Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie fosforylacji tau, zdolności wiązania tau w mikrotubulach i lokalizacji tau za pomocą mikroskopii konfokalnej w komórkach raka jelita grubego. Metoda ta może być skuteczna w większości biologicznych dziedzin badań, zwłaszcza w badaniach nad rakiem i demencją, gdzie fosforylacja i wiązanie mikrotubul są ważnymi czynnikami. Główną zaletą przedstawionego testu fosforatazy jest to, że zapewnia łatwy sposób postrzegania całej fosforylacji próbek białek.

Główną zaletą testu wiązania mikrotubul jest to, że jest to prosta procedura oddzielania białek wiążących mikrotubule od frakcji niewiążących. Jednak głównymi zaletami techniki lokalizacji tau jest to, że wymaga ona stosunkowo niewielkiej ilości przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przenieś około miliona komórek HCT 116 do szalek hodowlanych zawierających minimalną ilość niezbędnej pożywki uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% steptomycyną penicyliny. Gdy komórki osiągną 65% konfluencji, użyj aspiratora, aby usunąć pożywkę uzupełnioną FBS. Następnie dodaj MEM bez surowicy, zawierającą kurkuminę lub chlorek litu.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Następnie umyj komórki 10 mililitrami mrożonego zimnego PBS. Dodaj jeden mililitr lodowatego PBS, a następnie użyj skrobaka do komórek, aby zeskrobać komórki i przenieść je do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych.

Wirować przez cztery minuty w temperaturze 1800 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Zawieszamy granulki komórek w 100 mikrolitrach kompletnego buforu RIPA w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 20 minut, upewniając się, że regularnie stukamy w probówki, aby lizować komórki. Następnie krótko poddaj próbki sonikacji o amplitudzie 10%, pulsując przez 0,2 sekundy i wyłączając na 0,2 sekundy, w sumie przez 2 sekundy.

Odwirować homogenat komórek w temperaturze 22, 570 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Przenieść supernatanty do nowych znakowanych probówek, a następnie zmierzyć stężenie białka za pomocą testu Bradforda, jak opisano w protokole tekstowym. Po przygotowaniu próbek zawierających 20 mikrogramów białka ogółem, do każdej dodać dwa mikrolitry buforu fosfatazy alkalicznej i 10 mikrolitrów fosfatazy alkalicznej.

Następnie dodaj wodę destylowaną, tak aby końcowa objętość każdej próbki wynosiła 20 mikrolitrów. Inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Podczas inkubacji próbek należy przygotować dodatkowe próbki o tym samym stężeniu, ale bez fosfatazy do porównania.

Po godzinie należy zatrzymać reakcję, dodając EDTA o końcowym stężeniu 50 milimolów lub ortowanadan sodu o końcowym stężeniu 10 milimolów. Dodaj świeżo przygotowany bufor ładujący żel 4XSDS zawierający 400 milimolowy DTT. Używając bloku grzewczego, inkubować próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Zwiruj próbki, a następnie pozwól im ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Następnie załaduj 13 mikrolitrów próbki na studzienkę, a także drabinkę do ważenia molekularnego na 10% żelu poliakrylamidowym. Podłącz system elektroforezy do źródła zasilania i ustaw napięcie na 70 woltów na 20 minut, aby przenieść próbki białek z żelu do układania w stos do żelu rozdzielczego.

Następnie zwiększ napięcie do 125 V i uruchom żel przez około 70 do 120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu. Za pomocą mokrego systemu do elektroblotty przenieś żel na membranę z polifluorku winylidenu o napięciu 100 woltów przez około 100 minut. Następnie inkubować błonę, aby osuszyć 4% albuminę surowicy bydlęcej przez 90 minut w temperaturze pokojowej.

Inkubuj blot przez noc w roztworze przeciwciała pierwotnego w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj plamę trzy razy w PBST, za każdym razem myjąc przez siedem minut. Inkubować w niepewnym roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 90 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przemyj PBST cztery razy, przy czym każde pranie trwa siedem minut. Rozwiń blot za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z instrukcjami producenta. Przykryj wywołaną plamę przezroczystą folią plastikową, a następnie uzyskaj obrazy chemiluminescencyjne blot za pomocą dostępnego na rynku systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.

Po przygotowaniu świeżych próbek inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Ultraodwirować próbki w temperaturze 100 000 razy G i 25 stopni Celsjusza przez 60 minut. Następnie przenieś 120 mikrolitrów każdego supernatantu zawierającego niezwiązane tau do oddzielnych, czystych i oznakowanych probówek.

Dodać 120 mikrolitrów buforu do próbki Fibic do osadu zawierającego związane tau. Po dokładnym wymieszaniu, poprzez wirowanie i pipetowanie, przenieść mieszaninę do czystych, oznakowanych probówek. Po przygotowaniu próbek o równoważnym stężeniu białka dodać świeży bufor ładujący w żelu 4XSDS zawierający 400 milimolowy DTT.

Użyj bloku grzewczego, aby inkubować próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Zwirować próbki, a następnie pozostawić je do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Załaduj 13 mikrolitrów próbki na studzienkę i drabinkę masy cząsteczkowej na 10% żelu poliakrylamidowym.

Podłącz dodatnie i ujemne elektrody systemu elektroforezy do źródła zasilania, a następnie ustaw napięcie na 70 woltów na 20 minut. Następnie zwiększ napięcie do 125 V i uruchom żel przez około 70 do 120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu. Użyj mokrego systemu do elektrobicytacji, aby przenieść żel na membranę z polifluorku winylidenu pod napięciem 100 woltów przez około 100 minut.

Inkubować błonę, aby osuszyć w 4% albuminie surowicy bydlęcej przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować przez noc w roztworze przeciwciała pierwotnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj blot cztery razy PBST, przy czym każde pranie trwa siedem minut.

Inkubować przemytą plamę w odpowiednim roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie myj PBST przez siedem minut, powtarzając pranie w sumie cztery razy. Rozwiń plamę za pomocą zestawu do chemiluminescencji.

Przykryj przezroczystą folią i uzyskaj obrazy za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego. Na początek umieść szkiełka przykrywkowe w dołkach sześciodołkowej płytki przykrywającej tkanki, a następnie wysiewaj 250 000 komórek do każdej studzienki w zalecanej pożywce hodowlanej. Po 24 godzinach dwukrotnie przepłucz komórki PBS.

Dodaj bezsurowicowy MEM zawierający kurkuminę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Następnie ponownie umyj komórki lodowatym PBS. Utrwal komórki w 3,7% formaldehydzie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, w ciemności.

Umyj komórki PBS, a następnie utrwal je w lodowatym metanolu w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie inkubować komórki na lodzie w 3% BSA i 0,1% Triconex 100 w PBS przez 10 minut. Przemyć komórki PBS, a następnie inkubować w buforze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj 60 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do pokrojonego kawałka polifluorku winylidenu w każdym dołku. Umieszczenie szkiełek nakrywkowych w taki sposób, aby komórki stykały się z roztworem przeciwciała. Inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza w ciemnej, wilgotnej komorze.

Następnego dnia przemyj komórki czterokrotnie PBS. Dodać 80 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciała do każdego z kawałków polifluorku winylidenu, umieszczając szkiełka nakrywkowe w taki sposób, aby komórki stykały się z roztworem przeciwciała. Inkubować w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Następnie umyj komórki czterokrotnie PBS. Zamontuj próbki w podłożu montażowym za pomocą DAPI, a następnie zamocuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych. Następnie inkubować w ciemnej komorze w temperaturze pokojowej przez półtorej godziny.

Za pomocą mikroskopu konfokalnego zbadaj szkiełka. W tym badaniu fosforylacja tau specyficzna dla cytu jest oceniana przy użyciu przeciwciała fosfo-tau. Obserwuje się, że komórki traktowane kurkuminą wyrażają zmniejszone tau wraz ze wzrostem stężenia kurkuminy.

Z drugiej strony obserwuje się, że ekspresja fosfo-tau wzrasta przy niższych stężeniach kurkuminy, zmniejszając się tylko przy bardzo wysokich stężeniach. Następnie bada się komórki poddane działaniu chlorku litu. Jak widać, ekspresja zarówno tau, jak i fosfo-tau jest znacznie zmniejszona pod wpływem chlorku litu.

Ogólna fosforylacja jest następnie oceniana za pomocą testu fosfotazy. Zaobserwowano, że tau migruje szybciej w próbkach traktowanych fosfotazą w porównaniu z próbką kontrolną nietraktowaną, co wskazuje, że próbka kontrolna jest fosforylowana. Próbki komórek traktowane kurkuminą wykazały bardzo podobne wyniki, co wskazuje, że linie komórkowe raka jelita grubego leczone nie zmniejszyły fosforylacji tau.

Zarówno próbki poddane działaniu fosfatazy, jak i niepoddane działaniu fosfatazy poddały elektroforezie prawie taki sam zakres w próbkach komórek potraktowanych chlorkiem litu, co wskazuje na zmniejszenie fosforylacji tau. Następnie z powodzeniem przeprowadza się test wiązania mikrotubularnego próbek komórkowych przy użyciu tau 352 jako kontroli pozytywnej. Jak wykazano tutaj, zarówno kurkumina, jak i niskie stężenie chlorku litu powodują zahamowanie aktywności wiązania mikrotubul.

Następnie wykonywana jest mikroskopia konfokalna. Po leczeniu kurkuminą obserwuje się, że tau przemieszcza się do jądra. Potwierdza to wcześniejsze badania, które donosiły, że jądrowy tau odgrywa kluczową rolę w ochronie neuronalnego DNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test fosfotazy w celu określenia całkowitej fosforylacji próbek białek i jak wykonać test wiązania mikrotubul. Powinieneś być w stanie dowiedzieć się, jak wykonać test immunofluorescencyjny za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu różnych mniejszych ilości przeciwciał. Przedstawione tutaj procedury są opłacalne i potencjalnie pomogą w odkryciu i opracowaniu nowych środków terapeutycznych do leczenia różnych tau-forów i nowotworów.