Name: Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Poznaj metody badania fosforylacji i wiązania mikrotubul białka Tau w komórkach raka jelita grubego. Techniki te umożliwiają lokalizację białka i są kluczowe dla badań nad nowotworami oraz chorobami neurodegeneracyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania zostały przeprowadzone w ramach projektu zatytułowanego 'Rozwój i industrializacja wysokiej jakości surowców kosmetycznych z morskich mikroalg', finansowanego przez Ministerstwo Oceanów i Rybołówstwa, Korea, i były wspierane przez grant (2Z04930) z KIST Gangneung Institute of Natural Products.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Dodać 10 μl (1 mM) roztworu fluorku fenylometylosulfonylu, 10 μl (1x ze 100x bulionu) roztworu koktajlowego inhibitora proteazy i 10 μl (1x ze 100x bulionu) roztworu koktajlowego inhibitora fosfatazy do 1 ml 1x buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA), aby przygotować kompletny bufor do lizy RIPA.</li>
	<li>Przygotować 10x bufor ogólnego buforu tubuliny (PEM).
	<ol>
		<li>Dodać 800 mM (6,0474 g) kwasu piperazyno-N-N'-bis-2-etanosulfonowego, 10 mM (95,1 mg) glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego, 10 mM (51 mg) MgCl2 i 1,25 M (3 ml 10 M) NaOH w probówce o pojemności 50 ml, wymieszać z 15 ml wody destylowanej i rozpuścić za pomocą wiru. Sprawdź pH (powinno wynosić 6,9). Jeśli pH > 6,9, wyrzuć bufor i przygotuj nową partię. 
		UWAGA: NaOH powinien być poniżej 1,25 M, aby zapewnić, że pH nie przekroczy 6,9. Nie zaleca się stosowania HCl do regulacji pH >6,9.</li>
		<li>Dodawaj NaOH kroplami, aż pH wyniesie 6,9. Dodaj wodę destylowaną, aby uzupełnić do 25 ml 10X buforu PEM. Na koniec przefiltruj za pomocą strzykawki i filtra strzykawkowego 0,2 μm. Podzielić ten bufor na podwielokrotności w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 5x bufor do próbek ze środkiem redukującym i barwnikiem.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 300 μl (60 mM) 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 ml (25%) 50% glicerolu, 1 ml (2%) 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 1,2 ml wody destylowanej, aby uzupełnić 5 ml 5 ml buforu próbki 5x SDS. Przechowywać w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Ponieważ glicerol jest lepki, pomiar 1,25 ml glicerolu jest trudny. Jeden ml 100% glicerolu waży 1,26 g. Tak więc najpierw zważ 1,575 g 100% glicerolu (co odpowiada 1,25 ml 100% lub 2,5 ml 50% glicerolu) w probówce o pojemności 15 ml; Dobrze wymieszaj z pozostałymi składnikami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa, leczenie kurkuminą lub LiCl oraz badanie ekspresji białek
<ol>
	<li>Dodać ~1 x 106 komórek HCT 116 do 100-milimetrowych szalek do hodowli tkankowych zawierających minimalną ilość niezbędnych pożywek (MEM) uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną. Po jednym dniu hodowli komórki osiągną 60-70% konfluencji. 
	UWAGA: Liczba potrzebnych płytek zależy od liczby zabiegów opisanych poniżej.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną ~65% konfluencji (przybliżonej za pomocą mikroskopii), usuń pożywkę uzupełnioną MEM i dodaj MEM bez surowicy z kurkuminą 5 μM, 10 μM i 30 μM lub 25 mM, 50 mM i 100 mM LiCl. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .</li>
	<li>24 godziny po poddaniu działaniu roztworu należy przemyć komórki 1 ml lodowato zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek. Zeskrobane komórki przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i wirować przez 4 minuty w temperaturze 1 800 x g w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulek komórek.</li>
	<li>Poddać ogniwa lizie, zawieszając granulki w 100 μl kompletnego bufora RIPA w temperaturze 4 °C na 20 minut, regularnie stukając w probówki. Krótko poddać próbki działaniu sonikacji.</li>
	<li>Odwirować homogenaty komórkowe w wirówce stołowej o stężeniu 22 570 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty do innych znakowanych probówek za pomocą pipety.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka w supernatantach za pomocą testu Bradford45 przy użyciu komercyjnych zestawów do oznaczania białek.</li>
	<li>Przygotować próbki o równym stężeniu białka (10 μg białka/13 μl próbki) lizatów komórkowych z 4-krotnym buforem ładującym żel SDS. Przygotowany 4x świeży bufor żelowy SDS zawierający 400 mM ditiotreitol (DTT). 
	UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C, jeśli zajdzie taka potrzeba.</li>
	<li>Próbki inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Wymieszać próbki za pomocą wiru i odczekać na ich ostygnięcie przez ~10-15 minut.</li>
	<li>Zmontuj system elektroforezy.
	<ol>
		<li>Załadować 10 μg białka (13 μl próbki) na studzienkę na 10% żel poliakryloamidowy SDS do elektroforezy (SDS-PAGE). Załaduj drabinę o masie cząsteczkowej na żel na jeden pas. 
		UWAGA: Gdy rozpocznie się elektroforeza, drabinka białkowa rozpadnie się na pasma białkowe o pozornej masie cząsteczkowej. Użyj tych prążków, aby oszacować masy cząsteczkowe nieznanych prążków białkowych.</li>
		<li>Po załadowaniu próbek podłącz elektrody dodatnie i ujemne systemu elektroforezy do źródła zasilania, aby utrzymać stałe napięcie. Początkowo należy rozpocząć od napięcia 70 V przez 20 minut, aby przenieść próbki białka z żelu do układania w stos do żelu rozdzielczego. Następnie zwiększ napięcie do 125 V na około 70-120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu.</li>
		<li>Po zakończeniu elektroforezy należy przenieść żel na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą mokrego systemu do elektrobibuły. Przenoszenie przez ~100 min przy napięciu 100 V. Zablokowanie błony w 4% buforze blokującym albuminę surowicy bydlęcej (BSA) na 90 minut w temperaturze pokojowej około 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaznacz plamę, przecinając ją z boku drabiną o masie cząsteczkowej. Do przecięcia kleksa użyj przezroczystego plastikowego arkusza i ostrego noża. Przygotować roztwory przeciwciał pierwszorzędowych (anty-tau w stosunku 1:5 000; anty-fosfo-tau w stosunku 1:4 000) i inkubować blot w tym roztworze w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji przemyć blot przez 7 minut czterokrotnie w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej Tween-20 (PBST).</li>
	<li>Przygotować odpowiednie roztwory przeciwciał drugorzędowych (kozi anty-królik lub anty-mysie IgG w stosunku 1:5 000) i inkubować blot w tym roztworze przez 90 minut w temperaturze pokojowej około 25 °C. Przemyć w PBST cztery razy po 7 minut każdy.</li>
	<li>Opracuj blot za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z zaleceniami producenta. Przykryj blot przezroczystą folią. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencji dla chemiluminescencji za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
</ol>
3. Test fosfatazy
<ol>
	<li>Potraktować lizaty komórkowe (od kroku 2.5) fosfatazą alkaliczną w buforze fosfatazy alkalicznej.
	<ol>
		<li>Zarówno w przypadku próbek kontrolnych, jak i poddanych działaniu substancji należy przygotować 20 μl próbek zawierających 20 μg białka całkowitego. Dodać objętość lizatów komórkowych zawierających 20 μg białka ogółem, a następnie 2 μl buforu fosfatazy alkalicznej i 10 μl fosfatazy alkalicznej. Dodać wodę destylowaną do 20 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Zatrzymać reakcję przez dodanie kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o końcowym stężeniu 50 mM lub przez dodanie ortowanadanu sodu (Na3VO4) o końcowym stężeniu 10 mM. Reakcję można również zatrzymać przez ogrzewanie w temperaturze 75 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Przed zakończeniem inkubacji próbek z fosfatazą należy przygotować próbki o tym samym stężeniu bez dodawania fosfatazy w celu porównania z próbkami poddanymi działaniu fosfatazy.</li>
	<li>Dodaj świeżo przygotowany bufor 4X SDS do ładowania żelu zawierający 400 mM naziemnej telewizji cyfrowej.</li>
	<li>Inkubować próbki w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Wymieszać próbki za pomocą wiru. Schłodzić w temperaturze pokojowej przez ~ 10-15 min.</li>
	<li>Zmontuj system elektroforezy do uruchamiania 10% żelu poliakryloamidowego firmy SDS-PAGE.
	<ol>
		<li>Załaduj 10 μg białka (13 μl próbki) na studzienkę na 10% żel poliakrylamidowy. Załaduj drabinę o masie cząsteczkowej.</li>
		<li>Po załadowaniu próbki podłącz elektrody dodatnie i ujemne systemu elektroforezy do źródła zasilania, aby utrzymać stałe napięcie. Początkowo należy rozpocząć od napięcia 70 V przez 20 minut, aby przenieść próbki białka z żelu do układania w stos do żelu rozdzielczego. Następnie zwiększ napięcie do 125 V i uruchom żel na około 70-120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu.</li>
		<li>Po zakończeniu elektroforezy należy przenieść żel na membranę PVDF za pomocą mokrego systemu do elektrobibuły. Przesył przez ~100 min przy 100 V.</li>
		<li>Zaznacz plamę, wykonując małe nacięcie z boku drabiny o masie cząsteczkowej. Do przecięcia kleksa użyj przezroczystego plastikowego arkusza i ostrego noża.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zablokować membranę w 4% buforze blokującym BSA na 90 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować blot w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego (anty-tau w stosunku 1:5 000) w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj blot w PBST cztery razy, po 7 minut każdy.</li>
	<li>Przygotować odpowiedni roztwór przeciwciała drugorzędowego (kozia anty-mysia IgG w stosunku 1:5 000) i inkubować blot przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Umyj w PBST cztery razy, po 7 minut każdy.</li>
	<li>Opracuj blot za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z zaleceniami producenta. Przykryj plamę przezroczystą folią spożywczą. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencji dla chemiluminescencji za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
</ol>
4. Test wiązania mikrotubul
<ol>
	<li>W przypadku testu wiązania mikrotubul powtórzyć kroki 2.1-2.6.</li>
	<li>Przygotować 1X (2 ml) bufor PEM z 10X buforu PEM przechowywanego w temperaturze 4 °C, dodając 20 μM (40 μL) paklitakselu i 1 mM (20 μL) GTP. Pobrać wywar z mikrotubul (MT) z zamrażarki w temperaturze -80 °C, a materiał roboczy tau E. coli z zamrażarki w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować próbki zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Ultrawirować w temperaturze 25 °C przez 60 minut w temperaturze 100 000 x g.</li>
	<li>Przenieść 120 μl supernatantów zawierających niezwiązane tau do czystych i oznakowanych probówek.</li>
	<li>Dodać 120 μl (taka sama objętość jak supernatant) 5-krotnego buforu do próbki do osadu zawierającego związany tau i dokładnie wymieszać. Przenieś roztwór do czystych, oznakowanych probówek i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka (patrz krok 2.6). 
	UWAGA: Podczas przygotowywania próbek należy użyć objętości roztworu (krok 4.6) do przygotowania zarówno próbek osadu, jak i supernatantu.</li>
	<li>Przygotować próbki o równoważnym stężeniu białka i dodać świeżo przygotowany 4x SDS bufor do napełniania żelem zawierający DTT (400 mM). 
	UWAGA: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.5-3.10.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>próbka</td>
			<td colspan="2">Nazwa</td>
			<td colspan="2">Potrzebne mikrotubule</td>
			<td colspan="2">Potrzebne główne białko</td>
			<td colspan="2">PEM-GTP-PTX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">HCT 116-Control (6,21 μg/μl)</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">9,66 μl (60 μg)</td>
			<td colspan="2">108.34 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td colspan="2">HCT 116-kurkumina 10 μM (4,81 μg/μl)</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">16.63 μl (80 μg )</td>
			<td colspan="2">101.37 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">HCT 116-kurkumina 20 μM (3,28 μg/μl)</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">30.49 μl (100 μg)</td>
			<td colspan="2">87.51 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μg/μl)</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">18,42 μl (100 μg)</td>
			<td colspan="2">99.58 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">E. coli tau</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">1 μl tau-352</td>
			<td colspan="2">117 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2"tylko >MT</td>
			<td colspan="2">2 μl</td>
			<td colspan="2">X</td>
			<td colspan="2">118 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">120 μl każdy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przygotowanie próbki do testu wiązania mikrotubul.
5. Lokalizacja i ekspresja Tau po leczeniu komórek kurkuminą
<ol>
	<li>Wyczyść szkiełko nakrywkowe przy użyciu 70% etanolu i wysusz je chusteczką laboratoryjną. Umieścić pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku znakowanej 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Umieść płytkę w szafie bezpieczeństwa biologicznego i włącz światło UV na co najmniej 3 godziny.</li>
	<li>Zahoduj komórki i wysiewaj je do odpowiednich dołków 6-dołkowej płytki o wymiarach 2,5 x 105 komórek/basenik w zalecanej pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Po ~24 godzinach zbadaj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu, używając zarówno obiektywów 10X, jak i 40X, aby sprawdzić zmiany morfologiczne komórek. W razie potrzeby zrób zdjęcia.</li>
	<li>Przepłucz komórki dwukrotnie za pomocą PBS. Utrwalić komórki w 3,7% formaldehydzie w inkubatorze o temperaturze 37 °C w ciemności. 
	UWAGA: Utrwalanie formaldehydem w temperaturze pokojowej również działa dobrze. Podczas obchodzenia się z formaldehydem należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Umyj komórki w PBS. Utrwalić komórki w lodowatym metanolu w temperaturze -20 °C przez 15 minut. Przepuszczalność komórek poprzez inkubację w 3% BSA i 0,1% Triton X-100 w PBS na lodzie przez 10 minut. Umyj komórki PBS.</li>
	<li>Inkubować komórki w buforze blokującym (3% BSA i 0,1% Tween-20 w roztworze PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Inkubacja przez 2 godziny w temperaturze 4 °C również działa dobrze.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (anty-tau w stosunku 1:200) w 3% BSA i 0,1% Tween-20 w PBS (np. 2 μL przeciwciała tau-13 w 0,4 ml buforu).</li>
	<li>Wytnij małe kawałki membrany PVDF tak, aby pasowały do każdego dołka płytki 6-dołkowej; namocz je w wodzie na 5 minut. Umieść pocięty PVDF w każdym dołku.</li>
	<li>Dodaj 60 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do pociętych kawałków PVDF w każdym dołku. Umieść szkiełka nakrywkowe w taki sposób, aby komórki mogły stykać się z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować w temperaturze 4 °C w ciemnej, wilgotnej komorze przez noc. Umyj w PBS cztery razy.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego (anty-mysią IgG 594 sprzężoną z fluoresceiną w stosunku 1:400) w 3% BSA i 0,1% Tween-20 w PBS.</li>
	<li>Wytnij małe kawałki membrany PVDF tak, aby dobrze pasowały do każdej studzienki 6-dołkowej płytki i zanurz je w wodzie przez 5 minut. Umieść pocięty PVDF w każdym dołku.</li>
	<li>Dodać 80 μl roztworu przeciwciała wtórnego do każdego z kawałków PVDF na płytce 6-dołkowej. Umieść szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby komórki mogły dotknąć roztworu przeciwciała wtórnego. Inkubować w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Umyj PBS cztery razy.</li>
	<li>Umieścić próbki w podłożu montażowym za pomocą 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i przymocować szkiełka nakrywkowe do szkiełek podstawowych.
	<ol>
		<li>Dodaj jedną kroplę medium montażowego z DAPI na szkiełka podstawowe. Usuń szkiełka nakrywkowe z każdej studzienki i umieść je na szkiełkach zawierających podłoże montażowe z DAPI. Upewnij się, że powierzchnia każdego szkiełka nakrywkowego zawierającego poplamione komórki styka się z podłożem mocującym na odpowiednim szkiełku podstawowym.</li>
		<li>Nałóż lakier do paznokci wokół każdego szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić i szczelnie przymocować je do szkiełek podstawowych. W razie potrzeby wykonaj ten krok dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemnej komorze.</li>
	<li>Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając olejku immersyjnego na szkiełku nakrywkowym w ciemnym pomieszczeniu.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

W manuskrypcie tym ustalono różne warunki proceduralne wykrywania całkowitego tau i fosforylowanego tau w komórkach raka jelita grubego leczonych kurkuminą i LiCl. Aby ocenić ogólny stan fosforylacji tau w próbkach białek, opisano test fosfatazy. Test ten może być potencjalnie wykorzystany do zbadania stanu fosforylacji dowolnego białka.
Test ten opiera się na zasadzie, że ufosforylowane białko porusza się wolniej niż jego stan nieufosforylowany. W tym protokole stosuje się fosfatazę alkaliczn...

Tau zostało pierwotnie zidentyfikowane jako stabilne termicznie białko związane z mikrotubulami, które zostało oczyszczone z tubuliną1. Tau jest wyrażane wyłącznie u wyższych eukariontów2,3,4. Główną funkcją tau jest kontrola montażu mikrotubul1,5,6. Przyczynia się również do polimeryzacji mikrotubul7, transport aksonalny8, zmiany średnicy aksonów9, powstawanie polaryzacji nerwiaka i neurodegeneracja10. Tau działa również jako rusztowanie białkowe do kontrolowania niektórych szlaków sygnałowych. Badania mózgu szczurów sugerują, że tau jest specyficzne dla neuronów i że lokalizuje się głównie w aksonach11. Ponieważ tau jest niezbędne do polimeryzacji mikrotubul i rozwoju neuronów, postawiono hipotezę, że tau odgrywa główną rolę w rozwoju aksonów w ośrodkowym układzie nerwowym; Hipoteza ta została później zweryfikowana w eksperymentach in vitro i in vivo. Oprócz neuronów, tau ulega ekspresji w różnych komórkach nieneuronalnych, w tym w komórkach wątroby, nerek i mięśni12,13. Tau ulega również ekspresji w ludzkich liniach komórkowych i tkankach raka piersi, prostaty, jelita grubego, żołądka i trzustki14,15,16,17,18,19. Tau występuje również w zapaleniu mięśni ciała inkluzji jako skręcone rurki w ciałach inkluzyjnych20.
Tau może zawierać kilka modyfikacji potranslacyjnych. Ze wszystkich modyfikacji potranslacyjnych fosforylacja jest najczęstsza. Zwiększona fosforylacja tau zmniejsza jego powinowactwo do mikrotubul, ostatecznie destabilizując cytoszkielet. Opisano osiemdziesiąt pięć miejsc fosforylacji w białku tau wyizolowanym z tkanek mózgowych człowieka z chorobą Alzheimera. Spośród tych miejsc 53% składa się z seryny, 41% treoniny, a tylko 6% reszt tyrozyny21,22,23. Fosforylacja tau wpływa na jego lokalizację, funkcję, wiązanie, rozpuszczalność i podatność na inne modyfikacje potranslacyjne. Również fosforylacja tau w stopniu większym niż normalnie (lub w pełni nasycona grupami fosforanowymi) jest znana jako hiperfosforylacja, która replikuje strukturalne i funkcjonalne cechy choroby Alzheimera24. Tau utrzymuje prawidłowe funkcjonowanie mikrotubul aksonalnych i zapewnia prawidłowe funkcjonowanie neuronów w warunkach fizjologicznych. Jednak hiperfosforylowane tau nie utrzymuje dobrze zorganizowanego wiązania mikrotubul, powodując utratę neuronów z powodu demontażu mikrotubul. Normalne poziomy fosforylacji tau są wymagane do prawidłowego funkcjonowania tau, ale tau nie funkcjonuje normalnie, jeśli jego charakterystyczny poziom fosforylacji jest zmieniony i jeśli jest hiperfosforylowany25. W chorobie Alzheimera i niektórych innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem tau ulega hiperfosforylacji i tworzy sparowane włókna spiralne i splątki neurofibrylarne26,27. Dlatego ważne są metody oznaczania fosforylacji tau i wiązania mikrotubul.
Rak jelita grubego, rak związany ze starzeniem się, jest trzecim najczęściej diagnozowanym nowotworem i trzecim najczęściej powodującym zgony nowotworem zarówno dla mężczyzn, jak i kobiet28. Rak jelita grubego jest jednym z głównych nowotworów powodujących zgony w świecie zachodnim29. Ponieważ zarówno rak jelita grubego, jak i choroba Alzheimera są związane ze starzeniem się i występują głównie w krajach rozwiniętych, gdzie ludzie mają podobne nawyki żywieniowe, te dwie choroby mogą być w jakiś sposób skorelowane. Ponadto tau-dodatnie i tau-ujemne komórki nowotworowe różnie reagują na chemioterapeutyki, np. paklitaksel16.
Kurkumina jest jedną z głównych pochodnych Curcuma longa, indyjskiej przyprawy kurkuma30. Od wieków populacje Azji Południowej codziennie spożywały kurkumę w swojej diecie. Kurkumina jest stosowana w leczeniu różnych chorób, w tym raka jelita grubego, choroby Alzheimera, cukrzycy, mukowiscydozy, nieswoistego zapalenia jelit, zapalenia stawów, hiperlipidemii, miażdżycy i choroby niedokrwiennej serca31,32,33,34,35,36,37,38. Lit może również zabijać komórki raka jelita grubego lub zapobiegać ich namnażaniu39. Lit może być również stosowany w leczeniu choroby Alzheimera40, ponieważ zmniejsza agregację tau i zapobiega jego hiperfosforylacji, co zaobserwowano w transgenicznym modelu myszy41,42,43,44.
Ten manuskrypt ma na celu: 1) zmierzenie całkowitego poziomu ekspresji tau i fosfo-tau w leczonych komórkach; 2) opisać test fosfatazy w celu pomiaru ogólnej fosforylacji tau; 3) zbadać wiązanie tau przez mikrotubule; i 4) zlokalizować tau za pomocą mikroskopii konfokalnej w liniach komórkowych raka jelita grubego leczonych kurkuminą lub LiCl. Wyniki pokazują, że leczenie komórkowe kurkuminą, która jest rzekomo dobrym środkiem chemioterapeutycznym w przypadku raka jelita grubego, oraz leczenie LiCl może zmniejszyć ekspresję zarówno całkowitego tau, jak i fosforylowanego tau w liniach komórkowych raka jelita grubego. Zabiegi te mogą również powodować translokację jądrową tau. Jednak nieoczekiwanie kurkumina nie poprawia wiązania tau z mikrotubulami.

<table><tbody><tr><td>HCT 116 cell</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td></td></tr><tr><td>MEM (EBSS)</td><td>Hyclon</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>16000044</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Hyklon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>roztwór trypsyny-EDTA</td><td>WelGene</td><td>LS 015-01</td><td></td>Miska</tr><tr><td>100 mm</td><td>Corning</td><td>430161</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>Coster 3516</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Tau 13</td><td>abcam</td><td>ab19030</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Roche</td><td>10 708 984 001</td><td>Temperatura przechowywania: 2&ndash; 8 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Wirówki mikrolitrowe</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>MIKRO 200 R</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td>Temperatura przechowywania 2&ndash; 8 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Kurkumina</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td> <td>78246</td><td>Temperatura przechowywania 2&ndash; 8 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Mikrotubule (MT)</td><td>Cytoszkielet</td><td>MT001</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C (suchy)</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C w ciemności</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>WelGene</td><td>LB 001-02</td><td></td></tr><tr><td>Dysmubrator soniczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100 XP</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Obrazownik molekularny</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Odczynnik barwnikowy do oznaczania białek</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-tubulina (11H10) MAb królika</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2125</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) MAb królika</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Tau (fosfo S396)</td><td>abcam</td><td>ab109390</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>FastAP Termoczuła fosfataza alkaliczna</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Inhibitor fosfatazy Sygnalizacja komórkowa</td><td></td><td>koktajlu 5870</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Koktajl</td><td>komórkowy Sygnalizacja</td><td>5871</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Sigma</td><td>R 0278</td><td>Temperatura przechowywania 2&ndash; 8 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Tau-352 człowiek</td><td>Sigma</td><td>T 9950</td><td>Przechowuj pod kątem -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X - 100</td><td>Sklep na około 25 & deg; C</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG Wtórne</td><td>przeciwciało ThermoFisher</td><td>A-11005</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C w ciemności</td></tr><tr><td>Mikroskopia konfokalna</td><td>Leica Microsystem</td><td>Leica TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Affymetrix</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>Test białka</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; Z</td></tr></tbody></table>

test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka tau w komórkach raka jelita grubego

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Białko tau związane z mikrotubulami jest białkiem neuronalnym, które lokalizuje się głównie w aksonach. Ogólnie rzecz biorąc, tau jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania neuronów, ponieważ bierze udział w tworzeniu i stabilizacji mikrotubul. Oprócz neuronów, tau ulega ekspresji w ludzkim raku piersi, prostaty, żołądka, jelita grubego i trzustki, gdzie wykazuje prawie podobną budowę i pełni podobne funkcje jak neuronalne tau. Ilość tau i jego fosforylacja mogą zmienić jego funkcję jako stabilizatora mikrotubul i prowadzić do rozwoju sparowanych spiralnych włókien w różnych zaburzeniach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera. Istotne jest określenie stanu fosforylacji tau i jego charakterystyki wiązania mikrotubul. Ponadto badanie wewnątrzkomórkowej lokalizacji tau jest ważne w różnych chorobach. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje standardowe protokoły pomiaru fosforylacji tau i wiązania tau z mikrotubulami w komórkach raka jelita grubego z lub bez kurkuminy i leczenia LiCl. Zabiegi te mogą być stosowane w celu zatrzymania proliferacji i rozwoju komórek rakowych. Wewnątrzkomórkową lokalizację tau bada się za pomocą immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej przy użyciu niewielkich ilości przeciwciał. Testy te mogą być stosowane powtarzalnie do badań przesiewowych związków, które wpływają na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul. Nowatorskie terapie stosowane w różnych tauopatiach lub pokrewnych środkach przeciwnowotworowych można potencjalnie scharakteryzować za pomocą tych protokołów.

Ekspresję całkowitego białka tau oraz fosfo-tau badano po potraktowaniu komórek różnymi stężeniami kurkumy lub LiCl (Rycina 1). Potraktowanie komórek trzema różnymi stężeniami kurkumy obniżyło poziomy ekspresji tau; jednak ekspresja fosfo-tau wzrosła po zastosowaniu niskiego stężenia kurkumy, natomiast spadła po potraktowaniu komórek wyższymi stężeniami kurkumy. Do detekcji fosfo-tau użyto przeciwciał anty-fosfo-tau (Ser396). Poziomy zarówno całkowitego tau, ...

Ten manuskrypt opisuje standardowe protokoły pomiaru hiperfosforylacji tau, pomiaru wiązania tau z mikrotubulami oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowego tau po leczeniu farmakologicznym. Protokoły te mogą być stosowane wielokrotnie do badań przesiewowych leków lub innych związków, które są ukierunkowane na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul.

Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie fosforylacji białka tau, jego zdolności do wiązania z mikrotubulami oraz lokalizacji białka tau w komórkach raka jelita grubego przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może być skuteczna w większości dziedzin badań biologicznych, zwłaszcza w badaniach nad rakiem i otępieniem, gdzie fosforylacja i wiązanie z mikrotubulami są istotnymi czynnikami. Główną zaletą przedstawionego testu fosforazy jest zapewnienie prostego sposobu oceny całkowitej fosforylacji próbek białek.Główną zaletą analizy wiązania mikrotubul jest to, że jest to prosta procedura pozwalająca na oddzielenie białek wiążących mikrotubule od frakcji niewiążących. Z kolei główną korzyścią techniki lokalizacji tau jest fakt, że wymaga ona stosunkowo niewielkiej ilości przeciwciał pierwotnych i wtórnych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przenieś około jeden milion komórek HCT 116 do naczyń hodowlanych zawierających minimalne podłoże niezbędne (MEM) uzupełnione o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Gdy komórki osiągną 65% konfluencji, użyj aspiratora, aby usunąć podłoże z dodatkiem FBS. Następnie dodaj bezsurowicze MEM zawierające kurkuminę lub chlorek litu.Inkubować w temperaturze 37 °C w zwilżonej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Następnie przemyć komórki 10 ml schłodzonego PBS. Dodać 1 ml schłodzonego PBS, a następnie za pomocą skrobaka do komórek zebrać komórki i przenieść je do probówek do wirowania o pojemności 1,5 ml.Wiruj przez cztery minuty przy 1800 ×g i temperaturze 4 °C. Osady komórkowe resuspendujemy w 100 µL kompletnego buforu RIPA w temperaturze 4 °C przez 20 minut, regularnie opukując probówki, aby zlizować komórki. Następnie próbki krótko sonikujemy przy amplitudzie 10%, stosując impulsy 0,2 s włączony i 0,2 s wyłączony, przez łącznie 2 s.Odwiruj homogenat komórkowy przy 22 570 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Przenieś nad supernatanty do nowych, oznakowanych probówek, a następnie zmierz stężenie białka metodą Bradforda, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po przygotowaniu próbek zawierających 20 µg całkowitego białka, dodaj do każdej z nich 2 µL buforu do fosfatazy alkalicznej oraz 10 µL fosfatazy alkalicznej.Następnie dodać wodę destylowaną tak, aby końcowa objętość każdej próbki wynosiła 20 µL. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. W czasie inkubacji próbek przygotować dodatkowe próbki o tym samym stężeniu, ale bez fosfatazy w celu porównania.Po jednej godzinie zatrzymać reakcję poprzez dodanie EDTA do końcowego stężenia 50 millimolar lub ortowanadanu sodu do końcowego stężenia 10 millimolar. Dodać świeżo przygotowany 4XSDS bufor do ładowania żelu zawierający 400 millimolar DTT. Próbki inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut.Wymieszaj próbki w wortexie, a następnie pozostaw je do ochłodzenia w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Następnie nanieś 13 µL próbki na każdą studzienkę oraz marker masy cząsteczkowej na żel poliakrylamidowy 10%. Podłącz system elektroforetyczny do źródła zasilania i ustaw napięcie na 70 V przez 20 minut, aby przenieść próbki białek z żelu koncentrującego do żelu rozdzielczego.Następnie zwiększ napięcie do 125 V i prowadź elektroforezę przez około 70 do 120 minut, aż próbki oraz drabinka białkowa dotrą do końca żelu. Za pomocą mokrego systemu transferu białek przenieś białka z żelu na membranę z polifluorku winylidenu przy napięciu 100 V przez około 100 minut. Następnie inkubuj membranę w celu blokowania w 4% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) przez 90 minut w temperaturze pokojowej.Inkubować blot przez noc w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyć blot trzy razy w PBST, myjąc przez siedem minut za każdym razem. Inkubować w roztworze przeciwciał wtórnych przez 90 minut w temperaturze pokojowej.Następnie przemyć membranę czterokrotnie w PBST, przy czym każde płukanie powinno trwać siedem minut. Wywołać prążki, używając zestawu do chemiluminescencji zgodnie z instrukcją producenta. Przykryć wywołaną membranę przezroczystą folią spożywczą, a następnie pozyskać obrazy chemiluminescencyjne za pomocą dostępnego komercyjnie systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.Po przygotowaniu świeżych próbek inkubuj je w temperaturze 37°C przez 30 minut. Próbki poddaj ultracentryfugacji przy 100 000 ×g i 25°C przez 60 minut. Następnie przenieś 120 µL każdego supernatantu zawierającego niezwiązaną białka tau do oddzielnych, czystych i opisanych probówek.Do osadu zawierającego związane białko tau dodać 120 µL buforu do próbek Fibic. Po dokładnym wymieszaniu za pomocą wortexera i pipetowania, przenieść mieszaninę do czystych, opisanych probówek. Po przygotowaniu próbek o równym stężeniu białka, dodać świeży 4XSDS bufor do ładowania żelu zawierający 400 mM DTT.Użyj bloku grzewczego do inkubacji próbek w temperaturze 100 °C przez pięć minut. Próbki wymieszaj w wortexie, a następnie pozostaw do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Nałóż 13 µL próbki na każdą studzienkę oraz marker masy cząsteczkowej na 10% żel poliakrylamidowy.Podłącz elektrody dodatnią i ujemną układu elektroforetycznego do źródła zasilania, a następnie ustaw napięcie na 70 V na 20 minut. Po tym czasie zwiększ napięcie do 125 V i prowadź elektroforezę przez około 70 do 120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu. Wykorzystaj mokry system elektrotransferu, aby przenieść białka z żelu na membranę z polifluorku winylidenu przy napięciu 100 V przez około 100 minut.Inkubować membranę do Western blot w 4% albuminie surowicy bydlęcej przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować przez noc w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyć membranę czterokrotnie w PBST, przy czym każde płukanie powinno trwać siedem minut.Inkubować wypłukaną błonę w odpowiednim roztworze przeciwciał wtórnych przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie płukać w PBST przez siedem minut, powtarzając tę czynność łącznie cztery razy. Wywołać błonę, korzystając z zestawu do chemiluminescencji.Przykryć przezroczystą folią spożywczą i nabyć obrazy przy użyciu systemu obrazowania chemiluminescencyjnego. Na początek umieścić szkiełka podstawowe w dołkach płytki tkankowej z sześcioma dołkami, a następnie zasiać 250 000 komórek do każdego dołka w zalecanym medium hodowlanym. Po 24 godzinach wypłukać komórki dwukrotnie za pomocą PBS.Dodaj bezserwatkowe MEM zawierające kurkuminę i inkubuj w temperaturze 37°C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Następnie ponownie przemyj komórki lodowatym PBS. Utrwal komórki w 3,7% formaldehydzie w inkubatorze w temperaturze 37°C, w ciemności.Przemyj komórki PBS, a następnie utrwal je w lodowatym metanolu w temperaturze 20 °C przez 15 minut. Po tym czasie inkubuj komórki na lodzie w 3% BSA i 0,1% Triconex 100 w PBS przez 10 minut. Przemyj komórki PBS, a następnie inkubuj w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie do wyciętego fragmentu polifluorku winylidenu w każdej studzience należy dodać 60 µL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Należy umieścić szkiełka podstawowe w taki sposób, aby komórki miały kontakt z roztworem przeciwciał. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w ciemnej, wilgotnej komorze.Następnego dnia przemyć komórki czterokrotnie PBS. Do każdego kawałka poliwinylidenofluorureku dodać 80 µl roztworu przeciwciała wtórnego, umieszczając szkiełka nakrywowe w taki sposób, aby komórki miały kontakt z roztworem przeciwciał. Inkubować w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Następnie komórki należy przemyć czterokrotnie roztworem PBS. Próbki należy zamontować w medium montażowym z DAPI, a następnie przymocować szkiełka nakrywowe do szkiełek podstawnych. Następnie inkubować w ciemnej komorze w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny.Przy użyciu mikroskopu konfokalnego należy zbadać preparaty. W niniejszym badaniu specyficzną fosforylację białka tau ocenia się przy użyciu przeciwciała przeciwko fosfo-tau. W komórkach traktowanych kurkuminą obserwuje się zmniejszoną ekspresję białka tau wraz ze wzrostem stężenia kurkuminy.Z kolei zaobserwowano, że ekspresja fosfo-tau wzrasta przy niższych stężeniach kurkuminy i spada dopiero przy bardzo wysokich stężeniach. Następnie zbadano komórki traktowane chlorkiem litu. Jak widać, ekspresja zarówno białka tau, jak i fosfo-tau jest znacząco obniżona po zastosowaniu chlorku litu.Ogólną fosforylację ocenia się następnie za pomocą testu z fosfatazą. W próbkach traktowanych fosfatazą obserwuje się szybszą migrację białka Tau w porównaniu z nie traktowaną próbką kontrolną, co wskazuje, że próbka kontrolna jest fosforylowana. Próbki komórek traktowanych kurkuminą wykazały bardzo podobne wyniki, co wskazuje, że zastosowana terapia w liniach komórkowych raka jelita grubego nie zredukowała fosforylacji białka Tau.Zarówno próbki poddane działaniu fosfatazy, jak i próbki nietraktowane, wykazaly niemal ten sam zakres elektroforezy w przypadku komórek traktowanych chlorkiem litu, co wskazuje na redukcję fosforylacji białka tau. Następnie, przy użyciu tau 352 jako kontroli pozytywnej, pomyślnie przeprowadzono test wiązania mikrotubularnego w próbkach komórkowych. Jak pokazano tutaj, zarówno kurkumina, jak i niska koncentracja chlorku litu skutkują zahamowaniem aktywności wiązania mikrotubul.Następnie przeprowadzono mikroskopię konfokalną. Po zastosowaniu kurkumy zauważono translokację białka tau do jądra komórkowego. Potwierdza to wcześniejsze badania, z których wynikało, że jądrowe tau odgrywa kluczową rolę w ochronie neuronalnego DNA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić test fosfatazowy w celu określenia całkowitego poziomu fosforylacji w próbkach białek oraz jak wykonać test wiązania mikrotubul. Powinni Państwo być w stanie opracować sposób przeprowadzenia analizy immunofluorescencyjnej przy użyciu mikroskopii konfokalnej z zastosowaniem różnych, niewielkich ilości przeciwciał. Przedstawione tutaj procedury są kosztowo efektywne i mogą potencjalnie pomóc w odkrywaniu i opracowywaniu nowych czynników terapeutycznych do leczenia różnych taupopatii i nowotworów.

assay-for-phosphorylation-microtubule-binding-along-with-localization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje protokół oceny stanu fosforylacji białka tau za pomocą testu fosfatazy w komórkach raka jelita grubego. Enzym fosfataza działa na grupy fosforanowe obecne na białku tau, zwiększając ruchliwość białka tau w żelu SDS PAGE w porównaniu z nietraktowanymi próbkami białka tau.

Test fosfatazy w komórkach CRC: metoda badania stanu fosforylacji białka Tau w komórkach raka jelita grubego

Ten film opisuje test wiązania mikrotubul używany do oddzielania białka tau wiążącego mikrotubule od niewiążących, hiperfosforylowanych frakcji białka tau w komórkach raka jelita grubego. Test ten pomaga określić wpływ różnych substancji chemicznych, które mogą zmieniać stan fosforylacji białka tau, wpływając na jego wiązanie w mikrotubulach.

Test wiązania mikrotubul w komórkach CRC: metoda badania białka Tau wiążącego mikrotubule w komórkach raka jelita grubego

Homogenizuj tkankę, aby uwolnić białka do buforu. Inhibitory proteazy blokują aktywność proteazy, zapobiegając degradacji białek.

Wykrywanie ufosforylowanych białek tau w próbkach mózgu myszy za pomocą analizy Western Blot

Ten film demonstruje użycie technik magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) do identyfikacji wielu fosforylacji w białku. Fosforylacja białka przy określonym aminokwasie powoduje deekranację sąsiedniego wodoru amidowego, co generuje różnicę widmową.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w celu identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek

Ten film prezentuje test komórkowy określający ilościowo wychwyt Tau przez mysi mikroglej przy użyciu wrażliwych na pH, fluorescencyjnie znakowanych agregatów Tau, analizowanych za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu oceny ilościowej.

Test komórkowy do oceny wychwytu białka tau przez mikroglej

Niezmodyfikowane i hiperfosforylowane białka tau zostały użyte w dwóch testach agregacji in vitro, aby ujawnić kinetykę szybkiej agregacji zależnej od hiperfosforylacji. Testy te torują drogę do przyszłych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować skłonność hiperfosforylowanego tau do tworzenia włókienek, które leżą u podstaw postępu choroby Alzheimera.

In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Tutaj opisujemy test komórkowy do ilościowej oceny wychwytu tau przez mikroglej w celu stworzenia narzędzia badawczego do lepszego scharakteryzowania mechanizmów działania przeciwciał anty-tau.

Test komórkowy do badania klirensu Tau za pośrednictwem przeciwciał przez mikroglej

Tau jest białkiem neuronalnym obecnym zarówno w cytoplazmie, gdzie wiąże mikrotubule, jak i w jądrze, gdzie pełni niekonwencjonalne funkcje, w tym modulację genów związanych z chorobą Alzheimera. W tym miejscu opisujemy metodę badania funkcji jądrowego Tau przy jednoczesnym wykluczeniu wszelkich zakłóceń pochodzących z cytoplazmatycznego Tau.

Modulacja lokalizacji subkomórkowej Tau jako narzędzie do badania ekspresji genów związanych z chorobą

Mikrotubule, które są polimerami tubuliny, odgrywają kluczową rolę jako składnik cytoszkieletu w komórkach eukariotycznych i są znane ze swojej dynamicznej niestabilności. W badaniu tym opracowano metodę frakcjonowania mikrotubul w celu rozdzielenia ich na stabilne mikrotubule, labilne mikrotubule i wolną tubulinę w celu oceny stabilności mikrotubul w różnych tkankach myszy.

Ilościowa technika frakcjonowania mikrotubul w celu oddzielenia stabilnych mikrotubul, labilnych mikrotubul i wolnej tubuliny w tkankach myszy

Poznaj metody badania fosforylacji i wiązania mikrotubul białka Tau w komórkach raka jelita grubego. Techniki te umożliwiają lokalizację białka i są kluczowe dla badań nad nowotworami oraz chorobami neurodegeneracyjnymi.

Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego

Przeglądaj więcej filmów