Name: Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę izolacji ludzkich mioblastów z tkanki mięśniowej i oceny różnicowania miogennego. Technika umożliwia pomiar sygnałów wapniowych kluczowych dla regeneracji mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (numer grantu 310030-166313), "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Fundację Marcela Levaillanta" oraz "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire."

Próbki mięśni ludzkich (tkanki uzyskane z mięśni półścięgnistych) zostały pobrane podczas operacji ortopedycznej u zdrowych pacjentów jako odpady chirurgiczne. Wszystkie metody związane z badaniem na ludziach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami Szwajcarskich Organów Regulacyjnych ds. Zdrowia i zatwierdzone przez Komisję Cantonale d'Ethique de la Recherche z Władz Kantonalnych Genewy w Szwajcarii (protokół CER nr 12-259). Uzyskano świadome i pisemne zgody od wszystkich dorosłych uczestników biorących udział w badaniu.
1. Izolacja mioblastów od ludzkich mięśni szkieletowych
<ol>
	<li>Podczas wszystkich zabiegów należy utrzymywać sterylne warunki, pracując pod kapturem do hodowli tkankowych poziomu II oraz używając sterylnego podłoża i sterylnych. 
	Uwaga: Ta procedura może być stosowana do wielu ludzkich mięśni szkieletowych.</li>
</ol>
2. Protokół dysocjacji
<ol>
	<li>Próbki mięśni (2 - 3 g) przenieść na sterylną płytkę o średnicy 6 cm.</li>
	<li>Przemyć próbki mięśni 5 - 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Powtórz pranie.</li>
	<li>Usuń tkankę łączną i tłuszczową za pomocą zakrzywionych nożyczek i zacisku.</li>
	<li>Zważyć próbkę mięśni (patrz krok 2.13) i przenieść ją na nową, sterylną płytkę o średnicy 6 cm.</li>
	<li>Dodaj 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek pokrój i zmiel tkankę mięśniową na małe kawałki (mniej niż 2 mm).</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml przenieś mięsień mielony do butelki dysocjacyjnej o pojemności 200 ml zawierającej pręt magnetyczny. Powtarzaj ten krok, aż 90 ml 0,05% trypsyny-EDTA zostanie przeniesione ze wszystkimi zmielonymi mięśniami do pudełka dysocjacyjnego. Zamknąć butelkę dysocjacyjną i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut przy łagodnym wzburzeniu.</li>
	<li>Wyjąć butelkę dysocjacyjną z łaźni grzewczej i zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając 10 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS; 10% objętości końcowej) do butelki dysocjującej. Homogenizować mieszaninę za pomocą pipety.</li>
	<li>Przygotuj dwie probówki o pojemności 50 ml z sitkiem o pojemności 70 μm na każdej. Przepuścić połowę zawiesiny komórek przez sitko na każdej probówce, pipetując filtr w górę i w dół, aż zawiesina przejdzie przez filtr.</li>
	<li>Odwirować probówki o ciśnieniu 200 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut; zassać i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki za pomocą 10 ml pożywki wzrostowej (GM; Tabela 1) i przepuścić komórki przez sitko o wielkości 40 μm umieszczone na jednej probówce o pojemności 50 ml. Odwirować probówkę o ciśnieniu 200 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut; Odessać i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml GM i odwirować probówkę o ciśnieniu 200 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut; zassać i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki z 1 ml GM i policzyć komórki za pomocą komory Neubauera. 
	Uwaga: Zwykle należy zebrać plon 3 x 105 komórek na g mięśni. Wydajność oblicza się, dzieląc liczbę komórek przez masę biopsji mięśnia (krok 2.4).</li>
	<li>Umieścić 2 x 105 komórek na sterylnej 6-centymetrowej płytce zawierającej 4 ml GMO i inkubować w temperaturze 37 °C i 7% CO2 . Przygotuj tyle talerzy, ile potrzeba.</li>
	<li>Zmień GM po 3 dniach. 
	Uwaga: Świeżo zdysocjowane komórki potrzebują czasu, aby przylgnąć do płytki hodowlanej. Co więcej, czas pierwszego podwojenia komórek miogennych wynosi około 50 - 60 godzin. Po pierwszym podziale czas podwojenia wynosi około 20 godzin.</li>
	<li>Po 5 - 7 dniach, gdy komórki osiągną 70 - 80% zbieżności (około 1,5 x 106 komórek/na 6 cm płytki), rozpocznij barwienie przeciwciał i sortowanie komórek (krok 3).</li>
</ol>
3. Barwienie przeciwciał i sortowanie komórek
<ol>
	<li>Po jednokrotnym przepłukaniu PBS inkubować przylegające komórki (na 6-centymetrowej płytce) z 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C i 7% CO2 przez 3 minuty (lub inkubować w 5% CO2 ). Zatrzymaj reakcję, dodając 2 ml GM i zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Po odwirowaniu (200 x g przez 5 min) ponownie zawieś komórki w 1 ml GM.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory Neubauera.</li>
	<li>Wykonaj następujące procedury na ice. 
	Uwaga: Procedura ustawiania prawidłowej kompensacji fluorescencji na cytometrze jest niezbędna i powinna być podobna na każdym cytometrze. Probówki 1 i 2 są używane jako kontrole ujemne. Probówki 3 - 7 służą do ustawiania kompensacji na cytometrze podczas pierwszego eksperymentu (Tabela 2). Końcowe stężenie stosowane dla każdego przeciwciała i odpowiadającego mu izotypu powinno być takie samo (około 1 μg/106 komórek).</li>
	<li>Wysyłka 1 x 105 komórek w probówce (probówka 5 ml) dla probówek 1 - 7 (Tabela 2). Umieścić pozostałą zawiesinę komórek w probówce 8 w celu sortowania komórek.</li>
	<li>Umyj komórki 1 ml zimnego buforu FACS (PBS-5% FCS). Zamknąć i odwirować probówki o ciśnieniu 200 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut; Odessać i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu FACS na probówkę. Dodać przeciwciała do probówki zgodnie z tabelą 2. Inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj komórki: dodaj 1 ml buforu FACS do każdej probówki. Zamknąć probówki i odwirować je w temperaturze 200 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok jeszcze raz.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu FACS. Zamknij probówki i trzymaj je na lodzie do momentu sortowania komórek. Przygotuj 4 probówki po 1,5 ml, każda zawierająca 500 μl GM, która jest niezbędna do zebrania komórek podczas sortowania komórek. Trzymaj je na lodzie.</li>
	<li>Sortuj ludzkie mioblasty według cytometrii przepływowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Po wykluczeniu komórek krwiotwórczych CD45-dodatnich, oddziel komórki CD45-ujemne na podstawie ekspresji CD56. Następnie bramkuje populację CD56-dodatnią dla CD34, CD144 i CD146 (ludzkie mioblasty definiuje się jako komórki CD56 + / CD146 + / CD45 / CD34 / CD144-). Ponownie przeanalizuj niewielką część posortowanej populacji komórek, aby sprawdzić czystość.</li>
	<li>Zebrać probówki zawierające ludzkie mioblasty w jednej probówce o pojemności 15 ml i przemyć jednorazowo, dodając 5 ml GM. Odwirować probówkę o sile 200 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut; odessać i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml GM i umieścić komórki na niepowlekanej 6-centymetrowej płytce zawierającej 4 ml GM (2 x 10 5 komórek na płytkę). Inkubować w temperaturze 37 °C i 7% CO2 .</li>
</ol>
4. Konserwacja komórek
<ol>
	<li>Zmieniaj połowę pożywki co 2 dni. Usuń 2 ml starego GM z naczynia hodowlanego i dodaj 2 ml GM. 
	Uwaga: Mioblasty wytwarzają czynniki wzrostu, które są korzystne dla warunków hodowli.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki, gdy osiągną 70-80% konfluencji, aby uniknąć różnicowania wstępnego. Po jednokrotnym spłukaniu PBS inkubować przylegające komórki (na 6-centymetrowej płytce) z 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C i 7% CO2 przez 3 minuty. Zatrzymaj reakcję, dodając 2 ml GM i zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Po odwirowaniu (200 x g przez 5 min) ponownie zawieś komórki w 1 ml GM.</li>
	<li>Policz komórki i przygotuj 6 cm płytki po 2 x 10 po5 komórek na płytkę w 4 ml GM.</li>
	<li>Utrzymuj ludzkie mioblasty do 6 pasaży lub zamrażaj je w GM zawierającym 10% DMSO, 1 x 106 komórek na ml. Zamrozić komórki w pojemniku do stopniowego zamrażania (1 °C/min); W celu długotrwałego przechowywania umieść komórki w ciekłym azocie.</li>
</ol>
5. Transfekcja ludzkich mioblastów za pomocą siRNA
Uwaga: Mioblasty są transfekowane za pomocą komercyjnego odczynnika do transfekcji dwa dni przed indukcją różnicowania. Wpływ specyficznego siRNA na gen jest zawsze porównywany z efektem kontrolnego siRNA. siRNA to dwuniciowe RNA, które muszą być trzymane na lodzie i manipulowane w rękawiczkach.
<ol>
	<li>Uzyskaj 70 - 80% zlewającą się monowarstwę ludzkich mioblastów na 6-centymetrowej płytce (około 1,5 x 106 komórek). 
	Uwaga: 5 x 105 komórek na transfekcję jest potrzebnych do uzyskania zlewającej się monowarstwy transfekowanych mioblastów po 2 dniach w GM.</li>
	<li>Przygotować szklane szkiełka nakrywkowe (opisane dla obrazowania wapnia w kroku 7).</li>
	<li>Ciepły GM, 0,05% trypsyny-EDTA i PBS do 37 °C.</li>
	<li>Wykonaj wszystkie poniższe czynności w okapie do hodowli tkankowych poziomu II, aby zachować sterylność.</li>
	<li>W probówce o pojemności 1,5 ml należy przesłać 500 μl zredukowanej pożywki surowicy, 3 μl odczynnika do transfekcji i 1 μl siRNA w temperaturze 20 μM. Delikatnie wymieszać i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 - 20 minut.</li>
	<li>W tym czasie inkubacji przygotuj mioblasty do transfekcji. Po jednokrotnym spłukaniu PBS inkubować przylegające komórki (na 6-centymetrowej płytce) z 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C i 7% CO2 przez 3 minuty. Zatrzymaj reakcję, dodając 2 ml GM i zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Po odwirowaniu (200 x g przez 5 min) ponownie zawieś komórki w 1 ml GM.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory Neubauera.</li>
	<li>Zawiesić 5 x 105 komórek w 200 μl GM dla każdej transfekcji (tj. dla 2 transfekcji ponownie zawiesić w 400 μl).</li>
	<li>Dodać 200 μl zawiesiny komórkowej do każdych 500 μl mieszaniny siRNA-transfektant. Pipetować w górę i w dół dwa razy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 700 μl (komórki + transfektant siRNA) do 3,5 cm naczynia hodowlanego zawierającego szklane szkiełko nakrywkowe. Dodaj GM, aby uzyskać końcową objętość 2 ml.</li>
	<li>Po 24 godzinach w temperaturze 37 °C i 7% CO2 całkowicie zastąpić pożywkę 2 ml świeżego GM. Po kolejnych 24 godzinach zwykle obecna jest zlewająca się monowarstwa transfekowanych komórek; jeśli tak, wywołać różnicowanie mioblastów poprzez zastąpienie GM 2 ml pożywki różnicującej (DM; Tabela 1).</li>
	<li>Eksperymenty obrazowania wapnia należy wykonywać 24 - 48 godzin po indukcji różnicowania lub na proliferujących mioblastach. 
	Uwaga: Immunofluorescencję wykonuje się zwykle 48 godzin po indukcji różnicowania.</li>
</ol>
6. Barwienie immunofluorescencyjne markerów różnicowania
Uwaga: Barwienie immunofluorescencyjne wykonuje się po 48 godzinach w DM, ale można je również przeprowadzić w innych okresach różnicowania. Miogenina i MEF2 są białkami jądrowymi ulegającymi ekspresji tylko w zróżnicowanych komórkach (przed fuzją w miotubach), a ich barwienie pozwala na ocenę procesu różnicowania. Łańcuch ciężki miozyny (MyHC) ulega ekspresji tylko w miotubach i służy do oszacowania wielkości miotubki i wskaźnika fuzji (liczba jąder w miotubach/całkowita liczba jąder).
<ol>
	<li>Po 48 godzinach w stężeniu s.m. przemyć zlewającą się monowarstwę zróżnicowanych komórek dwukrotnie 1 ml PBS w temperaturze pokojowej. Zrób to ostrożnie, aby uniknąć odłączenia miotubes.</li>
	<li>Utrwalić komórki 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki PBS dwukrotnie, po 5 minut każda.</li>
	<li>Udrażnić komórki 1 ml PBS zawierającego 0,25% Triton X-100 przez 45 minut i przemyć 3 razy 1 ml PBS.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania poprzez inkubację komórek w PBS uzupełnionym 0,2% Tween-10 i 2% kozią surowicą (roztwór blokowy) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokowym (600 μl na płytkę 3,5 cm). 
	Uwaga: Stosowane są następujące przeciwciała pierwszorzędowe: mysia anty-miogenina (1:600), królicze przeciwciało anty-MEF2 (1:300) i mysie przeciwciało anty-MyHC (MF20, 1:1,000). Możliwe jest zmieszanie tego samego roztworu blokującego, ciężkiego łańcucha anty-miozyny myszy lub mysiej anty-miogeniny, z króliczym anty-MEF2.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokowy i dodać 600 μl roztworów przeciwciał pierwszorzędowych na 3,5-centymetrową płytkę i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy 1 ml PBS. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze z 600 μl przeciwciał drugorzędowych przygotowanych w roztworze blokowym, w następujący sposób: kozioł anty-mysz Alexa 488 (1:1,000), kozioł anty-królik Alexa 546 (1:1,000) i DAPI (1:50, roztwór podstawowy o stężeniu 15 μM). 
	UWAGA: DAPI jest toksycznym związkiem, z którym należy obchodzić się w rękawiczkach.</li>
	<li>Odessać i przemyć komórki 3 razy 1 ml PBS.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium mocującego z alkoholu poliwinylowego z roztworem zapobiegającym blaknięciu. Przechowywać je w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem do czasu obrazowania komórek.</li>
</ol>
7. Obrazowanie wapnia
<ol>
	<li>Wcześniejsza kultura przygotuj szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm. Umieść szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu na 48 godzin, aby usunąć tłuszcz i brud z powierzchni, co zmniejsza przyleganie komórek do szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Po kilkukrotnym spłukaniu szkiełek nakrywkowych wodą, włóż je z powrotem do wody i wysterylizuj (autoklawow).</li>
	<li>Umieść jedno szkiełko nakrywkowe na 3,5-centymetrowej płytce hodowlanej i pozostaw do wyschnięcia. Przechowuj szalki Petriego do dalszych eksperymentów lub użyj ich natychmiast.</li>
	<li>Dodaj transfekowane mioblasty (5 - 6 x 105 komórek) do szklanego szkiełka nakrywkowego. 
	Uwaga: Eksperymenty wykonuje się 24 - 48 godzin po indukcji różnicowania lub na proliferujących mioblastach.</li>
	<li>Aby wykonać obrazowanieCa2+, przemyj komórki 2 razy PBS lub bezpośrednio pożywką użytą do eksperymentów (pożywka zawierająca wapń; Tabela 3). Załaduj ogniwa 2 μM Fura-2/AM plus 1 μM kwas pluronowy przez około 30 minut w ciemności w RT. 
	Uwaga: Kwas pluronowy pomaga w rozpuszczaniu Fura-2. Fura-2/AM i kwas pluronowy rozpuszczają się w pożywce zawierającej wapń.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie w tym samym podłożu, ale bez Fura-2/AM i kwasu pluronowego i pozostaw je w ciemności na dodatkowe 10 - 15 minut, aby umożliwić deestryfikację Fura-2/AM.</li>
	<li>Jeśli wydajność ładowania Fura-2 jest zbyt niska, dodaj więcej Fura-2 (np. 4 μM) i/lub inkubuj komórki przez dłuższy czas (np. 40 min).</li>
	<li>Usunąć szkiełko nakrywkowe z płytki hodowlanej i umieścić je w komorze doświadczalnej. Dodać ~1 ml pożywki zawierającej wapń (w zależności od objętości komory doświadczalnej). Zainstaluj go na stoliku mikroskopu i rozpocznij nagrywanie. 
	Uwaga: Fluorescencyjna sonda Fura-2 czuła naCa 2+ jest wzbudzana na przemian przy 340 nm i 380 nm, a światło emisyjne jest zbierane przy 510 nm. Ponieważ wahania stężenia Ca2+ są stosunkowo powolne, należy uzyskać 1 stosunek co 2 s.</li>
	<li>Aby aktywować SOCE, stosuje się następujący klasyczny protokół ponownego dodawania thapsigarginy/Ca2+: pozostaw komórki na 2-3 minuty w pożywce zawierającej wapń. Zastąp pożywkę podłożem bezwapniowym na 1-2 minuty.
	<ol>
		<li>Dodać 1 μM thapsigarginy, aby wyczerpać wewnętrzne zapasy wapnia. 
		Uwaga: Thapsigargin jest nieodwracalnym blokerem aktywności pompy Ca2 + ATPazy (SERCA) siateczki sarko-endoplazmatycznej. Po 8 - 10 minutach szybko zastąp pożywkę pożywką zawierającą wapń. Ca2+ wejdzie do komórek przez kanały SOCE. Odczekaj około 5 minut przed zakończeniem eksperymentów. 
		UWAGA: Thapsigargin jest toksycznym związkiem, z którym należy obchodzić się w rękawiczkach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza pomiarowa Ca2+
Uwaga: Przeprowadź analizę za pomocą oprogramowania do akwizycji.
<ol>
	<li>Otwórz eksperyment. Narysuj region 1 w obszarze, w którym nie ma komórek (obszar tła) i narysuj inne regiony w cytoplazmie komórek, które mają być analizowane (regiony można narysować na dowolnym obrazie: obraz 340 nm, 380 nm lub obraz proporcji). Przejdź do sekcji "Uruchom eksperymenty" > "Obrazy referencyjne". Pod kanałami 340 i 380 wybierz "region 1", a następnie kliknij "Odejmij tło".</li>
	<li>Uruchom cały eksperyment (F4: do przodu), aby upewnić się, że nic nie zakłóca obszaru tła, takiego jak fluorescencyjna plamka pyłu, która przemieszcza się przez obszar tła, i że komórki nie poruszają się w czasie eksperymentów. 
	Uwaga: Wybrane obszary zainteresowania nie powinny zawierać ciemnych obszarów; W przeciwnym razie wartość współczynnika będzie wydawać się zaszumiona, ponieważ część tła zostanie uwzględniona w pomiarze.</li>
	<li>Kliknij "Dane dziennika" i ponownie odtwórz cały eksperyment. 
	Uwaga: Spowoduje to otwarcie arkusza kalkulacyjnego, w którym rejestrowany jest czas i stosunek. Możliwe jest również zapisanie poszczególnych długości fal 340 nm i 380 nm.</li>
	<li>Aby uzyskać informacje na temat SOCE, wyodrębnij dwa ważne parametry z eksperymentu: amplitudę ponownego dodawania Ca2+ i nachylenie fazy wejścia Ca2+ (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3).</li>
	<li>Amplitudę należy uzyskać, odejmując wartość współczynnika tuż przed ponownym dodaniem Ca2+ od maksymalnej amplitudy wysokości Ca2+. Maksymalne nachylenie należy uzyskać, dopasowując regresję liniową pierwszych sekund po ponownym dodaniu Ca2+. 
	Uwaga: Obszar pod krzywą odpowiedzi thapsigarginy jest również parametrem informacyjnym do wyodrębnienia, ponieważ odzwierciedla ilość wolnego wapnia przechowywanego w SR.</li>
</ol>

<ol><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration.</a> Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li>
<li>Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Adult skeletal muscle stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+blood-vessel-derived+multipotent+precursors+from+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (90), e51195(2014).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myogenic+stem+cells+from+cultures+of+cryopreserved+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle.</a> Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).</li>
<li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Expansion+and+In+Vivo+Self-Renewal+of+Human+Muscle+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li>
<li>Stiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+signalling+controls+store-operated+calcium+entry+required+for+development+and+contractile+function+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle.</a> Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-Operated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-Operated Calcium Channels.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).</li>
<li>Darbellay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1-+and+Orai1-dependent+store-operated+calcium+entry+regulates+human+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation.</a> J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).</li>
<li>Darbellay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+muscle+economy+myoblast+differentiation+and+excitation-contraction+coupling+use+the+same+molecular+partners%2C+STIM1+and+STIM2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2.</a> J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).</li>
<li>Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+cation+channels+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential cation channels in disease.</a> Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).</li>
<li>Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+TRPC+in+the+abnormal+calcium+influx+observed+in+dystrophic+%28mdx%29+mouse+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers.</a> J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).</li>
<li>Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+post-natal+human+myogenesis%2C+normal+myotube+size+requires+TRPC1-+and+TRPC4-mediated+Ca%282%29%28%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry.</a> J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).</li>
<li>Brinkmeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+in+skeletal+muscle%3A+gene+expression%2C+function+and+implications+for+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease.</a> Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).</li>
<li>Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+Ca2%2B+entry+in+muscle+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases.</a> BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).</li>
<li>Lacruz, R. S., Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases+caused+by+mutations+in+ORAI1+and+STIM1%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1.</a> Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1-Ca%282%2B%29+signaling+is+required+for+the+hypertrophic+growth+of+skeletal+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice.</a> Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).</li>
<li>Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orai1-dependent+calcium+entry+promotes+skeletal+muscle+growth+and+limits+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue.</a> Nat Commun. 4, 2805(2013).</li>
<li>Konig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+hyperpolarization+triggers+myogenin+and+myocyte+enhancer+factor-2+expression+during+human+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Associated+Methylation+Suppresses+SPRY1%2C+Leading+to+a+Failure+of+Re-quiescence+and+Loss+of+the+Reserve+Stem+Cell+Pool+in+Elderly+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle.</a> Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).</li>
<li>Bettadapur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Culture+of+Aligned+Skeletal+Myotubes+on+Micromolded+Gelatin+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels.</a> Sci Rep. 6, 28855(2016).</li>
<li>Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+is+a+new+actin-binding+splice+variant+involved+in+fast+repetitive+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release.</a> J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).</li>
<li>Sauc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+traps+and+gates+Orai1+channels+without+remodeling+the+cortical+ER%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER.</a> J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).</li>
<li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+measurements+in+organelles+with+Ca2%2B-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Izolacja i hodowla ludzkich mioblastów z dorosłych mięśni szkieletowych oferuje model in vitro do badania różnicowania i regeneracji mięśni. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół, który pozwala na oczyszczanie dużych plonów ludzkich mioblastów w prosty i niedrogi sposób. Ponadto technika ta zapewnia wiarygodne i powtarzalne wyniki pod względem procentu wyizolowanych mioblastów i ich skuteczności różnicowania miogennego. Rzeczywiście, uzyskaliśmy około 60% ludzkich mioblast...

Ludzkie mięśnie szkieletowe składają się z grup kurczliwych, wielojądrowych włókien mięśniowych powstałych w wyniku fuzji miogennych komórek prekursorowych. Mięśnie szkieletowe mają zdolność regeneracji po urazie dzięki obecności SCs, komórek macierzystych mięśni szkieletowych znajdujących się między błoną plazmatyczną włókien mięśniowych (sarkolemma) a blaszką podstawną. W nieuszkodzonych mięśniach SC są najczęściej obecne w stanie spoczynku. W odpowiedzi na naprężenia mechaniczne lub urazy, SC aktywują się (mioblasty), proliferują i ulegają różnicowaniu w celu utworzenia nowych włókien mięśniowych lub samoodnowie w celu uzupełnienia puli SC1,2. Z biegiem lat opracowano kilka technik izolowania SC i ich potomstwa, mioblastów, z biopsji mięśni szkieletowych. Dzięki lepszemu zrozumieniu markerów powierzchniowych komórek wyrażanych na tych komórkach i metodologii sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)3,4,5, możliwe jest teraz wyizolowanie czystych populacji ludzkich mioblastów z próbek mięśni.
Sygnalizacja wapniowa reguluje rozwój mięśni szkieletowych, homeostazę i regenerację. W szczególności duże znaczenie dla tych procesów ma wpis Ca2+, który jest aktywowany po wyczerpaniu zapasów wewnątrzkomórkowych, zwany SOCE6. Po stymulacji komórki poziom Ca2 + w retikulum endo/sarkoplazmatycznym (ER / SR) zmniejsza się, co z kolei aktywuje kanały Ca2 + błony plazmatycznej, które umożliwiają wejście Ca2 + w celu uzupełnienia klasy ER/SR7. Dwa główne białka zaangażowane w SOCE to białko cząsteczki interakcji zrębowej 1 (STIM1) wykrywające ER / SR Ca2 + i kanał Orai1 błony komórkowejCa2 +. Mięśnie szkieletowe obficie wyrażają te dwa białka, a także inne białka z tej samej rodziny (STIM2 i Orai2-Orai3)8,9 i kilka kanałów przepuszczalnych dla Ca2+ z rodziny TRPC (TRPC)10,11,12,13. Przenikanie Ca2+ przez szlak SOCE ma ogromne znaczenie dla tworzenia/regeneracji mięśni14. Mutacje białek STIM1 lub Orai1 mają szkodliwy wpływ na funkcjonowanie mięśni, prowadząc głównie do hipotonii mięśni15. Modele zwierzęce z upośledzeniem SOCE wykazują również zmniejszoną masę mięśniową i siłę, wraz ze zwiększoną męczliwością6,16,17. Jak wspomniano, inne białka STIM i Orai, a także wiele kanałów TRPC, ulegają ekspresji w mięśniach szkieletowych, a ich odpowiednie role nie zostały do tej pory określone. Obniżając ich poziom ekspresji, możliwe jest zatem zbadanie ich implikacji w SOCE i ich roli podczas różnicowania mięśni szkieletowych człowieka.
Pomiar SOCE może być wykonany przy użyciu dwóch różnych podejść: elektrofizjologicznych zapisów prądu i pomiarów Ca2+. Elektrofizjologia jest z pewnością bardziej bezpośrednią metodą, ponieważ mierzy prąd będący przedmiotem zainteresowania i związaną z nim sygnaturę elektrofizjologiczną. Jednak technika ta jest bardzo trudna do zastosowania w komórkach mięśniowych, głównie ze względu na duży rozmiar komórek mięśniowych i mały rozmiar endogennego prądu SOCE. Obrazowanie cytozolowego Ca2 + jest technicznie bardzo dostępne, ale pomiar jest bardziej pośredni, ponieważ poziom Ca2 + mierzony w cytozolu odzwierciedla zarówno wejście Ca2 +, jak i ponowne wypompowanie z komórki lub do magazynów wewnętrznych.
Metodologia, która obejmuje izolowanie mioblastów z małych kawałków ludzkich mięśni szkieletowych po trawieniu enzymatycznym, amplifikacji i FACS, jest wyjaśniona w tym artykule. Proces różnicowania mięśni i protokół immunofluorescencji w celu śledzenia ekspresji markerów różnicowania w czasie są opisane w 18. Na koniec wyjaśniono pomiar SOCE i rolę różnych kanałów jonowych w sygnalizacji Ca2 + i różnicowaniu mięśni szkieletowych.

<table><tbody><tr><td>Szynka" s F10</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31550-023</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>Lot 41G5532K</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>O5482</td><td></td></tr><tr><td>fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Corning</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethansone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Kreatyna</td><td>Sigma</td><td>27900</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td></td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,05%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtr siatkowy</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp; Probówka</td><td>ml Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Sokół 15&nbsp; Probówka Falcon</td><td></td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5&nbsp; Probówka mL (FACS)</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana: OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Reakcja transfektantowa: RNAiMax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1756064</td><td></td></tr><tr><td>PBS ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe</td><td>Fluka</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-MyHC *</td><td>DSHB</td><td>MF20&nbsp;</td><td>Koncentrat</td></tr><tr><td>Mysi anty-miogenin</td><td>BD Pharmigen</td><td>556358</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anty-MEF2</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>C-21</td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-myszy Alexa488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik Alexa 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty ludzka CD56-Alexa488</td><td>BD Pharmingen</td><td>557699</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty ludzka CD146-PECy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>562135</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty ludzka CD45-PE-CF594</td><td>BD Pharmingen</td><td>562279</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty ludzka CD34-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>345804</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty ludzka CD144-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>560410</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 mysz IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557702</td><td></td></tr><tr><td>PECy7 mysz IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 mysz IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>Mysz APC IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>550854</td><td></td></tr><tr><td>Mysz PE IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>556650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>UWAGA:&nbsp; toksyczny związek</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fluka</td><td>762400</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>UWAGA&nbsp;: toksyczny związek&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazowania ratiofowego: Metafluor 6.3</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*&nbsp;: MF 20 został zdeponowany w DSHB przez Fischmana, D.A.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Komórki satelitarne (SC) to komórki macierzyste mięśni znajdujące się pomiędzy błoną plazmatyczną włókien mięśniowych a otaczającą blaszką podstawną. Są one niezbędne do regeneracji mięśni. W przypadku urazu, który często występuje w mięśniach szkieletowych, aktywowane są SC. Namnażają się jako mioblasty i różnicują się, aby naprawić zmiany w mięśniach. Wśród wielu zdarzeń, które zachodzą podczas różnicowania mięśni, duże znaczenie mają cytozolowe sygnały Ca2+. Te sygnały Ca2 + powstają w wyniku uwalniania Ca2 + z wewnętrznych magazynów Ca2 +, a także w wyniku wejścia Ca2 + z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, w szczególności z wejścia Ca2+ w sklepie (SOCE). W pracy opisano metodologię zastosowaną do uzyskania czystej populacji ludzkich mioblastów z próbek mięśni pobranych po operacjach ortopedycznych. Tkanka jest trawiona mechanicznie i enzymatycznie, a komórki są amplifikowane, a następnie sortowane za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z obecnością określonych markerów błonowych. Po uzyskaniu ludzkie mioblasty są namnażane i angażują się w różnicowanie poprzez usuwanie czynników wzrostu z pożywki hodowlanej. Poziomy ekspresji specyficznych czynników transkrypcyjnych i immunofluorescencji in vitro wykorzystuje się do oceny procesu różnicowania miogennego w warunkach kontrolnych i po wyciszeniu białek biorących udział w sygnalizacji Ca2+. Na koniec szczegółowo opisujemy zastosowanie Fura-2 jako ratiometrycznej sondy Ca2+, która zapewnia wiarygodne i powtarzalne pomiary SOCE.

Po enzymatycznej dysocjacji próbki ludzkiego mięśnia komórki namnożono w GM. Ludzkie mioblasty, zdefiniowane jako komórki CD56+/CD146+/CD45-/CD34-/CD144-, uzyskano za pomocą FACS. Mioblasty stanowiły ponad 60% analizowanej populacji (Rysunek 1). Pierwotne ludzkie mioblasty przesiano, wyhodowano do pełnego zrostu i inkubowano w DM przez 48 h. Po immunobarwieniu na ekspresję czynnika transkrypcyjnego MEF2 oraz białka specyficznego dla mięśni – ciężkiego łańcucha miozyny (MyHC) – zaobserwowano,...

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie czystej populacji ludzkich mioblastów z mięśnia szkieletowego osoby dorosłej. Komórki te są wykorzystywane w badaniach funkcjonalnych, takich jak ocena różnicowania miogennego oraz pomiar wejścia wapnia regulowanego przez zapasy (store-operated calcium entry). Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona szybką, prostą i powtarzalną izolację pierwotnych ludzkich mioblastów.Te mioblasty stanowią nowy model ex-vivo do badania sygnalizacji wapniowej podczas regeneracji mięśni. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad mięśniami, takie jak identyfikacja kanałów jonowych oraz czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w różnicowanie mięśni. Dzięki temu metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat funkcji genów podczas ludzkiego różnicowania miogennego.Można je również zastosować w innych badaniach, takich jak potencjał wykorzystania miogennych komórek macierzystych w leczeniu dystrofii mięśniowych. Przenieś próbkę mięśnia na sterylną płytkę sześciocentymetrową i przemyj próbkę dwukrotnie PBS. Usuń pozostałą tkankę tłuszczową i zważ próbkę.Następnie należy dodać trypsynę i posiekać mięsień na kawałki o wielkości mniejszej niż 2 mm. Po posiekaniu, za pomocą pipety 10 ml, przenieść tkankę do butelki do dysocjacji o pojemności 200 ml zawierającej mieszadło magnetyczne, a następnie kontynuować zbieranie posiekanej tkanki w roztworze trypsyny, aż butelka do dysocjacji zostanie wypełniona do objętości 90 ml. Teraz inkubować tkankę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 60 minut przy delikatnym mieszaniu.Po godzinie dodać 10 ml FCS, aby zatrzymać reakcję, a następnie zhomogenizować mieszaninę poprzez tryturację. Następnie nałożyć sita o oczkach 70 µm na dwie probówki o pojemności 50 ml i przepuścić połowę zawiesiny komórkowej przez każde z sit, pipetując zawiesinę do filtrów. W dalszej kolejności przygotować zawiesinę komórek w pożywce wzrostowej i wysiać 200 000 komórek na płytki o średnicy 6 cm w 4 ml pożywki.Inkubować płytki, wymieniając pożywkę co trzy dni. Po pięciu do siedmiu dniach komórki powinny osiągnąć 70% do 80% konfluencji, wówczas należy je zabarwić. W pierwszej kolejności wypłukać płytkę z konfluentnymi komórkami za pomocą PBS.Następnie należy dodać 1 ml roztworu trypsyny i pozostawić enzym na trzy minuty. Reakcję zatrzymuje się poprzez dodanie 2 ml pożywki, a komórki zbiera do probówki o pojemności 15 ml. Następnie komórki należy odwirować i ponownie zawiesić w 1 ml pożywki.Następnie, przechowując komórki w lodzie, wykonaj pomiar liczby komórek. Do analizy faktów przygotuj siedem probówek, do każdej z nich wprowadzając 100 000 komórek. Pozostałe komórki przenieś do ósmej probówki w celu sortowania.Przemyj komórki jednym mililitrem zimnego buforu fax, następnie odwiruj zawartość probówek, a nadsącz odessij i odrzuć. Dodaj 200 mikrolitrów buforu fax z odpowiednimi przeciwciałami i inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut. Po 30 minutach ponownie przemyj komórki i resuspenduj je w 500 mikrolitrach buforu fax, a następnie przeprowadź sortowanie komórek przy użyciu cytometru przepływowego.Po wykluczeniu CD45-dodatnich komórek krwiotwórczych, należy wyizolować komórki CD45-ujemne na podstawie ekspresji CD56. Następnie, w populacji CD56-dodatniej, należy wyznaczyć bramki dla CD34, CD144 i CD146. Część posortowanej populacji należy poddać ponownej analizie w celu sprawdzenia czystości.Następnie należy zebrać ludzkie mioblasty i przemyć je pięcioma mililitrami pożywki. Następnie resuspender je w jednym mililitrze pożywki. Zawiesinę przenieść na płytkę o średnicy 6 cm zawierającą cztery mililitry pożywki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 7% CO2.Przed przystąpieniem do procedury należy przygotować hodowlę mioblastów oraz świeżą pożywkę do transwekcji. Pożywkę należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut. W czasie inkubacji pożywki należy przygotować mioblasty.Najpierw opłucz je raz buforem PBS. Następnie poddaj przylegające komórki trypsynizacji. Zatrzymaj reakcję, dodając dwa mililitry pożywki.Następnie zebrać komórki do probówki o pojemności 50 ml. Odwirować je i ponownie zawiesić w 1 ml pożywki. Dla każdej transfekcji przygotować 500 000 komórek w 200 µl pożywki.Do każdych 500 µL medium do transwekcji należy dodać 200 µL aliquotę komórek, a następnie wymieszać zawartość, wykonując tylko dwa ruchy pipetą. Następnie pozostawić reakcje na pięć minut w temperaturze pokojowej. Po upływie pięciu minut przenieść reakcje do szalek hodowlanych o średnicy 3,5 cm, z których każda zawiera jedno szkiełko podstawowe.Następnie należy dodać 1,3 ml pożywki, aby uzyskać końcową objętość 2 ml, a następnie inkubować szalki. Po 48 godzinach różnicowania komórki można poddać immunostynowaniu lub analizie z wykorzystaniem obrazowania wapnia. W obu przypadkach należy najpierw ostrożnie dwukrotnie przemyć komórki, używając 1 ml PBS w temperaturze pokojowej do płukania.Należy starać się unikać odrywania miotub. W celu przeprowadzenia obrazowania wapnia, należy przykryć przemyte komórki roztworem fura-2 AM o stężeniu 2 µM oraz kwasem treonicznym o stężeniu 1 µM w medium zawierającym wapń. Następnie należy inkubować je przez około 30 minut przed wymieszaniem.Następnie komórki należy przemyć dwukrotnie medium zawierającym wapń w formie niemodyfikowanej, a potem inkubować przez 10 do 15 minut w celu przeprowadzenia estryfikacji. Teraz należy wyjąć szkiełko nakrywkowe z płytki hodowlanej i umieścić je w komorze eksperymentalnej. Należy napełnić komorę medium zawierającym wapń, umieścić ją pod mikroskopem, a następnie rozpocząć rejestrację danych.Fura-2 jest wzbudzany naprzemiennie przy 340 i 380 nanometrach. Światło emisji jest zbierane przy 510 nanometrach. Podzielenie obrazów przy 340 nanometrach przez obrazy przy 380 nanometrach pozwala uzyskać stosunki obrazów; ponieważ fluktuacje i stężenie wapnia są stosunkowo niskie, należy rejestrować jeden stosunek obrazów co dwie sekundy.Po dwóch lub trzech minutach należy zastąpić pożywkę pożywką wolną od wapnia. Następnie przez jedną lub dwie minuty monitoruje się aktywność wapnia uwalnianego z magazynów wewnątrzkomórkowych. W kolejnym kroku do komórek dodaje się thapsigargin w stężeniu 1 µM, aby opróżnić ich wewnętrzne magazyny wapnia.Odczekać od 8 do 10 minut, a następnie szybko zastąpić medium pożywką zawierającą wapń i rejestrować obraz przez pięć minut, podczas gdy wapń wnika do komórek poprzez kanały suc. Po zakończeniu eksperymentu przeanalizować obrazy. W celu zdefiniowania tła wybrać obszar pozbawiony komórek jako region pierwszy, a następnie wybrać obszar w cytoplazmie jako region drugi.Dwa obszary można wyznaczyć na dowolnym z obrazów w serii. Następnie należy przejść do karty uruchamiania eksperymentów, wybrać obrazy referencyjne dla kanałów 340 i 380, zaznaczyć obszar pierwszy, a następnie kliknąć „subtract background”. Teraz należy uruchomić cały eksperyment, aby usunąć tło ze wszystkich obrazów.Po zakończeniu kliknij opcję logowania danych, aby otworzyć arkusz kalkulacyjny, w którym zarejestrowane są dane dotyczące czasu i stosunku. Komórki mięśniowe zostały wyhodowane, namnożone i posortowane za pomocą fax. Mioblasty stanowiły ponad 60% analizowanej populacji.Pierwotne ludzkie mioblasty hodowano następnie w medium różnicującym i poddano immunobarwieniu na czynnik transkrypcyjny MEF2 oraz białka ciężkich łańcuchów miozyny. Większość komórek wykazywała ekspresję ciężkich łańcuchów miozyny i tworzyła miotuby z wartościami indeksu fuzji na poziomie około 60%; pozostałe 40% komórek pozostało nieróżnicującymi się komórkami jednojądrowymi, znanymi również jako komórki rezerwowe. Opisany eksperyment dotyczący wejścia wapnia sterowanego przez magazyny został pomyślnie przeprowadzony na zróżnicowanych komórkach.Przeprowadzenie tego samego eksperymentu na komórkach transfekowanych małymi interferującymi RNA, skierowanymi przeciwko kanałom przepuszczalnym dla wapnia z rodziny TRPC, wykazuje, że wyciszenie genów miało mierzalny wpływ na wapniowy wpływ zależny od zapasów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować ludzkie mioblasty z dorosłego mięśnia szkieletowego. Wykorzystujemy te komórki do badania kolejnych etapów różnicowania mięśni, a w szczególności dezaktywacji czynników transkrypcyjnych i kanałów wapniowych.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura zajmuje mniej niż trzy godziny. Jest to szybka, prosta i powtarzalna metoda pozwalająca na uzyskanie wydajnej hodowli ludzkich mioblastów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie dopuścić do osiągnięcia przez kultury mioblastów pełnej konfluencji, ponieważ może dojść do niepożądanej spontanicznej dyferencjacji.

isolation-human-myoblasts-assessment-myogenic-differentiation-store

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Komórki mięśniowe należą do najbardziej złożonych komórek eukariotycznych. Przedstawiamy protokół różnicowania in vitro wysoko dojrzałych włókien mięśniowych, który pozwala na manipulację genetyczną i wyraźne obrazowanie na wszystkich etapach rozwoju.

In vitro Różnicowanie dojrzałych włókien mięśniowych do obrazowania na żywo

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj metodę izolacji ludzkich mioblastów z tkanki mięśniowej i oceny różnicowania miogennego. Technika umożliwia pomiar sygnałów wapniowych kluczowych dla regeneracji mięśni.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Przeglądaj więcej filmów