Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłych mięśni szkieletowych. Komórki te są wykorzystywane do badań funkcjonalnych, takich jak ocena różnicowania miogennego i pomiar wnikania wapnia w magazynie. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia szybką, prostą i powtarzalną izolację ludzkich pierwotnych mioblastów.

Te mioblasty są nowymi ex-vivo do badania sygnalizacji wapnia podczas regeneracji mięśni. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mięśni, takie jak identyfikacja kanałów jonowych i czynników transkrypcyjnych zaangażowanych podczas różnicowania mięśni. Metoda ta może bowiem dostarczyć wglądu w funkcje genów podczas różnicowania miogennego człowieka.

Może być również stosowany w innych badaniach, takich jak możliwość wykorzystania miogennych komórek macierzystych w leczeniu dystrofii mięśniowych. Przenieś próbkę mięśni na sterylną sześciocentymetrową płytkę, dwukrotnie umyj próbkę PBS. Usunąć pozostałą tkankę tłuszczową i zważyć próbkę.

Następnie dodaj trypsynę i zmiel mięsień na kawałki mniejsze niż dwa milimetry. Po zmieleniu użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść tkankę do 200-mililitrowej butelki dysocjacyjnej zawierającej mieszadło, a następnie kontynuuj zbieranie zmielonej tkanki w roztworze trypsyny, aż butelka dysocjująca zostanie napełniona do 90 mililitrów. Teraz inkubuj tkankę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut, delikatnie mieszając.

Po godzinie dodaj 10 mililitrów FCS, aby zatrzymać reakcję i homogenizować mieszaninę za pomocą rozcierania. Teraz załaduj sitka o wielkości 70 mikronów na dwie rurki o pojemności 50 mililitrów i przepuść połowę zawiesiny komórek przez każde sitko, pipetując zawiesinę do filtrów. Następnie wykonaj zawiesinę komórek w pożywce wzrostowej i umieść 200 000 komórek na sześciocentymetrowych płytkach z czterema mililitrami pożywki.

Inkubuj płytki, zmieniając podłoże co trzeci dzień. Po pięciu do siedmiu dniach komórki powinny być zlewające się w 70% do 80%, a następnie je zabarwić. Na początek przepłucz płytkę zbiegających się komórek PBS.

Następnie dodaj jeden mililitr roztworu trypsyny i pozwól enzymowi działać przez trzy minuty. Zatrzymaj reakcję, dodając dwa mililitry pożywki i zbierz komórki w 15-mililitrowej probówce. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś je w jednym mililitrze podłoża.

Następnie zlicz komórki, przechowując je na lodzie. W celu analizy faktów załaduj siedem probówek po 100 000 komórek każda. Załaduj pozostałe komórki do ósmej probówki w celu sortowania.

Umyć komórki jednym mililitrem zimnego buforu faksowego, następnie odwirować probówki, odessać i wyrzucić supernatant. Dodać z powrotem 200 mikrolitrów buforu faksowego z odpowiednimi przeciwciałami i pozostawić komórki do inkubacji na lodzie przez 30 minut. Po 30 minutach ponownie umyj komórki i ponownie zawieś je w 500 mikrolitrach bufora faksowego, a następnie posortuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.

Po wykluczeniu komórek krwiotwórczych CD45 dodatnich należy oddzielić komórki CD45 ujemne na podstawie ekspresji CD56. Następnie bramkuje populację CD56 dodatnią dla CD34, CD144 i CD146. Ponownie przeanalizuj ułamek posortowanej populacji, aby sprawdzić czystość.

Teraz wyciągnij ludzkie mioblasty i umyj je pięcioma mililitrami pożywki. Następnie ponownie zawiesić je w jednym mililitrze podłoża. Przenieś zawiesinę na sześciocentymetrową płytkę z czterema mililitrami pożywki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 7% dwutlenkiem węgla.

Do tej procedury należy przeprowadzić hodowlę mioblastów i przygotować świeżą pożywkę transwekcyjną. Inkubować podłoże w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut. Podczas inkubacji pożywki przygotuj mioblasty.

Najpierw spłucz je raz za pomocą PBS. Następnie trypsynizuj przylegające komórki. Zatrzymaj reakcję, dodając dwa mililitry pożywki.

Następnie zbierz komórki do 50-mililitrowej probówki. Zakręć je i ponownie zawieś w jednym mililitrze podłoża. Do każdej transwekcji przygotuj 500 000 komórek w 200 mikrolitrach pożywki.

Do każdych 500 mikrolitrów pożywki transwekcyjnej dodać 200 mikrolitrów podwielokrotności komórek, a następnie wymieszać, używając tylko dwóch ruchów pistoletu do pipet. Następnie pozwól reakcjom postępować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach przenieś reakcje na 3,5-centymetrowe szalki hodowlane, z których każda zawiera jedno szklane szkiełko nakrywkowe.

Następnie dodaj 1,3 mililitra pożywki, aby uzyskać końcową objętość dwóch mililitrów i inkubować naczynia. Po 48 godzinach od różnicowania komórki można wybarwić immunologicznie lub przeanalizować za pomocą obrazowania wapnia. W przypadku każdej opcji najpierw ostrożnie umyj komórki dwukrotnie, używając jednego mililitra PBS o temperaturze pokojowej do umycia.

Staraj się unikać odłączania miotubes. W celu obrazowania wapnia przykryj umyte komórki dwoma mikromolowymi fura-2 AM i jednym mikromolowym kwasem treonowym w pożywce zawierającej wapń. Następnie pozwól im inkubować przez około 30 minut przed wymieszaniem.

Następnie dwukrotnie przemyj komórki niezmodyfikowaną pożywką zawierającą wapń, a następnie inkubuj je przez 10 do 15 minut w celu estryfikacji. Teraz usuń szkiełko nakrywkowe z płytki hodowlanej i zainstaluj ją w komorze doświadczalnej. Załaduj komorę pożywką zawierającą wapń, umieść ją pod mikroskopem, a następnie rozpocznij rejestrację danych.

Fura-2 jest wzbudzana na przemian w czasie 340 i 380 nanometrów. Światło emisyjne jest zbierane w odległości 510 nanometrów. Nurkowanie z obrazami o długości 340 nanometrów przez obrazy 380 zapewnia proporcje obrazu, ponieważ fluktuacje i stężenie wapnia są stosunkowo niskie, uzyskuj jeden współczynnik obrazu co dwie sekundy.

Po dwóch lub trzech minutach zastąp pożywkę podłożem wolnym od wapnia. Następnie, przez jedną lub dwie minuty, monitoruj aktywność przechowywanego wapnia w komórkach. Następnie dodaj jedną mikromolową thapsigarginę do komórek, aby wyczerpać ich wewnętrzne zapasy wapnia.

Odczekaj od ośmiu do 10 minut, a następnie szybko zastąp pożywkę pożywką zawierającą wapń i nagrywaj przez pięć minut, aż wapń dostanie się do komórek przez kanały suc e. Po zakończeniu eksperymentu przeanalizuj obrazy. Wybierz obszar, w którym nie ma komórek dla regionu pierwszego, który definiuje tło, a następnie wybierz obszar w cytoplazmie dla regionu drugiego.

Te dwa obszary można narysować na dowolnym obrazie z serii. Następnie przejdź do zakładki uruchamiania eksperymentów i wybierz obrazy referencyjne dla kanałów 340 i 380, wybierz region pierwszy, a następnie kliknij odejmij tło. Teraz uruchom cały eksperyment, aby usunąć tło ze wszystkich obrazów.

Po zakończeniu kliknij opcję danych dziennika, aby otworzyć arkusz kalkulacyjny, w którym rejestrowane są dane dotyczące czasu i stosunku. Komórki mięśniowe zostały wyhodowane, rozprężone i posortowane za pomocą faksu. Mioblasty stanowiły ponad 60% badanej populacji.

Pierwotne ludzkie mioblasty zostały następnie wyhodowane w pożywce różnicującej i wybarwione immunologicznie dla czynnika transkrypcyjnego MEF2 i białek łańcucha ciężkiego miozyny. Większość komórek wykazywała ekspresję łańcucha ciężkiego miozyny i tworzyła miorurki o wartościach wskaźnika fuzji około 60%, pozostałe 40% komórek pozostało niezróżnicowanymi komórkami jednojądrowymi, znanymi również jako komórki rezerwowe. Opisany eksperyment z wprowadzaniem wapnia w sklepie przeprowadzono z powodzeniem na zróżnicowanych komórkach.

Przeprowadzenie tego samego eksperymentu na komórkach transfekowanych małym interferującym RNA, skierowanym przeciwko przepuszczalnym dla wapnia kanałom z rodziny TRPC, pokazuje, że knockdown miał mierzalny wpływ na wejście wapnia w magazynie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować ludzkie mioblasty od dorosłych mięśni szkieletowych. Wykorzystujemy te komórki do badania kolejnych etapów różnicowania mięśni, a w szczególności dezaktywacji czynników transkrypcyjnych i kanałów wapniowych.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Jest to szybka, prosta, powtarzalna metoda, która pozwala uzyskać wydajność ludzkich mioblastów. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby nie dopuścić do osiągnięcia pełnej pewności przez kultury mioblastów, ponieważ nastąpi niepożądane spontaniczne różnicowanie.