje pojedynczy etap inkubacji z inhibitorami i substratami w celu jednoczesnej oceny aktywności przeciwko dwóm izoformom HDAC.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację związków wiodących poprzez rozróżnienie związków selektywnych wobec HDAC6, takich jak tubastatyna A, od inhibitorów nieselektywnych lub selektywnych wobec klasy I.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe stosunki powierzchni piku substratów acetylowanych do deacetylowanych (np. MOCPAC/dMOCPAC dla HDAC1, BATCP/dBATCP dla HDAC6), co pozwala na powtarzalny odczyt aktywności.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatem płytek 96-dołkowych oraz możliwość automatyzacji w ramach kampanii przesiewowych o średniej przepustowości.
- Adaptacyjność: Łatwa możliwość przeniesienia metody na inne linie komórkowe, w tym komórki pierwotne i nowotworowe, w przypadku dostępności substratów specyficznych dla danej izoformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Pozwala na pomiar selektywności inhibitorów HDAC w żywych komórkach, łącząc potencjał biochemiczny z angażowaniem celu komórkowego.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Potwierdza, czy selektywność wobec HDAC6 zaobserwowana w testach biochemicznych utrzymuje się w środowisku komórkowym, co ogranicza liczbę wyników fałszywie dodatnich.
- Znaczenie dla modeli przedklinicznych: Wspiera ocenę inhibitorów HDAC w modelach nowotworów oraz chorób neurodegeneracyjnych, w których selektywność wobec HDAC6 jest korzystna terapeutycznie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając walidację celu oraz identyfikację związku wiodącego poprzez dostarczenie danych o selektywności komórkowej, które pozwalają na podjęcie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań przed zainwestowaniem środków w etap przedkliniczny.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących selektywnego hamowania izoform HDAC w systemie żywych komórek, wyjaśniając oddziaływanie z celem i modulację szlaków.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, multipleksowych odczytów aktywności, które wspierają standaryzację testu oraz profilowanie związków w odniesieniu do izoform HDAC.
- Analityka: Dostarcza dane o stosunku powierzchni pików z UHPLC-MS do obliczania procentu inhibicji oraz wartości IC50, co umożliwia porównawczą ocenę potencji.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne badania przesiewowe selektywności z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację oddziaływania z celem w kontekście komórkowym istotnym dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi platformę wielokrotnego użytku do oceny selektywności inhibitorów HDAC w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez pomiar endogennej aktywności HDAC w żywych komórkach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki jednokrotnemu etapowi inkubacji oraz ilościowemu oznaczeniu z wykorzystaniem UHPLC-MS.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka związanego z selektywnością inhibitorów HDAC, co zmniejsza odsetek niepowodzeń na późnych etapach z powodu braku specyficzności wobec celu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o potwierdzoną selektywność komórkową względem HDAC6 lub HDAC1.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej, pracy z związkami chemicznymi oraz obsługi UHPLC-MS w celu dokładnego wykrywania i oznaczania ilościowego metabolitów.
- Zależy od dostępu do systemów UHPLC-MS z możliwością ESI MS/MS oraz odpowiedniego rozdziału chromatograficznego w celu rozdzielenia substratu i produktu.
- Wymaga standaryzacji gęstości siewu komórek, czasów inkubacji oraz stężeń substratów w poszczególnych dołkach w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów przy przenoszeniu metody na inne linie komórkowe, w tym optymalizacją gęstości komórek i czasu inkubacji.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność stosowania syntetycznych substratów specyficznych dla izoform oraz ostrożne obchodzenie się z rozpuszczalnikami organicznymi podczas przetwarzania próbek.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
8:18
Conclusion
6:14
Results: Deacetylation of Specific Substrates by Endogenous HDACs and Potency of Standard HDAC Inhibitors
1:20
Cell Culture
3:00
Cell Treatment with Cell Compounds and HDAC Substrates, Cell Lysis, and Sample Preparation for UHPLC-ESI-MS/MS
5:14
UHPLC/MS-MS Analysis and Data Analysis
