Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Ogólnym celem tej procedury jest bezpośrednia obserwacja neuronów migrujących promieniście w organotypowej kulturze warstwowej przygotowanej z elektroporowanego mózgu embrionalnego za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta metoda może pomóc w badaniu kluczowych aspektów rozwoju kory nowej. Pozwala to na zbadanie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w polaryzację neuronów i radialną migrację neuronów do ich ostatecznej pozycji w mózgu.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można analizować dynamiczne właściwości migrujących neuronów, w tym profile prędkości, średnią prędkość migracji, a także zmiany kierunku migracji. Zacznij od umieszczenia odpowiednio znieczulonej ciężarnej myszy w pozycji leżącej na płycie grzewczej. Sprawdź, czy nie ma refleksu na pedał

A następnie ostrożnie przykryj oczy wazeliną, aby nie wyschły. Następnie delikatnie rozłóż kończyny i przymocuj je do płytki rozgrzewającej za pomocą taśmy chirurgicznej. Wysterylizuj jamę brzuszną przez wymaz z 70% etanolem, a następnie roztworem jodu, a następnie umieść sterylną gazę, w której wykonano nacięcie na brzuch, na brzuchu.

Zwilż gazę bakteriostatycznym roztworem chlorku sodu. Po ponownej ocenie rozwoju znieczulenia chirurgicznego, w wyniku utraty odruchu pedałowania, użyj ząbkowanych mikro kleszczyków Adson i cienkich nożyczek pod kątem, aby przeciąć skórę około 1,5 centymetra wzdłuż linii środkowej brzucha. Następnie przetnij leżący pod spodem mięsień wzdłuż kresy białej.

Chwyć róg macicy między zarodkami za pomocą kleszczy pierścieniowych i delikatnie umieść go na zwilżonej gazie, nie naruszając łożysk ani naczyń zasilających. Następnie ostrożnie ustaw zarodek, aby zapewnić wyraźny widok na komorę boczną, która przedstawia się jako cień w kształcie półksiężyca równoległy do zatoki strzałkowej. Miejsce wstrzyknięcia leży w środku linii między pigmentowanym okiem a zbiegiem zatok, gdzie zatoka strzałkowa rozgałęzia się do dwóch zatok transferowych.

Po zidentyfikowaniu należy wprowadzić igłę do mikroiniekcji przez ścianę macicy i do komory bocznej. Następnie użyj mikrowstrzykiwacza obsługiwanego pedałem nożnym, aby wstrzyknąć od jednego do dwóch mikrolitrów roztworu DNA z pięcioma do 10 impulsami. Udane wstrzyknięcie można monitorować za pomocą kolorowego roztworu DNA, który powinien wypełnić układ komorowy.

Następnie umieść elektrody typu pęseta tak, aby dodatni koniec znajdował się po tej samej stronie co wstrzyknięta komora, a ujemny koniec znajdował się po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory poniżej ucha głowy zarodka. Zwilżyć miejsce elektroporacji kilkoma kroplami bakteriostatycznego roztworu chlorku sodu i zastosować pięć impulsów prądu elektrycznego o czasie trwania 50 milisekund w odstępach 950 milisekund. Bąbelki na elektrodzie ujemnej wskazują na prąd elektryczny.

60 do 90 miliamperów jest zwykle wystarczające do udanej elektroporacji. Niższe prądy nie będą skutecznie transfekować neuronów, podczas gdy wyższe prądy mogą prowadzić do śmierci zarodka. Po powtórzeniu procedury dla każdego zarodka pierwszego rogu macicy, delikatnie umieść go z powrotem w jamie brzusznej.

Po zszyciu warstwy mięśniowej i skóry należy dokładnie zdezynfekować roztworem jodu i delikatnie usunąć wazelinę z oczu za pomocą wacików celulozowych. Umieść mysz pod lampą podczerwieni, aż się obudzi. Po eutanazji ciężarnej samicy przy użyciu zatwierdzonej metody, usuń macicę zawierającą zarodki i umieść ją na 10-centymetrowej szalce Petriego z lodowatym kompletnym HBSS.

Od tego momentu trzymaj wszystkie roztwory, zarodki i mózgi na lodzie. Podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczyków z cienką końcówką i pary nożyczek sprężynowych Vannas Tubingen, aby oddzielić każdy zarodek od macicy. Przenieść zarodki na inną szalkę Petriego zawierającą lodowato kompletny HBSS.

Wykonaj nacięcie na poziomie pnia mózgu i przetnij wzdłuż strzałkowej linii środkowej. Złudź skórę i chrząstki pokrywające mózg. Następnie odetnij pień mózgu tuż za półkulami i usuń mózg z czaszki.

Przenieś mózg za pomocą mikro szpatułki na 12-dołkową płytkę zawierającą lodowato zimny, kompletny HBSS. Zbierz wszystkie mózgi ze ściółki na 12-dołkowej płytce. Następnie użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby przebadać mózgi w 12-dołkowej płytce pod kątem jasności kwiatu, a także wielkości elektroporowanego obszaru.

Wybierz dwa do czterech mózgów z jasnymi sygnałami fluorescencyjnymi i przypuszczalną korą somatosensoryczną do dalszego przetwarzania. Następnie wlej stopiony 3% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia do odklejanej jednorazowej formy do zatapiania. Użyj szpatułki z mikro łyżką, aby usunąć mózg z 12-dołkowej płytki i ostrożnie odsączyć nadmiar kompletnego HBSS z całego mózgu za pomocą cienkiej bibuły.

Umieść delikatnie mózg w roztworze agarozy. Następnie użyj igły o rozmiarze 20, aby wepchnąć ją na dno formy i ostrożnie wyreguluj jej położenie. W przypadku odcinków koronalnych zorientuj mózg tak, aby opuszki węchowe były skierowane do góry.

Trzymaj pleśń na lodzie, aż roztwór agarozy zestali się, a następnie przystąp do sekcji mózgu. Użyj czystej żyletki, aby odciąć nadmiar agarozy wokół mózgu, pozostawiając około jednego milimetra agarozy ze wszystkich stron, z wyjątkiem opuszki węchowej, gdzie należy pozostawić od dwóch do trzech milimetrów agarozy. Po nałożeniu niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego na próbkę, przymocuj przycięty blok agarozy tak, aby opuszki węchowe były skierowane w dół.

Przenieś etap próbki do komory krojenia wibrującego mikrotomu z łopatkami zawierającego lodowaty kompletny HBSS i ustaw mózg grzbietową stroną w kierunku ostrza. Wytnij wycinki mózgu o grubości 250 mikronów zawierające elektroporowany obszar o niskiej lub umiarkowanej amplitudzie i bardzo niskiej prędkości cięcia. Zwykle z każdego pomyślnie elektroporowanego mózgu uzyskuje się od czterech do sześciu wycinków z jasnym sygnałem fluorescencyjnym.

Chwyć krawędź agarozy jednej sekcji za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i pociągnij plasterek na wygiętą szpatułkę z mikro łyżką. W ten sposób ostrożnie przenieś wycinki mózgu na sześciodołkową płytkę zawierającą lodowato kompletny HBSS. Zwilżyć wkłady membranowe pokryte lamininą 100 mikrolitrami kompletnego HBSS.

Następnie ostrożnie przenieś plastry na błony za pomocą wygiętej szpatułki z mikro łyżką i kleszczykami. Delikatnie wepchnij plasterek ze szpatułki na membranę, a następnie ułóż za pomocą kleszczy. Kontynuuj przenoszenie pozostałych plasterków.

Na jednej wkładce membranowej można umieścić do pięciu plastrów. Usunąć nadmiar kompletnego HBSS za pomocą pipety. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie umieść wkładki membranowe z plastrami na sześciodołkowej płytce zawierającej 1,8 mililitra pożywki hodowlanej w plasterkach.

Wybierz wycinek mózgu do obrazowania, oglądając wycinki przez odwrócony mikroskop. Wybierz wycinek z jasnymi pojedynczymi neuronami w górnym SVZ migrującymi promieniście w kierunku powierzchni stosu wycinka. Obecność drobnych procesów fluorescencyjnych promieniowych komórek glejowych, które obejmują całą płytkę sprzężoną, wskazuje na nienaruszone promieniste rusztowanie glejowe, które jest wykorzystywane przez migrujące neurony sprzężone.

Przenieś wkładkę membranową z wybranym plastrem do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 50 milimetrów, zawierającego dwa mililitry pożywki do hodowli plastrów. Umieść naczynie w komorze klimatycznej mikroskopu konfokalnego. Ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli.

Zwiększ prędkość skanowania z 400 Hz do 700 Hz, aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę z około 1,4 do około 2,5 klatek na sekundę. Uśredniaj nie więcej niż dwa razy. Zdefiniuj stos Z przechodzący przez obszar elektroporowany o wielkości kroku 1,5 mikrona.

Rozpocznij serię poklatkową, wykonując stos Z co 30 minut. Opisane ustawienia pozwalają na uzyskanie wystarczającej rozdzielczości i jasności obrazu przy jednoczesnym utrzymaniu niskich uszkodzeń zdjęcia podczas akwizycji. Ten film pokazuje neurony korowe E16.5 migrujące ze stref podbrzusznych komór do płytki korowej.

W Bcl11a floksowany warunkowy transgeniczny po elektroporacji plazmidu kontrolnego IRES-GFP w 14,5 dniu embrionalnym. Film składa się ze 108 klatek z szybkością pięciu klatek na sekundę. Pasek skali reprezentuje 100 mikronów.

Elektroporacja wektora plazmidowego DNA zawierającego Cre-IRES-GFP wpłynęła na migrację neuronów korowych w warunkowych mózgach z klapkami Bcl11a. Jak widać tutaj, bardzo niewiele neuronów przechodzi przez strefę pośrednią, aby dotrzeć do płytki korowej. Ten film pokazuje polaryzację neuronów korowych z kontroli znakowanej GFP po lewej stronie w porównaniu z neuronami z mutanta Bcl11a po prawej.

Te animowane ślady reprezentatywnej kontroli w zmutowanych neuronach Bcl11a uzyskano z serii poklatkowych kultur warstwowych E16.5 z rozdzielczością jednogodzinną. Ponownie, dane z mózgu kontrolnego są pokazane po lewej stronie, a dane z mózgu elektroporowanego Cre-IRES-GFP są pokazane po prawej. Jak widać z tego zbioru reprezentatywnych śladów z kultur kontrolnych i zmutowanych warstw Bcl11a, zmutowane neurony Bcl11a często przechodzą powtarzające się fazy zmniejszonej prędkości migracji i losowo zmienianej orientacji, jak oznaczono czerwonymi grotami strzałek.

Profile prędkości można obliczyć na podstawie śladów migrujących neuronów. Jak widać tutaj, większy odsetek zmutowanych neuronów Bcl11a ma wolniejsze prędkości migracji w porównaniu z grupą kontrolną. Kąt odchylenia można obliczyć na podstawie danych śladowych.

Jak widać z tego histogramu, zmutowane neurony Bcl11a reprezentowane przez czarne paski wykazują większe kąty odchylenia w porównaniu z grupą kontrolną. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w czasie krótszym niż dwie godziny w celu elektroporacji in utero i przygotowania organotypowej hodowli wycinków mózgu. Procedura ta może być łatwo dostosowana do przeprowadzania frakcyjnej analizy genów będących przedmiotem zainteresowania w radialnie migrujących neuronach korowych poprzez przyrost i utratę funkcji, a także eksperymenty naczyniowe.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak bezpośrednio obserwować radialnie migrujące neurony w organotypowej kulturze warstwowej przygotowanej z elektroporowanych mózgów embrionalnych za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej.