Name: Wysokoprzepustowa analiza zachowań lokomotorycznych w teście na wyspie Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę Island Assay do analizy zachowań lokomotorycznych Drosophila melanogaster z automatycznym przetwarzaniem danych. Ta technika umożliwia wysokoprzepustowe badania genetyczne i farmakologiczne chorób ruchu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Vienna Drosophila Resource Center oraz Bloomington Drosophila stock center (NIH P40OD018537) za dostarczenie szczepów Drosophila. Jesteśmy wdzięczni laboratorium Klämbt za wprowadzenie nas do testu wyspowego oraz Martijnowi Eidhofowi za zbudowanie zestawu do testowania wyspy. Badanie to było częściowo wspierane przez grant E-RARE-3 Joint Transnational Call "Przygotowanie terapii dla ataksji autosomalnych recesywnych" PREPARE (NWO 9003037604), grant TOP (912-12-109) z Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO) oraz dwa stypendia doktoranckie DCN/Radboud University Medical Center. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

<ol><li>Smeets, C. J., Verbeek, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+ataxia+and+functional+genomics%3A+Identifying+the+routes+to+cerebellar+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).</li>
<li>Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+have+learned+from+the+next-generation+sequencing%3A+Contributions+to+the+genetic+diagnoses+and+understanding+of+pathomechanisms+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases.</a> J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).</li>
<li>He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Genetic+Studies%3A+From+Genome-wide+Association+Mapping+to+Genome+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing.</a> Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).</li>
<li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">Genetics of Parkinson's disease.</a> Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).</li>
<li>Bjedov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+life+span+extension+by+rapamycin+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Cell Metab. 11, 35-46 (2010).</li>
<li>Hada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-chiro-inositol+and+pinitol+extend+the+life+span+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).</li>
<li>Schmidt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+heavy+chain+function+in+Drosophila+glial+cells+controls+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity.</a> J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).</li>
<li>Kochinke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Phenomics+Analysis+Deconvolutes+Genes+Mutated+in+Intellectual+Disability+into+Biologically+Coherent+Modules%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules.</a> Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).</li>
<li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell Metab. 22, 437-447 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).</li>
<li>RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.rstudio.com">http://www.rstudio.com</a> (2015).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing%3A+the+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics</a>. , 2nd ed, John Inglis. (2004).</li>
<li>Rothblum-Oviatt, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27884168">Ataxia telangiectasia: a review.</a> Orphanet J Rare Dis. 11, 159(2016).</li>
<li>Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+kinase+inhibition+in+glial+cells+activates+the+innate+immune+response+and+causes+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html</a> (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten opisuje makro "Test Wyspy Drosophila ", który ilościowo ocenia zachowanie motoryczne Drosophila podczas testu na wyspie. Makro dokładnie zlicza muchy na platformie w czasie, dzięki czemu test wyspowy jest bardzo czuły i nadaje się do ilościowej, wysokoprzepustowej oceny wad ruchowych. Metodologia ta pozwala na porównanie każdego schorzenia, z muchami hodowanymi w różnych warunkach genetycznych i/lub środowiskowych, w tym w ekspozycji na leki. Odczyt ten jest zatem szczególnie przydatny jako narzędzie odkrywcze podczas wykonywania dużych badań genetycznych lub farmaceutycznych, podczas badania modeli zaburzeń ruchowych i innych chorób neurologicznych Drosophila lub podczas badania zachowań związanych z lokomocją.
Protokół testu wyspowego przedstawiony w tym manuskrypcie zapewnia przewagę nad istniejącymi/alternatywnymi metodami. Na przykład lokomocja ze śledzeniem wideo jest znacznie bardziej czasochłonna i mniej odpowiednia do testowania dużych rozmiarów prób. Test wyspowy jest wysokoprzepustowym narzędziem przesiewowym i w tym sensie jest porównywalny z szybkim interaktywnym testem geotaksji ujemnej (RING)16. Różnica między nimi polega na tym, że testy wyspowe pozwalają na wykrycie szerszego zakresu problemów lokomotorycznych; Niezdolność much do opuszczenia platformy może być spowodowana wadami w locie, skakaniu lub chodzeniu spowodowanymi wadami skrzydeł (mięśni/neuronów) i/lub nóg (mięśni/neuronów). Z drugiej strony, test RING ocenia wady w zachowaniu podczas wspinaczki/chodzenia spowodowane wadami nóg (mięśni/neuronów). W przypadku, gdy użytkownicy są zainteresowani wieloma odczytami behawioralnymi, test wyspowy można również łatwo połączyć z innymi testami, takimi jak test RING. Ponadto lasery wymagane do optogenetyki można łatwo zainstalować w pojemniku testowym wyspy, a konfiguracja jest tak prosta, że można ją łatwo przenieść do pomieszczenia, w którym można kontrolować temperaturę i światło.
Aby zapewnić powodzenie i odtwarzalność opisanego tutaj testu wyspowego, należy postępować zgodnie z kilkoma zaleceniami. Porcję i przenieść muchy do eksperymentalnych fiolek testowych co najmniej jeden dzień przed eksperymentem, aby uniknąć skutków CO2 lub zimnego znieczulenia. Nie należy przepełniać eksperymentalnych fiolek (należy użyć 10 - 15 much na fiolkę; najlepiej jest zawsze umieszczać taką samą liczbę much w jednej fiolce). Trzymaj muchy na świeżym jedzeniu przez cały czas. Jeśli nie jesteś jeszcze zaznajomiony z przeprowadzaniem testu, poćwicz rzucanie much na platformę, aby zmaksymalizować wydajność. Ćwicz również szybkie cofanie ręki zaraz po tym, ponieważ przeszkadza to w analizie danych (analiza obrazu i liczenie much zaczynają się dopiero po tym, jak ręka znajdzie się poza obrazem). Utrzymuj identyczne warunki środowiskowe i eksperymentalne w eksperymentach, które muszą być porównane (np. grupa kontrolna kontra mutanty lub genotyp badany w różnym wieku). Eksperymenty należy zawsze wykonywać o tej samej porze dnia i utrzymywać fiolki w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności. Aby uzyskać moc statystyczną, należy zbadać co najmniej trzy kontrpróby techniczne na kontrpróbę biologiczną.
Aby zapewnić pomyślne działanie opisanego tutaj makra, ustawienia kamery internetowej i obrazu muszą zostać dostosowane w celu uzyskania maksymalnego kontrastu: muchy pojawiające się jako czarne obiekty na białej platformie. Gdy liczba much nie jest prawidłowo zliczana przez makro, dostosuj ustawienia kontrastu, sprawdź, czy ROI jest prawidłowo wybrany i upewnij się, że rozmiar much na platformie jest wyższy od określonego ustawienia minimalnego rozmiaru muchy (patrz krok 8.3 tego protokołu). Ustawienia należy zdefiniować tylko raz. Mają one zastosowanie do wszystkich eksperymentów, o ile odległość między kamerą internetową a platformą nie ulega zmianie. Ustawienia Circularity_min i max definiują okrągłość cząstek (cząstki = zliczone muchy), które zostaną uwzględnione w analizie (muchy = zliczone obiekty). 1 oznacza idealne koło, a 0 oznacza linię17. Ponieważ muchy zawsze wykazują pewien stopień kolistości (mucha nie może pojawić się jako linia prosta), ustawienie "Circularity_max" jest ustawione na 1, a ustawienie "Circularity_min" jest ustawione na 0,4. Jest mało prawdopodobne, że użytkownik będzie musiał dostosować te ustawienia.
Makro od czasu do czasu popełnia błędy w liczeniu, gdy mucha znajduje się blisko granicy platformy. Może się to zdarzyć, jeśli muchy nie mogą latać, ale wchodzą i wychodzą ze zdefiniowanego przez użytkownika zwrotu z inwestycji. W większości przypadków ponowny wybór ROI (dopasowanie go w jak największym stopniu do platformy) może łatwo rozwiązać ten problem. Jednak skrypt "Island Assay Analysis" jest w stanie stosunkowo dobrze wykryć i skorygować nieprawidłowe zliczanie danych spowodowane przez muchy wchodzące i wychodzące z ROI. Chociaż rozdzielczość prezentowanej tutaj kamery internetowej jest wystarczająco wysoka, aby dość dobrze rozróżniać muchy w bliskiej odległości, zaimplementowaliśmy dodatkowe algorytmy w procedurze przetwarzania obrazu makra "Drosophila Island Assay", takie jak funkcja watershed i erode17. Ułatwiają one prawidłowe rozgraniczenie much, które znajdują się w bliskiej odległości na platformie. Ponadto makro nie jest w stanie odróżnić much, które zeskoczyły z platformy lub odleciały od niej. Niemniej jednak ogólnie obserwuje się, że zdrowe młode szczepy much odlatują natychmiast po upuszczeniu na platformę, podczas gdy starsze muchy i muchy z deficytami lokomotorycznymi pozostają dłużej na platformie i ostatecznie skaczą lub spadają z platformy. Pomimo tych ograniczeń, test i analiza zapewniają bardzo dokładny pomiar zachowania lokomotorycznego.
Aby zapewnić pomyślne wykonanie skryptu "Analiza testu wyspowego", użytkownik musi upewnić się, że wprowadził poprawne ścieżki dla plików wejściowych i wyjściowych w wierszach skryptu wskazanych w protokole oraz podał dane w odpowiednim formacie folderu (jak pokazano na rysunku 2). Jeśli użytkownik uzna, że kryteria stosowane do odfiltrowywania niewiarygodnych danych eksperymentalnych są zbyt rygorystyczne (wiersz 68: pierwsza wartość w kolumnie "Liczba" jest mniejsza lub równa 5; wiersz 71: pierwsza wartość w kolumnie "Liczba" jest wyższa niż całkowita liczba much wyrzuconych na platformę +3), Wyłącz te ustawienia filtrowania, dodając znak # przed tekstem w wierszach 68 i 71 w skrypcie "Analiza testu wyspowego". W takim przypadku wszystkie zestawy danych zostaną uwzględnione w analizie. Alternatywnie ustawienia filtra można zmienić, dostosowując wartości w wierszach 68 i 71 zgodnie z potrzebami użytkownika. Możliwe artefakty w wartościach zliczania w "results.txt" wygenerowanym przez makro "Drosophila Island Assay" można również dostosować ręcznie, a skrypt można ponownie uruchomić na skorygowanych danych. W przypadku, gdy użytkownik jest zainteresowany przetwarzaniem więcej niż 10 kl./s lub więcej niż 10 s danych, należy dostosować liczbę klatek przetwarzanych przez skrypt "Island Assay Analysis". Analizę statystyczną można również zastąpić alternatywami zdefiniowanymi przez użytkownika.
Folder o nazwie "Przykłady testu wyspowego", zawierający przykłady z szeregami czasowymi obrazów uzyskanymi za pomocą testu wyspowego, można znaleźć na następującej stronie internetowej: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Pobierz folder "Examples Island Assay" i postępuj zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, aby szybko zapoznać się ze strukturą przechowywania plików, przetwarzaniem obrazów za pomocą makra "Drosophila Island assay" oraz skryptem "Island Assay Analysis".
Test wyspowy, w połączeniu z opracowanym skryptem makro i analitycznym, może być wykorzystany do oceny i ilościowego określenia nieprawidłowego zachowania ruchowego modelu Drosophila Ataxia-Teangiectasia. Ponieważ test może być skutecznie stosowany w różnym wieku, dobrze nadaje się do analizy potencjalnie postępującej natury fenotypów.
Podsumowując, test wyspowy, w połączeniu z makro "Drosophila Island Assay" i skryptem "Island Assay Analysis", jest opłacalnym, wiarygodnym i wysoce wydajnym testem do obiektywnej analizy i ilościowego określania wad lokomotorycznych modeli zaburzeń ruchowych Drosophila w sposób wysokoprzepustowy.

W ostatnich latach postęp w technologiach sekwencjonowania nowej generacji znacznie przyczynił się do identyfikacji genów leżących u podstaw degeneracyjnych zaburzeń ruchowych mózgu (np. ataksja móżdżkowa i choroba Parkinsona), pochodzenia obwodowego neuronalnego (np. stwardnienie zanikowe boczne i dziedziczna paraplegia spastyczna) oraz pochodzenia mięśniowego (np. dystrofia mięśniowa Duchenne'a i dystrofia miotoniczna)1,2,3,4. Mimo to niewiele wiadomo na temat mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw większości tych zaburzeń. Lepsze zrozumienie tych mechanizmów ma zasadnicze znaczenie dla opracowania terapii.
Podobnie jak u ludzi, ruch w organizmach modelowych, taki jak lot i lokomocja u Drosophila, jest kontrolowany przez centralny mózg, obwodowy układ nerwowy i mięśnie. Ponadto szybki czas generacji i zestaw narzędzi genetycznych Drosophila sprawiają, że ten organizm modelowy jest szczególnie odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych genów związanych z zaburzeniami ruchowymi oraz do testowania leków5,6. Ze względu na znaczną liczbę warunków, które muszą być testowane w takich ekranach, wysoce pożądane są wiarygodne, opłacalne i stosunkowo proste testy, a także narzędzia do ilościowego określania wyników wyjściowych w sposób zautomatyzowany.
Schmidt et al. (2012)7 opisali tani test zwany "testem wyspowym" do oceny zachowania lokomotorycznego Drosophila. Test wyspowy został z powodzeniem wykorzystany w badaniach przesiewowych na dużą skalę w celu identyfikacji genów o funkcjach specyficznych dla gleju7, w ocenie modeli niepełnosprawności intelektualnej Drosophila8, oraz do ogólnej oceny zachowania motorycznego muchy9. Podstawowa konstrukcja testu wyspowego składa się z podwyższonej platformy, na którą wrzuca się kilka much. Wywołuje to wrodzone zachowanie motoryczne, które umożliwia zdrowym muchom ucieczkę z platformy w ciągu kilku sekund. Test mierzy liczbę much pozostających na platformie w czasie7,8,9. Wszystkie te cechy wskazują, że test wyspowy może być potężnym narzędziem przesiewowym dla genów zaangażowanych w zaburzenia ruchowe.
Obecnie analiza ilościowa danych testowych z wyspy filmowej jest wykonywana ręcznie7,8,9. Aby poprawić wydajność testu, opracowano tanią metodę półautomatycznego ilościowego określania ucieczki much z platformy. Konfiguracja wykorzystuje prostą kamerę internetową podłączoną do laptopa do zbierania szeregów czasowych obrazu platformy, z klatkami rejestrowanymi co 0,1 s. Ramki są następnie przetwarzane za pomocą makra "Drosophila Island Assay", które określa ilościowo liczbę much na platformie w czasie. Makro "Test wyspy Drosophila" jest podzielone na trzy niezależne podmakra: (I) Makro podrzędne "Utwórz stos i projekcję" identyfikuje różne eksperymenty wyspowe przechowywane w różnych podfolderach i tworzy stos i projekcję każdego szeregu czasowego. (II) Podmakro "Define Platform" otworzy kolejno wszystkie pliki "Projection_image_name.tif" znajdujące się w poszczególnych podfolderach eksperymentalnych, w którym to momencie użytkownik jest proszony o ręczne zdefiniowanie platformy wyspy jako regionu zainteresowania (ROI). (III) "Analiza" automatycznie określa ilościowo liczbę much pozostających na platformie podczas szeregów czasowych. Makra podrzędne mogą być uruchamiane kolejno (w jednym przebiegu) lub niezależnie. Do analizy danych statystycznych opracowano skrypt, który automatycznie przetwarza uzyskane dane i stosuje test statystyczny w celu określenia, czy terapie/genotypy zachowują się znacząco różnie od siebie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Wreszcie wykazano, że ten układ można wykorzystać do oceny i ilościowego określenia nieprawidłowej zdolności lokomotorycznej modelu Drosophila dla ataksji-teleangiektazji (AT).

<table><tbody><tr><td>25 x 95 mm Drosophila fiolki</td><td>Flystuff</td><td>32-116SB-Kamera</td><td></td></tr> <tr><td>internetowa Logitech C525 HD</td><td>Logitech-Każda</td><td></td> <td>kamera internetowa ze złączem USB jest odpowiednia.</td></tr><tr><td>Stojak do trzymania kamery internetowej</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Lampa</td> <td>-</td><td>--</td> <td>Diody LED 12 V są odpowiednie</td></tr><tr><td>Podkładka do</td> <td>-</td><td></td> <td>Każda podkładka pod mysz działa</td></tr><tr><td>Pudełko testowe wyspy</td> <td>-</td><td></td> <td>Wymiary 40x35x2,5 cm. Otwór 20x30 cm. Przezroczysty.</td></tr><tr><td>Wanna do testów wyspowych</td> <td>-</td><td></td> <td>Wymiary 42x38x25 cm. Inna niż biała.</td></tr><tr><td>Wyspa/platforma</td><td>-</td><td>-</td><td>Wymiary 42x38x25 cm. Jednolita biała.</td></tr><tr><td>Mydło</td> <td>-</td><td></td> <td>odpowiedni jest standardowy detergent do mycia naczyń.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Skrypty komputerowe działają zarówno w systemie Windows, jak i Mac</td><td></td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do nagrywania obrazów: HandiAvi&reg; </td><td>AZcendant&reg; -</td><td></td><td>HandyAvi jest kompatybilny tylko z systemem Windows i został opisany w całym manuskrypcie. Można go pobrać z: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (wersja 5.0)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do nagrywania obrazu: WebcamCapture</td> <td>-</td><td></td> <td>wtyczka Fiji/ImageJ, która może być używana na komputerze Mac jako alternatywa dla HandyAvi do nagrywania obrazów i można ją pobrać z: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ Korzystając z tej metody, użytkownik musi użyć tych samych ustawień folderu i ustawień nagrywania obrazu, które są wskazane w tym manuskrypcie, z wyjątkiem tego, że dla każdego replikacji eksperymentalnej, przechwycony stos obrazów powinien zostać wyeksportowany jako Stack.tiff do odpowiedniego folderu replikacji eksperymentalnej. Po uruchomieniu makra "Drosophila Island Assay" na tych danych, w ustawieniu "Identyfikator pierwszej ramki" nie powinien znajdować się żaden tekst.</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>-</td><td>-</td><td>Wersja 1.4 lub nowsza, można pobrać z: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td></tr><tr><td>R studio</td><td>-</td><td>-</td><td>Można pobrać z: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr> <tr><td>R</td><td>-</td><td></td><td>-Wersja 3.3.2, można pobrać z: https://cran.rstudio.com</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa analiza zachowań lokomotorycznych w teście na wyspie drosophila

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Postępy w technologiach sekwencjonowania nowej generacji przyczyniają się do identyfikacji (kandydujących) genów chorobowych dla zaburzeń ruchowych i innych chorób neurologicznych w coraz szybszym tempie. Jednak niewiele wiadomo na temat mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tych zaburzeń. Genetyczny, molekularny i behawioralny zestaw narzędzi Drosophila melanogaster sprawia, że ten modelowy organizm jest szczególnie przydatny do charakteryzowania nowych genów i mechanizmów chorobowych w sposób wysokoprzepustowy. Niemniej jednak wysokoprzepustowe badania przesiewowe wymagają wydajnych i wiarygodnych testów, które w idealnym przypadku są opłacalne i pozwalają na zautomatyzowaną kwantyfikację cech istotnych dla tych zaburzeń. Test wyspowy jest opłacalną i łatwą do skonfigurowania metodą oceny zachowania lokomotorycznego Drosophila. W tym teście muchy są wyrzucane na platformę z ustalonej wysokości. Wywołuje to wrodzoną reakcję motoryczną, która umożliwia muchom ucieczkę z platformy w ciągu kilku sekund. Obecnie analizy ilościowe testów wysp filmowych są wykonywane ręcznie, co jest pracochłonnym przedsięwzięciem, szczególnie w przypadku wykonywania dużych ekranów.
Ten manuskrypt opisuje algorytmy "Drosophila Island Assay" i "Island Assay Analysis" do wysokowydajnego, zautomatyzowanego przetwarzania danych i kwantyfikacji danych z testów wyspowych. W konfiguracji prosta kamera internetowa podłączona do laptopa zbiera serię obrazów platformy podczas wykonywania testu. Algorytm "Drosophila Island Assay" opracowany dla oprogramowania open source Fidżi przetwarza te serie obrazów i określa ilościowo, dla każdego warunku eksperymentalnego, liczbę much na platformie w czasie. Skrypt "Island Assay Analysis", kompatybilny z darmowym oprogramowaniem R, został opracowany w celu automatycznego przetwarzania uzyskanych danych i obliczania, czy zabiegi/genotypy różnią się statystycznie. To znacznie poprawia wydajność testu wyspowego i sprawia, że jest to potężny odczyt dla podstawowych zachowań lokomocyjnych i lotnych. Dzięki temu można go zastosować na dużych ekranach badających zdolności lokomotoryczne much, modele zaburzeń ruchowych Drosophila i skuteczność leków.

W opisanym protokole dane z testu wyspowego Drosophila są pozyskiwane i przetwarzane w trzech etapach. Po pierwsze, reakcja ucieczki lotnej Drosophila wyrzuconych na platformę wyspową jest rejestrowana za pomocą kamery internetowej i zapisywana jako pojedyncze obrazy .bmp (sekcje protokołu 1 - 7). Po drugie, makro „Drosophila Island Assay” (krok 8) przetwarza klatki, generując plik tekstowy „result.txt” (Tabela 1), w którym podsumowano liczbę obiektów wykrytych w każdej klatce, oraz stos obrazów „Result_stack.tiff”, który pokazuje obiekty wykryte w obszarze platformy w każdej klatce. Po trzecie, skrypt „Island Assay Analysis” (sekcja protokołu 9) przetwarza dane z makra zapisane w plikach „results.txt” poszczególnych eksperymentów. W skrypcie zawarto kilka kroków w celu filtrowania i łączenia danych do analizy statystycznej. Wykrywana jest pierwsza klatka, w której muchy zostają wyrzucone na platformę, i przyjmuje się ją jako punkt czasowy 1. Wcześniejsze klatki są usuwane ze zbioru danych. Do analizy wybieranych jest 100 klatek następujących po punkcie czasowym 1 (odpowiadających 10 s). Eksperymenty, w których początkowa liczba much wykrytych na platformie jest mniejsza niż 5, są automatycznie wykluczane z analizy, co eliminuje niewiarygodne wyniki z eksperymentów o zbyt małej liczbie próbek. Wykluczane są również eksperymenty, w których początkowa liczba much wykrytych na platformie przekracza ustawienie „Number of flies per vial” powiększone o tolerancję wynoszącą 3. Eliminuje to zbiory danych, w których cząsteczki szumu zostały błędnie zidentyfikowane jako muchy. Następnie skrypt oblicza procent wykrytych much dla każdego punktu czasowego w stosunku do najwyższej liczby much wykrytych w serii. Błędy w zbiorach danych spowodowane wchodzeniem i wychodzeniem much z ROI (wykrywane jako spadek, a następnie wzrost procentu much na platformie w czasie) są automatycznie korygowane poprzez uznanie ich za stale obecne na platformie w wcześniejszych etapach. Wszystkie zbiory danych z powtórzeń dla określonego warunku eksperymentalnego, które znajdowały się w głównym katalogu, są łączone i eksportowane do pliku „data_all_conditions.csv”. Jego kolumny reprezentują zmienne opisane w Tabeli 2. Skrypt wyeksportuje również wykres liniowy dla każdego warunku eksperymentalnego, nazwany zgodnie z folderem zawierającym dane. Wykres ten przedstawia procent much pozostających na platformie w czasie (reakcja ucieczki lotnej) dla powtórzeń eksperymentalnych znajdujących się w odpowiednim folderze (Rycina 3A-B). Średnia, SD i SEM dla każdego warunku eksperymentalnego są obliczane i podsumowane w pliku „Statistics summary.csv”. Wykres liniowy o nazwie „Escape_response_all_conditions.tiff” pokazuje średnią reakcję ucieczki lotnej dla maksymalnie 12 warunków eksperymentalnych znajdujących się w głównym folderze (Rycina 3C). Na koniec obliczana jest powierzchnia pod krzywą dla wszystkich warunków eksperymentalnych znajdujących się w głównym folderze i podsumowywana w pliku „AUC.csv”. W zależności od liczby warunków w głównym folderze, skrypt przeprowadzi dwustronny nieparowany test t Welcha (2 warunki) lub analizę ANOVA z korekcją Tukeya dla wielokrotnych porównań (więcej niż 2 warunki), aby określić, czy warunki eksperymentalne różnią się od siebie znacząco. Wyniki te są podsumowane w plikach „Welch_t-test_results.txt” lub „AUC_anova_results.txt”. Podczas wykonywania analizy ANOVA skrypt wyeksportuje również plik „AUC_anova.tiff”, który wyświetla różnicę w średnim AUC oraz 95% przedziały ufności dla porównywanych warunków eksperymentalnych. Wartości bezwzględnej powierzchni pod krzywą dla powtórzeń eksperymentalnych wszystkich warunków eksperymentalnych są wyświetlane jako pojedyncze punkty danych z medianami w pliku „AUC.tiff” (Rycina 3D).
Ataksja telangiektazy (AT) jest autosomalnym recesywnym zaburzeniem ruchowym charakteryzującym się wczesnym wystąpieniem ataksji móżdżkowej w wyniku mutacji w genie Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM)14. Mutanty ortologa ATM u Drosophila, tefu, wykazują defekty w zakresie mobilności oraz długości życia15. Aby ocenić makro „Drosophila Island Assay”, w teście wyspy przebadano model AT u muszek Drosophila, a uzyskane przez makro dane zestawiono z wynikami ręcznego liczenia. Wyniki pokazują, że powszechny knockdown tefu (w-; Actin-Gal4/GD11950) znacząco zmniejsza zdolność tych muszek do opuszczenia platformy w porównaniu z kontrolami w tym samym tle genetycznym (w-; Actin-Gal4/+) (Rycina 4). Po 1 s platformę opuściło 50% muszek kontrolnych, w przeciwieństwie do &#60;1% muszek z tefu-RNAi. Co istotne, dane uzyskane za pomocą makra wiernie odwzorowały dane otrzymane poprzez ręczne liczenie, co wskazuje, że makro jest niezawodnym narzędziem, które może być wykorzystane do kwantyfikacji danych z testu wyspy oraz oceny defektów ruchu (Rycina 4 A-B).
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat przedstawiający wymagania, procedurę eksperymentalną i analizę testu wyspy (island assay). (A) Wyposażenie do testu wyspy. (B) Układ eksperymentalny dla testu wyspy. (C) Test wyspy. (D) Przetwarzanie danych z testu wyspy za pomocą makra „Drosophila Island Assay”. Makro „Drosophila Island Assay” składa się z 3 podmakr: 1) tworzenie stosu i projekcji, 2) definiowanie platformy oraz 3) analiza. (E) Przetwarzanie i ocena statystyczna danych przy użyciu skryptu „Island Assay Analysis”. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg" /> 
Rycina 2: Przykłady różnych regulacji wymaganych podczas realizacji protokołu. (A) Wymagana struktura katalogów, w której eksperymenty z testu wyspowego muszą być zapisywane w celu przetwarzania i analizy danych. (B) Podczas regulacji ustawień wideo muchy muszą być widoczne jako czarne obiekty na białym tle. (C) Pliki wyjściowe klatek obrazu zapisane przez oprogramowanie do rejestracji obrazu opisane w niniejszej pracy. (D) Żółta obramowanie wskazuje wybór platformy. Zapisany wybór platformy w „ROI Manager” jest wyróżniony na niebiesko. (E) Muchy są reprezentowane jako białe kropki podczas regulacji ustawienia „Minimum fly size”. Okno wyników pokazuje powierzchnię much w pikselach. (F) Przykład pojedynczej zarejestrowanej klatki obrazu (po lewej) i odpowiadającej jej klatki w wynikowym stosie obrazów, uzyskanym za pomocą makra „Drosophila Island Assay” (po prawej). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg" /> 
Rycina 3: Obrazy wynikowe otrzymane po przetworzeniu danych za pomocą skryptu „Island Assay Analysis”. (A) Wykres liniowy przedstawiający reakcję ucieczki lotnej dla każdego powtórzenia eksperymentalnego grupy kontrolnej. (B) Wykres liniowy przedstawiający reakcję ucieczki lotnej dla każdego powtórzenia eksperymentalnego tefu RNAi. (C) Średnia reakcja ucieczki lotnej dla wskazanych warunków eksperymentalnych; słupki błędów reprezentują SEM. (D) Wykresy kropkowe przedstawiające rozkład pola pod krzywą dla warunków kontrolnych i mutantów. Powtórzenia eksperymentalne dla warunków tefu RNAi oraz kontrolnych są wyświetlane jako poszczególne punkty danych (na czarno) z medianami (czerwona linia). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Muchy z powszechnym wyciszeniem genu tefu wykazują znacznie zmniejszoną zdolność do opuszczenia platformy. Dane przedstawiają procent much na platformie w czasie (s) dla much kontrolnych (w-; Actin-Gal4/+) oraz much z RNAi tefu (w-; Actin-Gal4/GD11950). (liczba powtórzeń = 5; słupki błędu reprezentują SEM). (A) Surowe dane uzyskane za pomocą makra „Drosophila Island Assay”. (B) Wykresy kropkowe przedstawiające rozkład pola pod krzywą dla warunków kontrolnych i RNAi tefu uzyskane za pomocą makra „Drosophila Island Assay” (nieparzysty test t Welcha, **p &lt;0,01). (C) Surowe dane uzyskane poprzez ręczne zliczanie liczby much obecnych na wyspie na sekundę. (D) Wykresy kropkowe przedstawiające rozkład pola pod krzywą dla warunków kontrolnych i RNAi Tefu uzyskane poprzez ręczne zliczanie (nieparzysty test t Welcha, **p &lt;0,01). Słupki błędu reprezentują SEM. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa kolumny</td>
			<td colspan="3">Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przekrój</td>
			<td colspan="3">Nazwa ramki.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba</td>
			<td colspan="3">Liczba obiektów wykrytych w klatce w obrębie obszaru zainteresowania (ROI) platformy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powierzchnia całkowita</td>
			<td colspan="3">Całkowita powierzchnia obiektów wykrytych w klatce w granicach platformy (ROI) wyrażona w pikselach.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Średnia wielkość</td>
			<td colspan="3">Całkowita powierzchnia obiektów wykrytych w klatce podzielona przez liczbę obiektów w obrębie obszaru zainteresowania (ROI) platformy.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% powierzchni</td>
			<td colspan="3">Procent powierzchni zajmowanej przez obiekty w stosunku do całkowitej powierzchni platformy (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okres ważności.</td>
			<td colspan="3">Całkowity obwód obiektów wykrytych w klatce w granicach obszaru zainteresowania (ROI) platformy, wyrażony w pikselach.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. rozmiar muchy</td>
			<td colspan="3">minimalny rozmiar muchy zdefiniowany przez użytkownika w interfejsie graficznym &#34;Muszka owocówka Test wyspowy&#34; makro (w pikselach).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obszar ROI</td>
			<td colspan="3">Obszar platformy (ROI) zdefiniowany przez użytkownika podczas uruchamiania podmakra define platform (w pikselach).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba much</td>
			<td colspan="3">Liczba much wykorzystywanych w każdym eksperymencie, określona przez użytkownika w interfejsie graficznym &#34;Muszka owocówka Test wyspowy&#34; makro.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry mierzone przez makro „Drosophila Island Assay”.Parametry opisane w tej tabeli pojawią się w pliku „results.txt” po uruchomieniu makra „Drosophila Island Assay”.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa kolumny</td>
			<td colspan="3">Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przekrój</td>
			<td colspan="3">Numer klatki.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba</td>
			<td colspan="3">Liczba much wykrytych w klatce w obrębie granic platformy (ROI).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Powierzchnia</td>
			<td colspan="3">Całkowita powierzchnia much wykrytych w klatce w granicach platformy (ROI) wyrażona w pikselach.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. wielkość muchy</td>
			<td colspan="3">minimalna wartość rozmiaru obszaru skanowania (fly size) zdefiniowana przez użytkownika w interfejsie graficznym &#34;Muszka owocówka Test wyspowy&#34; makro (w pikselach).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obszar ROI</td>
			<td colspan="3">Obszar platformy (ROI, w pikselach) zdefiniowany przez użytkownika podczas uruchamiania submakra &#34;zdefiniuj platformę&#34;.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba much</td>
			<td colspan="3">Liczba much użytych w eksperymencie, zdefiniowana przez użytkownika w interfejsie graficznym &#34;Muszka owocówka Analiza wyspowa&#34; makro.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% much obecnych na platformie w odpowiednim przekroju/klatce w stosunku do najwyższej liczby much wykrytych na platformie podczas eksperymentu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punkt czasowy</td>
			<td colspan="3">Punkt czasowy 1 reprezentuje pierwszą analizowaną klatkę i odpowiada klatce, w której muchy po raz pierwszy pojawiają się na platformie. W każdym powtórzeniu analizowanych jest łącznie 100 klatek (co przy zastosowaniu opisanych ustawień odpowiada 10 s).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eksperyment</td>
			<td colspan="3">Liczba powtórzeń dla każdego stanu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warunki</td>
			<td colspan="3">Wskazuje nazwę warunku eksperymentalnego (zgodnie z nazwą folderu zawierającego dane, zdefiniowaną przez użytkownika).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Opis zmiennych uzyskanych po przetworzeniu danych za pomocą skryptu „Island Assay Analysis”.Parametry opisane w tej tabeli pojawiają się w pliku „data_all_conditions.csv” po przetworzeniu danych za pomocą skryptu „Island Assay Analysis”.

Test wyspowy jest stosunkowo nowym, opłacalnym testem, który może być użyty do oceny podstawowego zachowania lokomotorycznego Drosophila melanogaster. W tym manuskrypcie opisano algorytmy automatycznego przetwarzania danych i obiektywnej kwantyfikacji danych z testów wyspowych, dzięki czemu test ten jest czułym, wysokowydajnym odczytem dla dużych badań genetycznych lub farmakologicznych.

Wysokoprzepustowa analiza zachowań lokomotorycznych w teście na wyspie Drosophila

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Ogólnym celem testu wyspowego (Island Assay) jest ocena podstawowego zachowania lokomotorycznego Drosophila melanogaster za pomocą automatycznego przetwarzania danych i obiektywnej kwantyfikacji. Metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji kluczowych regulatorów zachowania lokomotorycznego, takich jak geny uwikłągione w zaburzenia ruchu. Może ona służyć również do testowania leków, które mogą odwracać takie defekty.Główną zaletą tej techniki jest możliwość wysokoprzepustowej kwantyfikacji zachowań lokomotorycznych Drosophila, co czyni ją odpowiednią do przesiewów na szeroką skalę. Zdecydowaliśmy się opracować tę metodologię, aby móc analizować dużą liczbę modeli chorób. Aby było to możliwe, potrzebowaliśmy zautomatyzowanej analizy danych obrazowych.Wizualna demonstracja tej metody jest bardzo pomocna. Kilka kroków przetwarzania beta ma kluczowe znaczenie i może być trudnych dla nowych użytkowników, zwłaszcza tych nieznających stosowanych pakietów oprogramowania. Najpierw przygotuj co najmniej trzy fiolki na każdy warunek doświadczalny jako powtórzenia biologiczne.Każdy plik powinien zawierać około 15 much tej samej płci i w podobnym wieku. Co ważne, muchy muszą mieć nieuszkodzone skrzydła. Utwórz foldery do przechowywania eksperymentów.Wygeneruj te pliki w strukturze katalogów zdefiniowanej przez warunki i powtórzenia. Jeśli, na przykład, eksperyment obejmuje dwa genotypy z pięcioma powtórzeniami dla każdego z nich, utwórz główny folder z datą eksperymentu, a wewnątrz tego folderu utwórz oddzielny podfolder dla każdego genotypu. Następnie, w folderach genotypów, utwórz podfoldery dla każdego powtórzenia.Następnie należy przygotować aparat testowy. Do tacy z kąpielą należy dodać zimną wodę z niewielką ilością mydła i umieścić platformę na środku kąpieli, jeśli nie została ona wcześniej przymocowana. Tackę i platformę należy przykryć przezroczystym pojemnikiem.Aby oświetlić platformę, umieść nad nią lampę emitującą zimne światło, np. zwykłe diody LED 12 V. Bezpośrednio nad platformą umieść również kamerę internetową podłączoną do komputera. W komputerze uruchom oprogramowanie do rejestracji obrazu.Z systemu menu wybierz odpowiednią kamerę internetową jako urządzenie przechwytujące. Umieść martwą muchę na wyspie, aby dostosować ustawienia wideo. Skoryguj jasność, kontrast i kolor w oprogramowaniu tak, aby martwa mucha była widoczna jako czarna na białym tle.Następnie dostosuj ustawienia filmu time-lapse, aby zapisywać filmy w formacie AVI. Następnie przejdź do katalogu, w którym dane mają zostać zapisane, i określ nazwę filmu. Zapisz wprowadzone zmiany.W celu kompresji danych obrazu wybierz kodek Intel IYUV. Ustaw prędkość rejestracji na jedną klatkę co 0,1 s i dostosuj odpowiadającą jej prędkość odtwarzania do 10 obrazów na sekundę. Na koniec przejdź do ustawień zaawansowanych i zaznacz opcję Twórz obraz bmp dla każdej przechwyconej klatki.Następnie przejdź do tego samego katalogu, który wybrałeś do przechowywania plików AVI, i zatwierdź wybór, klikając OK. Przed rozpoczęciem upewnij się, że wyspa jest pusta i czysta. Następnie uruchom nagrywanie w interfejsie obrazowania poklatkowego (time lapse) oprogramowania do rejestracji obrazu.Należy wziąć fiolkę z muchami i stuknąć nią dwa lub trzy razy, aby wszystkie muchy opadły na dno. Następnie należy szybko wyjąć korek z fiolki i energicznie wytrzepać muchy na platformę. Wszystkie powinny uderzyć o platformę mniej więcej w tym samym czasie.Odczekaj do 30 sekund, aż muchy opuszczą platformę, a następnie zatrzymaj nagrywanie. W razie potrzeby ręcznie usuń z platformy pozostałe muchy. Przed przejściem do kolejnego eksperymentu upewnij się, że zdefiniowano katalog, w którym będzie przechowywany następny zestaw danych.Pierwszym zadaniem jest utworzenie stosów oraz projekcji z zebranych serii obrazów. W programie Fiji otwórz Drosophila Island Assay. W nowym oknie wprowadź identyfikator pierwszej serii czasowej obrazów.Następnie wybierz tylko podmakro tworzenia stosu i projekcji (create stack and projection). Kliknij OK i wskaż folder zawierający wszystkie podfoldery z poszczególnymi eksperymentami Island Assay. Po przetworzeniu danych w każdym poszczególnym podfolderze eksperymentalnym pojawią się dwa nowe pliki.Kolejnym zadaniem jest zdefiniowanie dokładnego położenia platformy na obrazach. Otwórz interfejs graficzny i zaznacz pole wyboru „define platform”. Następnie wybierz katalog, w którym przechowywane są podfoldery eksperymentalne.Otworzy się obraz projekcji oraz dwa okna. Na pierwszym obrazie, używając narzędzia zaznaczania wielokątem, narysuj wielokąt obejmujący peron wyspowy. W tym zaznaczeniu nie uwzględniaj linii brzegowej na obwodzie peronu.Dodaj zaznaczenie do okna menedżera ROI, klikając przycisk add w oknie menedżera ROI. Po dodaniu zaznaczenia do menedżera ROI pojawi się ono jako zestaw wartości. Następnie kliknij okay w oknie define the platform.Oprogramowanie przejdzie do następnego obrazu projekcyjnego zapisanego w folderze. Kontynuuj stosowanie tego samego ROI dla platformy do kolejnego obrazu projekcyjnego, wybierając ROI zapisane w menedżerze ROI i potwierdzając to ROI w oknie definiowania platformy. Przed przejściem do następnego obrazu projekcyjnego upewnij się, że platforma nie przesunęła się podczas eksperymentu.Jeśli pozycja platformy uległa zmianie, kliknij lewym przyciskiem myszy w centrum zaznaczenia i przeciągnij je do wymaganej pozycji. Jeśli ramka zaznaczenia nie pokrywa się z platformą, kliknij lewym przyciskiem myszy poza obszarem zaznaczenia i wyznacz nowy obszar dla platformy za pomocą narzędzia wielokąta. Dodaj to nowe zaznaczenie do menedżera ROI.Następnie potwierdź nowy wybór, klikając OK w oknie definiowania platformy, i kontynuuj procedurę, aż wszystkie obrazy będą miały prawidłowo zdefiniowane platformy. Ostatnim zadaniem przed przetworzeniem danych jest określenie minimalnego rozmiaru muchy. Jest to wyjaśnione w protokole tekstowym.Aby określić liczbę much uciekających z platformy, należy najpierw ustawić minimalny rozmiar muchy. Następnie należy wskazać największą liczbę much w jednym pliku w ramach serii eksperymentalnej. Uruchom funkcję analizy i w odpowiedzi na polecenie wybierz główny katalog eksperymentu.Po uruchomieniu makra należy zauważyć, że w każdym folderze pojawił się nowy plik z wynikami oraz nowy stos obrazów. Otwórz te pliki, aby upewnić się, że procedura przebiegła prawidłowo. Uruchom pakiet oprogramowania R lub RStudio i otwórz skrypt analizy Island Assay, aby przetworzyć wszystkie eksperymenty jednocześnie.Skrypt musi zostać poprawnie zedytowany, aby analiza zakończyła się powodzeniem. W wierszu 16 skryptu należy wpisać ścieżkę do głównego katalogu zawierającego eksperymenty przeznaczone do analizy. W wierszu 19 należy wpisać ścieżkę do folderu, w którym mają zostać zapisane pliki wynikowe analizy.Ta druga lokalizacja musi być inna niż katalog zawierający dane obrazowe przeznaczone do analizy. Teraz uruchom skrypt z paska narzędzi i przejdź do analizy wyników. Skrypt Island Assay analysis eksportuje wykres liniowy dla każdego warunku eksperymentalnego.Wykres przedstawia procent much pozostających na platformie w czasie dla każdego powtórzenia danego warunku. Eksportowany wykres liniowy „escape response:all conditions” podsumowuje średnią i błąd standardowy średniej reakcji ucieczki w locie dla pierwszych 12 warunków eksperymentalnych znajdujących się w głównym folderze. Obliczono pole pod krzywą dla każdego powtórzenia eksperymentalnego, aby ustalić, czy warunki eksperymentalne różnią się od siebie w sposób istotny.Pole pod krzywą oraz wartość mediana dla każdego warunku eksperymentalnego są eksportowane w formie wykresu. W zależności od liczby warunków znajdujących się w głównym folderze, skrypt przeprowadzi dwustronny nieparzysty test t Welcha dla dwóch warunków lub analizę ANOVA z poprawką Tukeya dla więcej niż dwóch warunków. Wszystkie dane numeryczne obliczone przez analizę Island Assay są również eksportowane i zapisywane jako pliki csv lub txt w folderze wyjściowym danych.Ataksja z telangiektazją jest autosomalną recesywną chorobą układu ruchu spowodowaną mutacjami w genie ATM. Choroba ta charakteryzuje się wczesnym wystąpieniem ataksji móżdżkowej. Wpływ powszechnego wyciszenia ortologa ATM u muchówek zbadano w teście Island Assay i porównano z grupami kontrolnymi.Ogólnie rzecz biorąc, powszechne wyciszenie ekspresji ortologa białka ATM u muchy, Tefu, znacząco obniżyło sprawność lokomocyjną w teście wyspowym (Island Assay) w porównaniu z kontrolami o tym samym tle genetycznym. Manualna analiza zarejestrowanych danych z testu wyspowego dała taki sam wynik, jak analiza zautomatyzowana. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić test wyspowy, jak uruchomić makro do testu wyspowego dla Drosophila oraz jak obsługiwać skrypt do analizy testu wyspowego.Podczas stosowania tego protokołu należy pamiętać, że jakość segmentacji obrazu jest skorelowana z jakością nagrań wideo. Im lepszy kontrast, tym sprawniejsza analiza. Po opracowaniu technika ta otwiera badaczom drogę do wysokoprzepustowych badań zdolności lokomocyjnych u Drosophila.Po przeprowadzeniu tego testu można zastosować inne analizy, takie jak testy negatywnej geotaksji, aby dokładniej zbadać defekty lokomoceji.

high-throughput-analysis-locomotor-behavior-drosophila-island

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Badanie złożonych zachowań lokomocyjnych u Drosophila melanogaster zależy od możliwości ilościowego określenia zmian w ruchu danej muchy. Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzić ten proces przy użyciu wysokorozdzielczego systemu śledzenia.

Wysokorozdzielcze śledzenie wideo lokomocji u dorosłych osobników Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Ten film opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania lokomocji muchy i pokazuje przeprowadzony test wspinaczki. Test wspinaczki muchowej jest ogólnym testem funkcji motorycznych, który opiera się na negatywnej odpowiedzi geotaksji.

Test wspinaczki muchowej: metoda testowania ogólnej lokomocji u Drosophila melanogaster

Ten film opisuje test wyspowy, metodę behawioralną używaną do badania lokomocji Drosophila. Protokół próbki zawiera konfigurację testu zgodną z półautomatyczną analizą obrazu.

Test wyspowy: wysokoprzepustowa metoda oceny zachowania lokomotorycznego Drosophila

Tutaj opisujemy metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe.

Ulepszona metoda dokładnego i szybkiego pomiaru charakterystyki lotu u Drosophila

Ten protokół opisuje test o wysokiej przepustowości do testowania preferencji składania jaj przez Drosophila melanogaster w rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia.  Ten test zapewnia prostą, wydajną i skalowalną platformę do identyfikacji genów i składników obwodów, które kontrolują prosty proces podejmowania decyzji.

Wysokoprzepustowy test do badania preferencji składania jaj u poszczególnych Drosophila melanogaster

Ten krok po kroku protokół analizuje zachowanie Drosophila w ujemnej geotaksji za pomocą zautomatyzowanego systemu wielocylindrowego, który pomieści setki much i synchronizuje ich działania za pomocą silnika elektrycznego. Po synchronizacji zachowanie ujemnej geotaksji much jest badane, nagrywane cyfrowo i analizowane za pomocą oprogramowania RflyDetection.

Automatyczne, szybkie, iteracyjne badanie ujemnej geotaksji do analizy zachowania wspinaczy u dorosłych w modelu Drosophila neurodegeneracji

Obecny protokół ocenia aktywność lokomotoryczną Drosophila poprzez śledzenie i analizowanie ruchu much na ręcznie wykonanej arenie za pomocą oprogramowania typu open source Fiji, kompatybilnego z wtyczkami do segmentacji pikseli każdej klatki na podstawie nagrania wideo w wysokiej rozdzielczości w celu obliczenia parametrów prędkości, odległości itp.

Prosta technika oznaczania aktywności lokomotorycznej u Drosophila

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Ten protokół zapewnia ramy do oceny zmian zachowania wywołanych stresem u Drosophila melanogaster. Łączenie uzupełniających się testów umożliwia ilościową ocenę aktywności, eksploracji i podejmowania decyzji dla poszczególnych much. Podejście to jest elastyczne i może być dostosowane do szerokiej gamy badań dotyczących biologii stresu, metabolizmu i funkcji neurobehawioralnych.

Multimodalowe fenotypowanie behawioralne stanów przypominających depresję indukowanych stresem u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę Island Assay do analizy zachowań lokomotorycznych Drosophila melanogaster z automatycznym przetwarzaniem danych. Ta technika umożliwia wysokoprzepustowe badania genetyczne i farmakologiczne chorób ruchu.

Wysokoprzepustowa analiza zachowań lokomotorycznych w teście na wyspie Drosophila

Przeglądaj więcej filmów