Wysokoprzepustowa analiza zachowań lokomotorycznych w teście na wyspie Drosophila
5 listopada 2017
Test wyspowy jest stosunkowo nowym, opłacalnym testem, który może być użyty do oceny podstawowego zachowania lokomotorycznego Drosophila melanogaster. W tym manuskrypcie opisano algorytmy automatycznego przetwarzania danych i obiektywnej kwantyfikacji danych z testów wyspowych, dzięki czemu test ten jest czułym, wysokowydajnym odczytem dla dużych badań genetycznych lub farmakologicznych.
Ogólnym celem testu wyspowego jest ocena podstawowych zachowań lokomotorycznych Drosophila melanogaster za pomocą automatycznego przetwarzania danych i obiektywnej kwantyfikacji. Metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji kluczowych regulatorów zachowań lokomotorycznych, takich jak geny związane z zaburzeniami ruchowymi. Może być używany do testowania leków, które mogą odwrócić takie wady.
Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wysokoprzepustową kwantyfikację zachowań lokomotorycznych Drosophila, dzięki czemu technika ta nadaje się do badań przesiewowych na dużą skalę. Zdecydowaliśmy się rozwinąć tę metodologię, aby móc analizować dużą liczbę modeli chorobowych. Potrzebowaliśmy zautomatyzowanej analizy danych obrazowych, aby było to wykonalne.
Wizualna demonstracja tej metody jest bardzo pomocna. Kilka etapów przetwarzania wersji beta jest kluczowych i może być trudne dla nowych użytkowników, zwłaszcza tych, którzy nie są zaznajomieni z używanymi pakietami oprogramowania. Po pierwsze, należy przygotować co najmniej trzy fiolki na warunki doświadczalne jako kontrpróby biologiczne.
Każdy plik powinien zawierać około 15 much tej samej płci i w podobnym wieku. Co ważne, muchy muszą mieć nienaruszone skrzydła. Utwórz foldery do przechowywania eksperymentów.
Wygeneruj je w strukturze katalogów zdefiniowanej przez warunki i replikacje. Jeśli, na przykład, eksperyment ma dwa genotypy, z których każdy ma pięć powtórzeń, utwórz główny folder z datą eksperymentu, a wewnątrz tego folderu utwórz jeden podfolder dla każdego genotypu. Następnie w folderach genotypu utwórz podfoldery dla każdej replikacji.
Następnie skonfiguruj aparaturę testową. Do brodzika wlej zimną wodę z niewielką ilością mydła i ustaw platformę na środku wanny, jeśli nie jest już zamocowana w wannie. Przykryj tacę i platformę przezroczystym pudełkiem.
Aby oświetlić platformę, umieść nad nią chłodną lampę, taką jak zwykłe diody LED 12 V. Umieść również kamerę internetową podłączoną do komputera bezpośrednio nad platformą. Na komputerze otwórz oprogramowanie do nagrywania obrazu.
Z systemu menu wybierz odpowiednią kamerę internetową jako urządzenie przechwytujące. Umieść martwą muchę na wyspie, aby dostosować ustawienia wideo. Dostosuj jasność, kontrast i kolor w oprogramowaniu, aby martwa mucha wyglądała na czarną na białym tle.
Następnie dostosuj ustawienia filmu poklatkowego, aby zapisać filmy jako pliki AVI. Następnie przejdź do katalogu, w którym mają zostać zapisane dane, i zdefiniuj nazwę filmu. Zapisz te zmiany.
Aby skompresować dane obrazu, wybierz kod Intel IYUV. Ustaw szybkość nagrywania na jedną klatkę co 0,1 sekundy i dostosuj odpowiednią szybkość odtwarzania do 10 obrazów na sekundę. Na koniec przejdź do ustawień zaawansowanych i wybierz Utwórz obraz bmp dla każdej przechwyconej klatki.
Następnie przejdź do tego samego katalogu, który wybrałeś do hostowania plików AVI i naciśnij OK. Przed rozpoczęciem upewnij się, że wyspa jest pusta i czysta. Następnie rozpocznij nagrywanie w interfejsie obrazu poklatkowego w oprogramowaniu do nagrywania obrazu.
Weź fiolkę zawierającą muchy i postukaj w nią dwa lub trzy razy, aby strącić wszystkie muchy na dno. Następnie szybko wyjmij zatyczkę z fiolki i energicznie postukaj muchami o platformę. Wszystkie powinny trafić na platformę mniej więcej w tym samym czasie.
Daj muchom do 30 sekund na opuszczenie platformy, a następnie zatrzymaj nagrywanie. W razie potrzeby ręcznie usuń wszelkie pozostałe muchy z platformy. Przed przystąpieniem do następnego eksperymentu należy ponownie zdefiniować katalog, w którym ma być przechowywany następny zestaw danych.
Pierwszym zadaniem jest wykonanie stosów i projekcji zebranych serii obrazów. Na Fidżi otwórz test na wyspie Drosophila. W nowym oknie wprowadź pierwszy identyfikator szeregów czasowych obrazu.
Następnie wybierz tylko makro podrzędne tworzenia stosu i projekcji. Kliknij przycisk OK i skieruj komputer do folderu zawierającego wszystkie podfoldery z poszczególnymi eksperymentami Island Assay. Po przetworzeniu danych w każdym podfolderze eksperymentalnym pojawią się dwa nowe pliki.
Kolejnym zadaniem jest zdefiniowanie dokładnej lokalizacji platformy na obrazach. Otwórz interfejs graficzny i zaznacz pole wyboru zdefiniuj platformę. Następnie wybierz katalog, w którym przechowywane są podfoldery eksperymentalne.
Otworzy się obraz projekcyjny i dwa okna. Na pierwszym obrazie narysuj wielokąt nad platformą wyspy za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów. W tym wyborze nie należy uwzględniać linii granicznej przy parametrze platformy.
Dodaj wybór do okna Menedżer zwrotu z inwestycji, klikając przycisk Dodaj w oknie Menedżer zwrotu z inwestycji. Po dodaniu wyboru do menedżera ROI, pojawi się on jako zestaw wartości. Następnie kliknij przycisk OK w oknie definiowania platformy.
Oprogramowanie przejdzie do następnego obrazu projekcyjnego zapisanego w folderze. Kontynuuj stosowanie tego samego zwrotu z inwestycji dla platformy do następnego obrazu projekcji, wybierając zwrot z inwestycji zapisany w menedżerze zwrotu z inwestycji i potwierdzając ten zwrot z inwestycji w oknie definiowania platformy. Zanim przejdziesz do następnego obrazu projekcyjnego, upewnij się, że platforma nie poruszyła się podczas eksperymentu.
Jeśli pozycja platformy się przesunęła, kliknij lewym przyciskiem myszy na środku zaznaczenia i przeciągnij ją w żądane miejsce. Jeśli pole wyboru nie pasuje do platformy, kliknij lewym przyciskiem myszy poza zaznaczeniem i narysuj nowe zaznaczenie dla platformy za pomocą narzędzia wielokąta. Dodaj ten nowy wybór do menedżera ROI.
Następnie sprawdź nowy wybór, klikając przycisk OK w oknie definiowania platformy i kontynuuj procedurę, aż wszystkie obrazy będą miały poprawnie zdefiniowane platformy. Ostatnim zadaniem przed przetworzeniem danych jest określenie minimalnego rozmiaru muchy. Jest to wyjaśnione w protokole tekstowym.
Aby określić ilościowo muchy uciekające z platformy, najpierw ustaw minimalny rozmiar muchy. Następnie wskaż największą liczbę much w pliku w ramach serii eksperymentalnej. Uruchom funkcję analizy, a następnie po wyświetleniu monitu wybierz katalog główny eksperymentu.
Po uruchomieniu makra zwróć uwagę, że w każdym folderze pojawił się nowy plik wyników i nowy stos obrazów. Otwórz te pliki, aby upewnić się, że procedura zadziałała poprawnie. Uruchom pakiet oprogramowania R lub RStudio i otwórz skrypt analizy testu wyspowego, aby przetworzyć wszystkie eksperymenty jednocześnie.
Aby analiza zakończyła się sukcesem, skrypt musi być poprawnie edytowany. W skrypcie w wierszu 16 wstaw ścieżkę do katalogu głównego zawierającego eksperymenty, które mają zostać przeanalizowane. W wierszu 19 wstaw ścieżkę do folderu, w którym mają być przechowywane pliki wyjściowe analizy.
Ta ostatnia lokalizacja musi być inna niż katalog zawierający dane obrazu, które mają być analizowane. Teraz uruchom skrypt z paska narzędzi i kontynuuj analizę wyników. Skrypt analizy testu wyspowego eksportuje wykres liniowy dla każdego warunku eksperymentalnego.
Wykres przedstawia procent much pozostających na platformie w czasie dla każdej repliki tego stanu. Wyeksportowany wykres liniowy, reakcja ucieczki: wszystkie warunki, podsumowuje średni i błąd standardowy średniej odpowiedzi ucieczki podczas lotu dla pierwszych 12 warunków eksperymentalnych obecnych w folderze głównym. Pole pod krzywą dla każdej kontrpróby doświadczalnej oblicza się w celu określenia, czy warunki doświadczalne różnią się od siebie znacząco.
Pole pod krzywą i wartość mediany dla każdego warunku eksperymentalnego są eksportowane jako wykres. W zależności od liczby warunków obecnych w folderze głównym, skrypt wykona albo dwustronny, niesparowany test Welcha T-test dla dwóch warunków, albo anova z poprawką dwóch kluczy dla więcej niż dwóch warunków. Wszystkie dane liczbowe obliczone przez skrypt Analiza Island Assay są również eksportowane i zapisywane jako pliki csv lub txt w folderze wyjściowym danych.
Ataksja-teleangiektazja jest autosomalnym recesywnym zaburzeniem ruchowym spowodowanym mutacjami w genie ATM. Choroba charakteryzuje się wczesnym wystąpieniem ataksji móżdżkowej. Efekt wszechobecnego strącania ortologa muchy ATM został zbadany w teście wyspowym i porównany z kontrolami.
Ogólnie rzecz biorąc, wszechobecne powalenie ortologa ATM muchy, Tefu, znacznie zmniejszyło sprawność lokomotoryczną w teście wyspowym w porównaniu z kontrolami tła genetycznego. Ręczna analiza zarejestrowanych danych z testu wyspowego dała taki sam wynik, jak analiza automatyczna. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test wyspowy, jak uruchomić makro testu wyspy Drosophila i jak obsługiwać skrypt analizy testu wyspowego.
Próbując tego protokołu, należy pamiętać, że jakość segmentacji obrazu jest skorelowana z jakością filmów. Im lepszy kontrast, tym płynniejsza analiza. Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom do badania zdolności lokomotorycznych u Drosophila w wysokiej przepustowości.
Po zastosowaniu tego testu, inne testy, takie jak te, które testują ujemną geotaksję, mogą być wykorzystane do dalszego badania wad lokomotorycznych.
Przegląd
Test wyspowy (Island Assay) to nowoczesna metoda oceny zachowania lokomotorycznego Drosophila melanogaster z wykorzystaniem zautomatyzowanego przetwarzania danych. Technika ta umożliwia wysokoprzepustowe przesiewy w badaniach genetycznych i farmakologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Przesiewy genetyczne
Wstęp
- Test wyspy (Island Assay) służy do oceny podstawowych zachowań lokomotorycznych u muszek owocówek.
- Pozwala on na zidentyfikowanie kluczowych regulatorów zaburzeń ruchu.
- Metoda ta wspiera wielkoskalowe przesiewy modeli chorób.
- Zautomatyzowana analiza obrazu zwiększa wydajność przetwarzania danych.
Cel badania
- Opracowanie wysokoprzepustowego testu do analizy zachowań lokomocyjnych.
- Ułatwienie identyfikacji czynników genetycznych wpływających na ruch.
- Testowanie środków farmakologicznych, które mogą korygować deficyty lokomocyjne.
Zastosowane metody
- Przygotowanie warunków eksperymentalnych z powtórzeniami biologicznymi.
- Konfiguracja aparatury rejestrującej z odpowiednim oświetleniem i kamerą.
- Zautomatyzowane przechwytywanie i przetwarzanie obrazów przy użyciu specjalistycznego oprogramowania.
- Kwantyfikacja zachowania much w oparciu o zdefiniowane parametry.
Główne wyniki
- Skuteczna implementacja testu wyspowego (Island Assay) do analizy lokomocyjnej.
- Generowanie mierzalnych danych dla obszernych przesiewów genetycznych.
- Identyfikacja potencjalnych kandydatów na leki w terapii zaburzeń ruchowych.
- Ustanowienie powtarzalnej metodologii dla przyszłych badań.
Wnioski
- Test wyspowy (Island Assay) zapewnia wiarygodne ramy do badania zachowań lokomotorycznych.
- Zautomatyzowane przetwarzanie zwiększa efektywność gromadzenia danych.
- Metoda ta jest odpowiednia do wysokoprzepustowych przesiewów genetycznych i farmakologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test wyspowy (Island Assay) umożliwia wysokoprzepustową, zautomatyzowaną kwantyfikację zachowania lokomotorycznego muszki owocówki \textit{Drosophila}, rozwiązując krytyczny problem wąskiego gardła w walidacji celów terapeutycznych w zaburzeniach ruchowych. Poprzez przekształcenie manualnej analizy wideo w obiektywne, powtarzalne dane wyjściowe, metoda ta wspiera skalowalny przesiew genetycznych i farmakologicznych modulatorów funkcji lokomotorycznej. Dzięki temu test ten stanowi mechanistycznie informacyjne i kosztowo efektywne narzędzie służące do ograniczania ryzyka we wczesnych etapach programów badawczych w neurologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację reakcji ucieczki lokomotorycznej jako funkcjonalnego odczytu efektów wyciszania genów lub działania leków.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki zautomatyzowanemu, obiektywnemu pomiarowi zachowania much w różnych warunkach genetycznych, co zmniejsza błąd obserwatora podczas przesiewania fenotypowego.
- Wartość prognostyczna: Generuje wskaźniki pola pod krzywą oraz mediany reakcji ucieczki, co ułatwia analizę porównawczą i priorytetyzację celów wykazujących istotne fenotypy lokomotoryczne.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanych, rozdzielczych w czasie danych o aktywności lokomotorycznej, co umożliwia wiarygodną ocenę związków w szeroko zakrojonych przesiewach substancji modyfikujących zaburzenia ruchu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność testu dzięki zautomatyzowanym potokom przetwarzania obrazów (Fiji i R), które minimalizują zmienność techniczną pomiędzy powtórzeniami i partiami eksperymentalnymi.
- Skalowalność: Kompatybilność z wysokoprzepustowymi procesami badawczymi dzięki niskokosztowej konfiguracji (kamera internetowa, oświetlenie LED) oraz zgodności z oprogramowaniem open-source, co umożliwia szerokie wdrożenie w laboratoriach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy genetyczne modele Drosophila (np. wyciszenie ortologa ATM) z mechanizmami ludzkich zaburzeń ruchowych poprzez konserwatywne fenotypy lokomotoryczne.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Dostarcza ilościowych wyników behawioralnych, które pomagają odróżnić ogólne deficyty motoryczne od specyficznych zaburzeń koordynacji lub wytrzymałości, co zwiększa pewność w doborze celu terapeutycznego.
- Zgodność przedkliniczna: Wspiera analizę zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowego działania środków farmakologicznych, umożliwiając wczesną ocenę skuteczności w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Test wyspowy (Island Assay) wpisuje się w kontinuum odkryć — od weryfikacji hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację związków wiodących, stanowiąc pomost fenotypowania behawioralnego pomiędzy przesiewami genetycznymi a badaniami mechanistycznymi w programach neurologicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i walidację celów poprzez powiązanie zaburzeń genetycznych (np. knockdown ATM) z mierzalnymi deficytami lokomocyjnymi, co umożliwia weryfikację hipotez dotyczących wybranych celów.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analiz dzięki zautomatyzowanej kwantyfikacji ucieczki much z platformy w czasie, generując zależne od dawki i czasu odczyty fenotypowe odpowiednie do przesiewania bibliotek związków.
- Analityka: Eksportuje wartości pola pod krzywą (AUC) oraz wartości mediany wraz z wynikami statystycznymi (test t Welch’a lub ANOVA), co umożliwia porównywanie różnych warunków i wybór trafień w kampaniach przesiewowych.
- Badania translacyjne: Koreluje z przesiewaniem fenotypowym w modelach chorób poprzez wykazanie zachowanych defektów lokomocyjnych w modelach Drosophila dla ludzkiej ataksji, co potwierdza ciągłość mechanistyczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalną, ustandaryzowaną platformę oceny lokomocyjnej, którą można zastosować do wielu celów, genotypów i przesiewów związków bez konieczności ponownej walidacji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki obiektywnej, wysokorozdzielczej kwantyfikacji behawioralnej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki zautomatyzowanemu przetwarzaniu danych, minimalizując nakład pracy ręcznej oraz zmienność między użytkownikami w przesiewach wielkoskalowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność podejmowania decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wczesnych, ilościowych danych fenotypowych, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach rozwoju neuroterapii.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie statystycznie wiarygodnych danych dotyczących odpowiedzi lokomotorycznej, co zwiększa efektywność kapitałową w portfolio badawczym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga znajomości oprogramowania Fiji oraz R/RStudio w celu wykonania makr i przeprowadzenia analizy skryptowej, co wiąże się z koniecznością podstawowego przeszkolenia w zakresie bioinformatyki lub analizy obrazu.
- Zależy od spójnych warunków obrazowania (oświetlenie, kontrast, stabilność platformy), aby zapewnić dokładną segmentację much oraz wiarygodną kwantyfikację w różnych eksperymentach.
- Wymaga standaryzowanego przygotowania much (nienaruszone skrzydła, wiek, płeć, zagęszczenie), aby zminimalizować zmienność biologiczną i zapewnić powtarzalność testu.
- Obejmuje etapy konfiguracji ręcznej (definicja ROI platformy, próg minimalnej wielkości muchy), które muszą być rygorystycznie stosowane w celu zachowania integralności danych między partiami.
- Ogranicza się do analizy zachowań w płaszczyźnie 2D; nie rejestruje lotu pionowego ani złożonych sekwencji ruchowych, co wymaga zastosowania uzupełniających testów w celu pełnego profilowania behawioralnego.
