Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny

Medycyna spersonalizowana wymaga różnych rodzajów analizy, od klasycznej histologii po analizę molekularną, a na guzie wykonuje się różne techniki in situ, aby wybrać najlepszą terapię. Techniki badawcze pozwalają na stosowanie różnych technologii analitycznych na podstawie pojedynczej próbki. Pokazujemy tutaj, używając niesieciującego utrwalacza w prostym etapie formaliny po utrwaleniu, że można użyć protokołów pierwotnie opracowanych i zwalidowanych dla formalnego i utrwalonego materiału zatopionego w parafinie, które można zastosować z próbki komórki, dając dobrą morfologię, dobrą jakość RNA i dobre wyniki dla pełniejszej hybrydyzacji in-situ.

Typowe warunki hybrydyzacji nie są odpowiednie dla utrwalonych tkanek bez formaliny do generowania wyników FISH. Wykazaliśmy, że to nie penetracja, ale czas korekcji chemicznej ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia porównywalnych wyników FISH z tkanki utrwalonej pektyną. Tylko sekcja używana dla FISH jest formalna i poprawiona po postach.

Pozostała utrwalona tkanka wolna od formaliny umożliwia lepszą analizę molekularną w stosunku do tkanki FFP, jak wykazano za pomocą RTPCR. Procedura, którą zademonstrowaliśmy przez Danielę Pabst, technika z mojego laboratorium. Na początek pokrój próbki tkanki raka piersi sterylnym skalpelem na dwie połówki, każda o grubości czterech milimetrów, aby zapewnić odpowiednią ilość tkanki.

Użyj maksymalnego rozmiaru 4x15x15 millimiterów do utrwalenia za pomocą standardowego buforowanego roztworu formaliny lub poprzez alternatywne, niesieciujące, wolne od formaliny utrwalanie tkanek. Umieść połowę próbki guza w standardowej kasecie na tkanki i zanurz ją w SBFS. Umieść drugą połowę próbki guza w alternatywnym roztworze utrwalającym na 24 godziny ze stosunkiem objętości do objętości czterech części utrwalacza i jednej części tkanki.

Następnie przenieś alternatywnie utrwalone próbki do roztworu stabilizatora na dwie do 72 godzin, otwierając pojemnik, obracając kasetę na tkanki o 180 stopni i zanurzając ją. Następnie umieść kasety z tkankami z próbkami utrwalonymi za pomocą SBFS w pojemniku wypełnionym 70% etanolem na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć pozostałości SBFS. Po przetworzeniu tkanek i zatopieniu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, użyj mikrotomu, aby wyciąć trzy mikronowe odcinki bloków FFPE i NCFPE.

Umieść po części każdego rodzaju sekcji w zimnej kąpieli wodnej. Podnieś pływającą sekcję cienkim pędzlem na cienkim szkiełku mikroskopowym i przenieś ją do ciepłej łaźni wodnej. Ponownie podnieś rozciągnięte odcinki pędzlem na szkiełko mikroskopowe bez żadnych zmarszczek.

Przygotuj się również do izolacji RNA, aby przeprowadzić PCR z odwrotną transkrypcją na tej samej próbce, umieszczając część każdego rodzaju sekcji w fiolce reakcyjnej. W celu odparafinowania skrawków tkanek nawadniamy skrawki stopniowo w temperaturze pokojowej w słoikach do barwienia za pomocą 250 mililitrów różnych odczynników. Najpierw umieść skrawki w 100% ksylenie dwa razy na 15 minut, a następnie przenieś skrawki do 96% etanolu dwa razy na 15 minut.

Następnie przenieś sekcje przez stopniowo obniżające się procenty etanolu, inkubując każdy roztwór przez dwie minuty. Na koniec przenieś skrawki do destylacji dwa razy przez 10 minut. Wykonaj utrwalanie szkiełek NCFPE, wkładając je do nowego słoika do barwienia wypełnionego SBFS na 24 godziny w temperaturze pokojowej.

Pozostaw słoik w dygestorium podczas 24-godzinnego etapu po utrwaleniu. Co zaskakujące, wszystkie czasy po utrwaleniu dłuższe niż 18 godzin dały wyniki podobne do uzyskanych z formalnego i utrwalonego materiału parafinowego. Usuń nadmiar SPFS ze szkiełek, myjąc je trzykrotnie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przez 10 minut.

Następnie dwa razy przemyj w wodzie destylowanej przez 10 minut. Następnie umieść słoik do barwienia zawierający 250 mililitrów roztworu do wstępnej obróbki cieplnej cytryny w łaźni wodnej o temperaturze 98 stopni Celsjusza. Umieść uwodniony FFPE w szkiełkach NCFPE po utrwaleniu w słoiku i inkubuj przez 15 minut.

Następnie umyj szkiełka w wodzie destylowanej przez trzy minuty w temperaturze pokojowej w nowym słoiku do barwienia. W celu proteolizy umieść szkiełka w hybrydyzacji o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gotowy do użycia roztwór pepsyny należy natychmiast nanieść kroplami na skrawki tkanki, aż zostaną całkowicie pokryte.

Następnie inkubuj przez dziewięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w systemie hybrydyzacji. Następnie umieść szkiełka w słoiku zawierającym bufor do płukania SSC i inkubuj przez pięć minut. Umieść szkiełka w wodzie destylowanej na jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Wykonaj odwodnienie sekcji w serii stopniowanych alkoholi, każdy przez jedną minutę. Po serii odwadniania wysusz sekcje na powietrzu. W celu hybrydyzacji należy odpipetować 10 mikrolitrów połączonej sondy HER2 i sun 17 na wysuszone skrawki tkanki, przykryć każdą próbkę szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić cementem gumowym.

Koduj denaturację sondy i próbki DNA w systemie hybrydyzacji w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez 10 minut. System hybrydyzacji automatycznie spada do 37 stopni Celsjusza, a hybrydyzacja zachodzi z dnia na dzień. Następnego dnia ostrożnie usuń cement kauczukowy i szkiełka nakrywkowe, a także kleszcze w celu późniejszej hybrydyzacji i ochrony.

Inkubuj rozmiary w słoiku do barwienia zawierającym 37 stopni Celsjusza wstępnie podgrzany 1X bufor A przez pięć minut. Następnie umyj szkiełka za pomocą wstępnie podgrzanego bufora myjącego 1X dwukrotnie przez pięć minut w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Następnie odwodnić szkiełka w 70%, 90% i 100% etanolu w ciągu jednej minuty dla każdego stężenia.

Wysuszyć próbki na powietrzu i chronić je przed światłem. Do barwienia nałóż 30 mikrolitrów roztworu DAPI na hybrydyzowany obszar, unikając pęcherzyków. Przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym przed inkubacją przez 15 minut, chroniąc je przed światłem.

Ostrożnie usunąć nadmiar roztworu DAPI, delikatnie naciskając szkiełko między bibułą filtracyjną. Przechowuj szkiełka w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza w ciemności przez okres do dwóch tygodni, aż do oceny za pomocą mikroskopii konfokalnej. Uzyskaj obrazy z filtrami dla kanałów zielonego i pomarańczowego.

Przystąp do interpretacji danych i oceny jakości RNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pokazano tutaj bezpośrednie porównanie wyniku uzyskanego z próbki formalnej i utrwalonej oraz próbki utrwalonej niesieciującej, która została utrwalona po utrwaleniu. Sygnały mają podobną intensywność, podobnie jak tło.

W normalnych komórkach interfazowych występuje równa liczba czerwonych i zielonych sygnałów odpowiadających locus HER2 i locus odniesienia sen 17, co pokazuje, że w genie HER2 nie ma amplifikacji. Pokazany tutaj jest wynik innego przypadku, w którym gen HER2 jest amplifikowany, a sygnał dla locus HER2 jest znacznie silniejszy i szerszy niż dla genu referencyjnego. Zjawisko to jest widoczne w tkance utrwalonej formalnej i utrwalonej oraz niesieciowanej.

Ten wykres pokazuje skuteczność amplifikacji dla różnych długości amplikonów mRNA GAPDH. W przypadku formaliny konieczne są około 23 cykle, a w przypadku niesieciującego materiału stałego jest to skracane do 20 cykli. Różnica staje się bardziej widoczna przy dłuższych amplikonach, co wskazuje, że zarówno fragmentacja, jak i modyfikacja chemiczna są znacznie zmniejszone dzięki zastosowaniu utrwalaczy niesieciujących.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób można użyć zatwierdzonego przez FDA klucza do materiału FFPN na niesieciowanym materiale stałym, dodając prosty krok po utrwaleniu w procedurze przedanalitycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że tylko sekcja używana do hybrydyzacji in-situ z pełnym sensem jest przeznaczona do utrwalania formaliną, podczas gdy pozostały blok jest utrwalany w utrwalaczu nieusieciowanym, a zatem może być używany do szerokiego spektrum analiz molekularnych. Protokół ten jest szczególnie przydatny w kontekście nowoczesnej medycyny spersonalizowanej, gdy konieczne jest wykonanie wielu analiz ze stosunkowo małych guzów, a przetwarzanie próbek tkanek dla różnych protokołów nie jest możliwe.

Co więcej, stosowanie utrwalacza niesieciującego ma tę zaletę, że zachowuje właściwości tkanek, takie jak kriokonserwacja. Pozwala to uniknąć konieczności zamrażania ciekłego azotu i utrzymania łańcucha chłodzenia w kontekście chemicznym. Te różnice w jakości RNA nie są oczywiste, tak więc przy użyciu klasycznych testów kontroli jakości RNA, takich jak liczby integralności RNA, ponieważ testy te nie są w pełni kształtujące pod względem jakości RNA wyizolowanego z materiału utrwalonego i zatopionego w parafinie.