Name: Identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego RIP-Tag; Model mysi RIP-tva (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę transferu genów w modelu mysim RIP-Tag; RIP-tva do identyfikacji czynników przerzutowych w nowotworach trzustki. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów metastazy i odkrywanie nowych celów terapeutycznych w onkologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Haroldowi Varmusowi, Brianowi C. Lewisowi, Douglasowi Hanahanowi, Danny'emu Huangowi, Sharon Pang, Megan Wong i Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. jest wspierany przez grant Departamentu Obrony W81XWH-16-1-0619 i grant NIH 1R01CA204916.

<ol><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multistep+nature+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The multistep nature of cancer.</a> Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).</li>
<li>Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models in cancer research.</a> Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).</li>
<li>Khanna, C., Hunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in vivo.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).</li>
<li>Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+tumor+progression+factors+by+somatic+gene+transfer+into+a+mouse+model%3A+Bcl-xL+promotes+islet+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion.</a> PLoS biology. 5 (10), e276(2007).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+formation+of+pancreatic+beta-cell+tumours+in+transgenic+mice+expressing+recombinant+insulin%2Fsimian+virus+40+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes.</a> Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).</li>
<li>Fisher, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+flexible+and+specific+gene+delivery+system+for+production+of+murine+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models.</a> Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).</li>
<li>Orsulic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RCAS-TVA-based+approach+to+designer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models.</a> Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).</li>
<li>Tuveson, D., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+medicine%3A+Cancer+lessons+from+mice+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans.</a> Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).</li>
<li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+promotes+metastasis+independent+of+its+anti-apoptotic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity.</a> Nat Commun. 7, 10384(2016).</li>
<li>Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+and+fall+of+apoptosis+during+multistage+tumorigenesis%3A+down-modulation+contributes+to+tumor+progression+from+angiogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors.</a> Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).</li>
<li>Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptor+plasmids+simplify+the+insertion+of+foreign+DNA+into+helper-independent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors.</a> J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).</li>
<li>Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+in+vivo+expression+of+a+muscle-specific+promoter+by+using+avian+retroviral+vectors+for+gene+transfer+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected].</a> J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).</li>
<li>Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest-directed+gene+transfer+demonstrates+Wnt1+role+in+melanocyte+expansion+and+differentiation+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).</li>
<li>Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+RCAS+vectors+useful+for+functional+genomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses.</a> DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).</li>
<li>Bromberg-White, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNA+sequences+by+using+a+replication-competent+avian+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector.</a> J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).</li>
<li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCAS-RNAi%3A+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).</li>
<li>Huse, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PTEN-regulating+microRNA+miR-26a+is+amplified+in+high-grade+glioma+and+facilitates+gliomagenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo.</a> Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).</li>
<li>Ahronian, L. G., Lewis, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+RCAS+virus+from+DF1+chicken+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+tumor+progression+factors+by+somatic+gene+transfer+into+a+mouse+model%3A+Bcl-xL+promotes+islet+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion.</a> PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).</li>
<li>Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+for+hyaluronan-mediated+motility+isoform+B+promotes+liver+metastasis+in+a+mouse+model+of+multistep+tumorigenesis+and+a+tail+vein+assay+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).</li>
<li>Guernet, A., Grumolato, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+editing+of+the+genome+for+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling.</a> Methods. , (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu opisaliśmy potężny model myszy, RIP-Tag; RIP-tva, w celu osiągnięcia dostarczania genów somatycznych za pośrednictwem ptasich retrowirusów w celu identyfikacji i charakterystyki czynników przerzutowych. Chociaż RIP-Tag; U myszy RIP-tva rozwijają się guzy neuroendokrynne trzustki, czynniki przerzutowe zidentyfikowane w tym modelu mysim mogą również sprzyjać przerzutom innych typów raka.
Nasze podejście ma tę zaletę, że wprowadza somatyczne zmiany genetyczne specy...

Większość nowotworów powstaje w wyniku mutacji somatycznych 1. Konwencjonalne genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) dostarczyły istotnych informacji na temat udziału określonych zmian genetycznych w nowotworzeniu 2. Mają jednak kilka ograniczeń. Główną wadą tych modeli jest to, że nie odtwarzają one sporadycznej natury powstawania nowotworów u ludzi, w których tylko niektóre komórki w tkance uzyskują zmiany genetyczne. Mutacje u myszy transgenicznych i nokautowych są również linią zarodkową, która może wpływać na rozwój. Co więcej, generowanie tych modeli myszy jest kosztowne i czasochłonne.
Przerzuty to poważny problem w dziedzinie raka. Modelowanie przerzutów w GEMM było trudne. Spontaniczne przerzuty są rzadkie u myszy. Penetracja jest zmienna, a opóźnienie jest duże w GEMM przerzutów 3. Eksperymentalne modele przerzutów wykorzystują bezpośrednie wstrzykiwanie komórek do krążenia myszy, dzięki czemu wczesne etapy kaskady przerzutowej są eliminowane.
Aby przezwyciężyć niektóre z powyższych ograniczeń w badaniu czynników przerzutowych w modelach mysich, opracowaliśmy dwutransgeniczny model myszy, RIP-Tag; RIP-tva4. Strategia opiera się na połączeniu wysoce zsynchronizowanego mysiego modelu progresji nowotworu, RIP-Tag 5, oraz receptora dla wirusa ptasiej białaczki podgrupy A, tva 6,7. Ten znacznik RIP; Mysi model RIP-tvapozwala na somatyczne wprowadzenie genów do pojedynczego bitransgenicznego szczepu myszy. Z antygenem SV40 T hamującym funkcje supresyjne nowotworu Rb i p53, myszy rozwijają guzy neuroendokrynne trzustki w podobny sposób jak ludzka noworoczyna, z etapami obejmującymi hiperplazję, angiogenezę, gruczolaka i raka inwazyjnego. Ten model RIP-Tag był bardzo pouczający dla naszego zrozumienia cech charakterystycznych raka, nie ograniczając się do guzów neuroendokrynnych trzustki. Był również używany w badaniach przedklinicznych 8.
Przedstawiamy protokół transferu genów somatycznych poprzez wstrzyknięcie ptasich retrowirusów dosercowo do RIP-Tag; Myszy RIP-tva. Skuteczne zakażenie retrowirusami ptaków pochodzącymi z RCASBP wymaga aktywnej proliferacji komórek docelowych. Dlatego wybraliśmy RIP-Tag; Myszy RIP-tva w wieku 7 tygodni, kiedy przerost rozwija się w około 50% wysp trzustkowych. Wstrzyknięcie dosercowe do lewej komory serca wirusów o wysokim mianie jest wymagane do osiągnięcia skuteczności infekcji na poziomie 10-20% 4. Ta metoda dostarczania zmniejsza znaczne rozcieńczenie cząstek wirusa w krążeniu, zanim wirusy dotrą do wysp trzustkowych.
Korzystając z tego podejścia, wykazaliśmy wcześniej, że Bcl-xL sprzyja przerzutom raka niezależnie od swojej funkcji antyapoptotycznej 4,9. Ta niezależna od apoptozy funkcja przerzutowa nie była obserwowana, gdy Bcl-xL był wyrażany przez transgen we wszystkich komórkach β trzustki podczas ontogenezy nowotworowej w RIP-Tag; Model myszy RIP-Bcl-xL 10. Dlatego nasz mysi model oferuje wyjątkową możliwość identyfikacji i scharakteryzowania funkcji genów, gdy ulegają ekspresji na późniejszym etapie nowotworzenia. Ponieważ 2-4% wysepek przekształca się w guzy w RIP-Tag; Myszy bitransgeniczne RIP-tva bez infekcji wirusowej i nie wszystkie zmiany przednowotworowe są zakażone retrowirusami ptaków pochodzącymi z RCASBP, można zidentyfikować tylko czynniki, które dają selektywną przewagę nad naturalnym przebiegiem nowotworzenia. W szczególności czynniki przerzutowe będą najłatwiej rozpoznane tą metodą, ponieważ przerzuty do węzłów chłonnych trzustki lub innych narządów zwykle nie występują w RIP-Tag; Myszy RIP-tva.

<table><tbody><tr><td>Plazmid RCASBP-Y DV</td><td>Addgene</td><td>11478</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid RCAS-RNAi</td><td>Addgene</td><td>15182</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS-/-, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Superfect</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa z poliallomeru</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm Nalgene Filtry strzykawkowe z membraną PES</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki do insuliny</td><td>BD</td><td></td><td></td>329461</tr><tr><td>synaptofizyna</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-S284</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (peroksydaza, królicza IgG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA AmpliTaq z technologiami Buffer II</td><td>Life N8080153</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA MyTaq</td><td>Bioline</td><td>BIO-21106</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego rip-tag; model mysi rip-tva

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Rak z przerzutami odpowiada za 90% zgonów u pacjentów z guzami litymi. Istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia czynników powodujących przerzuty nowotworowe i zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych. Aby zbadać zdarzenia molekularne, które napędzają progresję od pierwotnego raka do przerzutów, opracowaliśmy bitransgeniczny model myszy, RIP-Tag; RIP-tva. W tym modelu mysim promotor insuliny szczura (RIP) napędza ekspresję antygenu T SV40 (Tag) i receptora dla wirusa ptasiej białaczki podgrupy A (tva) w komórkach β trzustki. U myszy rozwijają się guzy neuroendokrynne trzustki ze 100% penetracją przez dobrze zdefiniowane etapy, które są podobne do ludzkiej nowotworzenia, z etapami obejmującymi hiperplazję, angiogenezę, gruczolaka i raka inwazyjnego. Ponieważ RIP-Tag; Myszy RIP-tva nie rozwijają choroby przerzutowej, można łatwo zidentyfikować zmiany genetyczne sprzyjające przerzutom. Transfer genów somatycznych do proliferujących β przednowotworowych zmian trzustkowych z ekspresją twa osiąga się poprzez wstrzyknięcie do serca ptasich retrowirusów zawierających pożądaną zmianę genetyczną. Miano >1 x 10,8 jednostek zakaźnych na ml uważa się za właściwe dla zakażenia in vivo. Ponadto ptasie retrowirusy mogą infekować linie komórkowe pochodzące z nowotworów w RIP-Tag; Myszy RIP-tva o wysokiej wydajności. Linie komórkowe można również wykorzystać do scharakteryzowania czynników przerzutowych. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać ten mysi model i linie komórkowe do oceny funkcji genów kandydujących w przerzutach nowotworowych.

Wskaźniki infekcji komórek nowotworowych RIP-Tag; RIP-tva przez wirusy oparte na RCASBP in vivo i in vitro wynoszą odpowiednio ~20% i ~80% 20. W modelu mysim RIP-Tag; RIP-tva około 4% z 40 wysepek trzustkowych w każdej myszy naturalnie przekształca się w guzy 20; w związku z tym w każdej myszy znajduje się wystarczająca liczba komórek nowotworowych do przeprowadzenia analizy histologicznej i fenotypowej po...

Prezentujemy protokół demonstrujący nowatorski somatyczny system transferu genów wykorzystujący RIP-Tag; Mysi model RIP-tva do badania funkcji genów w przerzutach. Ptasie retrowirusy są dostarczane dosercowo, aby zapewnić transfer genów do przedzłośliwych, nieinwazyjnych zmian komórek β trzustki u dorosłych myszy.

Identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego RIP-Tag; Model mysi RIP-tva

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego modelu mysiego RIP-Tag;RIP-tva. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutowania nowotworów, takie jak identyfikacja czynników napędzających ten proces oraz nowych celów terapeutycznych. Główną zaletą tego modelu mysiego w badaniach nad rakiem jest możliwość identyfikacji czynników przerzutowych poprzez somatyczny transfer genów do obszarów prekursorów komórek beta trzustki.Zacznij od zebrania zawartości jednej 15 cm płytki z produkującymi wirusa komórkami DF1 dla każdej myszy przeznaczonej do zakażenia. Najpierw pobierz pożywkę z konfluencyjnych płytek o średnicy 15 cm. Następnie usuń szczątki komórkowe poprzez wirowanie z niską prędkością w schłodzonej wcześniej wirówce przez 10 minut przy 1650 ×g i temperaturze 4 °C.Następnie przenieś nadsącz wirusowy do probówek do ultrawirowania z polialomeru. Wiruj w ultrawirowce przez 1,5 godziny przy 9540 ×g i temperaturze 4 °C. Usuń z probówek do ultrawirowania jak największą ilość nadsączu.Następnie do probówki do ultrawirówki należy dodać PBS, aby uzyskać końcową objętość zawiesiny wirusowej wynoszącą 100 µL na płytkę 15 cm. Probówki należy przykryć folią laboratoryjną i ponownie zawiesić niewidoczny osad wirusowy, wierzgając w wortexie przez dwie minuty przy średniej prędkości. Następnie probówki do ultrawirówki należy inkubować na wstrząsarce w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę lub przez noc.Po inkubacji przenieś zawiesinę wirusową do probówki do mikrocentryfugi i przystąp do miareczkowania wirusa. Rozpocznij procedurę miareczkowania, upewniając się, że komórki DF1 wysiane na 12-dołkowych płytkach do hodowli tkanek osiągnęły 30% konfluencji. Do każdego oznaczenia miana wirusa potrzebna jest jedna płytka 12-dołkowa.Rozpocznij dziesięciokrotne rozcieńczenie szeregowe supernatantów wirusowych, mieszając najpierw 5 µL supernatantu wirusowego z 495 µL pożywki wzrostowej w probówce do mikrocentryfugi, aby przygotować rozcieńczenie 10⁻². Krótko wymieszaj na wortexie przez kilka sekund. Następnie przenieś 40 µL rozcieńczenia 10⁻² do 360 µL pożywki wzrostowej w probówce do mikrocentryfugi, aby przygotować rozcieńczenie 10⁻³.Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex przez kilka sekund. Kontynuuj ten proces, aby uzyskać rozcieńczenia 10⁴ oraz 10⁵. Następnie odmierz 2,25 ml pożywki wzrostowej do każdej z pięciu polistyrenowych probówek o pojemności 6 ml.Oznacz je odpowiednio jako 10⁻⁶, 10⁻⁷, 10⁻⁸, 10⁻⁹ i 10⁻¹⁰. W celu przygotowania rozcieńczenia 10⁻⁶, wymieszaj 0,25 ml rozcieńczenia 10⁻⁵ z 2,25 ml pożywki wzrostowej w sześciomililitrowej probówce polistyrenowej. Wymieszaj krótko na wirówce vortex przez kilka sekund.Powtórz procedurę dla rozcieńczeń 10⁻⁷, 10⁻⁸, 10⁻⁹ oraz 10⁻¹⁰. Następnie usuń pierwotne pożywkę z komórek DF1 na płytkach 12-dołkowych. Do każdego dołka dodaj w dwóch powtórzeniach 1 ml rozcieńczonego wirusa.Pozostawić komórki do wzrostu w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez co najmniej siedem dni. Rozpocząć procedurę infekcji od znieczulenia siedmiotygodniowej myszy RIP-Tag RIP-tva. Nałożyć lubrykant do oczu do obu oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki.Ogolić sierść z klatki piersiowej myszy RIP-Tag RIP-tva, ułożyć mysz na grzbiecie klatką piersiową do góry na chłonnym papierze laboratoryjnym umieszczonym na podgrzewaczu snuggle safe. Wykonać uciśnięcie palca, aby sprawdzić brak reakcji zwierzęcia i potwierdzić pełny efekt znieczulenia. Wyprostować przednie kończyny i zabezpieczyć je taśmą.Zaznacz na klatce piersiowej myszy miejsce wstrzyknięcia. Zaznacz punkt w połowie odległości między wcięciem mostka a górną krawędzią wyrostka mieczowatego, nieco na lewo od mostka w ujęciu anatomicznym. Następnie przemyj przednią ścianę klatki piersiowej roztworem powidonu z jodem lub chlorheksydyną, a następnie gazikiem nasączonym 70% isopropyl alcohol lub 70% ethanol.Pobrać 50 µL powietrza do sterylnej strzykawki insulinowej o rozmiarze igły 28,5 G, aby stworzyć przestrzeń między tłokiem a meniskiem strzykawki o pojemności 500 µL. Następnie pobrać 100 µL wirusa. Obecność przestrzeni powietrznej bez cieczy na ściance jest kluczowa dla obserwacji tętna serca.Trzymając igłę pionowo, jedną ręką napnij skórę myszy i wprowadź igłę w zaznaczone miejsce. Gdy w strzykawce pojawi się jasnoczerwony impuls krwi, przestań posuwać igłę i jedną ręką utrwal jej głębokość wprowadzenia do organizmu myszy. Drugą ręką ostrożnie i powoli wciśnij tłok, aby podać zawiesinę wirusową w czasie około 60 s.Podawaj 10-20 µL za każdym razem, gdy w strzykawce pojawi się jasnoczerwony puls krwi. Ciągły dopływ czerwonej natlenionej krwi do przezroczystego piasty igły wskazuje na prawidłowe umiejscowienie igły w lewej komorze. Po ostatnim pchnięciu tłoka w celu podania zawiesiny wirusowej i przed pojawieniem się kolejnego czerwonego pulsu krwi, szybko wycofaj igłę z jamy klatki piersiowej.W miejscu wstrzyknięcia należy wywierać delikatny ucisk przez co najmniej jedną minutę, aby ograniczyć krwawienie. Następnie należy ostrożnie przenieść mysz na podkładkę grzewczą lub pod lampę grzewczą, aż do całkowitego odzyskania przez nią przytomności. Myszy RIP-Tag RIP-tva zostały zainfekowane wskazanym retrowirusem RCASBP-Bcl-xL w siódmym tygodniu życia i poddane eutanazji w 16. tygodniu życia.Na tej fotografii przedstawiono reprezentatywne barwienie synaptofizyny w przerzutowych neuroendokrynnych guzach trzustki w węzłach chłonnych trzustki. W tym przypadku myszy RIP-Tag RIP-tva zostały zainfekowane wskazanym wirusem RCASBP-RHAM B. Na tej fotografii przedstawiono reprezentatywne barwienie synaptofizyny w przerzutowych neuroendokrynnych guzach trzustki w węzłach chłonnych trzustki. Tutaj barwienie synaptofizyny widoczne jest w wątrobie po wstrzyknięciu wirusa RCASBP-RHAMM B.Należy pamiętać, że do infekcji in vivo proliferujących komórek TVA u myszy RIP-Tag RIP-tva wymagany jest miano przekraczające 10⁸ jednostek zakaźnych na mililitr, a wektor retrowirusowy RCASBP może przenosić cDNA o długości do 2,5 kb. Opracowanie tego modelu mysiego utorowało drogę do przełomowego odkrycia, że BCL-xL w rzeczywistości promuje przerzuty nowotworowe niezależnie od swojej funkcji antyapoptotycznej.

identification-characterization-metastatic-factors-gene-transfer-into

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje protokół dosercowego wstrzykiwania retrowirusów do transgenicznej myszy, aby zapewnić transfer genów do proliferujących zmian trzustkowych β przednowotworowych. Metoda ta może również pomóc w ocenie funkcji genów kandydujących w przerzutach nowotworowych.

Dosercowe dostarczanie wektorów wirusowych: technika wstrzykiwania wektorów wirusowych dosierdziowo w celu zbadania przerzutów do trzustki w modelu mysim

Aktywacja utajonych mutacji z adenowirusem-Cre w systemie przewodowym sutka powoduje klinicznie istotny przerzutowy rak piersi. Włączenie promotora YFP umożliwia śledzenie dystalnych komórek nowotworowych z przerzutami. Model ten jest przydatny do badania utajonych przerzutów, odporności przeciwnowotworowej oraz do projektowania nowych immunoterapii w leczeniu raka piersi.

Inicjacja przerzutowego raka piersi poprzez celowanie w nabłonek przewodowy za pomocą Adenovirus-Cre: nowy transgeniczny mysi model raka piersi

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Brakuje modeli przedklinicznych oceniających terapię adjuwantową ukierunkowaną na przerzuty raka piersi. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo gruczolakoraka sutka do płuc, w którym terapie stosowane w trybie adjuwantowym (pooperacyjna resekcja guzów pierwotnych) mogą być oceniane pod kątem skuteczności w oddziaływaniu na wcześniej zasiane przerzuty do płuc.

Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [18F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Szczegółowo opisujemy klinicznie istotny model raka jelita grubego z przerzutami do wątroby (CRLM) oraz wpływ reperfuzji niedokrwienia wątroby (I/R) na wzrost guza i przerzuty. Model ten może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw indukowanego przez operację wzrostu przerzutów do wątroby.

Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Poznaj metodę transferu genów w modelu mysim RIP-Tag; RIP-tva do identyfikacji czynników przerzutowych w nowotworach trzustki. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów metastazy i odkrywanie nowych celów terapeutycznych w onkologii.

Identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego RIP-Tag; Model mysi RIP-tva

Przeglądaj więcej filmów