Name: Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Poznaj metodę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów w organotypowej kulturze mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero. Technika ta umożliwia analizę dynamicznych właściwości migracji neuronów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jacqueline Andratschke, Elenie Werle, Sachi Takenace i Matthiasowi Tobererowi za doskonałą pomoc techniczną, a także Victorowi Tarabykinowi za pomocne dyskusje. Prace te zostały wsparte dotacją Deutsche Forschungsgemeinschaft dla S.B. (BR-2215).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt (Regierungspräsidium Tübingen) i przeprowadzone zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt i dyrektywą UE 2010/63/UE.
1. Elektroporacja in utero
<ol>
	<li>Igły do mikroiniekcji
	<ol>
		<li>Wciągnąć kapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna: 1,0 mm, średnica wewnętrzna: 0,58 mm, długość: 100 mm) do igieł do mikroiniekcji za pomocą ściągacza do mikropipet z filamentem w pudełku (2,5 mm x 2,5 mm) i następującym programem: CIEPŁO: 540, CIĄGNIĘCIE: 125, PRĘDKOŚĆ: 20 i OPÓŹNIENIE: 140. Określ wartość HEAT dla każdego żarnika z osobna, wykonując test RAMP (wartość HEAT: RAMP+25).</li>
		<li>Igły skośne pod kątem 38° i ze średnią lub dużą prędkością obrotową za pomocą mikromłynka, aby uzyskać rozmiar końcówki od 20 do 30 μm do wstrzykiwania w dniu embrionalnym (E) 13,5 lub młodszym oraz od 30 do 40 μm do wstrzykiwania w starszych stadiach embrionalnych. Do przechowywania przymocuj igły w pudełku lub na szalce Petriego z plasteliną, aby zapobiec uszkodzeniu końcówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór plazmidowego DNA
	<ol>
		<li>Przygotować konstrukt plazmidowego DNA zawierający fluorescencyjne białko reporterowe (np. GFP) przy użyciu zestawu do przygotowania maxi bez endotoksyn zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór plazmidowego DNA do końcowego stężenia 1 - 2 μg/μL w wolnym od endotoksyn buforze Tris-EDTA zawierającym Fast Green w końcowym stężeniu 0,01%. Podwielokrotny roztwór i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bakteriostatyczny roztwór chlorku sodu
	<ol>
		<li>Przygotować bakteriostatyczny roztwór chlorku sodu, dodając alkohol benzylowy do końcowego stężenia 0,9% do izotonicznego 0,9% roztworu chlorku sodu. Sterylny roztwór filtrujący bezpośrednio przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór do wstrzykiwań karprofenu
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór karprofenu do wstrzykiwań, dodając karprofen do końcowego stężenia 0,5 mg/ml do sterylnego izotonicznego 0,9% roztworu chlorku sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 28 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie, iniekcja DNA i elektroporacja
	<ol>
		<li>Zważ mysz w ciąży w ciąży E14,5 i umieść ją w przezroczystej komorze anestezjologicznej podłączonej do parownika i nasyconej 5% izofluranem. Gdy zwierzę jest nieprzytomne, przenieś je do maski znieczulającej przymocowanej do płytki grzewczej o temperaturze 37 °C i utrzymuj je w znieczuleniu za pomocą 1,8 - 2,2% izofluranu. 
		nuta: Oceń rozwój znieczulenia chirurgicznego na podstawie utraty szczypania ogona i odruchów pedałowania (szczypanie palców).</li>
		<li>W przypadku analgezji należy wstrzyknąć podskórnie 100 μl roztworu karprofenu do wstrzykiwań na 10 mg masy ciała myszy (5 mg/kg masy ciała). Obróć mysz tyłem do dołu i ostrożnie przykryj oczy wazeliną, aby nie wyschły.</li>
		<li>Delikatnie rozłóż kończyny i przymocuj je do płytki rozgrzewającej za pomocą taśmy chirurgicznej. Wysterylizuj jamę brzuszną 70% etanolem, a następnie roztworem jodu (7,5 mg/ml) za pomocą wacików celulozowych. Powtórz tę procedurę trzy razy, aby zapewnić prawidłową dezynfekcję.</li>
		<li>Przykryj brzuch jałową gazą, w której wycięto nacięcie, aby oszczędzić pole (średnica: 2 - 2,5 cm) na nacięcie brzucha. Zwilżyć gazę bakteriostatycznym roztworem chlorku sodu. 
		Uwaga: Ponownie oceń rozwój znieczulenia chirurgicznego przez utratę odruchu pedałowania.</li>
		<li>Za pomocą kleszczyków Micro Adson (ząbkowane, długość: 12 cm) i cienkich nożyczek (ustawionych pod kątem na bok, długość: 9 cm) przeciąć skórę około 1,5 cm wzdłuż linii środkowej brzucha. Przetnij leżący pod spodem mięsień wzdłuż linea alba.</li>
		<li>Usuń jeden róg macicy za pomocą kleszczyków pierścieniowych (długość: 9 cm, średnica zewnętrzna: 3 mm, średnica wewnętrzna: 2,2 mm) i delikatnie umieść go na zwilżonej gazie. 
		Uwaga: Trzymaj róg macicy kleszczami pierścieniowymi tylko między zarodkami i nie naruszaj łożyska ani żadnych naczyń zasilających. Utrzymuj macicę wilgotną przez cały czas za pomocą bakteriostatycznego roztworu chlorku sodu.</li>
		<li>Ostrożnie ustaw zarodek za pomocą kleszczy pierścieniowych i zlokalizuj boczną komorę, która przedstawia się jako cień w kształcie półksiężyca równoległy do zatoki strzałkowej. Miejsce wstrzyknięcia leży mniej więcej w środku linii między pigmentowanym okiem a zbiegiem zatok, gdzie zatoka strzałkowa rozgałęzia się do dwóch zatok poprzecznych. Wbić igłę do mikroiniekcji przez ścianę macicy do komory bocznej. 
		Uwaga: W razie potrzeby głębokość wstrzyknięcia można skorygować poprzez wycofanie igły.</li>
		<li>Wstrzyknąć od 1 do 2 μl roztworu DNA do komory bocznej za pomocą mikrowstrzykiwacza, który jest obsługiwany za pomocą pedału nożnego, stosując następujące ustawienia: 25 psi, 10 do 20 ms na impuls i 5 do 10 impulsów. Udane wstrzyknięcie może być monitorowane przez kolorowy roztwór DNA, który powinien wypełnić układ komorowy.</li>
		<li>Umieścić elektrody typu pęseta (o średnicy 3 mm dla E13,5 lub młodszych i o średnicy 5 mm dla E14,5 lub starszych) w taki sposób, aby "dodatni" koniec znajdował się po tej samej stronie co wstrzyknięta komora, a "ujemny" koniec znajdował się po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory poniżej ucha głowy zarodka.</li>
		<li>Zwilżyć miejsce elektroporacji kilkoma kroplami bakteriostatycznego roztworu chlorku sodu i zastosować 5 impulsów prądu elektrycznego (35 V dla E13.5 lub młodszych i 40 V dla E14.5 lub starszych) o czasie trwania 50 ms w odstępach 950 ms. 
		Uwaga: Prądy od 60 do 90 mA są zwykle wystarczające do udanej elektroporacji. Niższe prądy nie będą skutecznie transfekować neuronów, podczas gdy wyższe prądy mogą prowadzić do śmierci embrionalnej.</li>
		<li>Powtórzyć procedurę (por. kroki 1.5.7 do 1.5.10.) dla każdego zarodka rogu macicy i delikatnie umieścić go z powrotem w jamie brzusznej.</li>
		<li>Usuń róg macicy z drugiej strony i powtórz procedurę opisaną w Kroku 1.5.7 do 1.5.11.</li>
		<li>Zamknij jamę brzuszną, zszywając warstwę mięśniową przed zszyciem skóry za pomocą kleszczy Micro Adson, uchwytu igły Mathieu (węglik wolframu, długość: 14 cm) i niewchłanialnego szwu chirurgicznego (koło 3/8, 13 mm, punkt stożkowy). 
		Uwaga: Uważaj, aby nie uchwycić macicy ani żadnych innych narządów podczas szycia.</li>
		<li>Ostrożnie zdezynfekuj szew skórny roztworem jodu (7,5 mg/ml) i delikatnie usuń nadmiar wazeliny okołogałkowej za pomocą wacików celulozowych. Umieść mysz pod lampą podczerwieni, aż się obudzi. Uważnie monitoruj mysz przez następne dwa dni. Powtórzyć zabieg przeciwbólowy zgodnie z opisem w kroku 1.5.2 po 12 do 24 godzinach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Organotypowa kultura plastrów
<ol>
	<li>Roztwór podstawowy laminy
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1 mg liofilizowanej lamininy w sterylnej wodzie, aby otrzymać 1 mg/ml roztworu podstawowego lamininy. Przygotować 50 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór podstawowy poli-L-lizyny
	<ol>
		<li>Rozpuścić 50 mg poli-L-lizyny w sterylnej wodzie, aby otrzymać 1 mg/ml roztworu podstawowego poli-L-lizyny. Przygotować 0,5 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kompletny Zbilansowany Roztwór Soli Hanka (Kompletny HBSS)
	<ol>
		<li>Przygotuj kompletny HBSS, łącząc 50 ml 10 x roztworu HBSS, 1,25 ml 1 M buforu HEPES (pH 7,4), 15 ml 1 M roztworu D-glukozy, 5 ml 100 ml roztworu chlorku wapnia, 5 ml 100 ml roztworu siarczanu magnezu 100 ml i 2 ml 1 M roztworu wodorowęglanu sodu. Dodać sterylną wodę do 0,5 l, sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka do kultur plastrowych
	<ol>
		<li>Połącz 35 ml Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml kompletnego HBSS (por. sekcja 2.3.1), 1,35 ml 1 M D-glukozy, 0,25 ml 200 mM L-glutaminy i 0,5 ml penicyliny-streptomycyny, aby uzyskać 50 ml pożywki do hodowli warstwowej. Sterylnie przefiltruj i dodaj surowicę końską do końcowego stężenia 5%. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP)
	<ol>
		<li>Przygotować 3% roztwór agarozy LMP, rozpuszczając 1,5 g agarozy LMP w 50 ml kompletnego HBSS, ogrzewając w kuchence mikrofalowej przez 1 do 2 minut przy pośredniej mocy. 
		nuta: Uważnie monitoruj ciepło, aby zapobiec przelaniu się podczas gotowania.</li>
		<li>Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 38 °C do momentu, gdy będzie on gotowy do użycia. Przechowywać w temperaturze 4 °C i raz użyć ponownie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie wkładów membranowych
	<ol>
		<li>Dodać jedną porcję roztworu podstawowego lamininy (por. krok 2.1.1) i jedną podwielokrotność roztworu podstawowego poli-L-lizyny (por. krok 2.2.1.) do 6 ml sterylnej wody, aby uzyskać roztwór powlekający (wystarcza na 6 wkładek).</li>
		<li>Umieść wkładki membranowe w 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml sterylnej wody na dnie każdej studzienki. Dodać 1 ml roztworu powlekającego (por. krok 2.6.1.) na wierzch każdej membrany i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% atmosferze dwutlenku węgla. 
		Uwaga: Stosować wyłącznie wkładki z optycznie przezroczystymi membranami, takimi jak membrana z politetrafluoroetylenu (PTFE).</li>
		<li>Umyj membrany trzykrotnie 1 ml sterylnej wody i wysusz. Tego samego dnia należy stosować powlekane membrany lub przechowywać w czystej 6-dołkowej płytce w temperaturze 4 °C przez okres do czterech tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcja mózgu i osadzanie
	<ol>
		<li>Dwa dni po elektroporacji umieść mysz w przezroczystej komorze podłączonej do waporyzatora i nasyconej 5% izofluranem. Gdy zwierzę jest nieprzytomne, wyjmij je z komory i złóż w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
		<li>Usuń macicę zawierającą zarodki i umieść ją na 10-centymetrowej szalce Petriego z lodowatym kompletnym HBSS. 
		Uwaga: Od tego momentu wszystkie roztwory, zarodki i mózgi należy przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Użyj mikroskopu stereoskopowego, kleszczyków z cienką końcówką (prostych, 11 cm) i pary nożyczek sprężynowych Vannas Tübingen (ustawionych pod kątem, długość: 9,5 cm), aby oddzielić każdy zarodek od macicy i przenieść go na inną szalkę Petriego zawierającą lodowato zimny, kompletny HBSS.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie na poziomie pnia mózgu i przetnij wzdłuż strzałkowej linii środkowej. Złudź skórę i chrząstki pokrywające mózg. Następnie odetnij pień mózgu tuż za półkulami i usuń mózg z czaszki. Przenieś mózg za pomocą szpatułki z mikrołyżeczką (185 mm x 5 mm) na 12-dołkową płytkę zawierającą lodowaty kompletny HBSS. Zbierz wszystkie mózgi ze ściółki na 12-dołkowej płytce.</li>
		<li>Użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby przebadać mózgi w 12-dołkowej płytce pod kątem jasności fluorescencji, a także wielkości elektroporowanego obszaru. Wybierz od 2 do 4 mózgów z jasnymi sygnałami fluorescencyjnymi w przypuszczalnej korze somatosensorycznej do dalszego przetwarzania.</li>
		<li>Wlać 3% roztwór agarozy LMP utrzymywany w temperaturze 38 °C do odklejanej jednorazowej formy do zatapiania. Usuń mózg z 12-dołkowej płytki za pomocą szpatułki z mikrołyżką i ostrożnie odsącz nadmiar kompletnego HBSS wokół mózgu za pomocą cienkiej bibuły.</li>
		<li>Delikatnie umieść mózg w roztworze agarozy, popchnij go na dno formy i ostrożnie wyreguluj jego położenie za pomocą igły o rozmiarze 20. W przypadku odcinków koronalnych zorientuj mózg tak, aby opuszki węchowe były skierowane do góry. Trzymaj pleśń na lodzie, aż roztwór agarozy zestali się i kontynuuj cięcie mózgu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcja wibratomu i kultura plastrów
	<ol>
		<li>Wyjmij blok agarozy z formy i umieść go na pokrywce sterylnej szalki Petriego. Odetnij nadmiar agarozy czystą żyletką, pozostawiając około 2 do 3 mm poniżej opuszki węchowej i 1 mm agarozy po pozostałych stronach. Przymocuj przycięty blok agarozy z opuszkami węchowymi skierowanymi w dół do etapu próbki za pomocą kleju cyjanoakrylowego. 
		Uwaga: Przed cięciem wysterylizuj narzędzia i sprzęt 70% etanolem.</li>
		<li>Przenieś etap próbki do komory krojenia wibrującego mikrotomu z łopatkami zawierającego lodowaty kompletny HBSS i ustaw mózg grzbietową stroną w kierunku ostrza. Wytnij plastry mózgu o grubości 250 μm zawierające obszar elektroporowany o niskiej lub umiarkowanej amplitudzie 0,9 mm i bardzo niskiej prędkości cięcia 0,09-0,12 mm/s. Zwykle z każdego pomyślnie naelektryzowanego mózgu uzyskuje się od 4 do 6 wycinków z jasnym sygnałem fluorescencyjnym.</li>
		<li>Za pomocą wygiętej szpatułki z mikrołyżeczką i kleszczykami z cienką końcówką ostrożnie przenieś wycinki mózgu wraz z otaczającą je agarozą na 6-dołkową płytkę zawierającą lodowato kompletny HBSS. 
		Uwaga: Uważaj, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej, dotykając tylko obrzeża agarozy wokół sekcji kleszczykami podczas przenoszenia.</li>
		<li>Przetwarzaj wszystkie wybrane mózgi zgodnie z opisem w krokach od 2.8.1 do 2.8.3.</li>
		<li>Zwilż wkładki membranowe 100 μl kompletnego HBSS przed umieszczeniem plastrów mózgu na błonach, aby ułatwić ich umieszczenie. Na 1 wkładce membranowej można umieścić do 5 plastrów.</li>
		<li>Ostrożnie przenieś plastry na błony za pomocą wygiętej szpatułki z mikrołyżeczką i kleszczyków z cienką końcówką. Delikatnie naciągnij plasterek na szpatułkę, dotykając tylko krawędzi agarozy kleszczami i delikatnie wepchnij plasterek ze szpatułki na błonę. Ułóż plasterek za pomocą kleszczy i kontynuuj przenoszenie pozostałych plasterków. Usunąć nadmiar kompletnego HBSS za pomocą pipety. 
		Uwaga: Nie nakładaj plasterków na siebie.</li>
		<li>Za pomocą kleszczyków ostrożnie umieścić wkładki membranowe z plastrami na 6-dołkowej płytce zawierającej 1,8 ml pożywki do hodowli plastrów (por. krok 2.4.1.) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% atmosferze dwutlenku węgla aż do obrazowania poklatkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie poklatkowe
<ol>
	<li>Konfiguracja mikroskopu
	<ol>
		<li>Ustawić komorę klimatyczną umieszczoną na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego na temperaturę 37 °C i 5% atmosfery dwutlenku węgla. Użyj detektora hybrydowego, aby zmniejszyć intensywność lasera i poprawić żywotność komórek. Do szczegółowej analizy należy użyć suchego obiektywu o bardzo dużej odległości roboczej 40X i aperturze numerycznej 0,6 lub większej. 
		Uwaga: Wszystkie elementy mikroskopu muszą być wstępnie podgrzane do 37 °C przez 2 - 3 godziny przed obrazowaniem, aby zapewnić stabilną ostrość podczas procesu obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie warstw
	<ol>
		<li>Wybierz wycinek mózgu do obrazowania z 6-dołkowej płytki zawierającej wkładki membranowe za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. 
		Ostrzeżenie: Unikaj długotrwałej ekspozycji na światło ultrafioletowe, ponieważ może to spowodować fotouszkodzenie komórek. 
		Uwaga: Wybierz wycinek z jasnymi pojedynczymi neuronami w górnej części SVZ migrującymi promieniście w kierunku powierzchni wycinka. Drobne procesy fluorescencyjne promienistych komórek glejowych, które obejmują cały CP, wskazują na nienaruszone promieniste rusztowanie glejowe, które jest wykorzystywane przez promieniście migrujące neurony korowe.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy przenieś wkładkę membranową z plastrem, który został wybrany do obrazowania poklatkowego, do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 50 mm zawierającego 2 ml pożywki do hodowli plastrów. Umieść naczynie w komorze klimatycznej mikroskopu konfokalnego.</li>
		<li>Ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli i zwiększ prędkość skanowania z 400 Hz do 700 Hz, aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę odpowiednio z około 1,4 do około 2,5 klatki na sekundę. Uśredniaj nie więcej niż dwa razy. Zdefiniuj stos z przechodzący przez obszar elektroporowany (zwykle 400-100 μm) z rozmiarem kroku 1,5 μm. Łącznie ustawienia te pozwalają na uzyskanie wystarczającej rozdzielczości i jasności obrazu przy jednoczesnym utrzymaniu niskiego poziomu fotouszkodzeń podczas akwizycji. Rozpocznij serię poklatkową, wykonując stos z co 30 min. 
		Uwaga: Długotrwała ekspozycja plastra na światło laserowe wywoła fotouszkodzenia, zmniejszając żywotność komórek. Dostosuj odpowiednio czas ekspozycji na światło lasera.</li>
		<li>Analizuj serie poklatkowe za pomocą oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) lub jego odpowiednika.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).</li>
<li>Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+co-regulation+of+neuronal+migration+and+laminar+identity+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex.</a> Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>LoTurco, J. J., Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multipolar+stage+and+disruptions+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The multipolar stage and disruptions in neuronal migration.</a> Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).</li>
<li>Tabata, H., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+mechanisms+of+neuronal+migration+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation.</a> Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).</li>
<li>Wiegreffe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11a+%28Ctip1%29+Controls+Migration+of+Cortical+Projection+Neurons+through+Regulation+of+Sema3c%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c.</a> Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).</li>
<li>John, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11a+is+required+for+neuronal+morphogenesis+and+sensory+circuit+formation+in+dorsal+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development.</a> Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), pl9(2002).</li>
<li>Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+logic+of+neocortical+projection+neuron+specification%2C+development+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-selective+electroporation+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subtype-selective electroporation of cortical interneurons.</a> J Vis Exp. (90), e51518(2014).</li>
<li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+electroporation+and+organotypic+slice+culture+of+mouse+hippocampal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+of+Bcl11b%2FCtip2+in+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).</li>
<li>Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dose-dependent+cortical+neuronal+migration+and+neurite+extension+defects+in+Lis1+and+Ndel1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice.</a> J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).</li>
<li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).</li>
<li>Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+analyzing+neuronal+progenitor+development+and+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).</li>
<li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).</li>
<li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trekking+across+the+brain%3A+the+journey+of+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-43 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Migracja promieniowa jest kluczowym procesem w rozwoju kory nowej. Mutacje w genach wpływających na różne etapy tego procesu mogą powodować poważne wady rozwojowe kory mózgowej, w tym lizencefalię i heterotopię istoty białej 1,2. Niedawno wykazaliśmy, że Bcl11a, który ulega ekspresji w młodych migrujących neuronach projekcyjnych kory mózgowej, odgrywa rolę w migracji radialnej. Użyliśmy poklatkowego obrazowania konfokalnego migrujących neuronów w ostrych wycinkac...

Kora nowa jest głównym miejscem funkcji poznawczych, emocjonalnych i sensomotorycznych. Składa się z sześciu poziomych warstw zorientowanych równolegle do powierzchni mózgu. Podczas rozwoju komórki progenitorowe w bocznej ścianie kresomózgowia grzbietowego dają początek neuronom projekcyjnym, które migrują promieniście w kierunku powierzchni pial i uzyskują tożsamość neuronalną specyficzną dla typu warstwy. Po wytworzeniu w strefach komorowych/podkomorowych (VZ/SVZ) neurony te stają się przejściowo wielobiegunowe i spowalniają swoją migrację. Po krótkim pobycie w strefie pośredniej (IZ) przechodzą na morfologię dwubiegunową, przyczepiają się do promienistego rusztowania glejowego i kontynuują promieniście zorientowaną migrację do płytki korowej (CP). Po dotarciu do ostatecznego celu projekcji neurony odłączają się od radialnych procesów glejowych i uzyskują tożsamość specyficzną dla warstwy. Mutacje w genach wpływających na różne etapy migracji neuronów mogą powodować poważne wady rozwojowe kory mózgowej, takie jak lizencefalia lub heterotopia istoty białej1,2.
Elektroporacja in utero to szybka i skuteczna technika transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się mózgu embrionów gryzoni3,4. Dzięki tej technice możliwe jest wyłączenie i/lub nadekspresja genów będących przedmiotem zainteresowania w celu zbadania ich funkcji w rozwoju neuronów. Metoda ta w szczególności pomogła opisać szczegóły morfologiczne i scharakteryzować molekularne mechanizmy procesu migracji radialnej5,6,7,8,9. Neurony migrujące promieniście podlegają dynamicznym zmianom kształtu komórki, szybkości migracji, a także kierunku migracji, które wymagają bezpośredniej i ciągłej obserwacji w czasie. Organotypowa hodowla warstwowa i poklatkowe obrazowanie konfokalne mózgów poddanych elektroporacji pozwalają na bezpośrednią obserwację migrujących neuronów w czasie. Korzystając z tego połączonego podejścia, możliwe jest przeanalizowanie różnych cech migrujących neuronów, których nie można zbadać w nieruchomych odcinkach tkanek mózgów poddanych elektropoturowaniu.
Niedawno zastosowaliśmy konfokalne obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów w kulturach warstwowych mózgów poddanych elektroporacji, aby zbadać rolę czynnika transkrypcyjnego komórki B CLL/chłoniaka 11a (Bcl11a) podczas rozwoju kory mózgowej10. Bcl11a ulega ekspresji w młodych, migrujących neuronach korowych, a my użyliśmy warunkowo zmutowanego allelu Bcl11a (Bcl11aflox)11 do zbadania jego funkcji. Elektroporacja rekombinazy Cre wraz z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) do korowych komórek progenitorowych mózgów Bcl11aflox/flox pozwoliła nam stworzyć mozaikową sytuację mutanta, w której tylko kilka komórek jest zmutowanych na tle typu dzikiego. W ten sposób możliwe było zbadanie autonomicznych funkcji Bcl11a na poziomie pojedynczej komórki. Odkryliśmy, że zmutowane neurony Bcl11a wykazują zmniejszoną prędkość, zmiany w swoich profilach prędkości, a także losowe zmiany orientacji podczas migracji10. W przedstawionym protokole opisujemy przebieg udanej elektroporacji i przygotowania kultur warstwowych12 mózgów myszy, a także poklatkowe obrazowanie konfokalne kultur warstw korowych.

<table><tbody><tr><td>izofluran</td><td>Abbott Laboratories&nbsp;</td><td>506949</td><td>Płytka</td></tr><tr><td>6-dołkowa</td><td>Forene Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>płytka 12-dołkowa</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>niewchłanialny szew chirurgiczny</td><td>Ethicon</td><td>K890H</td><td>Koło 3/8, 13 mm, punkt stożkowy</td></tr><tr><td>Micro Adson Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td>ząbkowane, długość: 12 cm</td></tr><tr><td>cienkie nożyczki</td><td>Narzędzia</td> <td>do nauki14063-09</td><td>kąt na bok, długość: 9 cm</td></tr><tr><td>Uchwyt igły Mathieu</td><td>Fine Science Tools</td><td>12510-14</td><td>węglik wolframu, długość: 14 cm</td></tr><tr><td>kleszcze z cienką końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>proste, 11 cm</td></tr><tr><td>Vannas T&uuml; Bingen Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td>kątowe do góry,</td></tr><tr><td>kleszcze pierścieniowe</td> 9,5 cm <td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td>OD: 3mm, ID, 2.2 mm, długość: 9 cm</td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Gibco</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>surowica konia</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>26050088</tr> Naczynia <tr><td>włosowate ze szkła borokrzemianowego</td> BME Gib 41010026 <td></td><td></td><td></td>co Aparat Harvard 30-0016 1,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm</tr><tr><td>system anestezjologiczny</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6471</td><td></td></tr><tr><td>komora anestezjologiczna</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0460</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> kanister filtra fluosorberowego Harvard Apparaus <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>34-0415</td><td></td></tr><tr><td>agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>mikrotom z wibrującymi ostrzami</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M125</td><td></td></tr> z <tr><td>odwróconą fluorescencją</td><td>Leica</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td> Detektor hybrydowy <td>Leica</td><td>TCS SP5II</td><td></td></tr> Obiektyw <tr><td></td><td>Leica</td><td>HyD</td><td></td></tr><tr><td>, 40x/0.60 NA</td><td></td><td></td> System kontroli temperatury mikroskopu Leica 11506201 <td></td></tr><tr><td></td><td>Usługi obrazowania życia</td><td>Cube, Brick & Pudełkowa</td><td></td></tr><tr><td>wkładka do hodowli komórkowych</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>mikromłynek</td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td>zastosowanie kąta 38&deg; do ukosowania</td></tr><tr><td>mikrowtryskiwacza</td><td>Parker Hannifin&nbsp;</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III</td></tr><tr><td>karprofen</td><td>Pfizer Animal Health</td><td>NDC 61106-8507</td><td></td></tr><tr><td>Forma do emdeddingu</td> Rimadyl <td>Polysciences</td><td>18986-1</td><td></td></tr> zestaw <tr><td>maxi plazmidu bez endotoksyn</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>szybki zielony</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magensium</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>elektroporator o fali kwadratowej</td><td>Sonidel</td><td>CUY21EDIT</td><td></td></tr><tr><td>pęseta z platynowymi elektrodami dyskowymi 5 mm</td><td>Ściągacz do mikropipet Sonidel</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>pudełko filamentu</td><td>Sutter Instrument</td><td>FB255B</td> Szpatułka do mikrołyżek <td>2,5 mm x 2,5 mm</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>231-0191</td> Naczynie szklane <td>185 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>, 50 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr></tbody></table>

poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Elektroporacja in utero to szybkie i skuteczne podejście do badania procesu migracji promieniowej w korze mózgowej rozwijających się embrionów myszy. Pomogło to w opisaniu różnych etapów migracji radialnej i scharakteryzowaniu mechanizmów molekularnych kontrolujących ten proces. Aby bezpośrednio i dynamicznie analizować migrujące neurony, należy je prześledzić w czasie. Protokół ten opisuje przebieg pracy, który łączy elektroporację in utero z organotypową hodowlą plastrów i poklatkowym obrazowaniem konfokalnym, co pozwala na bezpośrednie badanie i dynamiczną analizę radialnie migrujących neuronów korowych. Ponadto możliwa jest szczegółowa charakterystyka migrujących neuronów, taka jak prędkość migracji, profile prędkości, a także zmiany orientacji radialnej. Metodę tę można łatwo dostosować do przeprowadzania analiz funkcjonalnych genów będących przedmiotem zainteresowania w radialnie migrujących neuronach korowych poprzez utratę i zysk funkcji, a także eksperymentów ratunkowych. Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów jest najnowocześniejszą techniką, która po ustaleniu jest potężnym narzędziem do badania rozwoju kory mózgowej w mysich modelach zaburzeń migracji neuronów.

Wcześniej wykazaliśmy, że genetyczna delecja Bcl1a poprzez elektroporację in utero upośledza migrację radialną późno powstających neuronów projekcyjnych warstw górnych10. Elektroporacja plazmidowego wektora DNA zawierającego Cre-IRES-GFP skutecznie usunęła Bcl1a w warunkowych mózgach Bcl11aflox/flox 1. Podczas analizy elektroporowanych mózgów E14.5 trzy dni po zabiegu większość neuronów...

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest bezpośrednia obserwacja neuronów migrujących radialnie w organotypowej hodowli plastrów przygotowanej z elektroporowanego zarodkowego mózgu przy użyciu konfokalnej mikroskopii poklatkowej. Metoda ta może pomóc w badaniu kluczowych aspektów rozwoju neocortex. Pozwala ona na analizę mechanizmów molekularnych zaangażowanych w polaryzację neuronów oraz ich migrację radialną do docelowej pozycji w obrębie mózgu.Główną zaletą tej techniki jest możliwość analizy właściwości dynamicznych migrujących neuronów, w tym profili prędkości, średniej prędkości migracji oraz zmian kierunku migracji. Rozpocznij od umieszczenia odpowiednio znieczulonej ciężarnej myszy w pozycji grzbietowej na płycie grzewczej. Sprawdź brak odruchu stopowego.Następnie należy ostrożnie pokryć oczy wazeliną, aby zapobiec ich wysychaniu. Potem delikatnie rozsunąć kończyny i przymocować je do płyty grzewczej za pomocą taśmy chirurgicznej. Brzuch należy wysterylizować, przecierając go 70% ethanol, a następnie roztworem jodu, po czym na brzuchu należy położyć sterylną gazę z wykonanym nacięciem pod cięcie brzuszne.Zwilż gazę bakteriostatycznym roztworem chlorku sodu. Po ponownej ocenie głębokości znieczulenia chirurgicznego poprzez sprawdzenie utraty odruchu stopy, użyj ząbkowanej mikropincety Adsona i zakrzywionych nożyczek precyzyjnych, aby naciąć skórę na długości około 1,5 centymetra wzdłuż linii środkowej brzucha. Następnie przetnij znajdujący się pod skórą mięsień wzdłuż białej linii brzusznej.Uchwyć róg macicy pomiędzy embrionami za pomocą kleszczy pierścieniowych i delikatnie połóż go na zwilżonej gazie, nie naruszając łożysk ani naczyń doprowadzających. Następnie ostrożnie ustaw embrion tak, aby uzyskać wyraźny widok komory bocznej, która przejawia się jako cień w kształcie półksiężyca przebiegający równolegle do zatoki strzałkowej. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się w połowie linii łączącej pigmentowane oko z splotem zatok, w miejscu, gdzie zatoka strzałkowa rozgałęzia się na dwie zatoki przenoszące.Po zidentyfikowaniu odpowiedniego miejsca, wprowadzić igłę do mikroiniekcji przez ścianę macicy do komory bocznej. Następnie, używając mikroinjektora sterowanego pedałem nożnym, wstrzyknąć od 1 do 2 µL roztworu DNA w 5 do 10 pulsach. Prawidłowe wykonanie iniekcji można monitorować dzięki barwionemu roztworowi DNA, który powinien wypełnić układ komorowy.Następnie umieść elektrody typu pęsetowego tak, aby biegun dodatni znajdował się po tej samej stronie co wstrzyknięty komora mózgu, a biegun ujemny po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory, poniżej ucha głowy zarodka. Zwilż miejsce elektroporacji kilkoma kroplami bakteriostatycznego roztworu chlorku sodu i zastosuj pięć impulsów prądu elektrycznego o czasie trwania 50 ms w odstępach 950 ms. Pęcherzyki powietrza przy elektrodzie ujemnej wskazują na przepływ prądu elektrycznego.Do skutecznej elektroporacji zazwyczaj wystarczające jest natężenie od 60 do 90 mA. Niższe natężenia nie zapewnią wydajnej transfekcji neuronów, natomiast wyższe mogą doprowadzić do śmierci zarodkowej. Po powtórzeniu tej procedury dla każdego embrionu z pierwszego rogu macicy, delikatnie umieść go z powrotem w jamie brzusznej.Po zaszyciu warstwy mięśniowej i skóry należy starannie zdezynfekować miejsce operacji roztworem jodyny i delikatnie usunąć wazelinę z oczu za pomocą wacików celulozowych. Umieścić mysz pod lampą podczerwieni aż do momentu wybudzenia. Po eutanazji ciężarnej samicy metodą zatwierdzoną przez komisję, wyciąć macicę zawierającą embriony i umieścić ją w 10-centymetrowej płytce Petriego z lodowatym, kompletnym roztworem HBSS.Od tego momentu wszystkie roztwory, embriony i mózgi należy przechowywać w lodzie. Pracując pod stereomikroskopem, należy użyć pęsety z cienkimi końcówkami oraz nożyczek sprężynowych Vannas Tubingen, aby oddzielić każdy embrion od macicy. Następnie należy przenieść embriony do innej szalki Petriego zawierającej lodowaty kompletny HBSS.Wykonaj nacięcie na poziomie pnia mózgu i przetnij wzdłuż linii środkowej w płaszczyźnie strzałkowej. Odchyl skórę i chrząstkę pokrywającą mózg. Następnie odetnij pień mózgu bezpośrednio za półkulami i wyjmij mózg z czaszki.Przenieś mózg za pomocą mikroszpatułki do płytki 12-dołkowej zawierającej schłodzony do temperatury lodu kompletny roztwór HBSS. Zbierz wszystkie mózgi z miotu w jednej płytce 12-dołkowej. Następnie użyj fluorescencyjnego stereomikroskopu, aby ocenić mózgi w płytce pod kątem natężenia fluorescencji oraz wielkości obszaru poddanego elektroporacji.Wybierz od dwóch do czterech mózgów z silnym sygnałem fluorescencyjnym i widoczną korą somatosensoryczną do dalszej obróbki. Następnie wlej stopiony 3% roztwór agarozy niskotopliwej do jednorazowej formy do zatapiania z możliwością odrywania ścianek. Za pomocą mikrołopatki wyjmij mózg z płytki 12-dołkowej i ostrożnie osusz nadmiar kompletnego roztworu HBSS wokół mózgu, używając drobnoziarnistego papieru do tkanek.Ostrożnie umieść mózg w roztworze agarozy. Następnie, używając igły 20 G, dociśnij go do dna formy i starannie skoryguj jego pozycję. W przypadku przekrojów wieńcowych (koronalnych), zorientuj mózg tak, aby opłaty węchowe były skierowane ku górze.Przechowywać formę w lodu, aż roztwór agarozy stężeje, a następnie przystąpić do sekcjonowania mózgu. Za pomocą czystej żyletki odciąć nadmiar agarozy wokół mózgu, pozostawiając około jeden milimetr agarozy z każdej strony, z wyjątkiem cebulek węchowych, gdzie należy pozostawić od dwóch do trzech milimetrów agarozy. Po nałożeniu niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego na podłoże, przymocować przyciętą kostkę agarozy tak, aby cebulki węchowe były skierowane w dół.Przenieś platformę z preparatem do komory tnącej mikrotomu z wibracyjnym nożem zawierającej lodowaty, kompletny roztwór HBSS i ustaw mózg stroną grzbietową w stronę noża. Wykonaj przekroje mózgu o grubości 250 micron obejmujące obszar poddany elektroporacji, stosując niską lub umiarkowaną amplitudę oraz bardzo niską prędkość cięcia. Z każdego pomyślnie poddanego elektroporacji mózgu zazwyczaj uzyskuje się od czterech do sześciu przekrojów z jasnym sygnałem fluorescencyjnym.Chwyć krawędź agarozy jednego przekroju za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami i przenieś go na wygiętą mikrołopatkę. W ten sposób ostrożnie przenieś przekroje mózgu do płytki sześciodołkowej zawierającej lodowaty kompletny HBSS. Zwilż wkładki z membran powlekanych lamininą 100 µL kompletnego HBSS.Następnie, ostrożnie przenieś plasterki na membrany, używając wygiętej mikroszpatułki i pęsety. Delikatnie przesuń plasterek ze szpatułki na membranę, a następnie ustaw go za pomocą pęsety. Kontynuuj przenoszenie pozostałych plasterków.Na jednym wkładzie membranowym można umieścić do pięciu przekrojów. Za pomocą pipety usuń nadmiar kompletnego roztworu HBSS. Następnie, przy pomocy pincety, ostrożnie umieść wkłady membranowe z przekrojami w płytce sześciościołowej zawierającej 1,8 mililitra pożywki do hodowli przekrojów.Wybierz przekrój mózgu do obrazowania, oglądając preparaty pod mikroskopem odwróconym. Wybierz taki przekrój, w którym widoczne są jasne, pojedyncze neurony w górnej części SVZ, migrujące radialnie w kierunku powierzchni przekroju. Obecność cienkich, fluorescencyjnych wypustek komórek glejowe radialne, które przechodzą przez całą płytkę conjugate, świadczy o nienaruszonym rusztowaniu glejowym, z którego korzystają migrujące neurony conjugate.Przenieś wkład membranowy z wybranym skrawkiem do szalki z szklanym dnem o średnicy 50 mm zawierającej 2 ml pożywki do hodowli skrawków. Umieść szalkę w komorze klimatycznej mikroskopu konfokalnego. Ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli.Zwiększ szybkość skanowania z 400 hertz do 700 hertz, aby zwiększyć liczbę klatek z około 1,4 do około 2,5 klatek na sekundę. Użyj uśredniania nie więcej niż dwukrotnie. Zdefiniuj stos Z (Z-stack) przechodzący przez obszar poddany elektroporacji z rozmiarem kroku 1,5 microns.Rozpocznij serię time-lapse, wykonując stos Z (Z-stack) co 30 minut. Opisane ustawienia zapewniają wystarczającą rozdzielczość i jasność obrazu, ograniczając jednocześnie fotouszkodzenia podczas akwizycji. Ten film przedstawia neurony korowe E16.5 migrujące z strefy podkomorowej do płytki korowej.W transgenicznej linii warunkowej Bcl11a floxed po elektroporacji kontrolnego plazmidu IRES-GFP w 14,5 dniu embrionalnym. Film składa się ze 108 klatek przy prędkości pięciu klatek na sekundę. Pasek skali odpowiada 100 mikronom.Elektroporacja plazmidowego wektora DNA zawierającego Cre-IRES-GFP wpłynęła na migrację neuronów korowych w warunkowych mózgach z Bcl11a floxed. Jak widać tutaj, bardzo niewiele neuronów przemieszcza się poza strefę pośrednią, aby dotrzeć do blaszki korowej. Ten film pokazuje polaryzację neuronów korowych z kontroli znakowanej GFP po lewej stronie w porównaniu z neuronami mutanta Bcl11a po prawej stronie.Te animowane ślady reprezentatywnej kontroli w neuronach z mutacją Bcl11a zostały uzyskane z serii obrazów time-lapse kultur plastrów E16.5 z rozdzielczością czasową co jedną godzinę. Ponownie, dane z mózgu kontrolnego przedstawiono po lewej stronie, a dane z mózgu electroporowanego Cre-IRES-GFP po prawej stronie. Jak wynika z tego zbioru reprezentatywnych śladów z kontrolnych i zmutowanych kultur plastrów Bcl11a, neurony z mutacją Bcl11a często przechodzą powtarzające się fazy zmniejszonej prędkości migracji i losowo zmienionej orientacji, zaznaczone czerwonymi grotami strzałek.Profile prędkości można obliczyć na podstawie ścieżek migrujących neuronów. Jak widać tutaj, większa proporcja neuronów z mutacją Bcl11a wykazuje wolniejszą prędkość migracji w porównaniu z grupą kontrolną. Kąt odchylenia można obliczyć z danych dotyczących ścieżek.Jak widać na tym histogramie, neurony z mutacją Bcl11a, przedstawione przez czarne słupki, wykazują większe kąty odchylenia w porównaniu z grupą kontrolną. Po opanowaniu techniki, zarówno elektroporacja in utero, jak i przygotowanie organotypowych hodowli skrawków mózgu mogą zostać wykonane w czasie krótszym niż dwie godziny każda. Procedura ta może być łatwo dostosowana do analizy frakcyjnej wybranych genów w radialnie migrujących neuronach korowych poprzez zwiększenie lub zniesienie ich funkcji, a także do eksperymentów naczyniowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat bezpośredniej obserwacji neuronów migrujących radialnie w organotypowych kulturach skrawków przygotowanych z elektroporowanych mózgów embrionalnych przy użyciu konfokalnej mikroskopii poklatkowej.

time-lapse-confocal-imaging-migrating-neurons-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę przygotowania organotypowych skrawków embrionów myszy w połowie okresu gestacji do hodowli i obrazowania time-lapse wzrostu nerwów obwodowych.

Organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Źródło: Wiegreffe, C., et. al.,  Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017) Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów w organotypowej kulturze mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero. Technika ta umożliwia analizę dynamicznych właściwości migracji neuronów w czasie rzeczywistym.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero (Wideo) | JoVE Journal

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Przeglądaj więcej filmów