Name: Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego pomiaru aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS. Technika ta umożliwia szybką ocenę selektywności inhibitorów w żywych komórkach, wspierając odkrywanie leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy uznają COST Action CM1406 (Epigenetic Chemical Biology). Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez fundację Pierre'a Merciera.

1. Hodowla komórkowa
UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane w standardowej komorze do hodowli tkanek. Wymagana jest znajomość technik sterylnych.
<ol>
	<li>Hodować komórki HeLa do 80% konfluencji w kolbie T75 do hodowli komórkowej w pożywce MEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, penicylinę G (100 U/mL) oraz streptomycynę (100 mg/mL). 
	UWAGA: Etapy hodowli komórkowej, traktowania i lizy przeprowadza się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, natomiast inkubację komórek w 37 °C wykonuje się w warunkach sterylnych, w atmosferze uwilgotnionej 5% CO2.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie 5 mL DPBS, odessać DPBS i dodać 1 mL odczynnika do dysocjacji komórek. Inkubować w 37 °C przez 5 min w celu odklejenia komórek.</li>
	<li>Dodać 9 mL pożywki hodowlanej MEM, dokładnie resuspendować zawiesinę komórkową i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Dostosować gęstość zawiesiny komórkowej do 6 x 104 komórek/mL w MEM.</li>
	<li>Dodać 100 µL zawiesiny komórkowej do studzienek kontrolnych i testowych sterylnej, płaskodنnej płytki 96-dołkowej przeznaczonej do hodowli tkanek (Rysunek 1A).</li>
	<li>Dodać 100 µL pożywki hodowlanej MEM do studzienek pustych (blank) płytki 96-dołkowej (Rysunek 1A).</li>
	<li>Inkubować płytkę 96-dołkową w 37 °C przez 24 h. 
	UWAGA: Inkubacja przez 24 h jest odpowiednim czasem do badania endogennej aktywności HDAC w komórkach HeLa. W przypadku różnych typów komórek o nieznanej aktywności HDAC może być konieczna ocena przebiegu czasowego dla komórek kontrolnych.</li>
</ol>
2. Traktowanie komórek związkami testowymi i substratami HDAC
<ol>
	<li>Odssać pożywkę z dołków płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Do dołków testowych dodać 25 µL 2x związków testowych (np. trichostatyny A, MS275 i tubastatyny A) w MEM. Do dołków kontrolnych i ślepych dodać 25 µL MEM. 
	UWAGA: Stężenie związków testowych należy dostosować tak, aby uzyskać zakres co najmniej 5 końcowych stężeń testowych (jedno stężenie na dołek). Końcowe stężenie DMSO w związku testowym nie powinno przekraczać 0,5% i powinno być takie samo w każdym dołku, w tym w ślepych i kontrolnych. Końcowa objętość inkubacji wynosi 50 µL na dołek. Trichostatynę A testuje się w 5 stężeniach w zakresie od 500 do 1,95 nM (rozcieńczenie 1:4). MS275 i tubastatynę A testuje się w 5 stężeniach w zakresie od 8 000 do 6,17 nM (rozcieńczenie 1:6). Pożądane końcowe stężenie testowe dla każdego związku testowego powinien określić poszczególni użytkownicy poprzez stworzenie krzywej zależności efektu od dawki.</li>
	<li>Do dołków kontrolnych i testowych dodać 25 µL mieszaniny substratów (42 µM MAL, 42 µM MOCPAC i 42 µM BATCP w MEM). Do dołków ślepych dodać 25 µL MEM. 
	UWAGA: Końcowe stężenie każdego substratu wynosi 21 µM. MOCPAC i BATCP rozróżniają odpowiednio aktywność HDAC1 i HDAC6 (Ryc. 1B). W przypadku braku zaobserwowania aktywności z tymi substratami, zastosowanie MAL może potencjalnie prowadzić do zidentyfikowania aktywności przeciwko innej izoformie HDAC.</li>
	<li>Inkubować płytkę 96-dołkową w temperaturze 37 °C przez 8 h w inkubatorze z wilgotnym powietrzem i 5% CO2. 
	UWAGA: Ten czas inkubacji jest odpowiedni dla komórek HeLa i pozwala endogennej HDAC na oddziaływanie z substratami syntetycznymi. Różne linie komórkowe mogą wymagać korekty czasu inkubacji i/lub stężenia substratu.</li>
</ol>
3. Lizą komórek i przygotowanie próbek do analizy UHPLC-ESI-MS/MS
Ostrzeżenie: Etapy przygotowania próbek wymagają użycia chemikaliów organicznych, które są łatwopalne i toksyczne w przypadku połknięcia lub wdychania. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawiczki i okulary ochronne.
<ol>
	<li>Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodać 10 µL buforu RIPA 6x (rozcieńczonego z buforu RIPA 10x) z dodatkiem inhibitora proteaz.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, dodając do każdego dołka 160 µL zimnego acetonitrylu, a następnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. 
	UWAGA: Przed tym krokiem acetonitryl należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Umieścić płytkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 10 min.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z zamrażarki i przenieść 220 µL zawartości każdego dołka do niesterylnej płytki 96-dołkowej z dnem stożkowym (V-bottom). Odwiruzować płytkę przy 5,000 x g i 4 °C przez 10 min. 
	UWAGA: Celem tego kroku jest usunięcie białek i soli. W razie potrzeby roztwory można przenieść do pojedynczych stożkowych probówek do wirowania przed centryfugacją lub przefiltrować przez zestaw 96-dołkowych płyt filtracyjnych PVDF 0,65 µm. Skuteczne usunięcie osadu jest wymagane przed analizą UHPLC.</li>
	<li>Przenieść 200 µL supernatantu (lub filtratu) do płytki 96-dołkowej kompatybilnej z systemem UHPLC i szczelnie zamknąć ją za pomocą folii termotopliwej z możliwością odrywania, używając uszczelniacza płytek. 
	UWAGA: Podczas pobierania supernatantów należy unikać aspirowania osadu. Jeśli analiza UHPLC nie może być wykonana natychmiast, płytkę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 h do czasu analizy.</li>
</ol>
4. Analiza UHPLC/MS-MS
<ol>
	<li>Przygotować system UHPLC, napełniając go układem fazy ruchomej (95% A:5% B): 
	A: H2O, klasy HPLC, zawierający 0,1% kwasu mrówkowego (przygotować 1 L) 
	B: Acetonitryl, stopnia HPLC, zawierający 0,1% kwasu mrówkowego (przygotować 1 l). 
	Uwaga: Faza ruchoma zawiera związki organiczne, które są łatwopalne i toksyczne w przypadku połknięcia lub wdychania. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawiczki i okulary ochronne.</li>
	<li>Umieść płytkę 96-dołkową w managerze próbek wyposażonym w uchwyt do płytek. Przeanalizuj próbki zgodnie z podanymi warunkami UHPLC-ESI-MS/MS w Tabela 1. 
	UWAGA: Każda kolumna analitycznej płytki 96-dołkowej powinna zawierać jeden dołek kontrolny i jeden dołek ślepy (zgodnie z przedstawionym schematem płytki) Rycina 1A). Próby kontrolne reprezentują 100% aktywności enzymatycznej w badanej linii komórkowej, natomiast próby ślepe służą do sprawdzenia, czy źródło MS zapewnia spójne tło. Niezwykłe piki MS wykryte w danej próbie ślepej powinny zostać zbadane, aby zapobiec zmianom czułości MS.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Zintegruj pole powierzchni piku dla każdego substratu oraz jego zdeacetylowanego produktu przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do integracji UHPLC. 
	UWAGA: Należy zastosować parametry integracji automatycznej z metodą wygładzania (na przykład: średnia, rozmiar okna 3 i liczba wygładzeń 2). Przy zastosowaniu warunków chromatograficznych podanych w Tabeli 1, kolejność elucji to: dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (6,2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8,9 min) oraz BATCP (9,8 min), co przedstawiono na Ryc. 1C.</li>
	<li>Dla każdego substratu oblicz stosunek pól powierzchni pików (zdeacetylowany/acetylowany) w każdym chromatogramie (próbki badawcze i kontrolne).</li>
	<li>Oblicz procent hamowania HDAC dla każdej próbki badawczej: 
	<img alt="Wzór na procent hamowania, % Inhibition=100-(Test ratio x 100/Control ratio)." src="/files/ftp_upload/55878/55878eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
	UWAGA: Hamowanie HDAC1 oblicza się na podstawie stosunku pól powierzchni pików dMOCPAC/MOCPAC; hamowanie HDAC6 oblicza się na podstawie stosunku dBATCP/BATCP. Stosunek dMAL/MAL można wykorzystać do określenia ogólnego hamowania HDAC.</li>
</ol>

<ol><li>Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+protein+families%3A+a+new+frontier+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).</li>
<li>Henikoff, S., Greally, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+cellular+memory+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, cellular memory and gene regulation.</a> Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+inhibitor+blocks+amyloid+beta-induced+impairment+of+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li>
<li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deacetylase+HDAC6+regulates+aggresome+formation+and+cell+viability+in+response+to+misfolded+protein+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress.</a> Cell. 115 (6), 727-738 (2003).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+p53+at+lysine+373%2F382+by+the+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+induces+expression+of+p21%28Waf1%2FCip1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1).</a> Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://expert.sgst.cn/upload/attach/attach200904010401046mjwfsp6qt.pdf">Histone modifications in transcriptional regulation.</a> Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).</li>
<li>Simões-Pires, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+as+a+target+for+neurodegenerative+diseases%3A+what+makes+it+different+from+the+other+HDACs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?</a> Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).</li>
<li>Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+in+clinical+studies+as+templates+for+new+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents.</a> Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).</li>
<li>Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+histone+deacetylase+as+antitumor+agents%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review.</a> Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).</li>
<li>Mack, G. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21139608">To selectivity and beyond.</a> Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).</li>
<li>U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751</a> (1211).</li>
<li>U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283</a> (2012).</li>
<li>U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840</a> (2013).</li>
<li>U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242</a> (2015).</li>
<li>Yee, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ricolinostat+plus+lenalidomide%2C+and+dexamethasone+in+relapsed+or+refractory+multiple+myeloma%3A+a+multicentre+phase+1b+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial.</a> Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).</li>
<li>Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1517/13543776.13.6.935">Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity.</a> Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935(2003).</li>
<li>Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+multi-substrate+assay+coupled+to+UHPLC-ESI-MS%2FMS+for+a+quick+identification+of+class-specific+HDAC+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Enzyme+Inhibi+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors.</a> J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).</li>
<li>Khan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+class+and+isoform+selectivity+of+small-molecule+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).</li>
<li>Glaser, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+acetylation+induced+by+novel+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).</li>
<li>Butler, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+simple+chemistry+yield+a+superior%2C+neuroprotective+HDAC6+inhibitor%2C+tubastatin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A.</a> J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).</li>
<li>Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJung%2C+M+%22Epigenetic+Targets+in+Drug+Discovery%22">Epigenetic Targets in Drug Discovery</a>. Sippl, W., Jung, M. , Wiley-VCH. (2010).</li>
<li>Milli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+cellular+response+to+novel+proapoptotic+agents+related+to+atypical+retinoids+in+human+IGROV-1+ovarian+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells.</a> J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).</li>
<li>Zwick, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+selective+HDAC6+inhibitor+active+in+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).</li>
<li>Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homogeneous+cellular+histone+deacetylase+assay+suitable+for+compound+profiling+and+robotic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening.</a> Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).</li>
<li>Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+selective+substrates+for+histone+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Subtype selective substrates for histone deacetylases.</a> J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).</li>
<li>Copeland, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCopeland%2C+RA+%22Evaluation+of+enzyme+inhibitors+in+drug+discovery%22">Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery</a>. , Wiley. (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hamowanie HDAC jest gorącym tematem w odkrywaniu leków, z obecnym naciskiem na selektywne inhibitory HDAC6 w terapii nowotworów21. Selektywność HDAC jest zwykle oceniana za pomocą serii wysokoprzepustowych, bezkomórkowych testów, które mają na celu określenie siły hamującej w stosunku do poszczególnych izoform HDAC21. Jednak selektywność inhibitora musi być dodatkowo potwierdzona w żywych komórkach poprzez ocenę statusu acetylacji endogennych substratów białkowych, takich j...

HDAC należą do rodziny enzymów zdolnych do deacetylacji histonów w obrębie struktury chromatyny. Posiadają one również inne substraty białkowe w cytozolu i występują w różnych przedziałach komórkowych. Do tej pory zidentyfikowano łącznie 18 izoform HDAC, które powiązano z wieloma mechanizmami komórkowymi, w tym z regulacją czynników transkrypcyjnych i ekspresji genów, a także z sygnalizacją i transportem komórkowym1,2,3,4,5,6,7. Inhibitory katalityczne HDAC pojawiły się jako potencjalne leki w terapii nowotworów. Większość inhibitorów HDAC zatwierdzonych obecnie przez FDA służy do leczenia chłoniaka z komórek T oraz szpiczaka mnogiego i są to niespecyficzne inhibitory HDAC, takie jak vorinostat (SAHA), belinostat i panobinostat8,9. Jednakże z inhibitorami pan-HDAC wiąże się szereg skutków ubocznych, a poszukiwanie małocząsteczkowych związków specyficznych dla danych izoform jest obecnie gorącym tematem w chemii medycznej i odkrywaniu leków. W związku z tym romidepsyna, selektywny inhibitor klasy I (HDAC1-3 i HDAC8), jest lekiem już zatwierdzonym10, podczas gdy inhibitory specyficzne dla HDAC6 znajdują się obecnie w fazie badań klinicznych, wykazując zwiększony potencjał terapeutyczny w leczeniu szpiczaka mnogiego11,12,13,14,15.
Testy przesiewowe służące do charakteryzacji inhibitorów HDAC opierają się na inkubacji substratu HDAC z źródłem enzymatycznym (pojedynczą izoformą, ekstraktem jądrowym lub lizatem komórkowym). Substrat stanowi zazwyczaj krótka sekwencja peptydowa zawierająca resztę acetyloizoleucyny sprzężoną z rozszczepialnym fluoroforem (np. kumaryną), taką jak N-(4-metylo-7-aminokumarynylo)-Nα-(t-butoxykarbonylo)-Nω-acetyloizoleucynamid (MAL)16. Aby rozróżnić aktywności specyficzne dla danej izoformy, konieczne jest przeprowadzenie oddzielnych testów bezkomórkowych z udziałem każdej izoformy, co może nie odzwierciedlać rzeczywistej aktywności izoform w żywych komórkach. Dostępne są komercyjnie substraty specyficzne dla izoform, takie jak benzylowy (S)-[1-(4-metylo-2-okso-2H-chromen-7-ylokarbamoilo)-5-propionyloaminopentyl]karbaminian (MOCPAC, substrat specyficzny dla HDAC1) oraz (S)-[5-acetyloamino-1-(2-okso-4-trifluorometylo-2H-chromen-7-ylokarbamoilo)pentyl]kwas karbamowy tert-butyl ester (BATCP, substrat specyficzny dla HDAC6) (Ryc. 1B). Jednakże zastosowanie w żywych komórkach mieszaniny wielu substratów zawierającej MAL, MOCPAC i BATCP nie pozwoli na wykrycie poszczególnych produktów deacetylacji za pomocą pomiaru fluorometrycznego, ponieważ posiadają one ten sam rozszczepialny fluorofor.
Opisana tutaj metoda umożliwia detekcję i względną kwantyfikację każdego substratu oraz jego deacetylowanego produktu w komórkach HeLa przy użyciu testu wielosubstratowego, a następnie analizy UHPLC-ESI-MS/MS17. Test HDAC przeprowadza się na komórkach HeLa, aby umożliwić bezpośrednią identyfikację aktywności hamującej HDAC oraz specyficzności badanych związków w odniesieniu do endogennych HDAC. Szczególna uwaga skupiona jest na HDAC1 i HDAC6, które są oceniane jednocześnie. Aby przeprowadzić te pomiary enzymatyczne w ramach jednego testu z inkubacją, do traktowanych i nietraktowanych komórek HeLa wysianych na płytce 96-dołkowej dodaje się mieszaninę nieswoistych i swoistych substratów HDAC. Po etapie inkubacji komórki są lizowane w celu uwolnienia substratów i odpowiadających im produktów reakcji, które są rozdzielane i wykrywane metodą UHPLC-MS (Rysunek 1C). Produktami deacetylacji substratów MAL, MOCPAC i BATCP są odpowiednio deacetylowany MAL (dMAL), deacetylowany MOCPAC (dMOCPAC) i deacetylowany BATCP (dBATCP). Dla związków aktywnych można wykreślić krzywe zależności efektu od dawki.
<img alt="Test inhibicji komórek w płycie z chromatogramem UHPLC-MS do analizy związków i reakcji substratów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ogólny schemat testu HDAC w oparciu o komórki w celu identyfikacji inhibitorów specyficznych dla HDAC1 i HDAC6 poprzez analizę wielu substratów za pomocą UHPLC-MS. (A) Schemat typowej płytki 96-dołkowej zawierającej komórki HeLa poddane działaniu związków testowych oraz niepoddane działaniu związków (kontrola), a także próbki ślepe bez komórek. (B) Struktura chemiczna substratów dodanych w formie mieszaniny (każdy w stężeniu 21 µM) w celu deacetylacji przez endogenne HDAC. (C) Typowy chromatogram UHPLC-MS przedstawiający piki dodanych substratów (MAL, MOCPAC i BATCP) oraz ich produktów deacetylacji (odpowiednio dMAL, dMOCPAC i dBACTP). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>BATCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4061</td><td></td></tr><tr><td>MAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCP0168</td><td>Synonim: BOC-Ac-Lys-AMC</td></tr><tr><td>MOCPAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2195</td><td></td></tr><tr><td>MS275</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EPS002</td><td></td></tr><tr><td>Trichostatyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td></td></tr><tr><td>Tubastatyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0044</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, klasa LC/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>10596814</td><td></td></tr><tr><td>H2O,</td><td>destylowany H2O klasy HPLC</td><td></td><td></td> przefiltrowany przez system oczyszczania Milli-Q</tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Dysocjacja komórek odczynnik TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, klasa hodowli komórkowej</td><td>Applichem</td><td>146463</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor RIPA</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki inhibitora proteazy SigmaFast</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe, sterylne, płaskodenne, poddane hodowli tkankowej Corning</td><td>VWR</td><td>29442-058</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe, niesterylne, V-bottom Corning</td><td>VWR</td><td>29442-404</td><td>stosowane na etapie wirowania</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa, stożkowe dno, Nunc</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>249944</td><td>kompatybilna z systemem Acquity UHPLC</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych T75 Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>Zrywalna folia termozgrzewalna</td><td>System</td> UPLC <td>Waters 186002789</td><td></td></tr><tr><td>Acquity</td><td></td> Wirówka Waters <td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-413-323</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie integracyjne: MassLynx V4.1</td><td>Waters</td><td></td><td>Numer katalogowy niedostępny</td></tr><tr><td>Zgrzewarka termiczna Combi SP-0669/240</td><td>Waters</td><td></td><td>Numer katalogowy niedostępny</td></tr><tr><td>Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td><td>Waters</td><td></td><td>Numer katalogowy niedostępny</td></tr></tbody></table>

jednoczesny pomiar aktywności hdac1 i hdac6 w komórkach hela za pomocą uhplc-ms

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Poszukiwanie nowych inhibitorów deacetylazy histonowej (HDAC) cieszy się coraz większym zainteresowaniem w odkrywaniu leków. Selektywność izoform znajduje się w centrum uwagi od czasu zatwierdzenia romidepsyny, inhibitora HDAC klasy I do terapii nowotworów, oraz badania klinicznego inhibitorów specyficznych dla HDAC6 w leczeniu szpiczaka mnogiego. Niniejsza metoda służy do oznaczania aktywności hamującej badanych związków na HDAC1 i HDAC6 w komórkach. Aktywność izoformy mierzy się za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej – analizy spektrometrii mas (UHPLC-MS) określonych substratów inkubowanych z leczonymi i nietraktowanymi komórkami HeLa. Zaletą tej metody jest to, że odzwierciedla endogenną aktywność HDAC w środowisku komórkowym, w przeciwieństwie do bezkomórkowych testów biochemicznych przeprowadzanych na izolowanych izoformach. Ponadto, ponieważ metoda opiera się na oznaczaniu ilościowym substratów syntetycznych, nie wymaga rozpoznawania przeciwciał endogennych białek acetylowanych. Można go łatwo dostosować do kilku linii komórkowych i zautomatyzowanego procesu. Metoda ta okazała się już przydatna w poszukiwaniu związków selektywnych dla HDAC6 w neuroblastach. Reprezentatywne wyniki przedstawiono tutaj dla standardowych inhibitorów HDAC trichostatyny A (nieswoistej), MS275 (specyficznej dla HDAC1) i tubastatyny A (specyficznej dla HDAC6) przy użyciu komórek HeLa.

Aby zademonstrować zastosowanie tej metody do identyfikacji inhibitorów nieselektywnych i selektywnych dla HDAC1 (klasa I) oraz HDAC6 (klasa IIb), komórki HeLa potraktowano znanymi związkami standardowymi: trichostatiną A (nieselektywną w odniesieniu do HDAC1 i HDAC6)18, MS275 (inhibitorem selektywnym dla HDAC1)19 oraz tubastatiną A (inhibitorem selektywnym dla HDAC6)20. Wykorzystując niniejszą metodę (<strong class="...

Obecna metoda służy do identyfikacji specyficznych dla izoform inhibitorów deacetylaz histonowych (HDAC) w komórkach HeLa za pomocą analizy UHPLC-MS wielu substratów. Jest to metoda wolna od przeciwciał opracowana w celu odzwierciedlenia aktywności HDAC1 i HDAC6 w środowisku żywych komórek, w przeciwieństwie do testów bezkomórkowych z pojedynczymi izoformami.

Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Ogólnym celem tej metody jest określenie potencjału hamującego HDAC przez związki oraz identyfikacja selektywności wobec HDAC6 lub HDAC1 w komórkach przy użyciu pojedynczego testu z wykorzystaniem ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie poszukiwania leków, takie jak ustalenie, czy inhibitor HDAC jest selektywny dla HDAC6 w stosunku do HDAC klasy I w żywych komórkach. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga ona pojedynczego etapu inkubacji komórek, inhibitorów i selektywnych substratów w celu jednoczesnego określenia aktywności przeciwko dwóm izoformom HDAC.Zastosowanie tej techniki rozszerza się na wczesny etap poszukiwania selektywnych inhibitorów HDAC, ponieważ pozwala ona stwierdzić, czy selektywność wobec HDAC6 jest zachowana w żywych komórkach, z pominięciem analiz acetylacji endogennych białek. Chociaż metoda ta ocenia selektywność inhibitorów HDAC w komórkach HeLa, może ona zostać zastosowana również do innych linii komórkowych, takich jak pierwotne komórki oraz inne komórki nowotworowe, w tym materiały kliniczne. Hodować komórki HeLa do 80% konfluencji w kolbie hodowlanej T75 w minimalnej pożywce niezbędnej (MEM) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, penicylinę G oraz streptomycynę.Przemyj komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami roztworu Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline. Następnie odessij bufor i dodaj jeden mililitr odczynnika do dysocjacji komórek. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć minut, aby odczepić komórki.Po pięciu minutach dodać dziewięć mililitrów pożywki MEM do komórek i dokładnie resuspender zawiesinę komórkową. Przenieść komórki do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Dostosować gęstość zawiesiny komórkowej do poziomu 60 000 komórek na mililitr w pożywce MEM.Następnie dodaj 100 µL zawiesiny komórkowej do studzienek kontrolnych i testowych sterylnej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem, przeznaczonej do hodowli tkanek. Następnie dodaj 100 µL pożywki hodowlanej MEM do studzienek pustych (blank) płytki 96-dołkowej. Inkubuj płytkę 96-dołkową w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.Odssać pożywkę z dołków płytki 96-dołkowej. Podczas odsysania pożywki należy unikać odrywania i usuwania komórek z dołka. Można to osiągnąć, stosując niską prędkość odsysania i ostrożnie umieszczając końcówki ssące w narożniku dna powierzchni dołka.Następnie do dołków testowych dodaj 25 µL dwukrotnie stężonych związków testowych w MEM, w tym Trichostatin A, MS275 oraz Tubastatin A. Do dołków kontrolnych i pustych dodaj 25 µL MEM. Następnie do dołków kontrolnych i testowych dodaj 25 µL mieszaniny substratu. Na koniec do dołków pustych dodaj 25 µL MEM.Inkubować płytkę 96-dołkową w temperaturze 37 °C przez osiem godzin w inkubatorze z dodatkiem 5% dwutlenku węgla i zapewnioną wilgotnością. Aby przeprowadzić lizę komórek, należy najpierw dodać 10 µL sześciokrotnie stężonego buforu RIPA z dodatkiem inhibitora proteaz do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Reakcję zatrzymać poprzez dodanie 160 µL zimnego acetonitrylu do każdego dołka i wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół.Umieść płytkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 10 minut. Wyjmij płytkę z zamrażarki i przenieś 220 µL zawartości każdego dołka do niesterylnej płytki 96-dołkowej z stożkowym dnem. Wirowarkuj płytkę przy 5 000 ×g i temperaturze 4 °C przez 10 minut.Po wirowaniu przenieś 200 µL nadsączu do płytki 96-dołkowej kompatybilnej z systemem UHPLC. Następnie szczelnie zamknij płytkę za pomocą zgrzewarki do płytek, używając odrywalnej folii termozgrzewalnej. Przygotuj system ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas, napełniając go fazą ruchomą.Umieść płytkę 96-dołkową w próbnikach wyposażonych w uchwyt na płytki. Próbki analizuj zgodnie z warunkami UHPLC ESI MS/MS opisanymi w tekście. W celu przeprowadzenia analizy danych, zintegruj pole powierzchni piku dla każdego substratu oraz jego deacetylowanego produktu za pomocą odpowiedniego oprogramowania do integracji UHPLC.Dla każdego substratu oblicz stosunek powierzchni piku formy deacetylowanej do acetylowanej w każdym chromatogramie. Uwzględnij próbki testowe oraz kontrolne. Na koniec oblicz procentową inhibicję HDAC dla każdej próbki testowej zgodnie z równaniem zawartym w protokole tekstowym.Przedstawiono tutaj chromatogram UHPLC-MS próbki. Piki odpowiadające substratom dodanym do komórek są wykrywane zgodnie z ich przejściami masowymi opisanymi w tabeli pierwszej protokołu pisemnego. MOCPAC ulega deacetylacji przez HDAC1, co daje pik deacetylowanego MOCPAC.Podobnie, BATCP jest deacetylowany przez HDAC6, co daje pik deacetylowanego BATCP. Na koniec MAL dostarcza piku deacetylowanego MAL, który odzwierciedla nieswoistą deacetylację kilku endogennych HDAC. Przedstawiono tutaj rycinię z chromatogramem uzyskanym przy różnych stężeniach inhibitora HDAC, Trichostatyny A. Przeprowadzono ocenę odpowiedzi na dawkę standardowych inhibitorów HDAC.Zintegrowane wartości uzyskane z MOCPAC i dMOCPAC zostały wykorzystane do obliczenia aktywności inhibitorów wzorcowych przeciwko HDAC1. Po obliczeniu wartości IC 50 wykazano, że MS275, selektywny inhibitor HDAC klasy I, charakteryzuje się niższymi wartościami IC 50 dla HDAC1 niż Tubastatyna A, znany inhibitor HDAC6. Z kolei wartości izolowane z BATCP i dBATCP posłużyły do obliczenia aktywności wzorców przeciwko HDAC6.W tym przypadku Tubastatin A wykazała niższą wartość IC 50 niż MS275, co potwierdza profil selektywności izoform tych związków. Trichostatin A jest silnym, nieselektywnym inhibitorem. Po opanowaniu tej techniki, cały proces może zostać przeprowadzony w ciągu 72 godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania, wliczając czas inkubacji komórek oraz analizę płytki 96-dołkowej.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wskazane tutaj czasy inkubacji dotyczą komórek HeLa. W przypadku zastosowania innej linii komórkowej parametry te wymagają optymalizacji. Po wykonaniu tej procedury można zmierzyć selektywną aktywność inhibicyjną innych izoform HDAC, o ile dostępne są specyficzne substraty.Należy pamiętać, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi i innymi odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić okulary ochronne, rękawiczki oraz fartuch laboratoryjny.

simultaneous-measurement-hdac1-hdac6-activity-hela-cells-using-uhplc

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisujemy zestaw analiz służących do badania poziomów ekspresji histonów łączących H1. Ilościowy pomiar mRNA poszczególnych genów H1 przeprowadzono za pomocą odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem randomowych starterów, a następnie w czasie rzeczywistym za pomocą techniki PCR, natomiast do ilościowego oznaczenia białek histonów H1 wykorzystano analizę HPLC.

Analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Technologia HaloTag to wielofunkcyjna technologia, która odniosła znaczący sukces w izolacji zarówno małych, jak i dużych kompleksów białkowych z komórek ssaków. Tutaj podkreślamy zalety tej technologii w porównaniu z istniejącymi alternatywami i pokazujemy jej użyteczność do badania wielu aspektów funkcji białek wewnątrz komórek eukariotycznych.

Odkrywanie interakcji białek i charakteryzowanie funkcji białek za pomocą technologii HaloTag

W tym protokole opisujemy nowatorską technikę BrdU-ChIP-Slot-Western do badania białek i modyfikacji histonów związanych z nowo zsyntetyzowanym lub powstającym DNA.

Badanie białek związanych z powstającym DNA w komórkach ssaków techniką BrdU-ChIP-Slot-Western

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Inhibitory acetylotransferaz histonowych (HAT, znane również jako acetylotransferazy lizyny), takie jak CBP/p300, są potencjalnymi terapiami w leczeniu raka. Potrzebne są jednak rygorystyczne metody walidacji tych inhibitorów. Trzy metody walidacji in vitro obejmują testy HAT z rekombinowanymi acetylotransferazami, immunoblotting acetylacji histonów w hodowli komórkowej oraz ChIP-qPCR.

Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Szybkie i dokładne testy chemiczne do badań przesiewowych pod kątem określonych inhibitorów są ważnym narzędziem w arsenale rozwoju leków. Tutaj przedstawiamy skalowalny test chemiczny acetylu do pomiaru hamowania aktywności acetylacji HAT1.

Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Poznaj metodę jednoczesnego pomiaru aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS. Technika ta umożliwia szybką ocenę selektywności inhibitorów w żywych komórkach, wspierając odkrywanie leków.

Jednoczesny pomiar aktywności HDAC1 i HDAC6 w komórkach HeLa za pomocą UHPLC-MS

Przeglądaj więcej filmów