Identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego RIP-Tag; Model mysi RIP-tva
16 października 2017
Prezentujemy protokół demonstrujący nowatorski somatyczny system transferu genów wykorzystujący RIP-Tag; Mysi model RIP-tva do badania funkcji genów w przerzutach. Ptasie retrowirusy są dostarczane dosercowo, aby zapewnić transfer genów do przedzłośliwych, nieinwazyjnych zmian komórek β trzustki u dorosłych myszy.
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego znacznika RIP-Tag; Model myszy RIP-tva. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów nowotworowych, takie jak identyfikacja czynników napędzających i nowych celów terapeutycznych. Główną zaletą tego mysiego modelu raka jest identyfikacja czynników przerzutowych poprzez somatyczny transfer genów do legionów prekursorowych komórek beta trzustki.
Zacznij od zebrania jednego 15-centymetrowego naczynia wirusa produkującego komórki DF1 na mysz, która ma zostać zainfekowana. Najpierw zbierz podłoże z zlewających się 15-centymetrowych naczyń. Następnie usuń resztki komórek przez wirowanie z niską prędkością w wstępnie schłodzonej wirówce przez 10 minut w temperaturze 1650 razy G i czterech stopniach Celsjusza.
Następnie przenieś supernatant wirusa do probówek ultrawirówek poliallomerowych. Wirować w ultrawirówce przez 1,5 godziny w temperaturze 9540 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Usunąć jak najwięcej supernatantu z probówek ultrawirówek.
Następnie dodaj PBS do probówki ultrawirówkowej, aby uzyskać ostateczną zawiesinę wirusową o objętości 100 mikrolitrów na 15-centymetrowe naczynie. Przykryj probówki folią laboratoryjną i ponownie zawiesić niewidoczny osad wirusa, wirując przez dwie minuty ze średnią prędkością. Następnie kołysz probówkami ultrawirówkowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę lub noc.
Po inkubacji przenieść zawiesinę wirusa do probówki mikrowirówkowej i przystąpić do mianowania wirusa. Procedurę miareczkowania należy rozpocząć od upewnienia się, że komórki DF1 osadzone na 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych osiągnęły 30% konfluencji. Do każdego oznaczenia miana wirusa potrzebna jest jedna płytka dwunastodołkowa.
Rozpocznij dziesięciokrotne seryjne rozcieńczanie supernatantów wirusa, najpierw mieszając pięć mikrolitrów wirusowego supernatantu z 495 mikrolitrami pożywki wzrostowej w probówce do mikrowirówki, aby uzyskać rozcieńczenie dziesięć do drugiego. Wiruj krótko przez kilka sekund. Następnie przenieś 40 mikrolitrów dziesięciu do drugiego rozcieńczenia do 360 mikrolitrów pożywki wzrostowej w probówce mikrowirówkowej dla dziesięciu do trzeciego rozcieńczenia.
Wiruj krótko przez kilka sekund. Kontynuuj ten proces, aby rozcieńczyć do dziesięciu do czwartego i dziesięciu do piątego. Następnie podajcie 2,25 mililitra pożywki wzrostowej do każdej z pięciu sześciomililitrowych rurek polistyrenowych.
I oznacz je odpowiednio dziesięcioma do szóstego, dziesięć do siódmego, dziesięć do ósmego, dziesięć do dziewiątego i dziesięć do dziesiątego. Wymieszaj 0,25 mililitra dziesięcio- do piątego rozcieńczenia z 2,25 mililitra pożywki wzrostowej w sześciomililitrowej probówce z polistyrenu dla dziesięciu do szóstego rozcieńczenia. Wiruj krótko przez kilka sekund.
Powtórz procedurę dla dziesięciu do siódmego, dziesięciu do ósmego, dziesięciu do dziewiątego i dziesięciu do dziesiątych rozcieńczeń. Następnie należy usunąć oryginalną pożywkę hodowlaną z komórek DF1 znajdujących się na płytkach 12-dołkowych. I dodaj jeden mililitr rozcieńczonego wirusa do każdej studzienki w dwóch egzemplarzach.
Pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 CO2 przez co najmniej siedem dni. Procedurę infekcji należy rozpocząć od znieczulenia siedmiotygodniowej myszy RIP-Tag RIP-tva. Nałóż smar do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
Ogol włosy z jamy klatki piersiowej myszy RIP-Tag RIP-tva, ułóż mysz na plecach klatką piersiową skierowaną do góry na chłonnym papierze laboratoryjnym na przytulnym, bezpiecznym ocieplaczu. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby sprawdzić, czy zwierzę nie reaguje i potwierdzić pełny efekt znieczulenia. Wyprostuj przednie kończyny i zabezpiecz je taśmą.
Oznaczyć klatkę piersiową myszy do wstrzyknięcia. Zaznacz położenie w połowie odległości między wcięciem mostka a szczytem wyrostka mieczykowatego i nieco w lewo anatomicznie od mostka. Następnie wyszoruj przednią ścianę klatki piersiowej peelingiem jodowym powidonu lub peelingiem chlorheksydyny, a następnie gąbką z gazy nasączoną 70% alkoholem izopropylowym lub 70% etanolem.
Wciągnij 50 mikrolitrów powietrza do sterylnej strzykawki insulinowej o rozmiarze 28,5, aby stworzyć przestrzeń między tłokiem a meniskiem strzykawki o rozmiarze 500 mikrolitrów. Przygotuj 100 mikrolitrów wirusa. Przestrzeń powietrzna bez płynu na ścianie ma kluczowe znaczenie dla zobaczenia tętna serca.
Trzymaj igłę w pozycji pionowej, jedną ręką trzymaj napiętą skórę myszy i włóż igłę w zaznaczone miejsce. Gdy w strzykawce pojawi się jaskrawoczerwony puls krwi, przestań przesuwać igłę i jedną ręką ustal głębokość igły w myszy. Drugą ręką ostrożnie i powoli popchnij tłok, aby dostarczyć zawiesinę wirusa przez około 60 sekund.
Podaj 10-20 mikrolitrów za każdym razem, gdy w strzykawce pojawi się jaskrawoczerwony puls krwi. Ciągłe wnikanie czerwonej natlenionej krwi do przezroczystej piasty igły wskazuje na prawidłowe umiejscowienie igły w lewej komorze. Po ostatnim pchnięciu grabieży w celu dostarczenia zawiesiny wirusa i zanim zobaczysz kolejny czerwony impuls krwi, szybko wycofaj igłę z jamy klatki piersiowej.
Delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia przez co najmniej jedną minutę, aby zmniejszyć krwawienie. Następnie ostrożnie przesuń mysz na poduszkę grzewczą lub pod lampę grzewczą, aż będzie w pełni przytomna. Myszy RIP-tva RIP-tva zostały zarażone wskazanym wirusem retro RCASBP-Bcl-xL w wieku siedmiu tygodni i poddane eutanazji w wieku 16 tygodni.
Zdjęcie przedstawia reprezentatywne barwienie synaptofizyną przerzutowych guzów neuroendokrynnych trzustki w węzłach chłonnych trzustki. W tym przypadku myszy RIP-Tag RIP-tva zostały zakażone wskazanym RCASBP-RHAM B. To zdjęcie przedstawia reprezentatywne barwienie synaptofizyną przerzutowych guzów neuroendokrynnych trzustki w węzłach chłonnych trzustki. W tym przypadku zabarwienie synaptofizyną jest widoczne w wątrobie po wstrzyknięciu wirusa RCASBP-RHAMM B.
Ważne jest, aby pamiętać, że tytuł większy niż dziesięć do ośmiu jednostek zakaźnych na mililitr jest wymagany do infekcji in vivo proliferujących komórek TVA w myszy RIP-Tag RIP-tva, a retro wirus RCASBP może dostarczyć CDNA do 2,5 kilozasad. Po opracowaniu tego mysiego modelu utorowało to drogę do zmiany paradygmatu, stwierdzając, że BCL-xL faktycznie sprzyja przerzutom raka niezależnie od jego funkcji antyapoptotycznej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół nowatorskiego systemu somatycznego transferu genów z wykorzystaniem modelu mysiego RIP-Tag; RIP-tva w celu zbadania funkcji genów w przerzutach. Metoda ta polega na wewnątrzsercowym podaniu retrowirusów ptasich w celu ukierunkowania na przednowotworowe zmiany komórek β trzustki u dorosłych myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Onkologia
- Terapia genowa
Wstęp
- Zrozumienie przerzutowania nowotworów jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii.
- Model mysi RIP-Tag; RIP-tva umożliwia ukierunkowany transfer genów.
- Retrowirusy ptasie mogą być wykorzystane do efektywnego dostarczania genów.
- Podejście to koncentruje się na zmianach prekursorowych komórek β trzustki.
Cel badania
- Identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutniczych za pomocą transferu genów.
- Badanie potencjalnych punktów uchwytu dla terapii w leczeniu nowotworów.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów napędzających przerzutowanie.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie komórek DF1 do produkcji wirusa.
- Zbieranie i wirowanie pożywki hodowli komórkowej.
- Dostarczanie retrowirusów drogą wewnątrzsercową do zmian docelowych.
- Charakterystyka funkcji genów w procesach przerzutowania.
Główne wyniki
- Skuteczny transfer genów do zmian w komórkach β trzustki.
- Identyfikacja kluczowych czynników uczestniczących w przerzutowaniu.
- Potencjalne nowe cele terapeutyczne w leczeniu nowotworów.
- Walidacja modelu RIP-Tag; RIP-tva w badaniach nad nowotworami.
Wnioski
- Protokół przedstawia skuteczną metodę badania przerzutowania.
- Wyniki mogą prowadzić do postępów w terapiach nowotworowych.
- Model RIP-Tag; RIP-tva jest cennym narzędziem dla przyszłych badań.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Niniejszy protokół umożliwia systematyczną identyfikację genów napędzających przerzutowanie w dobrze zdefiniowanym modelu guza neuroendokrynnego trzustki, wypełniając istotną lukę w przedklinicznej walidacji celów terapeutycznych. Poprzez umożliwienie somatycznego transferu genów do zmian przednowotworowych, wspiera on mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do kandydackich celów terapeutycznych przed kosztownymi badaniami in vivo. 100% penetracja nowotworowa modelu oraz zdefiniowane stadia progresji stanowią powtarzalną platformę do oceny funkcji genów w procesie przerzutowania, co bezpośrednio wpływa na pewność wyboru celu oraz decyzje dotyczące selekcji projektów w portfelu odkrywania leków w onkologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez badanie, czy konkretne geny promują lub hamują przerzutowanie in vivo.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje somatyczny transfer genów w celu obejścia ograniczeń linii zarodkowej, co pozwala na szybkie testowanie wielu kandydatów w tym samym tle genetycznym.
- Wartość prognostyczna: Identyfikuje czynniki promujące przerzutowanie niezależnie od apoptozy, co wykazano na przykładzie BCL-xL, ujawniając niekanoniczne mechanizmy, które mogłyby zostać pominięte w standardowych testach.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie izogenicznych linii komórkowych przerzutujących i nieprzerzutujących z tego samego tła nowotworowego, co umożliwia kontrolowane porównanie funkcji genów w procesach inwazji i kolonizacji.
- Wartość operacyjna: Ptasie wektory retrowirusowe zapewniają wysoką wydajność infekcji komórek wykazujących ekspresję TVA, co wspiera skalowalną produkcję zmodyfikowanych linii komórkowych do dalszych analiz.
- Gotowość testu: Miana wirusa >1x10^8 IU/mL zapewniają spójną infekcję in vivo, stanowiąc ilościowy punkt odniesienia dla powtarzalności eksperymentalnej w różnych badaniach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Charakteryzuje czynniki przerzutowe w modelu odtwarzającym etapy nowotworzenia u ludzi, od hiperplazji do raka naciekającego, co zwiększa istotność translacyjną.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie przerzutów do narządów takich jak wątroba i węzły chłonne za pomocą immunohistochemii, wspierając histopatologiczną walidację wpływu genów.
- Łagodzenie ryzyka: Identyfikuje geny napędzające przerzutowanie bez konieczności formowania guza pierwotnego, pozwalając na skoncentrowanie zasobów na rzeczywistych regulatorach przerzutów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w continuum odkryć — od generowania hipotez dotyczących celów po walidację przedkliniczną — umożliwiając w szczególności walidację funkcjonalną genów związanych z przerzutowaniem, zidentyfikowanych w badaniach omicznych lub kampaniach przesiewowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez, umożliwiając badania funkcji wzmocnionej lub utraconej w szlakach metastatycznych w zdefiniowanym modelu nowotworowym.
- Przesiewy: Pozwala na otrzymanie zestandaryzowanych, genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych, które mogą być wykorzystane w testach inwazji, migracji lub kolonizacji w celu priorytetyzacji wyników z przesiewów pierwotnych.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty obciążenia przerzutowego poprzez analizę zapadalności na nowotwory w narządach oraz ocenę histopatologiczną, co umożliwia statystyczne porównanie różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy funkcję genu z progresją przerzutową w klinicznie istotnym miejscu w organizmie, wspierając dopasowanie biomarkerów do późniejszej walidacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Model RIP-Tag;RIP-tva oraz system retrowirusowy oparty na DF1 mogą być ponownie wykorzystywane w wielu projektach, co redukuje koszty ponownego opracowywania metod w badaniach nad przerzutami.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez odizolowanie funkcji przerzutniczej genów od ich wpływu na wzrost guza pierwotnego lub apoptozę.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dostarczanie genów poprzez wstrzyknięcie wewnątrzsercowe z określonymi mianami wirusów, co poprawia powtarzalność między laboratoriami i zmniejsza zmienność w testach przerzutniczych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez odróżnienie rzeczywistych czynników napędzających przerzutowanie od zmian pasażerskich, co zapobiega inwestowaniu w wyniki fałszywie dodatnie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie zwalidowanej aktywności pro- lub antyprzerzutniczej, co zwiększa efektywność kapitałową w projektach onkologicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przeprowadzaniu operacji na myszach, pracy z wirusami oraz stosowania protokołów poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) przy użyciu ptasich retrowirusów.
- Wymaga zastosowania ultrawirówki do koncentracji wirusa oraz miareczkowania za pomocą testów infekcji komórek DF1.
- Konieczna jest standaryzacja miana wirusa (>1x10^8 IU/mL) oraz objętości iniekcji (100 µL) we wszystkich eksperymentach, aby zapewnić spójne celowanie w zmiany chorobowe.
- Metoda jest ograniczona do modeli wykazujących ekspresję TVA; adaptacja do innych systemów wymaga stworzenia odpowiednich linii receptorowo-dodatnich.
- Ocena przerzutów opiera się na badaniu histologicznym w punkcie końcowym, co wymaga specjalistycznego wsparcia patomorfologicznego w celu wykrycia zmian w organach takich jak wątroba i węzły chłonne.
