Name: Lokalizacja genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy przez hybrydyzację RNA in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę hybrydyzacji RNA in situ do lokalizacji genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy. Technika z zastosowaniem sond znakowanych digoksigeniną i biotyną umożliwia wykrywanie genów o niskim poziomie ekspresji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez grant z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (No.31472037). Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach handlowych w tym artykule ma na celu wyłącznie dostarczenie konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji.

UWAGA: Aby ograniczyć degradację RNA, przygotuj roztwory używając wody destylowanej w mokro autoklawizowanej (o temperaturze 121 °C przez 60 min), a także materiałów z mokrego autoklawu.
1. Przygotowanie antysensownych i sond RNA ISH
<ol>
	<li>Amplifikacja i oczyszczanie genów docelowych
	<ol>
		<li>Najpierw wyprodukuj dwuniciowy fragment L. migratoria OR1 o długości 387 pz (LmigOR1, GenBank: JQ766965) z plazmidu zawierającego cDNA LmigOR1 o pełnej długości z polimerazą DNA Taq, która dodaje adeniny do obu końców fragmentów.
		<ol>
			<li>Użyć 100 μl końcowej objętości reakcyjnej, zawierającej 50 μl 2x mieszaniny reakcyjnej, po 4 μl starterów sensownych i antysensownych (Tabela 1), 1 μl matrycy plazmidowej i 41 μlH2Owolnego od RNaz. Stosować następujący protokół PCR: 94 °C przez 5 minut, a następnie 30 cykli po 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min, a następnie 72 °C przez 10 min.</li>
			<li>Powtórz te kroki, aby uzyskać dwuniciowy fragment LmigOR2 o masie 1 303 pz (GenBank: JQ766966) i dwuniciowy fragment LmigORco o długości 1 251 pz (GenBank: JN989549). Startery użyte w tych doświadczeniach przedstawiono w tabeli 1.</li>
			<li>Uruchom produkty PCR na 1,2% żelach agarozowych w 1x buforze Tris-acetate-EDTA i wizualizuj za pomocą barwienia bromkiem etydyny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ekstrahuj te produkty PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu.
		<ol>
			<li>Po elektroforezie należy wyciąć prążki DNA z żelu i umieścić plastry żelu w probówce o pojemności 1,5 ml. Następnie dodać 100 μl buforu wiążącego (Buffer PN) na 0,1 g plastra żelu. Wirować i inkubować w temperaturze 50 °C, aż plasterek żelu całkowicie się rozpuści.</li>
			<li>Wprowadzić kolumnę adsorpcyjną CA2 do probówki zbiorczej i dodać 500 μl buforu równoważącego (bufor BL). Poprawia to zdolność absorpcji i stabilność membrany krzemionkowej. Wirować przy 12 400 x g przez 1 min.</li>
			<li>Przenieść rozpuszczoną mieszaninę żelu do zespołu kolumny adsorpcyjnej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Następnie odwirować probówki o stężeniu 12 400 x g przez 1 min. Wyrzuć przepływ i ponownie włóż kolumnę adsorpcyjną do probówki zbiorczej.</li>
			<li>Dodać dwukrotnie 600 μl roztworu do przemywania (z dodatkiem etanolu, buforu PW). Wirować przy 12 400 x g przez 1 min. Odrzucić przepływ i ponownie włożyć kolumnę adsorpcyjną do probówki zbiorczej.</li>
			<li>Opróżnij probówkę zbiorczą i ponownie odwiruj zespół kolumny przy 12 400 x g przez 2 minuty, aby umożliwić odparowanie resztek etanolu.</li>
			<li>Ostrożnie przenieść kolumnę adsorpcyjną do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wysuszyć granulkę na powietrzu przez 5-10 minut i ponownie rozpuścić DNA w odpowiedniej objętości (np. 30 μl) wody wolnej od nukleaz.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Wirować przy 12 400 x g przez 2 minuty. Odrzucić kolumnę adsorpcyjną i przechowywać DNA w temperaturze 4 °C lub -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstruowanie rekombinowanych plazmidów
	<ol>
		<li>Indywidualnie podlicytować fragment LmigOR1 o długości 387 pz, fragment LmigOR2 o długości 1 303 pz i fragment LmigORco o długości 1 251 pz do wektora T, który zawiera promotory polimeraz RNA T7 (upstream) i SP6 (downstream) sąsiadujących z wstawionym DNA za pomocą ligazy DNA T4. Przygotować następujące 10 μl reakcji: 5 μl 2x buforu ligacyjnego, 1 μl wektora T, 3 μl (∼100 ng) DNA wstawionego genu i 1 μl ligazy DNA T4 i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 5 μl każdego rekombinowanego plazmidu zawierającego 387 pz fragment LmigOR1, 1,303 pz fragment LmigOR2 i 1,251 pz fragment LmigORco oddzielnie do 50 μl kompetentnych komórek Escherichia coli DH5α w sterylnych probówkach 1,5 mL.
		<ol>
			<li>Delikatnie wymieszać i umieścić probówki w lodzie na 30 minut, a następnie inkubować je przez 90 s w temperaturze 42 °C. Przenieść je z powrotem do lodu na 3 minuty.</li>
			<li>Do każdej probówki dodać 450 μl płynnej pożywki Luria-Bertani (LB) bez ampicyliny i inkubować je w wytrząsarce z prędkością 150 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu przywrócenia E. coli DH5α.</li>
			<li>Pobrać 100 μl podwielokrotności każdego transformantu i użyć ich do zaszczepienia płytek stałego substratu LB zawierających 50 μg/ml ampicyliny, 24 μg/ml izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i 40 μg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozydu (X-gal).</li>
			<li>Inkubować te płytki w inkubatorze ciągłym w temperaturze 37 °C przez 18 godzin. Przebadać docelowe rekombinowane plazmidy metodą przesiewową niebiesko-białą. Zsekwencjonuj docelowe rekombinowane plazmidy za pomocą sekwencjonowania Sangera i zidentyfikuj kierunki wstawiania trzech genów OR.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz endonukleazy restrykcyjne do linearyzacji rekombinowanych plazmidów
	<ol>
		<li>Używaj endonukleaz restrykcyjnych, które nie tylko trawią się w miejscu wielokrotnego klonowania wektora, ale także nie przecinają wstawionego DNA. W tym eksperymencie wszystkie 3 geny są wprowadzane do wektora T w kierunku odpowiadającym wektorowi.</li>
		<li>Użyj endonukleazy restrykcyjnej Nco I, aby zlinearyzować rekombinowane plazmidy zawierające fragment LmigOR1 o długości 387 pz, fragment LmigOR2 o długości 1,303 pz i fragment LmigORco o długości 1,251 pz w celu wytworzenia sond antysensownych. Użyj endonukleazy restrykcyjnej Spe I, aby wyprodukować sondy wykrywające. 
		UWAGA: Jeśli kierunek wstawiania odpowiada kierunkowi wektora, wówczas wybiera się unikalne miejsce restrykcyjne od końca T7 do linearyzacji rekombinowanego plazmidu, a polimeraza SP6 RNA jest używana do przygotowania sondy antysensownej. Do linearyzacji rekombinowanego plazmidu wybiera się unikalne miejsce restrykcyjne od końca SP6, a polimerazę RNA T7 wykorzystuje się do przygotowania sondy czujnikowej. W przeciwnym razie, jeśli kierunek wstawiania nie odpowiada kierunkowi wektora, wówczas wybiera się unikalne miejsce restrykcyjne od końca SP6 do linearyzacji rekombinowanego plazmidu, a polimeraza RNA T7 jest używana do przygotowania sondy antysensownej. Unikalne miejsce restrykcyjne od końca T7 jest wybierane do linearyzacji rekombinowanego plazmidu, a polimeraza RNA SP6 jest używana do przygotowania sondy wykrywającej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie linearyzowanych rekombinowanych plazmidów
	<ol>
		<li>Trawić 20 μg każdego z trzech rekombinowanych plazmidów zawierających 387 pz fragment LmigLUB1, 1,303 pz fragment LmigOR2 i 1,251 pz fragment LmigORco przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej Nco I w 100 μl reakcji, która zawiera 10 μl 10x buforu, 40 μl 0,5 μg/μL plazmidu, 3 μl Nco I i 47 μl H2O wolnego od RNaz, a następnie 3 godziny inkubacji w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Podobnie, trawić 20 μg każdego z tych trzech rekombinowanych plazmidów za pomocą endonukleazy restrykcyjnej Spe I.</li>
		<li>Oczyścić te strawione plazmidy za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, jak opisano w ppkt 1.1.2. Określić stężenia tych ekstrahowanych, zlinearyzowanych rekombinowanych plazmidów za pomocą spektrofotometrii i dostosować do 0,5 μg/μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj sondy antysensowne i czujnikowe
	<ol>
		<li>Użyj systemu transkrypcji RNA T7/SP6 do generowania sond antysensownych i zmysłowych. Polimeraza RNA SP6 służy do transkrypcji dwuniciowego RNA dla znakowanych DIG i biotyną sond antysensownych dla tych trzech genów OR przy użyciu linearyzowanych rekombinowanych plazmidów jako matryc in vitro. Polimeraza RNA T7 jest używana do produkcji sond pomiarowych. Przeprowadzić reakcję w 20 μL końcowej objętości, zawierającej 2 μL 10x mieszaniny NTP, 2 μL 10-krotnego buforu transkrypcyjnego, 1 μL inhibitora RNazy, 2 μL polimerazy RNA T7 lub SP6, 4 μL 0,5 μg/μL zlinearyzowanego plazmidu i 9 μLH2Owolnego od RNaz, następnie 3 godziny inkubacji w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Inkubować sondy antysensowne i wykrywające znakowane DIG i biotyną przez 30 minut z 1 μl DNazy w temperaturze 37 °C. Dodać 2,5 μl 5 M LiCl i 75 μl absolutnego etanolu, a następnie inkubować reakcje przez 30 minut w temperaturze -70 °C.</li>
		<li>Wirować przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant. Dodaj 150 μl 70% etanolu, aby przepłukać środek strącający. Przygotuj 70% etanol (1 l), dodając 95% etanolu (736,8 ml) do sterylnej wody destylowanej (263,2 ml).</li>
		<li>Ponownie odwirować przy 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i wysuszyć osad na powietrzu przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 25 μl H2O wolnego od RNaz, aby rozpuścić antysensowne sondy RNA i czujnikowe.</li>
		<li>Jeśli długość wstawionego genu jest dłuższa niż 1 kb, następnie fragmentuj antysens RNA i sonduj wyczuwanie do średniej długości ~ 300 pz przez inkubację w roztworach buforowych wodorowęglanowo-węglanowych. Przeprowadzić reakcję w końcowej objętości 50 μl, zawierającej 25 μl sondy RNA i 25 μl roztworu buforowego wodorowęglanowo-węglanowego (80 mM NaHCO3, 120 mM Na2CO3, pH 10,2) w temperaturze 60 °C. Wymagany czas hydrolizy jest określony przez wcześniej opublikowany wzór17.</li>
		<li>Dodać 5 μl 10% kwasu octowego, aby zatrzymać reakcję. W tym eksperymencie należy rozdrobnić sondy antysensowne i sensowne LmigOR2 i LmigORco odpowiednio przez 24 i 23 minut. 
		t = (Lo-L f)/kXLoXLf 
		Lo = początkowe długości fragmentów w kb 
		Lf = końcowa długość fragmentu w kb 
		k = stała szybkości hydrolizy, około 0,11 KB-1 min-1 
		t = czas hydrolizy w min</li>
		<li>Na koniec dodać 250 μl buforu hybrydyzacyjnego i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie sekcji kriostatu
<ol>
	<li>Schłodzić mikrotom do zamrażania do temperatury -24 °C.</li>
	<li>Wybierz nowe dorosłe szarańcze, które linieją i mają nienaruszone czułki. Pokrój anteny na kawałki 2-3 mm za pomocą sterylnych maszynek do golenia.</li>
	<li>Umieść związek O.C.T. na uchwycie mikrotomu do zamrażania i umieść jedną lub dwie próbki na związku poziomo. Następnie przenieść posiadacza do mikrotomu zamrażającego w temperaturze -24 °C, aby zrównoważyć stan mieszanki aż do zamarznięcia. Wyjmij uchwyt i przykryj próbki niewielką ilością związku. Ponownie przenieść uchwyt do mikrotomu zamrażającego w temperaturze -24 °C na co najmniej 10 minut (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1). 
	UWAGA: Unikaj dostania się pęcherzyków do związku.</li>
	<li>Zamocować uchwyt z próbkami w mikrotomie do zamrażania, a następnie podzielić zamrożone próbki na plastry o grubości 12 μm w temperaturze -24 °C.</li>
	<li>Rozmrozić, ułożyć plastry jeden po drugim na szkiełkach podstawowych (25 x 75 mm; bez nukleaz) i wysuszyć na powietrzu przez 10 minut.</li>
</ol>
3. Mocowanie sekcji
<ol>
	<li>Po przygotowaniu skrawków kriostatu umieścić szkiełka w plastikowym pojemniku (~100 x 40 x 80 mm) i utrwalić tkanki, inkubując szkiełka w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Myć szkiełka w 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 1 minutę.</li>
	<li>Aby wyeliminować białka alkaliczne, przenieś szkiełka do 0,2 M HCl na 10 minut.</li>
	<li>Aby wyeliminować białko powierzchniowe kwasu nukleinowego, przenieś szkiełka do 1XPBS z 1% Triton X-100 na 2 minuty.</li>
	<li>Umyj szkiełka dwukrotnie przez 30 s w 1x PBS.</li>
	<li>Na koniec płukać szkiełka w roztworze formamidu przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja
<ol>
	<li>Przygotuj sondy antysensowne i czujnikowe
	<ol>
		<li>Użyj buforu hybrydyzacyjnego do rozcieńczenia antysensu RNA lub sond wykrywających w 1,5 ml probówkach bez nukleazy. W tym eksperymencie, dla wszystkich sond antysensownych i sensownych (LmigOR1, LmigOR2 i LmigOrco), dodaj 1 μl sondy do 99 μl buforu hybrydyzacyjnego na szkiełko. Ogólnie rzecz biorąc, użycie rozcieńczeń sond antysensownych w stosunku 1:100 powoduje uzyskanie znaczących sygnałów dodatnich i niskiego tła przy użyciu tego protokołu.</li>
		<li>W celu detekcji chromogennej należy rozcieńczać sondy z oznaczeniem DIG pojedynczo.</li>
		<li>W celu wykrycia TSA rozcieńczyć LmigOR1 znakowany DIG za pomocą sond LmigOrco znakowanych biotyną lub LmigOR2 znakowany DIG sondami LmigOR1 znakowanymi biotyną razem w buforze hybrydyzacyjnym</li>.
		<li>Podgrzewać rozcieńczenia przez 10 minut w temperaturze 65 °C i umieszczać je na lodzie na co najmniej 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>krzyżowanie
	<ol>
		<li>Opróżnić szkiełka i dodać 100 μl rozcieńczonych sond antysensownych i czujnikowych (krok 4.1) do skrawków tkanki. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe (24 mm x 50 mm; bez nukleazy) na skrawkach tkanki.</li>
		<li>Umieść zakryte szkiełka poziomo w wilgotnym pudełku (∼300 x 180 x 50 mm3; <silna klasa="xfig">Rysunek 2) i inkubować w temperaturze 55 °C przez 22 godziny. Dodaj roztwór formamidu lub 1X PBS na dno pudełka, aby utrzymać wilgotne środowisko, ale nie zanurzaj szkiełek w płynie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie i blokowanie.
	<ol>
		<li>Po hybrydyzacji ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe. Umyć szkiełka dwukrotnie przez 30 minut w 0,1x sól fizjologiczna z cytrynianu sodu (SSC) w temperaturze 60 °C. 
		UWAGA: Mycie polega na umieszczeniu szkiełek w uchwycie na szkiełka, który następnie umieszcza się w plastikowym pojemniku i delikatnie miesza na bujaku (~50 obr./min; <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Płucz szkiełka w 1x soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS) przez 30 s.</li>
		<li>Dodać 1 ml 1% odczynnika blokującego do TBS uzupełnionego 0,03% Triton X-100 na każde szkiełko i inkubować przez 30 minut. Następnie wyrzuć roztwór blokujący.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemia.
	<ol>
		<li>Do wykrywania chromogennego należy użyć odczynnika blokującego w TBS, aby rozcieńczyć 750 jednostek (U)/ml przeciwciała sprzężonego z anty-digoksygeniną AP do 1,5 U/ml roztworu AP. Dodać 100 μl roztworu AP na zakryte szkiełko (24 mm x 50 mm).</li>
		<li>Do wykrywania TSA należy użyć odczynnika blokującego w TBS, aby rozcieńczyć 750 U/ml przeciwciała sprzężonego z anty-digoksygeniną AP- i przeciwciała sprzężonego z anty-biotyną streptawidyną HRP do roztworu AP/HRP. Dodać 100 μl roztworu AP/HRP na zakryte szkiełko (24 mm x 50 mm).</li>
		<li>Inkubować szkiełka w wilgotnym pudełku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2) przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Użyj roztworu formamidu lub 1X PBS, aby pudełko było wilgotne, ale nie rozmoczone.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Barwienie
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe. Umyj szkiełka trzy razy przez 5 minut w 1x TBS uzupełnionym 0,05% Tween-20. Przepłukać szkiełka w buforze DAP (wykrywanie chromogenne: pH 9,5; Wykrywanie TSA: pH 8,0) przez 5 min.</li>
	<li>Barwienie (detekcja chromogenna)
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl roztworu substratu NBT (375 μg/ml)/BCIP (188 μg/ml) (rozcieńczonego w DAP; pH 9,5) do każdego szkiełka. Ostrożnie umieść szkiełka nakrywkowe (24 x 50 mm) na szkiełkach.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w wilgotnym pojemniku z roztworem substratu przez 10 minut - O/N w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Sprawdź rozwój, patrząc od czasu do czasu na szkiełka pod mikroskopem.</li>
		<li>Gdy rozwój jest gotowy, zatrzymaj reakcję, przenosząc szkiełka do wody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie (wykrywanie TSA)
	<ol>
		<li>Za pomocą strzykawki przesunąć substrat HNPP (100 μg/ml)/Fast Red (250 μg/ml) z filtra strzykawkowego (0,22 μm; <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Dodać 100 μl podłoża HNPP/Fast Red na szkiełko pokryte szkiełkiem nakrywkowym (24 x 50 mm). Inkubować szkiełka przez 30 minut z podłożem HNPP/Fast Red w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe i umyj je trzy razy przez 5 minut w 1X TBS uzupełnionym 0,05% Tween-20.</li>
		<li>Użyj 100 μl podłoża TSA/szkiełka przykrytego (24 x 50 mm2). Inkubować szkiełka z substratem TSA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe i umyj je trzy razy przez 5 minut w 1x TBS uzupełnionym 0,05% Tween-20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadź szkiełka w PBS/glicerolu (1:3). 
	UWAGA: Po zakończeniu tych procedur należy jak najszybciej obserwować szkiełka, ponieważ sygnał fluorescencyjny szybko wygaśnie.</li>
</ol>
6. Obserwacja
<ol>
	<li>Detekcja chromogenna
	<ol>
		<li>Obserwuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopu optycznego. Wybierz soczewki obiektywowe 10X, 20X i 40X, aby obserwować wyniki detekcji chromogenicznej.</li>
		<li>Użyj oprogramowania DP-BSW, aby przeanalizować wyniki i uchwycić obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja TSA
	<ol>
		<li>Obserwuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopu konfokalnego. Geny znakowane DIG powinny być obserwowane w świetle o długości fali 543 nm, o barwie czerwonej, a geny znakowane biotyną powinny być obserwowane w świetle o długości fali 488 nm, o zielonym kolorze. Kiedy się pojawiają, mają żółty kolor.</li>
		<li>Wybierz soczewki obiektywowe 20X i 40X, aby obserwować wyniki detekcji TSA.</li>
		<li>Użyj oprogramowania FV1000, aby przeanalizować wyniki i uchwycić obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+olfactory+receptors+are+heteromeric+ligand-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels.</a> Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).</li>
<li>Smart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+odorant+receptors+are+novel+seven+transmembrane+domain+proteins+that+can+signal+independently+of+heterotrimeric+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).</li>
<li>Wicher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+odorant+receptors+are+both+ligand-gated+and+cyclic-nucleotide-activated+cation+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels.</a> Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).</li>
<li>Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+reception+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li>
<li>Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+odor+coding+in+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).</li>
<li>Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+ecology+of+locusts+and+related+acridids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Chemical ecology of locusts and related acridids.</a> Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).</li>
<li>Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00267823">A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes.</a> Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).</li>
<li>Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96 (5), 725-736 (1999).</li>
<li>Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+co-receptor+Orco+from+the+migratory+locust+%28Locusta+migratoria%29+and+the+desert+locust+%28Schistocerca+gregaria%29%3A+identification+and+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern.</a> Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).</li>
<li>Schultze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+co-expression+pattern+of+odorant+binding+proteins+and+olfactory+receptors+identify+distinct+trichoid+sensilla+on+the+antenna+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS One. 8 (7), e69412(2013).</li>
<li>Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+two+novel+odorant+receptors+in+the+locust+%28Locusta+migratoria%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria).</a> BMC Neurosci. 14, 50(2013).</li>
<li>Saina, M., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+olfactory+receptor+expression+and+localization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).</li>
<li>Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+receptors+are+expressed+in+olfactory+sensory+neurons+of+coeloconic+sensilla+on+the+antenna+of+the+desert+locust+%28Schistocerca+gregaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria).</a> Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).</li>
<li>You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+tuned+odorant+receptor+in+neurons+of+trichoid+sensilla+in+locust%2C+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria.</a> Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).</li>
<li>Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+two+%22Sensory+Neuron+Membrane+Proteins%22+%28SNMPs%29+of+the+desert+locust%2C+Schistocerca+gregaria+%28Orthoptera%3A+Acrididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae).</a> J Insect Sci. 16 (1), 33(2016).</li>
<li>Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAngerer%2C+LM+%22In+situ+hybridization%22">In situ hybridization</a>. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2(1992).</li>
<li>Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+35S-+and+digoxigenin-labeled+RNA+and+oligonucleotide+probes+for+in+situ+hybridization.+Expression+of+mRNA+of+the+seminal+vesicle+secretion+protein+II+and+androgen+receptor+genes+in+the+rat+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li>
<li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose%3A+Bio-blots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li>
<li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li>
<li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają żadnych innych konfliktów interesów.

Trudno jest wykonać RNA ISH w celu zlokalizowania genów OR w czułkach owadów, ponieważ poziomy ekspresji genów OR, z wyjątkiem ORco, są bardzo niskie, a zachowanie histologicznych wycinków czułków owadów jest bardzo trudne. Ponadto wykrywanie TSA jest również bardzo trudne. Aby rozwiązać te problemy, należy podjąć następujące środki. Czułki są wybierane spośród nowo liniejących dorosłych szarańczy, które mają cienkie i miękkie skórki czułkowe, które zachowują swoją morfologię na szkiełku. Zamrożone próbki dzieli...

Czułki owadów, które są najważniejszymi narządami chemosensorycznymi, pokryte są wieloma strukturami przypominającymi włosy - zwanymi sensilla - które są unerwione przez neurony receptorów węchowych (ORN). Na błonie ORN owadów, receptory zapachowe (OR), rodzaj białka zawierającego siedem domen transbłonowych, są wyrażane przez koreceptor (ORco), tworząc heteromer, który działa jako kanał jonowy bramkowany nawaniaczem1,2,3. Różne sale operacyjne reagują na różne kombinacje związków chemicznych4,5,6.
Szarańcza (Locusta migratoria) głównie polega na sygnałach węchowych, aby wywołać ważne zachowania7. Sale operacyjne szarańczy są kluczowymi czynnikami dla zrozumienia molekularnych mechanizmów węchowych. Lokalizacja specyficznego genu OR szarańczy w neuronie morfologicznie specyficznego typu sensillum przez hybrydyzację RNA In Situ (RNA ISH) jest pierwszym krokiem w badaniu funkcji OR.
RNA ISH używa znakowanej komplementarnej sondy RNA do pomiaru i lokalizacji określonej sekwencji RNA w przekroju tkanki, komórek lub całych wierzchowców in situ, dostarczając wglądu w procesy fizjologiczne i patogenezę chorób. Sondy RNA znakowane digoksygeniną (znakowane DIG) i biotyną są szeroko stosowane w hybrydyzacji RNA. Znakowanie RNA digoksygeniną-11-UTP lub biotyną-16-UTP można przygotować przez transkrypcję in vitro z polimerazami SP6 i T7 RNA. Sondy RNA znakowane DIG i biotyną mają następujące zalety: są nieradioaktywne; bezpieczny; stajnia; bardzo wrażliwy; bardzo specyficzny; i łatwe do wyprodukowania przy użyciu PCR i transkrypcji in vitro. Sondy RNA znakowane DIG i biotyną mogą być wykrywane chromatogennie i fluorescencyjnie. Sondy RNA znakowane DIG można wykryć za pomocą przeciwciał sprzężonych z fosfatazą alkaliczną anty-digoksygeniną (AP), które można uwidocznić za pomocą bardzo czułych substratów chemiluminescencyjnych: soli toluidynowej chlorku tetrazolu nitroniebieskiego tetrazolu chlorku / 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu toluidyny (NBT / BCIP) za pomocą mikroskopu optycznego lub fosforanu 2-hydroksy-3-naftoinowego-2'-fenylanilidu (HNPP) sprzężonego z solą chlorku hemi-4-chloro-2-metylobenzenodiazonium (Fast Red) za pomocą mikroskopu konfokalnego. Sondy RNA znakowane biotyną można wykryć za pomocą przeciwciał sprzężonych z peroksydazą chrzanu (HRP) przeciwko streptatynie, które można uwidocznić za pomocą fluoresceiny-tyramidu za pomocą mikroskopu konfokalnego. W ten sposób dwukolorową fluorescencyjną hybrydyzację in situ można przeprowadzić w celu wykrycia dwóch docelowych genów w jednym wycinku za pomocą sond RNA znakowanych DIG i biotyną.
RNA ISH z sondami znakowanymi DIG i/lub biotyną został z powodzeniem wykorzystany do lokalizacji genów związanych z węchem, takich jak OR, receptor jonotropowy, białko wiążące zapachy i białko błony neuronu czuciowego, w czułkach owadów, ale nie wyłącznie, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, L. migratoria i szarańczy pustynnej Schistocera gregaria8,9,10,11,12,13,14,15,16. Istnieją jednak dwa zasadnicze wyzwania związane z wykonywaniem RNA ISH dla OR owadów: (1) geny OR (z wyjątkiem ORco) ulegają ekspresji na niskich poziomach i tylko w kilku komórkach, co bardzo utrudnia wykrycie sygnału, oraz (2) zachowanie tkanki owada do histologii, tak aby morfologia była zachowana, a szum tła niski, może być wyzwaniem. W artykule przedstawiono szczegółowy i skuteczny protokół opisujący RNA ISH do lokalizacji genów OR w czułkach owadów, obejmujący detekcję zarówno chromogenną, jak i tyramidową amplifikację sygnału (TSA).

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&razy; TSINGKETM Master Mix</td><td>TSINGKE, Chiny</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>Bez RNaz H2O</td><td>TIANGEN, Chiny</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>REGULAR AGAROSE G-10</td><td>BIOWEST, HISZPANIA</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wiążący</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, Chiny</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Bufor balansujący</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, Chiny</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do mycia</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, Chiny</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T Vector</td><td>Promega, USA</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>Promega, USA</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>TIANGEN, Chiny</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma, USA</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd</td><td>Inalco, USA</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galaktopiranozyd</td><td>SBS Genetech, Chiny</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>Nco I</td><td>BioLabs, Nowa Anglia</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>BioLabs, Nowa Anglia</td> Zestaw do znakowania <td>RNA R0133M</td><td></td></tr><tr><td>RNA</td><td>Roche, Szwajcaria</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania RNA biotyny</td><td>Roche, Szwajcaria</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania RNA DNase DIG, Roche, Szwajcaria</td><td>11175025910</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, Chiny</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Holandia</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, Chiny</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, Stany Zjednoczone</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, Stany Zjednoczone</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium chlorek / 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforan toluidyny</td><td>sól Roche, Szwajcaria</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&razy; Tris-octan-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>0,04 mol/L Tris-Base</td></tr><tr><td>1 razy; Tris-acetate-EDTA</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, Chiny</td><td>10000292</td><td>0,12% kwasu octowego</td></tr><tr><td>1 razy; Tris-octan-EDTA</td><td>Sigma, Stany Zjednoczone</td><td>03677</td><td>Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)</td></tr><tr><td>Płynne podłoże Luria-Bertani (LB)</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) płynne podłoże</td><td>MERCK, Niemcy</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Pepton z kazeiny (Trypton)</td></tr><tr><td>Płynne podłoże Luria-Bertani (LB)</td><td>MERCK, Niemcy</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Ekstrakt drożdżowy</td></tr><tr><td>Płyta z twardym podłożem LB</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>LB płyta z podłożem stałym</td><td>MERCK, Niemcy</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Pepton z kazeiny (tryptonu)</td></tr><tr><td>LB płyta z podłożem stałym</td><td>MERCK, Niemcy</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Ekstrakt drożdżowy</td></tr><tr><td>Płytka z podłożem stałym LB</td><td>ŻUBR ING, Kanada</td><td>800-010-CG</td><td>15 g/L Agar klasy bakteriologicznej</td></tr><tr><td>10 i razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,1)</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10019392</td><td>8,5% NaCl</td></tr><tr><td>10 razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900041-500G</td><td>14 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>10&razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900268-500G</td><td>80 mM Na2HPO4</td></tr><tr><td>10&razy; Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS, pH 7,5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>1 M Tris-Base</td></tr><tr><td>10&razy; Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS, pH 7,5)</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10019392</td><td>1,5 M</td></tr><tr><td>bufor do wykrywania NaCl (DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; detekcja chromogenna pH 9,5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Detekcja TSA pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Bufor detekcyjny Tris-Base (DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; detekcja chromogenna pH 9,5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Detekcja TSA pH 8,0</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10019392</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Bufor detekcyjny NaCl (DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; detekcja chromogenna pH 9,5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Detekcja TSA pH 8,0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl2&middot; 6H2O</td></tr><tr><td>20 razy; cytrynian soli i sodu (pH 7,0)</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10019392</td><td>3 M NaCl</td></tr><tr><td>20 razy; sól fizjologiczno-sodowa cytrynian (pH 7,0)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900095-500G</td><td>0,3 M Na-cytrynian</td></tr><tr><td>4% roztwór paraformaldehydu (PFA, pH 9,5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900894-100G</td><td>4% paraformaldehyd</td></tr><tr><td>Bufor węglanu sodu</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>0,1 M NaHCO3</td></tr><tr><td>Bufor węglanu sodu (pH 10,2)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO3</ bufor</td></tr> <tr><td>węglanu sodu sub> (pH 10,2)</td><td>Sigma, USA</td><td>S7795-500G</td><td>120 mM Na2CO3</td></tr><tr><td>Roztwór formamidu (pH 10,2)</td><td>MPBIO, USA</td><td></td><td>FORMD002 50% Dejonizowany roztwór formamidu formamidu</td></tr><tr><td>(pH 10,2)</td><td></td><td></td><td>5&razy; Bufor blokujący cytrynian soli soli</td></tr><tr><td>w TBS</td><td>Roche, Szwajcaria</td><td>11175041910</td><td>1%</td></tr><tr><td>Bufor blokujący blot w TBS</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0694-500ML</td><td>0,03% Bufor blokujący Triton X-100</td></tr><tr><td>w TBS</td><td></td><td></td><td>1 razy; Buforowany roztworem</td></tr><tr><td>fosfatazy alkalicznej</td> Tris <td>Roche, Szwajcaria</td><td>11175041910</td><td>1,5 U/ml przeciwciało sprzężone z fosfatazą alkaliczną anty-digoksygeniny</td></tr><tr><td></td><td>Bufor blokujący w TBS</td>Fosfataza alkaliczna / roztwór peroksydazy chrzanowej Roche, Szwajcaria 11175041910 1,5 U/ml sprzężona fosfataza alkaliczna anty-digoksygeniny <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> przeciwciało</td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna / roztwór peroksydazy chrzanowej</td><td>Zestaw TSA, Perkin Elmer, USA</td><td></td><td>NEL701A001KT 1% przeciwciało sprzężone z peroksydazą chrzanową antybiotyną streptawidyny - przeciwciało sprzężone</td></tr> z <tr><td>fosfatazą alkaliczną / roztworem</td><td></td><td></td> peroksydazy chrzanu <td>Bufor blokujący w</td></tr><tr><td>buforze hybrydyzacyjnym</td><td>TBS MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% dejonizowana</td></tr><tr><td>hybrydyzacja formamidu Bufor</td><td></td><td></td><td>2 razy; Bufor hybrydyzacyjny solowo-sodowy cytrynian</td></tr><tr><td></td><td>sodu Sigma, USA</td><td>D8906-50G</td><td>10% siarczan dekstranu</td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny</td><td>invitrogen, USA</td><td>AM7119</td><td>20 i mikro; g / ml drożdży t-RNA</td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny</td><td>Sigma, USA</td><td>D3159-10G</td><td>0,2 mg / ml DNA plemników śledzia</td></tr><tr><td>Fosforan 2-hydroksy-3-naftoinowy-2'-fenylanilidu / 4-chloro-2-metylobenzenodiazonium substrat soli hemi-chlorku</td><td>Roche, Szwajcaria</td><td>11758888001</td><td>1% fosforan kwasu 2-hydroksy-3-naftoinowego-2'-fenylanilidu (10 mg / ml)</td></tr><tr><td>Fosforan kwasu 2-hydroksy-3-naftoinowego-2'-fenylanilidu / substrat soli chlorku hemi-4-chloro-2-metylobenzenodiazonium</td><td>Roche, Szwajcaria</td><td>11758888001</td><td>1% sól hemi chlorku 4-chloro-2-metylobenzenodiazonium (25 mg / ml)</td></tr> <tr><td>kwasu 2-hydroksy-3-naftoinowego-fosforan 2'-fenylanilidu / substrat soli hemi chlorku 4-chloro-2-metylobenzenodiazonium</td><td>Bufor detekcji</td>Sygnał tyramidowy <td></td><td></td></tr><tr><td> substrat wzmacniający</td><td>Zestaw TSA, Perkin Elmer, USA</td><td></td><td>NEL701A001KT 2% fluoresceiny-tyramidy</td></tr><tr><td>Podłoże do wzmacniania sygnału Tyramid</td><td>Zestaw TSA, Perkin Elmer, USA</td><td></td><td>NEL701A001KT Rozcieńczalnik do amplifikacji</td></tr> <tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamrażanie mikrotom</td><td>Leica, Nussloch, Niemcy</td><td>Jung CM300 krioskop</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Olympus, Tokio, Japonia</td><td>Mikroskop Olympus IX71</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus, Tokio, Japonia</td><td>Olympus BX45 mikroskop</td><td></td> konfokalny</tr></tbody></table>

lokalizacja genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy przez hybrydyzację rna in situ

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Owady rozwinęły wyrafinowane systemy odbioru węchu, aby wykrywać egzogenne sygnały chemiczne. Te sygnały chemiczne są przekazywane przez neurony receptorów węchowych (ORN) umieszczone w strukturach przypominających włosy, zwanych chemosensillami, anten. Uważa się, że receptory zapachowe (OR) są zaangażowane w kodowanie zapachów na błonach ORN. W związku z tym zdolność do identyfikacji genów zlokalizowanych w ORN jest niezbędna do rozpoznania genów OR i stanowi fundamentalną podstawę do dalszych funkcjonalnych badań in situ. Poziomy ekspresji RNA specyficznych ORw czułkach owadów są bardzo niskie, a zachowanie tkanki owada do badań histologicznych jest wyzwaniem. W związku z tym trudno jest zlokalizować OR do określonego typu sensilli za pomocą hybrydyzacji RNA in situ. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy i wysoce skuteczny protokół hybrydyzacji RNA in situ, szczególnie w przypadku genów OR owadów o niskiej ekspresji. Ponadto zidentyfikowano specyficzny gen OR poprzez przeprowadzenie eksperymentów hybrydyzacji in situ z dwukolorową fluorescencyjną metodą przy użyciu genu receptora o koekspresji, Orco, jako markera.

W przypadku wykrywania chromogenicznego niewielki podzbiór komórek czułkowych w każdym przekroju czułka dorosłego osobnika został oznaczony sondami antysensownymi doznanymi DIG skierowanymi przeciwko LmigOR1 i LmigOR2 (Rycina 3). Badanie lokalizacji LmigOR1 i LmigOR2 metodą RNA ISH na kolejnych przekrojach wykazało, że komórki czułkowe eksprymujące te dwa geny znajdowały się w skupiskach neuronów receptorycznych (ORN) ekspr...

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół hybrydyzacji RNA in situ, szczególnie dla niskopoziomowych genów receptora zapachowego (OR), jak również innych genów, w czułkach owadów za pomocą sond znakowanych digoksygeniną (DIG) lub biotyną.

Lokalizacja genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy przez hybrydyzację RNA in situ

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Ogólnym celem tej procedury jest zlokalizowanie genów receptora zapachowego o niskiej ekspresji, a także innych genów w czułkach owadów za pomocą sond znakowanych digoksygeniną lub biotyną. Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz nowe liniejące dorosłe szarańcze, które są aktywne i mają nienaruszone czułki, a następnie pokrój czułki na dwa do trzech milimetrowych kawałków za pomocą sterylnych maszynek do golenia. Następnie nałóż związek OCT na uchwyt mikrotomu do zamrażania i umieść próbki na związku poziomo.Przenieść posiadacza do mikrotomu zamrażającego w temperaturze minus 24 stopni Celsjusza, aby zrównoważyć aż do zamarznięcia związku. Następnie wyjmij uchwyt i przykryj próbki niewielką ilością związku. Ponownie przenieść uchwyt do mikrotomu zamrażającego w temperaturze minus 24 stopni Celsjusza na co najmniej 10 minut, a następnie podzielić zamrożone próbki na plastry o grubości 12 mikrometrów.Następnie rozmrozić plastry jeden po drugim na szkiełkach i wysuszyć je na powietrzu przez 10 minut. Po przygotowaniu skrawków kriostatu umieść szkiełka w plastikowym pojemniku i utrwal tkanki, inkubując szkiełka w 4% roztworze PFA przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 30 minutach myj szkiełka w jednym X PBS przez jedną minutę.Aby wyeliminować białka alkaliczne, przenieś szkiełka do 0,2 molowego chlorowodoru na 10 minut, a następnie przenieś szkiełka do jednego X PBS z 1% Triton X-100 na dwie minuty, aby wyeliminować białko powierzchniowe kwasu nukleinowego. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie przez 30 sekund w jednym X PBS. Następnie płukać szkiełka w roztworze formamidu przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Opróżnij szkiełka i dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonych sond antysensownych i czujnikowych, a następnie umieść szkiełka nakrywkowe na skrawkach tkanki. Następnie dodaj roztwór formamidu lub jeden X PBS na dno pudełka, aby utrzymać wilgotne środowisko, ale nie zanurzaj szkiełek w płynie. Następnie umieść przykryte szkiełka poziomo w wilgotnym pudełku i inkubuj w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 22 godziny.Po hybrydyzacji ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe. Umyj boki dwukrotnie, delikatnie mieszając je na bujaku przez 30 minut w 0,1 X SSC w temperaturze 60 stopni Celsjusza, a następnie płucz szkiełka w jednym X TBS przez 30 sekund. Dodać jeden mililitr 1% odczynnika blokującego w TBS uzupełnionego 0,03%Tritin X-100 na każde szkiełko i inkubować przez 30 minut.Następnie wyrzuć roztwór blokujący. Do wykrywania chromogennego należy użyć odczynnika blokującego w TBS, aby rozcieńczyć 750 jednostek na mililitr sprzężonego przeciwciała anty-digoksygeniny-AP do 1,5 jednostki na mililitr roztworu AP. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu AP do każdego zakrytego szkiełka.W celu wykrycia TSA należy użyć odczynnika blokującego w TBS, aby rozcieńczyć 750 jednostek na mililitr przeciwciała sprzężonego anty-digoksygenina-AP i przeciwciała sprzężonego z anty-biotyną streptawidyny HRP do roztworu AP HRP, a następnie dodać 100 mikrolitrów roztworu AP HRP do każdego zakrytego szkiełka. Dodaj roztwór formamidu lub jeden X PBS, aby pudełko było wilgotne, ale nie rozmoczone. Następnie inkubuj szkiełka w wilgotnym pudełku przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w jednym X TBS uzupełnionym 0,05%TWEEN 20 na bujaku. Następnie płucz szkiełka w buforze DAP przez pięć minut, delikatnie mieszając plastikowy pojemnik na bujaku. W celu wykrycia chromogennego dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu NBT/BCIP do każdego szkiełka.Ostrożnie umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach, a następnie inkubuj szkiełka w wilgotnym pudełku z roztworem substratu przez 10 minut do nocy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sprawdź rozwój, patrząc od czasu do czasu na szkiełka pod mikroskopem. Gdy rozwój jest gotowy, zatrzymaj reakcję, przenosząc szkiełka do wody.W celu wykrycia TSA użyj strzykawki, aby przesunąć substrat HNPP/Fast Red z filtra strzykawkowego, a następnie dodaj 100 mikrolitrów substratu HNPP/Fast Red do każdego szkiełka pokrytego szkiełkiem nakrywkowym. Następnie inkubować szkiełka przez 30 minut z podłożem HNPP/Fast Red w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach ostrożnie zdejmij szkiełka nakrywkowe i umyj je trzy razy przez pięć minut w jednym X TBS uzupełnionym 0,05%TWEEN 20.Inkubować szkiełka z 100 mikrolitrami substratu TSA na przykryte szkiełko przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe i umyj je trzy razy przez pięć minut w jednym X TBS uzupełnionym 0,05%TWEEN 20 przed zatopieniem szkiełek w glicerolu PBS. W celu wykrycia chromogennego obserwuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopu optycznego.Pokazano tutaj wzór etykietowania sondy antysensownej LmigOR1 i LmigORco na kolejnych odcinkach anteny szarańczy. Oto wzór oznakowania sondy antysensownej LmigORco i LmigOR2 na kolejnych sekcjach anteny szarańczy. Ilustracja czasami oznaczanych struktur podobnych do dendrytów jest pokazana tutaj.W celu wykrycia TSA obserwuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopu konfokalnego. W tym przypadku przeprowadzono dwukolorową hybrydyzację in situ na podłużnym przekroju anteny, aby zilustrować ekspresję LmigOR1 i LmigORco. Lokalizacja komórek eksprymujących LmigOR1 w klastrach komórkowych eksprymujących LmigORco potwierdziła jego tożsamość neuronalną, a oto bliski widok obszarów pudełkowych.Czasami oznaczana struktura podobna do dendrytu jest oznaczona strzałką, a zakreślone obszary wskazują na klaster neuronów receptora węchowego wyrażających LmigORco i dzielących tę samą wrażliwość.

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Tutaj opisujemy proces barwienia immunologicznego czułków Drosophila przez całe mocowanie, co pozwala nam lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne związane z dywersyfikacją neuronów receptorów węchowych (ORN).

Znakowanie immunologiczne całej góry neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila

Opisujemy protokół używania anten owadów w postaci elektroantennogramów (EAG) na autonomicznych robotach. Nasza eksperymentalna konstrukcja pozwala na stabilne nagrania w ciągu jednego dnia i rozwiązuje indywidualne plamy zapachowe do 10 Hz. Skuteczność czujników EAG w poszukiwaniu węchu jest wykazywana poprzez kierowanie robota w kierunku źródła zapachu.

Wykorzystanie czujników elektroantennogramu owadów w autonomicznych robotach do wyszukiwania węchowego

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Pluskwy polegają na neuronach receptorów węchowych umieszczonych w ich czułkach węchowych do wykrywania substancji semiochemicznych w środowisku. Wykorzystując rejestrację pojedynczego czujnika, demonstrujemy metodę oceny reakcji pluskiew na substancje semiochemiczne i badamy związany z tym proces kodowania.

Wykorzystanie pojedynczego zapisu sensillum do wykrywania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne

Tutaj prezentujemy protokół do etapowania i preparowania rozwijającej się tkanki węchowej z gatunku Drosophila. Wypreparowana tkanka może być później wykorzystana do analiz molekularnych, takich jak ilościowa reakcja łańcuchowa RT-Transcription-Polymerase Chain Reaction) lub sekwencjonowanie RNA (RNAseq), a także do analiz in vivo, takich jak immunohistochemia lub hybrydyzacja in situ.

Przygotowanie rozwijającej się obwodowej tkanki węchowej do analizy molekularnej i immunohistochemicznej u Drosophila

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół dla pojedynczych nagrań sensillum z sensilla basiconica na palpach aparatów gębowych owadów.

Single Sensillum Recordings dla Locust Palp Sensilla Basiconica

To badanie wprowadza eksperymentalne protokoły dla bio-hybrydowego drona wykrywającego zapachy, opartego na antenach jedwabnika. Przedstawiono działanie eksperymentalnego urządzenia elektroantennogramowego z czułkami jedwabnika, a także konstrukcję biohybrydowego drona przeznaczonego do lokalizacji źródła zapachów za pomocą algorytmu spiralnego przypływu.

Biohybrydowy dron wykrywający zapachy oparty na elektroantennografii wykorzystujący anteny Silkmoth do lokalizacji źródła zapachów

Artykuł opisuje metody i odczynniki niezbędne do przeprowadzenia hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, hybrydyzacji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), aby ujawnić wgląd w przestrzenną i komórkową rozdzielczość genów receptorów chemosensorycznych w czułku komara i palpie szczękowym.

Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Poznaj metodę hybrydyzacji RNA in situ do lokalizacji genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy. Technika z zastosowaniem sond znakowanych digoksigeniną i biotyną umożliwia wykrywanie genów o niskim poziomie ekspresji.

Lokalizacja genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy przez hybrydyzację RNA in situ

Przeglądaj więcej filmów