Lokalizacja genów receptora zapachowego w czułkach szarańczy przez hybrydyzację RNA in situ

Ogólnym celem tej procedury jest zlokalizowanie genów receptora zapachowego o niskiej ekspresji, a także innych genów w czułkach owadów za pomocą sond znakowanych digoksygeniną lub biotyną. Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz nowe liniejące dorosłe szarańcze, które są aktywne i mają nienaruszone czułki, a następnie pokrój czułki na dwa do trzech milimetrowych kawałków za pomocą sterylnych maszynek do golenia. Następnie nałóż związek OCT na uchwyt mikrotomu do zamrażania i umieść próbki na związku poziomo.

Przenieść posiadacza do mikrotomu zamrażającego w temperaturze minus 24 stopni Celsjusza, aby zrównoważyć aż do zamarznięcia związku. Następnie wyjmij uchwyt i przykryj próbki niewielką ilością związku. Ponownie przenieść uchwyt do mikrotomu zamrażającego w temperaturze minus 24 stopni Celsjusza na co najmniej 10 minut, a następnie podzielić zamrożone próbki na plastry o grubości 12 mikrometrów.

Następnie rozmrozić plastry jeden po drugim na szkiełkach i wysuszyć je na powietrzu przez 10 minut. Po przygotowaniu skrawków kriostatu umieść szkiełka w plastikowym pojemniku i utrwal tkanki, inkubując szkiełka w 4% roztworze PFA przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po 30 minutach myj szkiełka w jednym X PBS przez jedną minutę.

Aby wyeliminować białka alkaliczne, przenieś szkiełka do 0,2 molowego chlorowodoru na 10 minut, a następnie przenieś szkiełka do jednego X PBS z 1% Triton X-100 na dwie minuty, aby wyeliminować białko powierzchniowe kwasu nukleinowego. Następnie umyj szkiełka dwukrotnie przez 30 sekund w jednym X PBS. Następnie płukać szkiełka w roztworze formamidu przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Opróżnij szkiełka i dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonych sond antysensownych i czujnikowych, a następnie umieść szkiełka nakrywkowe na skrawkach tkanki. Następnie dodaj roztwór formamidu lub jeden X PBS na dno pudełka, aby utrzymać wilgotne środowisko, ale nie zanurzaj szkiełek w płynie. Następnie umieść przykryte szkiełka poziomo w wilgotnym pudełku i inkubuj w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 22 godziny.

Po hybrydyzacji ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe. Umyj boki dwukrotnie, delikatnie mieszając je na bujaku przez 30 minut w 0,1 X SSC w temperaturze 60 stopni Celsjusza, a następnie płucz szkiełka w jednym X TBS przez 30 sekund. Dodać jeden mililitr 1% odczynnika blokującego w TBS uzupełnionego 0,03%Tritin X-100 na każde szkiełko i inkubować przez 30 minut.

Następnie wyrzuć roztwór blokujący. Do wykrywania chromogennego należy użyć odczynnika blokującego w TBS, aby rozcieńczyć 750 jednostek na mililitr sprzężonego przeciwciała anty-digoksygeniny-AP do 1,5 jednostki na mililitr roztworu AP. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu AP do każdego zakrytego szkiełka.

W celu wykrycia TSA należy użyć odczynnika blokującego w TBS, aby rozcieńczyć 750 jednostek na mililitr przeciwciała sprzężonego anty-digoksygenina-AP i przeciwciała sprzężonego z anty-biotyną streptawidyny HRP do roztworu AP HRP, a następnie dodać 100 mikrolitrów roztworu AP HRP do każdego zakrytego szkiełka. Dodaj roztwór formamidu lub jeden X PBS, aby pudełko było wilgotne, ale nie rozmoczone. Następnie inkubuj szkiełka w wilgotnym pudełku przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut w jednym X TBS uzupełnionym 0,05%TWEEN 20 na bujaku. Następnie płucz szkiełka w buforze DAP przez pięć minut, delikatnie mieszając plastikowy pojemnik na bujaku. W celu wykrycia chromogennego dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu NBT/BCIP do każdego szkiełka.

Ostrożnie umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach, a następnie inkubuj szkiełka w wilgotnym pudełku z roztworem substratu przez 10 minut do nocy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sprawdź rozwój, patrząc od czasu do czasu na szkiełka pod mikroskopem. Gdy rozwój jest gotowy, zatrzymaj reakcję, przenosząc szkiełka do wody.

W celu wykrycia TSA użyj strzykawki, aby przesunąć substrat HNPP/Fast Red z filtra strzykawkowego, a następnie dodaj 100 mikrolitrów substratu HNPP/Fast Red do każdego szkiełka pokrytego szkiełkiem nakrywkowym. Następnie inkubować szkiełka przez 30 minut z podłożem HNPP/Fast Red w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach ostrożnie zdejmij szkiełka nakrywkowe i umyj je trzy razy przez pięć minut w jednym X TBS uzupełnionym 0,05%TWEEN 20.

Inkubować szkiełka z 100 mikrolitrami substratu TSA na przykryte szkiełko przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe i umyj je trzy razy przez pięć minut w jednym X TBS uzupełnionym 0,05%TWEEN 20 przed zatopieniem szkiełek w glicerolu PBS. W celu wykrycia chromogennego obserwuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopu optycznego.

Pokazano tutaj wzór etykietowania sondy antysensownej LmigOR1 i LmigORco na kolejnych odcinkach anteny szarańczy. Oto wzór oznakowania sondy antysensownej LmigORco i LmigOR2 na kolejnych sekcjach anteny szarańczy. Ilustracja czasami oznaczanych struktur podobnych do dendrytów jest pokazana tutaj.

W celu wykrycia TSA obserwuj skrawki tkanek za pomocą mikroskopu konfokalnego. W tym przypadku przeprowadzono dwukolorową hybrydyzację in situ na podłużnym przekroju anteny, aby zilustrować ekspresję LmigOR1 i LmigORco. Lokalizacja komórek eksprymujących LmigOR1 w klastrach komórkowych eksprymujących LmigORco potwierdziła jego tożsamość neuronalną, a oto bliski widok obszarów pudełkowych.

Czasami oznaczana struktura podobna do dendrytu jest oznaczona strzałką, a zakreślone obszary wskazują na klaster neuronów receptora węchowego wyrażających LmigORco i dzielących tę samą wrażliwość.