Name: Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj protokół HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego utrwalacza bez formaliny, umożliwiającego analizę morfologiczną i molekularną z tej samej próbki nowotworowej. Metoda ta wspiera spersonalizowaną medycynę poprzez integrację wielu technik diagnostycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy zespołowi laboratorium patologii molekularnej w Instytucie Patologii Uniwersytetu Medycznego w Grazu za ich wiedzę i wsparcie. Ponadto dziękujemy Iris Kufferath i Danieli Pabst za pomoc techniczną, Bernadette Rieger i Sylvii Eidenhammer za opracowanie przypadków HER2, a także Kingi Szurian (patolog) i Tamasowi Regényi (3DHISTEC). Dziękujemy Penelope Kungl za korektę rękopisu. Prace te zostały wsparte finansowo przez Chrześcijański Fundusz Badawczy Dopplera, Austriackie Federalne Ministerstwo Nauki, Badań i Gospodarki oraz Narodową Fundację Badań, Technologii i Rozwoju.

Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Grazu (numer referencyjny 20-066), Austria. Próbki tkanek pobrano z dwóch przypadków chirurgicznie wyciętego pierwotnego inwazyjnego raka piersi po wyrażeniu przez pacjentki pisemnej świadomej zgody.
1. Utrwalenie tkanek
UWAGA: Utrwalanie tkanek odbywa się za pomocą standardowego buforowanego roztworu formaliny (SBFS), zdefiniowanego jako 10 % roztwór formaliny zawierający udział masowy 3,7 % (co odpowiada ułamkowi objętościowemu 4 %) formaldehydu buforowanego do pH 6,8 do pH 7,2 zgodnie z CEN/TS 16827-1:2015 lub niesieciowany, wolny od formaliny system utrwalania tkanek (określany również jako alternatywny roztwór utrwalający poniżej) składający się z roztworu utrwalającego i stabilizującego w temperaturze pokojowej (RT).
<ol>
	<li>Pokrój próbki tkanki raka piersi sterylnym skalpelem na dwie połówki o grubości 4 mm każda, aby zapewnić odpowiednią ilość tkanki. Użyj maksymalnego rozmiaru 4 x 15 x 15 mm do mocowania tkanek NCFPE lub SBFS.</li>
	<li>Umieść każdą połówkę próbki guza w standardowej kasecie tkankowej i zanurz ją w SBFS lub alternatywnym roztworze utrwalającym na 24 godziny ze stosunkiem objętości do objętości (v/v) 4 części utrwalacza i jednej części tkanki (4 ml / 1 g tkanki (najlepiej 10 ml / 1 g)).</li>
	<li>Przenieść alternatywnie utrwalone próbki do roztworu stabilizatora na 2-72 godziny, otwierając pojemnik, obracając kasetę z tkankami o 180° i zanurzając ją.</li>
	<li>Umieścić kasety z tkankami z próbkami utrwalonymi przez SBFS w 250 ml 70 % etanolu na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pozostałości SBFS. 
	UWAGA: Ten krok jest ważny, aby uniknąć zanieczyszczenia SBFS próbek poddanych działaniu utrwalacza niesieciującego w automatycznym procesorze tkanek, co zniszczyłoby korzystne właściwości utrwalaczy niesieciujących dla zachowania biomolekuł. 
	UWAGA: SBFS jest niebezpiecznym roztworem, powoduje podrażnienie skóry, poważne uszkodzenie oczu, może powodować alergiczną reakcję skórną, podejrzewa się o powodowanie wad genetycznych, może powodować raka, podrażnienie dróg oddechowych, senność i powoduje uszkodzenia narządów. Alternatywny utrwalacz jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu, działa drażniąco na oczy i skórę, co grozi bardzo poważnymi, nieodwracalnymi skutkami w wyniku wdychania, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. W przypadku obu roztworów utrwalających należy unikać wdychania i kontaktu fizycznego. Nosić odpowiednią odzież ochronną, rękawice oraz ochronę oczu i twarzy. Praca pod wyciągiem.</li>
	<li>Przejdź do przetwarzania tkanek, osadzania i cięcia tkanek (sekcje 2 i 3).</li>
</ol>
2. Przetwarzanie i osadzanie tkanek
<ol>
	<li>Przeprowadzić stopniowe odwadnianie kaset tkankowych za pomocą utrwalonych próbek tkanek w 70 % (2 x 15 min), 80 % (30 min), 90 % (60 min) i 99 % (2 x 60 min) etanolu, a następnie ksylenu (2 x 60 min). Następnie naciekać parafiną w automatycznym procesorze tkanek (4 x 45 min).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy umieść odwodnione i naciekane parafiną próbki (alternatywnie i utrwalone SBFS) w metalowych formach.</li>
	<li>Zanurzyć próbki w 5 - 10 ml stopionej parafiny (temperatura krzepnięcia 56-58 °C) za pomocą przyrządu do zatapiania parafiny.</li>
	<li>Umieścić foremki na płycie chłodzącej w temperaturze -5 °C na 30 minut.</li>
	<li>Odzyskaj bloki tkanek zatopione w parafinie z form.</li>
	<li>Powstałe w ten sposób bloki (alternatywnie utrwalone, zatopione w parafinie (NCFPE) i zatopione w parafinie SBFS (FFPE)) należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Cięcie tkanek i przygotowanie preparatu dla FISH
UWAGA: Sekcje FFPE są bezpośrednio używane do FISH, podczas gdy slajdy z sekcjami NCFPE są mocowane w SBFS na 24 godziny przed procedurą FISH.
<ol>
	<li>Włóż jednorazowe ostrze do mikrotomu i ustaw mikrotom na 10 μm.</li>
	<li>Wyjmij pierwszy blok z płyty chłodzącej i włóż go do instrumentu.</li>
	<li>Przytnij blok, aż uzyskasz równą powierzchnię. Wyczyść mikrotom za pomocą szczoteczki i ustaw go na 3 μm. Odrzuć pierwsze 2-3 sekcje.</li>
	<li>Wytnij 3 μm odcinki bloków NCFPE i FFPE i umieść je w zimnej kąpieli wodnej (woda ultraczysta). 
	UWAGA: Aby uzyskać lepsze zdjęcia bez nakładających się jąder, w tym miejscu pokazane są obrazy odcinków 2 μm zamiast 3-5 μm, jak zaleca się w instrukcjach producenta.</li>
	<li>Podnieś każdą pływającą sekcję za pomocą cienkiego pędzla i igły na powlekane szkiełko mikroskopowe w celu przyklejenia odcinków tkanki.</li>
	<li>Zanurz tę zjeżdżalnię w ciepłej (40 °C) łaźni wodnej i pozwól, aby sekcja całkowicie się rozciągnęła.</li>
	<li>Umieść sekcję z powrotem na zjeżdżalni, ostrożnie wyciągając zjeżdżalnię z wody i unikając zmarszczek.</li>
	<li>Pozostaw wszystkie sekcje do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Podgrzewać szkiełka w temperaturze 70 °C przez 30 minut w inkubatorze, aby rozpuścić parafinę.</li>
	<li>Umieść szkiełka poziomo w szklanym słoiku do barwienia.</li>
	<li>Ponownie uwodnić skrawki krok po kroku w temperaturze pokojowej w słoikach do barwienia wypełnionych 250 ml każdego z następujących płynów: 100 % ksylen 2 x 15 min, 96 % etanol 2 x 15 min, 90 % etanol 2 min, 80 % etanol 2 min, 70 % etanol 2 min, 50 % etanol 2 min i woda destylowana 2 x 10 min. 
	UWAGA: Etapy deparafinowania i ponownego nawodnienia należy wykonywać w dygestorium, nie wdychać toksycznych rozpuszczalników ulatniających się. 
	UWAGA: W zależności od skrawków i tkanek może być konieczne wcześniejsze przetestowanie różnych czasów inkubacji.</li>
</ol>
4. Po utrwaleniu próbek NCFPE
<ol>
	<li>Wykonaj utrwalenie szkiełek NCFPE, umieszczając je w nowym słoiku do barwienia wypełnionym SBFS na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Umieść słoik w dygestorium podczas 24-godzinnego etapu po utrwaleniu.</li>
	<li>Usunąć nadmiar SBFS przez przemycie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (3 x 10 min) i wodą destylowaną (2 x 10 min).</li>
</ol>
5. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
UWAGA: Tutaj FISH jest wykonywany przy użyciu dostępnego na rynku zestawu dwukolorowej sondy HER2/CEN17 zgodnie z instrukcjami producenta. Nie dopuścić do wyschnięcia skrawków tkanki podczas etapów hybrydyzacji i mycia. Nie pozwól, aby sonda DNA i roztwory 4', 6-diamidyno-2-fenyloindolowe (DAPI) DNA były wystawione na działanie światła przez dłuższy czas. Wykonaj te czynności w ciemności, używając światłoszczelnych pojemników. W zależności od wieku i etapu utrwalania materiału próbki, zwiększ lub zmniejsz temperaturę denaturacji i płukania, aby uzyskać lepsze wyniki hybrydyzacji.
<ol>
	<li>Umieścić słoik do barwienia zawierający 250 ml roztworu do wstępnej obróbki cieplnej cytryny w łaźni wodnej o temperaturze 98 °C.</li>
	<li>Umieść ponownie uwodnione szkiełka FFPE i NCFPE po utrwaleniu w słoiku i inkubuj przez 15 minut. Nie używaj więcej niż sześciu szkiełek na słoik do barwienia.</li>
	<li>Myj szkiełka w wodzie destylowanej przez 3 minuty w temperaturze suchej tonacji w nowym słoiku do barwienia.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia proteolizy należy umieścić szkiełka w systemie hybrydyzacji o kontrolowanej temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Gotowy do użycia roztwór pepsyny (2 mg/ml) należy natychmiast nanieść kroplami (~ 30 μl na kroplę) na skrawki tkanki, aż do całkowitego pokrycia. Inkubować przez 9 minut w temperaturze 37 °C w systemie hybrydyzacji. 
		UWAGA: Zalecany czas inkubacji wynosi 5-15 minut. Optymalny czas na proteolizę należy ustalić z wyprzedzeniem</li>.
		<li>Umieścić szkiełka w słoiku zawierającym bufor do płukania SSC i inkubować przez 5 minut.</li>
		<li>Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przeprowadzić dehydratację sekcji w następujących stopniowanych alkoholach: 50 %, 70 %, 90 % i 100 % każdy przez 1 minutę. Wysuszyć sekcje na powietrzu.</li>
		<li>W celu hybrydyzacji należy pobrać pipetę 10 μl sondy HER2/CEN17 na wysuszone skrawki tkanki, przykryć każdą próbkę szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić cementem gumowym. 
		UWAGA: Zaleca się 10 μl sondy na powierzchnię tkanki 22 x 22 mm. Delikatne nagrzewanie sondy ułatwia proces pipetowania. Unikaj pęcherzyków powietrza i długiej ekspozycji sondy na światło.</li>
		<li>Sonda kodenaturacji i próbka DNA w układzie hybrydyzacji w temperaturze 75 °C przez 10 min.</li>
		<li>Ustaw system hybrydyzacji na 37 °C i hybrydyzuj przez noc.</li>
		<li>Ostrożnie usuń cement kauczukowy za pomocą kleszczy w celu późniejszej hybrydyzacji i wykrywania.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w słoiku do barwienia zawierającym 37 °C, wstępnie podgrzanym, 1 x bufor do płukania A przez 5 minut. Usunąć szkiełka nakrywkowe.</li>
		<li>Umyć szkiełka przy użyciu wstępnie podgrzanego 1 x buforu myjącego A dwukrotnie przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odwodnić szkiełka w 70%, 90% i 100% etanolu, każdy po 1 minutę.</li>
		<li>Wysuszyć próbki na powietrzu i chronić przed światłem.</li>
		<li>Do barwienia nałóż 30 μl roztworu DAPI na hybrydyzowany obszar, unikając pęcherzyków. Przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Inkubować przez 15 minut, chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć nadmiar roztworu DAPI, delikatnie naciskając szkiełko między bibułą filtracyjną.</li>
		<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 2 - 8 °C w ciemności przez okres do 2 tygodni, do czasu oceny za pomocą mikroskopii konfokalnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Obrazowanie konfokalne i skanowanie preparatów FISH
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie konfokalne i skanowanie slajdów na konfokalnym skanerze cyfrowym wyposażonym w obiektyw 40x/1,2 NA, filtry czteropasmowe (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) oraz 5,5 Mpx, 16-bitową, chłodzoną naukową kamerę z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (CMOS).</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów odbywa się za pomocą filtrów dla kanałów zielonego (wzbudzenie: 503 nm, emisja: 528 nm) i pomarańczowego (wzbudzenie: 547 nm, emisja: 572 nm).</li>
</ol>
7. Interpretacja
UWAGA: Sonda HER2/CEN17 jest mieszaniną sondy CEN17 znakowanej czerwonym fluorochromem specyficznej dla regionu centromerowego alfa satelitarnego chromosomu 17 (D17Z1) i zielonej sondy HER2 znakowanej fluorochromem specyficznej dla genu HER2 (lokalizacja sondy 17q12). Próbki guza o stosunku HER2:CEN17 ≤2,0 na jądro są oceniane normalnie, podczas gdy te o stosunku HER2:CEN17 ≥2,0 są oceniane jako amplifikowane17.
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę jakości obrazów za pomocą oprogramowania CaseViewer 2.120.
	<ol>
		<li>Oceń co najmniej 20 komórek, które znajdują się w dwóch różnych regionach inwazyjnego składnika raka, zgodnie z definicją patologa. Uwzględnić wyraźnie rozróżnialne, dobrze rozmieszczone jądra w obszarze zliczania. Wyklucz z liczenia obszary tkanki na granicy oraz obszary cofnięte lub ściśnięte.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Jakość RNA
<ol>
	<li>Ekstrakcja RNA
	<ol>
		<li>Upewnij się, że wszystkie instrumenty i narzędzia są wolne od RNAzy. Użyj roztworu do usuwania RNAse.</li>
		<li>Wyciąć od 10 do 20 odcinków (o grubości 5 μm) próbek NCFPE lub FFPE za pomocą mikrotomu zgodnie z protokołem do kroku 3.8.</li>
		<li>Ekstrahuj RNA z próbek NCFPE za pomocą zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów). Ekstrakcja RNA z próbek FFPE za pomocą zestawu do izolacji RNA FFPE. 
		UWAGA: Ekstrakcja RNA z utrwalaczy niesieciujących wymaga metody izolacji dostosowanej do metody utrwalania. Nie należy stosować żadnej innej metody izolacji RNA (np. Trizol, RNeasy FFPE itp. dla próbki NCFPE).</li>
		<li>Oznaczyć stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru. Stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm (A260/280) powinien wynosić ~ 2,0.</li>
		<li>Wyizolowany RNA należy przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj PCR z odwrotną transkrypcją dehydrogenazy 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego (GAPDH) w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów do generowania amplikonów o różnych długościach8,9.
	<ol>
		<li>Użyj zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi syntezy cDNA. Użyj 500 ng RNA z każdej próbki. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.</li>
		<li>Przygotuj główną mieszankę PCR zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Odpipetować główną mieszaninę PCR w trzech egzemplarzach na 384-dołkowej płytce reakcyjnej. Dodać 4 μl cDNA rozcieńczonego w stosunku 1:16 (matryca PCR). Wykonaj PCR zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Dla ludzkiego GAPDH zastosowano następujące startery: GAPDH do przodu: 5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3'; GAPDH odwrócony: 71 bp 5'-ACCAGGCGCCCAATACG-3', 153 bp 5'-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3', 200 bp 5'-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3', 277 bp 5'-ACTTGATTTGGAGGAGGGATCT-3', 323 bp 5'-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3' i 530 bp 5'-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3'.</li>
		<li>Przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania odpowiedniego dla maszyny do PCR. Produkty niespecyficzne muszą być wykluczone na podstawie analizy krzywej topnienia21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> J. Histochem.Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+banks%3A+well-guarded+treasures+in+the+interest+of+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients.</a> Nat. Rev. Cancer. 3 (1), 73-77 (2003).</li>
<li>Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chemical+modification+of+RNA+from+formalin-fixed+samples+and+optimization+of+molecular+biology+applications+for+such+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples.</a> Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).</li>
<li>Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+formaldehyde-induced+modifications+in+proteins%3A+reactionswith+model+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides.</a> J. Biol. Chem. 279 (8), 6235-6243 (2003).</li>
<li>Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+formaldehyde+fixation+on+RNA%3A+optimization+of+formaldehyde+adduct+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal.</a> J.Mol. Diagn. 13 (3), 282-288 (2011).</li>
<li>Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-formalin+fixative+versus+formalin-fixed+tissue%3A+A+comparison+of+histology+and+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality.</a> Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 188-194 (2013).</li>
<li>Do, H., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+artifacts+in+DNA+from+formalin-fixed+tissues%3A+causes+and+strategies+for+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization.</a> Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).</li>
<li>Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Control+of+RNA+Preservation+and+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissue%3A+Implications+for+RT-PCR+and+Microarray+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis.</a> PloS One. 8 (7), e70714(2013).</li>
<li>Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technology+for+stabilization+of+biomolecules+in+tissues+for+combined%09histological+and+molecular+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined	histological and molecular analyses.</a> J. Mol. Diagn. 14 (5), 458-466 (2012).</li>
<li>Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+colon+cancer+histomorphology%3A+A+comparison+between+formalin+and+PAXgene+tissue+fixation+by+an+international+ring+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial.</a> Virchows Arch. 465 (5), 509-519 (2014).</li>
<li>Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+PAXgene-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues.</a> J. Proteome Res. 9 (10), 5188-5196 (2010).</li>
<li>Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+Assessment+of+PAXgene+Tissue+Fixation+and+Stabilization+Reagents%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27704(2011).</li>
<li>Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Evaluation+of+the+PAXgene+Tissue+Fixation+System%3A+Morphology%2C+Immunohistochemistry%2C+Molecular+Biology%2C+and+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics.</a> Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).</li>
<li>Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+HER2+FISH+determination+on+PAXgene-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Exp.+Path%22%5BJournal%5D)">Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer.</a> Int J. Exp. Path. 97 (2), 202-206 (2016).</li>
<li>Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+ofHER-2%2Fneu+gene+amplification+in+human+breast+cancer+archival+material+using+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization.</a> Oncogene. 13 (1), 63-72 (1996).</li>
<li>Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+amplification+ratios+by+fluorescence+in+situ+hybridization+and+correlation+with+immunohistochemistry+in+a+cohort+of+6556+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues.</a> Clin.Breast Cancer. 5 (1), 63-69 (2004).</li>
<li>Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19548375">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer.</a> Arch Pathol Lab Med. 131 (1), 18-43 (2007).</li>
<li>Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER-2%2Fneu+gene+amplification+characterized+by+fluorescence+in+situ+hybridization%3A+poor+prognosis+in+node-negative+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas.</a> J. Clin. Oncol. 15 (8), 2894-2904 (1997).</li>
<li>Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+a+tumor+marker+ready+for+prime+time%3F+A+case+study+of+c-erbB-2+as+a+predictive+factor+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer.</a> J. Clin. Oncol. 19 (8), 2334-2356 (2001).</li>
<li>Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+image+analysis+algorithm+for+detecting+nuclear+signals+in+digital+whole+slides+for+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology.</a> Cytometry A. , (2017).</li>
<li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4489822.pdf">QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software</a>. , Publication Number 4489822 (2013).</li>
<li>NCCLS. <a target="_blank" href="https://infostore.saiglobal.com/store/details.aspx?ProductID=800906">Quality Assurance for Immunocytochemistry</a>. , Wayne. (1999).</li>
<li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaker%2C+JR+%22Principles+of+Biological+Microtechnique%22">Principles of Biological Microtechnique</a>. , London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).</li>
<li>Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+handling+and+specimen+preparation+in+surgical+pathology%3A+issues+concerning+the+recovery+of+nucleic+acids+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Arch Pathol. Lab Med. 132 (12), 1929-1935 (2008).</li>
</ol>

D.G. jest zatrudniony przez Qiagen i posiada opcje na akcje lub obligacje w ramach planu emerytalnego firmy. Dane przedstawione w tym manuskrypcie odnoszą się do systemu tkankowego PAXgene, który został opracowany we wspólnym wysiłku przez Qiagen i PreAnalytiX. Qiagen jest partnerem przemysłowym finansowanego ze środków publicznych Chrześcijańskiego Laboratorium Dopplerowskiego ds. Badań Biopróbek i Technologii Biobankowania. Wszystkich autorów nie ma konfliktu interesów ani konkurujących interesów finansowych.

Wyniki wskazują na dwa kluczowe wnioski. Po pierwsze, prosty 24-godzinny etap SBFS po utrwaleniu skrawków wyciętych z tkanek NCFPE jest wystarczający do uzyskania wyników równoważnych do tych z FFPE w analizach FISH przy użyciu testów FISH zatwierdzonych dla tkanek FFPE (patrz również odniesienie14). Protokół ten ma tę zaletę, że wykorzystuje testy FISH pierwotnie opracowane i zatwierdzone dla FFPE bez konieczności kompleksowej ponownej walidacji (np. poprzez optymalizację warunków przed hybrydyzacją dla tkanek nieusieciowanych). Protokół FISH może być używany dokładnie tak, jak opisano w instrukcjach producenta.
Drobne modyfikacje w stosunku do instrukcji producenta opisanej w niniejszym protokole (np. średnica przekroju tkanki i okresy inkubacji na etapach deparafinowania) wynikają z wcześniejszych adaptacji, co jest wyraźnie zalecane przez producenta ze względu na zastosowanie różnych typów tkanek i metod utrwalania.
Etap po utrwaleniu ma kluczowe znaczenie, ponieważ wymaga czasu reakcji chemicznej wynoszącego 18-24 godziny, co wydłuża czas analizy o jeden dzień, ale pozwala na taki sam codzienny przepływ pracy, jak w przypadku tkanek FFPE (ryc. 1). Podawano, że SBFS przenika do tkanek ze średnią szybkością 1 mm na godzinę,od 22 do 5 mm w ciągu 2 godzin, w zależności od typu tkanki23,24. Obserwacja, że tylko przedłużone okresy po utrwaleniu, trwające dłużej niż 18 godzin, mogą zmienić właściwości NCFPE na skrawki FFPE, wskazuje, że nie penetracja utrwalacza, ale czas reakcji chemicznej ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia pożądanych rezultatów 1,14.
Po drugie, pozostała tkanka NCFPE, która nie jest używana do utrwalenia, może być wykorzystana do dalszych analiz molekularnych, ponieważ biomolekuły są dobrze zachowane. Wykazano to za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (Figura 3). Test jest bardziej czuły i specyficzny niż wartość RIN pochodząca z elektroferogramu (liczba integralności RNA) w odniesieniu do jakości RNA (tj. modyfikacji chemicznej i fragmentacji) dla mRNA wyizolowanego z tkanek zanurzonych w parafinie8. Kontrola jakości została ograniczona w tym badaniu do PCR w czasie rzeczywistym, ponieważ niezależne grupy wykazały, że oprócz RNA, jakość DNA i białek wyizolowanych z NCFPE jest lepsza niż z tkanek FFPE 8,9,13.
Przedstawiony protokół jest następujący, w stosownych przypadkach (np. receptura SBFS, warunki utrwalania, kontrola jakości RNA, walidacja), wymagania specyfikacji technicznych CEN dotyczących procedur przedanalitycznych w diagnostyce in vitro (IVD), które zostały niedawno wydane przez Europejski Komitet Normalizacyjny (CEN) (np. CEN/TS 16827-1:2015 dla izolacji RNA z tkanek FFPE, która odnosi się do normy ISO 15189).
Metoda ogranicza się do tego konkretnego utrwalacza. Chociaż dobre zachowanie biomolekuł i morfologii przy użyciu niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza zostało przedstawione w kilku badaniach, jest on stosowany głównie w badaniach, ale nie w rutynowych zastosowaniach medycznych. Jednym z powodów jest to, że zastąpienie złotego standardu utrwalania SBFS innym utrwalaczem wymagałoby różnych badań walidacyjnych, ponieważ nie wszystkie protokoły zoptymalizowane pod kątem materiału FFPE mogą być stosowane do materiałów utrwalanych za pomocą utrwalaczy niesieciujących. Inne metody utrwalania tkanek nie były testowane dla tego protokołu FISH.
Prosty etap po utrwaleniu opisany w tym manuskrypcie ma tę zaletę, że wykorzystuje testy zatwierdzone do diagnostyki in vitro zarówno dla tkanek FFPE, jak i NCFPE.

Medycyna spersonalizowana w coraz większym stopniu opiera się na testach wieloparametrowych obejmujących morfologiczne i molekularne analizy tkanek. Fixacja tkanek formaliną, będąca złotym standardem, zapewnia doskonałą jakość morfologiczną1,2. Jednakże wywołana formaliną modyfikacja chemiczna i sieciowanie białek oraz kwasów nukleinowych3,4,5 negatywnie wpływają na analizę molekularną6. Modyfikacje molekularne te ograniczają jakość kwasów nukleinowych i białek oraz mogą prowadzić do powstania artefaktów w sekwencjach genów7 lub do obniżenia czułości testów opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)8. Mimo znacznych wysiłków podjętych w celu optymalizacji testów molekularnych dla tkanek FFPE, krio-konserwacja tkanek jest w ogólnym ujęciu lepsza od fixacji formaliną, co sprawia, że konieczny jest podział próbek tkankowych na różne procedury konserwacji. Aby uniknąć konieczności krio-konserwacji w analizach molekularnych, opracowano PAXgene Tissue – fiksatyw bezformalinowy, niewywołujący sieciowania. Ten dostępny komercyjnie system składa się z roztworu do fixacji i stabilizacji, zawierającego różne alkohole, kwas octowy oraz rozpuszczalny związek organiczny. Prawidłową konserwację kwasów nukleinowych, (fosfo)białek i morfologii wykazano w kilku badaniach6,9,10,1,12,13.
Jednym ze szczególnych zastosowań w diagnostyce nowotworów jest metoda FISH, która pozwala na wykrycie szerokiego zakresu zmian chromosomalnych, takich jak translokacje, delecje submikroskopowe i amplifikacje 14. Na przykład u dwudziestu procent pacjentów z inwazywnym rakiem piersi stwierdza się amplifikację genu ludzkiego receptora 2 czynnika wzrostu naskórka (HER2)15,16,17, co wiąże się ze złym rokowaniem18,19. Oznaczenie stanu nadekspresji i amplifikacji HER2 w raku piersi za pomocą metody FISH jest niezbędne do wyboru pacjentów do terapii skierowanej przeciwko HER2 i stanowi diagnostykę towarzyszącą zatwierdzoną przez Federalną Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) (http://www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. Aby umożliwić szerokie zastosowanie diagnostyki towarzyszącej opartej na metodzie FISH w opiece zdrowotnej, opracowano i zatwierdzono testy dla tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE).
W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że tkanki NCFPE nie mogą być stosowane w testach FISH, które zostały zatwierdzone dla tkanek FFPE. Jednakże testy serii czasowych różnych procedur dofixacji tkanek NCFPE w 4 % buforowanym formaldehydzie wykazały, że czas dofixacji przekroczył 18 h dla skrawków tkanek NCFPE pozwolił na uzyskanie wyników równoważnych z wynikami uzyskanymi dla tkanek FFPE14.
W niniejszym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół i demonstrujemy wpływ utrwalania tkanek bez użycia formaliny i bez sieciowania oraz 24-godzinnej postfiksacji w 4% buforowanym formaldehydzie na skrawki wykorzystywane do badania HER2 FISH oraz na jakość RNA z tego samego pierwotnego preparatu tkankowego.
<img alt="Schemat przetwarzania próbek tkankowych; obejmuje fiksację, ekstrakcję RNA oraz analizę real-time PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Schemat przedstawiający etapy fluorescencji in situ hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) oraz analiza RNA tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) oraz tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych bez użycia formaliny i bez tworzenia wiązań krzyżowych (NCFPE). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

<table><tbody><tr><td>SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Niemcy</td><td>www.sav-lp.de</td><td>FN-200L-4-1</td><td>Utrwalacz tkanek</td></tr><tr><td>Simport Plastic Ltd., Beloeil, Kanada</td><td>www.simport.com</td><td>M-498</td><td>Urządzenie zabezpieczające zapewniające etykietowanie, utrwalanie i osadzanie parafiny w próbkach tkanek.</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy</td><td>www.qiagen.com</td><td>765112</td><td>Do pobierania, utrwalania i stabilizacji próbek tkanek: 10 wstępnie napełnionych pojemników na odczynniki, zawierających PAXgene Tissue FIX i PAXgene Tissue STABILIZER.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>813150</td><td>Przetwarzanie próbek biologicznych od utrwalenia chemicznego do infiltracji parafiny</td></tr><tr><td>Merck Millipore, Monachium, Niemcy</td><td>www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html</td><td>MC1009834000</td><td>Odwodnienie próbek tkanek</td></tr><tr><td>VWR Chemicals, Darmstadt, Niemcy</td><td>https://at.vwr.com</td><td>10293EP</td><td>Odwodnienie próbek tkanek</td></tr><tr><td>ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Wiedeń, Austria</td><td></td><td>www.herba-chemosan.at 2549662 32</td><td>Parafina stosowana w urządzeniu do przetwarzania tkanek</td></tr><tr><td>Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Wiedeń, Austria</td><td></td><td>www.LeicaBiosystems.com 39602004</td><td>Podłoże do zatapiania parafiny</td></tr><tr><td>Sanova Diagnostik, Wiedeń, Austria</td><td>www.sanova.at</td><td>5229</td><td>Przyrząd do zatapiania parafiny w tkankach do badań histologicznych</td></tr><tr><td>Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria</td><td>www.histocom.info</td><td>M 910010 To</td><td>urządzenie jest używane do szczególnie wyrafinowanych technik cięcia parafiny w biologii i medycynie. Tylko wykwalifikowany lub specjalnie przeszkolony personel może obsługiwać mikrotom, tj. zaciskać próbkę, przycinać, ciąć i zdejmować skrawki z instrumentu.</td></tr><tr><td>Dako Denmark A/S, Glostrup, Dania</td><td>www.chem.agilent.com</td><td>K802021-2</td><td>Szkiełka podstawowe powlekane, przeznaczone do montażu skrawków tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Niemcy</td><td>www.qiagen.com</td><td>73504</td><td>Do oczyszczania całkowitego RNA z utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawków tkanek</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy</td><td></td><td>www.qiagen.com 765134</td><td>Do oczyszczania całkowitego RNA z utrwalonych przez PAXgene, zatopionych w parafinie skrawków tkanek</td></tr><tr><td>ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Niemcy</td><td>www.zytovision.com</td><td>Z-2015-200</td><td>Do wykrywania amplifikacji genu ERBB2 (znanej również jako HER2) często obserwowanej w litych nowotworach złośliwych, np. próbkach raka piersi.</td></tr><tr><td>3DHISTEC, Budapeszt, Węgry</td><td>www.3dhistech.com</td><td></td><td>Cyfrowe urządzenie do skanowania preparatów tkankowych wyposażone w obiektyw 40x/1,2 NA, filtry czteropasmowe (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) oraz 5,5Mpx, 16-bitową, chłodzoną naukową kamerę CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor).</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4368814</td><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności zawiera wszystkie składniki niezbędne do ilościowej konwersji do 2 &mikro; g całkowitego RNA do jednoniciowego cDNA w pojedynczym 20 &mikro; Reakcja L.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4367659</td><td>PCR Master Mix zawierający polimerazę, nukleotydy i SYBR Green do PCR i kwantyfikacji amplikonów.</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE</td><td>www.thermofisher.com</td><td>Ser. Nr. F239</td><td>Spektrofotometr do oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych.</td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 7 Flex www.thermofisher.com</td><td></td><td>4485701</td><td>maszynie do PCR,</td></tr> <tr><td>Laboratoria Vysis / Abbott. Abbott Park, Illinois, Stany Zjednoczone</td><td>www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order</td><td>e.g. (ThermoBrite) 07J91-020</td><td>System przetwarzania szkiełek z kontrolowaną temperaturą do procedur denaturacji/hybrydyzacji in-situ.</td></tr></tbody></table>

protokół dla her2 fish z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny

Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Morfologiczna ocena próbek tkanek z utrwalonymi w formalinie, zatopionymi w parafinie (FFPE) była złotym standardem w diagnostyce raka przez dziesięciolecia ze względu na doskonałe zachowanie morfologii. Medycyna spersonalizowana w coraz większym stopniu zapewnia indywidualnie dostosowane i ukierunkowane terapie dla scharakteryzowanych poszczególnych chorób, możliwe dzięki połączonym technologiom analizy morfologicznej i molekularnej oraz diagnostyce. Wykonanie testów morfologicznych i molekularnych z tej samej próbki FFPE jest trudne ze względu na negatywny wpływ formaliny spowodowany modyfikacją chemiczną i sieciowaniem kwasów nukleinowych i białek. Niedawno opracowano niesieciowany, wolny od formaliny utrwalacz tkankowy, aby spełnić oba wymagania, tj. zachować morfologię, taką jak FFPE i biomolekuły, takie jak kriokonserwacja. Ponieważ FISH jest często wymagany w połączeniu z histopatologią i diagnostyką molekularną, przetestowaliśmy możliwość zastosowania protokołów FISH na tkankach leczonych tym nowym utrwalaczem. Odkryliśmy, że formalina po utrwaleniu histologicznych odcinków tkanki raka piersi niesieciowanej, wolnej od formaliny i zatopionej w parafinie (NCFPE) uzyskała wyniki równoważne wynikom z tkanką FFPE w analizie FISH receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2). Protokół ten opisuje, w jaki sposób test FISH, pierwotnie opracowany i zwalidowany dla tkanki FFPE, może być wykorzystany do tkanek NCFPE poprzez prosty etap po utrwaleniu odcinków histologicznych.

Oznaczanie HER2 metodą FISH:
Intensywności sygnałów HER2-FISH w próbkach FFPE i NCFPE są podobne (Rycina 2). W obu przypadkach w większości komórek widoczna jest wyraźna nadwyżka sygnału zielonego (wskazującego na amplifikację locus genu HER2) w porównaniu z sygnałem czerwonym (gen referencyjny CEN17). Oznacza to, że w badanych przypadkach występuje amplifikacja genu HER2, co sugeruje, że pacjent ten powinien odpowiedzieć na trastuzumab, terapię celowaną anty-HER2. Próbka FFPE posłużyła jako kontrola dodatnia. Sygnały obserwowane w komórkach nienowotworowych (zarówno w FFPE, jak i NCFPE) służą jako referencja wewnętrzna i kontrola ujemna amplifikacji genu HER2. W każdej serii analiz należy wykorzystać co najmniej jeden przekrój o znanym statusie amplifikacji genu jako kontrolę dodatnią reakcji hybrydyzacji.
Jakość RNA:
Odpowiadające sobie próbki FFPE i NCFPE z dwóch różnych przypadków wykazują różnice w jakości RNA przy zastosowaniu polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (real-time RT-PCR). Uzyskane wyniki pokazują różną wydajność amplifikacji dla różnych długości amplikonów (tj. 71 bp, 153 bp, 20 bp, 275 bp, 323 bp) mRNA GAPDH. Wszystkie wartości Ct (cycle threshold) uzyskane z próbek FFPE były wyższe niż te z NCFPE. Różnica ta świadczy o niższej zdolności do amplifikacji PCR mRNA wyizolowanego z tkanek FFPE, co sugeruje bardziej wyraźną modyfikację chemiczną. Co więcej, wyższe wartości Ct dla długich w porównaniu z krótkimi amplikonami są wskaźnikiem fragmentacji mRNA. W porównaniu, nachylenie krzywych wartości Ct dla różnych długości amplikonów wykazuje bardziej zaznaczoną fragmentację mRNA w tkankach FFPE niż w NCFPE (Rycina 3).
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej komórek przedstawiające rozkład markerów chromosomowych w analizie DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki badania HER2 FISH dla odpowiadających im przekrojów tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) oraz przekrojów tkanek zatopionych w parafinie, utrwalonych bez użycia formaliny i bez tworzenia wiązań sieciujących (NCFPE). Przedstawiono odpowiadające sobie próbki z tych samych tkanek FFPE (A) i NCFPE (B). W przeciwieństwie do prawidłowych komórek w fazie interfazy (C), w których oczekuje się dwóch sygnałów zielonych (HER2) i dwóch czerwonych (CEN17), komórki z amplifikacją locus genu HER2 wykazują wielokrotne kopie sygnałów zielonych (HER2) (D). Status amplifikacji HER2 był identyczny zarówno w preparatach FFPE, jak i w sekcjach NCFPE po utrwaleniu (A, B). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Kontrola jakości RNA; RT-PCR w czasie rzeczywistym; wykres; wartości Ct w zależności od długości amplikonu GAPDH; porównanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyniki analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym wykorzystanej do kontroli jakości RNA. Oś Y: wartości Ct (próg cyklu) dla genu GAPDH przedstawiono dla różnych długości amplikonów (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) na osi X. mRNA wyizolowano z FFPE i NCFPE dwóch różnych próbek tkanki raka piersi przetwarzanych równolegle, a następnie przetranskrybowano do cDNA na potrzeby reakcji PCR. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ (FISH) jest często wymagana w połączeniu z histopatologią i diagnostyką molekularną w celu wyboru terapii w medycynie spersonalizowanej. Nowatorski, niesieciowany, wolny od formaliny utrwalacz tkankowy, który umożliwia wysokiej jakości analizy morfologiczne, molekularne i FISH z tej samej próbki poprzez dodanie etapu po utrwaleniu przed przedstawieniem FISH.

Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its ...

Medycyna personalizowana wymaga różnych rodzajów analiz, od klasycznej histologii po analizę molekularną, a w celu doboru najlepszej terapii w guzie przeprowadza się różne techniki in situ. Metody badawcze umożliwiają zastosowanie wielu technologii analitycznych na pojedynczej próbce. Demonstrujemy tutaj, że dzięki zastosowaniu utrwalacza niesieciującego w prostym etapie potutrwalania formaliną, można wykorzystać protokoły opracowane i zwalidowane pierwotnie dla materiałów utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie na próbkach komórkowych, co pozwala uzyskać dobrą morfologię, wysoką jakość RNA oraz prawidłowe wyniki hybrydyzacji in situ z pełnym sensem (fuller sense in-situ hybridization).Typowe warunki hybrydyzacji nie są odpowiednie dla tkanek utrwalonych bez użycia formaliny w celu uzyskania wyników FISH. Wykazaliśmy, że kluczowym czynnikiem pozwalającym na osiągnięcie porównywalnych wyników FISH w tkance utrwalonej pektyną nie jest penetracja, lecz czas korekcji chemicznej. Tylko przekrój wykorzystany do FISH jest utrwalony formaliną i poddany post-utrwalaniu.Pozostała tkanka utrwalona bez użycia formaliny umożliwia dokładniejszą analizę molekularną w porównaniu z tkanką FFP, co zostało wykazane za pomocą RTPCR. Procedurę tę zaprezentowała Daniela Pabst, technik z mojego laboratorium. Na początek, za pomocą sterylnego skalpela, należy przekroić próbki tkanki raka piersi na dwie połowy o grubości 4 mm każda, aby zapewnić odpowiednią ilość materiału tkankowego.Do utrwalenia w standardowym buforowanym roztworze formaliny lub w alternatywnej, nie sieciującej metodzie utrwalania tkanek bez użycia formaliny, należy użyć fragmentów o maksymalnych wymiarach 4x15x15 milimetrów. Jedną połowę próbki guza należy umieścić w standardowej kasecie do tkanek i zanurzyć w SBFS. Drugą połowę próbki guza należy umieścić w alternatywnym roztworze utrwalającym na 24 godziny, zachowując stosunek objętościowy czterech części utrwalacza do jednej części tkanki.Następnie przenieś próbki utrwalone alternatywnie do roztworu stabilizującego na okres od 2 do 72 godzin, otwierając pojemnik, obracając kasetkę do tkanek o 180 stopni i zanurzając ją. Następnie umieść kasetki do tkanek z próbkami utrwalonymi w SBFS w pojemniku wypełnionym 70% ethanol przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pozostałości SBFS. Po przetworzeniu i zatopieniu tkanek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, użyj mikrotomu do wykonania skrawków o grubości trzech mikronów z bloków FFPE i NCFPE.Umieść kilka przekrojów każdego rodzaju w kąpieli w zimnej wodzie. Za pomocą cienkiego pędzla przenieś pływający przekrój na cienkie szkiełko przedmiotowe, a następnie przełóż go do kąpieli w ciepłej wodzie. Ponownie zbierz rozciągnięte przekroje pędzlem na szkiełko przedmiotowe, dbając o to, aby nie powstały zmarszczki.Należy również przygotować próbki do izolacji RNA w celu przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji i PCR na tej samej próbce, umieszczając część każdego rodzaju skrawka w probówce do reakcji. W celu odparafinyzacji skrawków tkanki nawadniamy je stopniowo w temperaturze pokojowej w naczyniach do barwienia z 250 mililitrami różnych odczynników. Najpierw umieszczamy skrawki w 100% ksylenie dwukrotnie po 15 minut, a następnie przenosimy je do 96% etanolu dwukrotnie po 15 minut.Następnie przenosi się skrawki przez roztwory etanolu o stopniowo zmniejszonym stężeniu, inkubując w każdym z nich przez dwie minuty. Na koniec skrawki przenosi się dwukrotnie do wody destylowanej na 10 minut. Postfiksację preparatów NCFPE przeprowadza się, umieszczając je w nowym naczyniu do barwienia wypełnionym SBFS na 24 godziny w temperaturze pokojowej.Pozostaw słoik w dygestorium podczas 24-godzinnego etapu post-fiksacji. Co zaskakujące, wszystkie czasy post-fiksacji przekraczające 18 godzin dały wyniki podobne do tych uzyskanych przy materiale utrwalonym formaliną i zablokowanym w parafinie. Usuń nadmiar SPFS z preparatów, płucząc je w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym trzykrotnie przez 10 minut.Następnie przeprowadź drugie płukanie w wodzie destylowanej przez 10 minut, powtarzając tę czynność dwukrotnie. Dalej, umieść naczynie do barwienia zawierające 250 milliliters roztworu do wstępnej obróbki termicznej z kwasem cytrynowym w łaźni wodnej o temperaturze 98 degree celsius. Umieść uwodnione preparaty FFPE na szkiełkach post-fixed NCFPE w naczyniu i inkubuj przez 15 minut.Następnie przemyj preparaty w wodzie destylowanej przez trzy minuty w temperaturze pokojowej w nowym naczyniu do barwienia. W celu przeprowadzenia proteolizy umieść preparaty w urządzeniu do hybrydyzacji z kontrolą temperatury ustawioną na 37 °C. Natychmiast nanieś kroplowo gotowy do użycia roztwór pepsyny na skrawki tkanek, aż zostaną one całkowicie pokryte.Następnie inkubować przez dziewięć minut w 37 °C w systemie do hybrydyzacji. Dalej, umieścić szkiełka w słoiku zawierającym bufor do płukania SSC i inkubować przez pięć minut. Umieścić szkiełka w wodzie destylowanej na jedną minutę w temperaturze pokojowej.Przeprowadź odwodnienie skrawków w serii alkoholi o rosnącym stężeniu, po jednej minucie w każdym. Po zakończeniu serii odwodnienia wysusz skrawki na powietrzu. W celu przeprowadzenia hybrydyzacji nanieś pipetą 10 µL połączonej sondy HER2 i sun 17 na wysuszone skrawki tkanek, przykryj każdą próbkę szkiełkiem podstawowym i uszczelnij klejem gumowym.Denaturuj sondę oraz DNA preparatu w systemie hybrydyzacyjnym w temperaturze 75 °C przez 10 minut. System hybrydyzacyjny automatycznie obniża temperaturę do 37 °C, a hybrydyzacja trwa przez noc. Następnego dnia ostrożnie usuń pęsetą klej gumowy oraz szkiełka nakrywkowe w celu przeprowadzenia etapów po hybrydyzacji i ochrony.Inkubować preparaty w naczyniu do barwienia zawierającym podgrzany do 37 °C 1X bufor A przez pięć minut. Następnie dwukrotnie przemyć preparaty, używając podgrzanego 1X buforu do płukania, przez pięć minut w temperaturze 27 °C. Następnie odwodnić preparaty w 70%, 90% i 100% etanolu przez jedną minutę dla każdego stężenia.Próbki należy wysuszyć na powietrzu i chronić przed światłem. W celu barwienia należy nanieść 30 µL roztworu DAPI na obszar zhybrydyzowany, unikając powstania pęcherzyków powietrza. Przykryć skrawki szkiełkiem podstawowym przed inkubacją przez 15 minut w warunkach ochrony przed światłem.Ostrożnie usuń nadmiar roztworu DAPI, delikatnie dociskając szkiełko między papierami filtracyjnymi. Przechowuj szkiełka w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza w ciemności do dwóch tygodni, aż do momentu oceny za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pozyskaj obrazy, korzystając z filtrów dla kanałów zielonego i pomarańczowego.Należy przystąpić do interpretacji danych i oceny jakości RNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj bezpośrednie porównanie wyniku uzyskanego z próbki formalnie utrwalonej oraz próbki utrwalonej bez sieciowania, która została poddana utrwalaniu wtórnemu. Sygnały mają podobną intensywność, a tło jest również zbliżone.W normalnych komórkach w fazie interfazy liczba sygnałów czerwonych i zielonych, odpowiadających locus HER2 oraz locus referencyjnemu cen 17, jest taka sama, co wskazuje na brak amplifikacji genu HER2. Przedstawiono tutaj wynik innego przypadku, w którym gen HER2 jest amplifikowany, a sygnał dla locus HER2 jest znacznie silniejszy i szerszy niż dla genu referencyjnego. Zjawisko to jest widoczne w tkance utrwalonej formaliną oraz w tkance utrwalonej metodą bez sieciowania.Wykres ten przedstawia wydajność amplifikacji dla różnych długości amplikonów mRNA GAPDH. W przypadku utrwalania formaliną konieczne jest około 23 cykli, natomiast dla materiału utrwalonego metodami bez sieciowania liczba ta zmniejsza się do 20 cykli. Różnica staje się bardziej wyraźna przy dłuższych amplikonach, co wskazuje, że zarówno fragmentacja, jak i modyfikacje chemiczne są znacznie ograniczone dzięki zastosowaniu utrwalaczy bez sieciowania.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak można wykorzystać zatwierdzony przez FDA klucz do materiału FFPN na materiale utrwalonym bez sieciowania, dodając prosty etap post-utrwalania w procedurze przedanalitycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że tylko przekrój wykorzystywany do pełnej hybrydyzacji in-situ jest post-utrwalany formaliną, podczas gdy pozostały blok jest utrwalony w utrwalaczu bez sieciowania, a tym samym może być wykorzystany do szerokiego spektrum analiz molekularnych. Protokół ten jest szczególnie użyteczny w kontekście nowoczesnej medycyny personalizowanej, gdy z relatywnie małych guzów należy przeprowadzić wiele analiz, a procesowanie próbek tkankowych zgodnie z różnymi protokołami nie jest możliwe.Ponadto stosowanie utrwalacza nietworzącego wiązań krzyżowych ma tę zaletę, że zachowuje właściwości tkanki podobnie jak krioterapia. Pozwala to uniknąć konieczności zamrażania w ciekłym azocie oraz utrzymywania łańcucha chłodniczego w kontekście chemicznym. Różnice te w jakości RNA nie są oczywiste przy stosowaniu klasycznych testów kontroli jakości RNA, takich jak wskaźniki integralności RNA (RNA integrity numbers), ponieważ testy te nie są w pełni miarodajne w przypadku jakości RNA wyizolowanego z materiału utrwalonego w parafinie.

protocol-for-her2-fish-using-non-cross-linking-formalin-free-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiono kombinację różnych technik w celu maksymalizacji zakresu gromadzonych danych z tkanki mysiej.

Łączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany, szczegółowy protokół podwójnego barwienia immunologicznego w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i obwodowych węzłów chłonnych (LN).

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

Opracowaliśmy protokoły i zaprojektowaliśmy niestandardowe urządzenie, aby umożliwić osadzanie próbek w skali milimetrowej. Przedstawiamy procedury przygotowania próbek z naciskiem na zatapianie w rurkach z żywicy akrylowej i poliimidu w celu uzyskania sztywnego unieruchomienia i długotrwałego przechowywania próbek w celu zbadania architektury tkanek i morfologii komórek za pomocą mikro-CT.

Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do utrwalania, barwienia immunologicznego i sekcji zarodków w celu wykrycia wyspecjalizowanych filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami w rozwijających się tkankach myszy.

Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Poznaj protokół HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego utrwalacza bez formaliny, umożliwiającego analizę morfologiczną i molekularną z tej samej próbki nowotworowej. Metoda ta wspiera spersonalizowaną medycynę poprzez integrację wielu technik diagnostycznych.

Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny (Wideo) | JoVE Journal

Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny

Przeglądaj więcej filmów