A Caenorhabditis elegans test oparty na unikaniu miedzi w oparciu o status żywienia
26 lipca 2017
Przedstawiamy tu specyficzny dla Caenorhabditis elegans test zaprojektowany w celu oceny zmian w zachowaniu unikania miedzi i zdolności do zlokalizowania wspólnego źródła pożywienia, w miarę jak organizm przechodzi ze stanu dobrze odżywionego do stanu głodnego.
Ogólnym celem tego testu awersji do miedzi opartego na statusie żywienia jest ocena reakcji nicieni na odstraszającą substancję chemiczną i źródło pokarmu w ciągu czterech godzin. Umożliwia to jednoczesną ocenę statusu żywienia. Ta metoda może pomóc w dziedzinie neurobiologii behawioralnej poprzez identyfikację mutantów, które nie modulują wzorców ruchowych i reakcji na odstraszającą substancję chemiczną mimo warunków głodu.
Główną zaletą tej techniki jest to, że może być przeprowadzona w dłuższym okresie czasu, co pozwala na analizę statusu żywienia, gdy robaki stają się stopniowo bardziej wygłodniałe w ciągu czterech godzin. Aby przygotować organizmy eksperymentalne do testu, wybierz 10 nicieni w stadium L4 na każdy strumień, 24 godziny przed rozpoczęciem testu, aby upewnić się, że organizmy są młodymi dorosłymi, gdy są testowane. Dla każdego testowanego mutanta lub kontrolnego nicienia wybierz 10 L4.
Utrzymuj organizmy L4, stosując standardowe metody przez 24 godziny na standardowych płytkach agarowych zasiedlonych OP50 E.Coli. 24 godziny przed testem, użyj linijki i grubego trwałego markera, aby narysować linię na spodniej stronie wcześniej przygotowanej płytki z pożywką do hodowli nicieni lub płytki NGM wzdłuż zewnętrznej krawędzi. Zaznacz środkową barierę równo oddaloną od każdej krawędzi płytki.
Zasiej płytkę z 50 mikrolitami OP50 E.Coli tylko z jednej strony bariery miedzi, aby stworzyć jednolite trawniki. Użyj zaznaczonych linii na spodniej stronie płytki, aby upewnić się, że bakterie nie stykają się z roztworem miedzi. Upewnij się, że roztwór miedzi wyliniuje krawędź płytki i utworzy środkową barierę i przenieś bakterie tak, aby roztwór miedzi nie stykał się z źródłem pokarmu.
Zaznacz drugi zestaw płytek bez OP50 E.Coli, aby służyły jako negatywna kontrola. Pozostaw, aby bakterie wyschły, a następnie inkubuje płytki w 37 stopniach celsjusza przez noc. Upewnij się, że łatki bakterii nie są zakłócane podczas przenoszenia nicieni do inkubatora 37 stopni celsjusza.
Nadmierne zakłócenie może zmienić lokalizację lub kształt plamki pokarmowej. Po nocnej inkubacji usuń płytki z inkubatora i używając zaznaczonej spodniej strony płytki jako przewodnika, pipetą pobierz 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego 0,5 molarnego roztworu siarczanu miedzi(II) na krawędź agaru, aby stworzyć zewnętrzną barierę miedzi. Pipetą pobierz 25 mikrolitrów roztworu siarczanu miedzi(II), aby stworzyć środkową barierę.
Upewnij się, że roztwór siarczanu miedzi(II) nie styka się z łatką bakterii i pozwól, aby roztwór miedzi wyschł na płytce. Sprawdzaj co pięć minut po przeniesieniu suchość za pomocą papieru laboratoryjnego, lekko przytłaczając roztwór w pobliżu krawędzi płytki, aby rozpoznać. Natychmiast przed testem przenieś eksperymentalne organizmy na płytkę agarową bez bakterii i pozwól nicieniom swobodnie poruszać się przez jedną minutę, aby usunąć nadmiar bakterii.
Następnie pipetą pobierz jeden mililitr M9 na płytkę z młodymi dorosłymi, które zostały przeniesione 24 godziny wcześniej, aby spłukać robaki do mikrocentrifugowej probówki. Wyśrodkuj nicienie przy 3 000 x G przez jedną minutę. Robaki powinny utworzyć osiadłość na dnie probówki.
Wysusz roztwór M9 bez zakłócania osiadłości robaków. Dodaj jeden mililitr roztworu M9 do osiadłości robaków. Odwróć probówkę, aby wymieszać robaki z roztworem.
Jeśli początkowo wraz z robakami zostało przeniesiona nadmiarowa ilość bakterii, powtórz całość pięć razy. Po ostatnim płukaniu wysusz nadstan do 100 mikrolitrów roztworu M9 i osiadłości robaków. Natychmiast przenieś robaki z roztworu po zakończeniu płukania.
Pipetą pobierz 20 mikrolitrów osiadłości robaków z dna probówki na wolną od bakterii połowę płytki testowej, upewnij się, że 10 robaków zostało przeniesionych na płytkę testową i że nie ma zanieczyszczającego pokarmu. Na płytki ścierania pokarmu miedzianego nie należy przenosić żadnych bakterii. Usuń nadmiar roztworu M9 z nicieni za pomocą papieru laboratoryjnego w ciągu jednej minuty.
Upewnij się, że roztwór M9 nie styka się z roztworem siarczanu miedzi(II) i że robaki i powierzchnia agaru pozostają nietknięte. Wyrzuć robaki, które zostały przypadkowo usunięte za pomocą papieru laboratoryjnego. Gdy roztwór M9 zostanie usunięty, a wszystkie robaki rozpoczęły nie-płynne wzorce ruchowe, czyli gdy przestaną się wzdrygać.
Rozpocznij sekundomierz testowy, jeśli przypadkowo włączono dodatkowe robaki, usuń je za pomocą halokarbonowego oleju, aby upewnić się, że żadne bakterie nie zostały dodane do płytki. Sprawdzaj płytki testowe co 30 minut. Dla płytek testowych z łatkami bakterii, przypisz pozytywny wynik organizmom, jeśli osiągną plamkę pokarmu w ciągu czterech godzin.
Dla negatywnych płytek kontrolnych, przypisz pozytywny wynik organizmom, jeśli przekroczą barierę. Wykorzystaliśmy mutację
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia specyficzny dla Caenorhabditis elegans test do oceny zachowania unikania miedzi i lokalizacji źródła pokarmu, gdy organizm przechodzi z stanu dobrze odżywionego do stanu głodnego.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka behawioralna
- Biologia nicieni
Tło
- Test ocenia reakcje nicieni na substancję chemiczną wywołującą odrazę i źródło pokarmu.
- Ocenia zmiany behawioralne w ciągu czterech godzin.
- Ta metoda identyfikuje mutanty, które nie dostosowują wzorców ruchowych w stanie głodu.
- Zezwalla na analizę statusu żywienia, gdy robaki stopniowo głodują.
Cel badania
- Ocenić zmiany w zachowaniu unikania miedzi u C. elegans.
- Ocenić zdolność do lokalizowania źródeł pokarmu w różnych stanach żywieniowych.
- Przyczynić się do zrozumienia reakcji behawioralnych w warunkach głodu.
Stosowane metody
- Test przeprowadzany w ciągu czterech godzin.
- Wykorzystanie nicieni w stadium L4 do testowania.
- Symultaniczne ocena statusu żywienia i zachowania.
- Wybór 10 nicieni w stadium L4 na każdy strumień do eksperymentu.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano zmiany behawioralne w reakcji na unikanie miedzi.
- Wykazano zdolność nicieni do lokalizowania źródeł pokarmu mimo głodu.
- Podkreślono skuteczność testu w badaniach neuronauki behawioralnej.
- Pokazano, że test można przedłużyć w czasie dla kompleksowej analizy.
Wnioski
- Test jest cennym narzędziem do badania reakcji behawioralnych u C. elegans.
- Pomaga w identyfikacji mutantów o zmienionych reakcjach unikania.
- Ta metoda poprawia zrozumienie wpływu statusu żywieniowego na zachowanie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This assay enables behavioral neuroscience researchers to evaluate how nutritional status modulates aversive responses in a genetically tractable model. By tracking copper aversion and food-seeking behavior over time, it supports mechanistic de-risking of targets involved in sensory integration and feeding regulation. The method provides predictive confidence for target validation in pathways linking metabolic state to behavioral output.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses about how nutritional status gates aversive chemical responses.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring locomotory pattern modulation in response to combined sensory cues.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying mutants that fail to integrate starvation signals with aversion behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening of compounds affecting sensory integration.
- Operational Value: Standardizes quantitative behavioral readouts over extended time courses to improve assay reproducibility.
- Scalability: Permits increased sample size for simultaneous evaluation of large populations, enhancing screening throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage behavioral phenotypes to preclinical models of feeding regulation and sensory processing.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing whether targets affect adaptive behavior under changing metabolic conditions.
- Mechanistic De-risking: Focuses on targets that modulate behavioral flexibility rather than static aversion or attraction.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for pathways linking nutritional state to behavioral output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how metabolic cues modulate aversive responses in neural circuits.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible quantification of barrier-crossing behavior over four hours.
- Analytics: Generates time-dependent behavioral measurements that enable comparison of genetic or pharmacological conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling how nutritional status affects decision-making in simple nervous systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating multiple targets in sensory integration and feeding behavior pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by revealing dynamic behavioral responses to combined aversive and appetitive cues.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through timed scoring and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose modulation fails to adapt behavior under metabolic stress.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by distinguishing between static sensory defects and dynamic integration deficits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode handling, behavioral observation, and timed assay execution.
- Depends on standardized agar plates, copper sulfate solution preparation, and bacterial lawn control.
- Necessitates cross-team standardization of scoring criteria for food-patch arrival and barrier-crossing events.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different genetic backgrounds or environmental stressors.
- Includes practical limitations such as avoiding physical disruption of copper barriers during worm transfers and maintaining consistent incubation conditions.
