Name: Oczyszczanie przedziału błony w celu degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj protokół izolacji pęcherzyków do oczyszczania przedziałów błonowych w prezentacji krzyżowej. Ta metoda umożliwia badanie degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w komórkach dendrytycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Uniwersytet Zdrowia i Opieki Społecznej w Takasaki.

1. Hodowla komórek i dodawanie antygenów egzogennych
<ol>
	<li>Przygotować bOVA za pomocą zestawu do znakowania biotyny i białka zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Zwykle bOVA zawiera średnio 2 M biotyny na 1 M OVA.</li>
	<li>Hoduj komórki DC2.4 w RPMI-1640 uzupełnione 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny, 55 mM 2-merkaptoetanolu, 10 mM HEPES (pH 7,5) i 10% płodowej surowicy cielęcej (zwanej dalej RPMI) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze (dalej bez wzmianki, komórki są inkubowane w tym stanie). Możliwe jest również stosowanie DMEM uzupełnionego o 10% płodową surowicę cielęcą, 3,7 g/L NaHCO3 (dalej DMEM) zamiast RPMI.</li>
	<li>Dzień przed oczyszczeniem podziel komórki na RPMI na 1 x 105 komórek/ml na płytce do hodowli tkankowej. Unikaj utrzymywania komórek w stanie zlewania się. Komórki DC2.4 mogą w dużym stopniu włączać antygeny egzogenne aż do stanu półzlewu, ale szybko tracą tę zdolność po osiągnięciu stanu nadmiernego zlewania się.</li>
	<li>Zanim komórki DC2.4 staną się częściowo zlewne, dodaj 250 μg/ml bOVA dla 1 x 106 komórek/ml i inkubuj przez 2 - 4 godziny 
	UWAGA: Podczas dalszych eksperymentów wszystkie i odczynniki są przechowywane w temperaturze 4 °C, chyba że wskazano inaczej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikrosomów
<ol>
	<li>Pobrać komórki DC2.4 przez delikatne pipetowanie z płytki tkankowej do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut, 4 °C i ostrożnie usunąć pożywkę z bOVA przez aspirację.</li>
	<li>Przepłukać komórki DC2.4 dwukrotnie 40 ml buforu PBS (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4) przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut, 4 °C i odrzucić supernatant za każdym razem przez aspirację.</li>
	<li>Zawiesić osad w kroku 2,3 w 1 - 2 ml (1/20-1/10 objętości pożywki hodowlanej) pożywki homogenizacyjnej (0,25 M sacharozy, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7,4]) z 1/1,000 objętości koktajli inhibitorów proteazy i przenieść zawieszone komórki DC2.4 do lodowatego homogenizatora Dounce.</li>
	<li>Delikatnie rozbić zawieszone komórki DC2.4 za pomocą 10 - 20 pociągnięć za pomocą lodowatego homogenizatora Dounce. 
	UWAGA: Podczas etapu przerywania homogenizator Dounce jest schładzany na lodzie.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę rozłożoną na komórki do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 8 - 9 ml pożywki homogenizacyjnej do 10 ml ogółem i odwirować stożkową probówkę przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu usunięcia nieuszkodzonych komórek i jąder, a następnie ponownie odwirować probówkę stożkową przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki do ultrawirowania i wirować przez 45 minut przy 100 000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad w 1-2 ml pożywki homogenizacyjnej z 1/1000 objętości koktajli inhibitorów proteazy, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę iw dół, aby uzyskać frakcję mikrosomową do dalszych eksperymentów.</li>
	<li>Przenieść frakcję mikrosomową do nowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. 
	UWAGA: Po tym etapie możliwe jest wzbogacenie obiektywnych mikrosomów poprzez wirowanie w gradicycie gęstości jodiksanolu zgodnie z protokołem producenta, w celu usunięcia niespecyficznych mikrosomów. Frakcje pikowe antygenów egzogennych są zbierane, a następnie poddawane kolejnemu etapowi oczyszczania (etap 3).</li>
</ol>
3. Oczyszczanie mikrosomów za pomocą bOVA w trakcie ERAD
<ol>
	<li>Dodać 1/100 objętości świeżych kulek magnetycznych SA do frakcji mikrosomowej z kroku 2.11 w probówce o okrągłym dnie 5 ml. 
	UWAGA: Przed tym etapem możliwe jest wstępne oczyszczenie frakcji mikrosomowej za pomocą kontrolnych kulek magnetycznych w celu zmniejszenia zanieczyszczenia mikrosomami niespecyficznymi.</li>
	<li>Delikatnie dobrze wymieszać i powoli obracać rurkę z okrągłym dnem przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 2-3 ml pożywki homogenizacyjnej do łącznie 4 ml do probówki z okrągłym dnem i delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Umieścić probówkę z okrągłym dnem na stojaku magnetycznym i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponieważ kulki związane z pęcherzykami są przyciągane do magnesu, brązowe mikrokulki będą stopniowo gromadzić się na ściance rurki znajdującej się najbliżej magnesu.</li>
	<li>Trzymając probówkę w stojaku magnetycznym, ostrożnie wyrzuć supernatanty przez aspirację w celu usunięcia niezwiązanych pęcherzyków.</li>
	<li>Przemyć kulki magnetyczne związane z pęcherzykami dwukrotnie 5 ml pożywki homogenizacyjnej za pomocą stojaka magnetycznego przez 10 minut w temperaturze 4 °C i za każdym razem odrzucić supernatant przez ostrożne zasysanie. 
	UWAGA: Bez podstawy magnetycznej możliwe jest również oczyszczanie przez wirowanie przy 2 000 x g przez 10 minut, 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zawiesić kulki magnetyczne związane z pęcherzykami w pożywce homogenizacyjnej o pojemności 100 μl, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieś zawieszone pęcherzyki do nowej mikroprobówki jako oczyszczony mikrosom do dalszych eksperymentów. 
	UWAGA: Zazwyczaj można wyizolować 50 μl frakcji mikrosomowej zawierającej 5 - 20 μg białek z 1 x 107 komórek.</li>
</ol>
4. Analiza oczyszczonych mikrosomów
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić kulki magnetyczne związane z pęcherzykami z kroku 3.8 za pomocą 100 - 200 μl buforu TNE (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) z 1/1,000 objętości koktajli inhibitorów proteazy zamiast pożywki homogenizującej.</li>
	<li>Przenieś lizat z kroku 4.1 do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Określić stężenie białka w kroku 4.2 za pomocą zestawu do oznaczania BCA zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Zazwyczaj do określenia stężenia białka wystarcza 5 - 10 μl lizatu z kroku 4.2.</li>
	<li>Przenieś lizat z kroku 4.2 (2 μg białka do barwienia srebrem i 10 μg białka do Western blotting) do nowych mikroprobówek.</li>
	<li>Umieść mikroprobówki na bloku grzewczym w temperaturze 95 °C i gotuj białka w 1x buforze ładującym żel SDS (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 200 mM ditiotreitol, 4% SDS, 0,2% błękit bromofenolowy, 20% glicerol) przez 5 minut.</li>
	<li>Odwirować mikroprobówki przez 10 minut w temperaturze 21 500 x g i temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty do nowych mikroprobówek w celu usunięcia nierozpuszczalnych frakcji.</li>
	<li>Analizować rozwiązane białka w kroku 4.6 (2 μg) za pomocą standardowej SD-PAGE.</li>
	<li>Zwizualizuj prążki białkowe przez barwienie srebrem za pomocą zestawu do barwienia srebra zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Analizuj rozwiązane białka w kroku 4.6 (10 μg) za pomocą standardowego SD-PAGE i Western-blotting. Użyj odczynnika (SA-HRP) zgodnie z protokołem producenta i wizualizuj za pomocą fluorografii.</li>
</ol>
5. Rekonstrukcja in vitro ERAD Ubikwitynacja bOVA przy użyciu oczyszczonych mikrosomów
<ol>
	<li>Przenieś oczyszczone mikrosomy (5 - 10 μg białka) z kroku 3.8 z 50% objętością lizatu retikulocytów (RL), w 1x buforze reakcyjnym (50 mM Tris pH 7,4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl2) i 0,2 pM ubikwityny znakowanej flagą w nowej mikroprobówce. Końcowa objętość tego eksperymentu to 20 - 40 μL.</li>
	<li>Inkubować mikroprobówkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Jeśli ilość ubikwitynowanego bOVA w kroku 5.12 jest zbyt mała, aby można ją było wykryć za pomocą Western blot, dodaj 10 μM MG132 lub 2 μM laktacystyny, aby zahamować przetwarzanie ubikwitynowanej bOVA przez proteasomy.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję, umieszczając mikroprobówkę na lodzie.</li>
	<li>Rozpuścić mikrosomy, dodając 500 μl buforu TNE z 1/1,000 objętości koktajli inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Odwirować mikroprobówkę przez 10 minut w temperaturze 21 500 x g i temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty do nowej mikroprobówki w celu usunięcia nierozpuszczalnych frakcji, które zawierają ubikwitynowane bOVA w DC2.4 przed testem ubikwitynacji in vitro.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej mikroprobówki i dodać 1/100 objętości nowych kulek magnetycznych SA (zwykle 5 μl na 500 μl supernatantów).</li>
	<li>Delikatnie dobrze wymieszać i powoli obracać mikroprobówkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować mikroprobówkę przez 10 minut w temperaturze 21 500 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez aspirację w celu odzyskania bOVA i ubikwitynowanych bOVA związanych kulkami magnetycznymi SA.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie zebrane kulki magnetyczne SA 1 ml buforu TNE przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 21 500 x g i w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant za każdym razem przez aspirację.</li>
	<li>Gotować kulki magnetyczne SA w 1x bufor ładujący żel SDS przez 5 minut w temperaturze 95 °C na bloku grzewczym, aby rozpuścić oczyszczone białka za pomocą kulek magnetycznych SA.</li>
	<li>Odwirować mikroprobówkę przez 10 minut w temperaturze 21 500 x g i temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty do nowej mikroprobówki w celu usunięcia nierozpuszczalnych frakcji.</li>
	<li>Przeanalizuj kulki magnetyczne SA związane z białkami za pomocą standardowej SD-PAGE i Western-bloting. Stosowanie przeciwciał (anty-Flag, anty-multi-Ub i anty-mysich IgG-HRP) oraz odczynnika (SA-HRP) jest zgodne z protokołem producenta i wizualizowane za pomocą fluorografii.</li>
</ol>

<ol><li>van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Providing+ligands+for+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Providing ligands for MHC class I molecules.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).</li>
<li>Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+C+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).</li>
<li>McDevitt, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+the+role+of+the+major+histocompatibility+complex+in+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response.</a> Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).</li>
<li>Bedoui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+viral+and+self+antigens+by+skin-derived+CD103%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells.</a> Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).</li>
<li>Segura, E., Villadangos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by dendritic cells in vivo.</a> Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).</li>
<li>Cheong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+stimulation+fully+differentiates+monocytes+to+DC-SIGN%2FCD209%28%2B%29+dendritic+cells+for+immune+T+cell+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas.</a> Cell. 143 (3), 416-429 (2010).</li>
<li>Henri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).</li>
<li>Shortman, K., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD8%2B+dendritic+cell+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The CD8+ dendritic cell subset.</a> Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).</li>
<li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation%3A+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li>
<li>Nair-Gupta, P., Blander, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+view+of+the+intracellular+mechanisms+regulating+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation.</a> Front Immunol. , (2013).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Kurts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).</li>
<li>Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I-restricted+cross-presentation+of+exogenous+self-antigens+leads+to+deletion+of+autoreactive+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells.</a> J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).</li>
<li>Bonifaz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+protein+antigen+to+the+dendritic+cell+receptor+DEC-205+in+the+steady+state+leads+to+antigen+presentation+on+major+histocompatibility+complex+class+I+products+and+peripheral+CD8%2B+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance.</a> J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).</li>
<li>Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+in+viral+immunity+and+self-tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance.</a> Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).</li>
<li>Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+antigens+are+processed+through+the+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+%28ERAD%29+in+cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells.</a> Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).</li>
<li>Houde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+are+competent+organelles+for+antigen+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation.</a> Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).</li>
<li>Guermonprez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-phagosome+fusion+defines+an+MHC+class+I+cross-presentation+compartment+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells.</a> Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).</li>
<li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).</li>
<li>Lizée, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+cell+cross-presentation+by+the+major+histocompatibility+complex+class+I+cytoplasmic+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain.</a> Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).</li>
<li>Basha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD74-dependent+MHC+class+I+endolysosomal+cross-presentation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway.</a> Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).</li>
<li>Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity%2C+contradictions%2C+and+conundrums%3A+studying+post-proteasomal+proteolysis+in+HLA+class+I+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation.</a> Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).</li>
<li>Wiertz, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec61-mediated+transfer+of+a+membrane+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+to+the+proteasome+for+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction.</a> Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).</li>
<li>Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+degradation+in+protein+quality+control+and+cellular+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).</li>
<li>Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-translocation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum+into+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).</li>
<li>Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+targeting+and+translocation+of+proteins+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).</li>
<li>Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein homeostasis.</a> IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).</li>
<li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li>
<li>Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+subcellular+compartment+in+which+exogenous+antigens+undergo+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells.</a> Heliyon. , (2016).</li>
<li>Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phagosome-to-cytosol+pathway+for+exogenous+antigens+presented+on+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules.</a> Science. 267 (5195), 243-246 (1995).</li>
<li>Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761306004262">A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells.</a> Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).</li>
<li>Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phagosomes+in+dendritic+cells+form+a+cellular+compartment+sufficient+for+cross+presentation+of+exogenous+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).</li>
<li>Saveanu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRAP+identifies+an+endosomal+compartment+required+for+MHC+class+I+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation.</a> Science. 325 (5937), 213-217 (2009).</li>
<li>Zehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translocon+protein+Sec61+mediates+antigen+transport+from+endosomes+in+the+cytosol+for+cross-presentation+to+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells.</a> Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W poprzednich badaniach CP włączone antygeny egzogenne gromadziły się w ograniczonym obszarze późnego endosomu lub ER za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej 16,30,31,32. Szacuje się, że podobny do ERAD transport i przetwarzanie egzogennych antygenów odbywa się w tych wyspecjalizowanych obszarach ER lub późnego endosomu, ponieważ przedział komórkowy został zidentyfikowany przez wirowanie w...

Cząsteczki MHC I są wyrażane na powierzchni wszystkich komórek jądrzastych, za pomocą krótkich peptydów antygenowych pochodzących z antygenów endogennych, które są przetwarzane przez układ ubikwityna-proteasom w cytozolu1. Po przetworzeniu peptydy antygenowe są transportowane do światła retikulum endoplazmatycznego (ER) przez transporter peptydów TAP. W świetle ER szereg specyficznych białek opiekuńczych wspomaga ładowanie peptydów i prawidłowe fałdowanie kompleksu MHC I. Ta seria cząsteczek nazywana jest kompleksem ładującym peptydy (PLC), co wskazuje, że ER jest centralnym przedziałem do ładowania peptydów na MHC I2. Po załadowaniu peptydami cząsteczki MHC I są transportowane na powierzchnię komórki i odgrywają kluczową rolę w adaptacyjnym układzie odpornościowym jako automarkery i umożliwiają cytotoksycznym limfocytom T CD8 + (CTL) wykrywanie komórek rakowych lub czynników zakaźnych przez peptydy antygenowe z białek innych niż selfs3.
W komórkach prezentujących antygen (APC), peptydy antygenowe z antygenów egzogennych są również prezentowane na MHC I4,5,6,7,8 przez CP, który jest głównie realizowany przez DCs9,10,11. CP jest niezbędny zarówno do aktywacji naiwnych limfocytów T CD8 + i limfocytów T pamięci CD8 + do przeciwzakaźnych i przeciwnowotworowych CTL12,13, jak i do utrzymania tolerancji immunologicznej poprzez inaktywację samoczynnych naiwnych limfocytów T14,15. CP odgrywa wiele ważnych ról w adaptacyjnym układzie odpornościowym, jednak mechanizmy molekularne CP nie zostały jeszcze szczegółowo opisane. Wcześniejsze badania CP wykazały, że antygeny egzogenne były zlokalizowane zarówno w ER, jak i endosomie i były przetwarzane przez ERAD, co sugeruje, że antygeny egzogenne są transportowane z endosomu do ER w celu przetwarzania podobnego do ERAD i ładowania peptydów16. Jednak coraz więcej dowodów wskazuje, że obciążenie peptydowe CP nie odbywa się w ER, ale raczej w nieklasycznych przedziałach endocytarnych, które również mają charakterystyczne cechy ER (Rysunek 1)17,18,19,20,21. Aby uniknąć degradacji prekursorów peptydów antygenowych przez wysoką aktywność aminopeptydazy22 w cytozolu, przetwarzanie i ładowanie peptydów w CP zachodzi w proksymalnym obszarze tych nieklasycznych przedziałów endocytarnych (Figura 1). Chociaż charakterystyka tych przedziałów endocytarnych jest kontrowersyjna, w tym przedziale nie ma istniejących specyficznych cząsteczek innych niż antygeny egzogenne.
ERAD to ścieżka komórkowa, która usuwa nieprawidłowo sfałdowane białka z ER. W szlaku ERAD nieprawidłowo sfałdowane białka są wstecznie transportowane przez błonę ER do cytoplazmy i przetwarzane przez układ ubikwityna-proteasom23,24,25. Kiedy duże cząsteczki, takie jak białka, są transportowane przez dwuwarstwę lipidową, cząsteczki te przechodzą przez aparat molekularny zwany translokonem, taki jak kompleks Sec61 i kompleks Derlin w klasie ER<sup="xref">26, oraz kompleks Tom i kompleks Tim w mitochondriach27. Kiedy egzogennie dodane antygeny są transportowane przez błonę ER, muszą przeniknąć do dwuwarstwy lipidowej w kompleksie z translokonami, takimi jak kompleks Sec61. Opisana tutaj metoda oczyściła docelowy pęcherzyk, wykorzystując te cząsteczki przenikające przez błonę jako markery przedziałów endocytarnych.
Opisana tutaj metoda to nowy protokół oczyszczania pęcherzyków przy użyciu linii komórkowej podobnej do DC2.428 i biotynylowanej albuminy jaja kurzego (bOVA) jako egzogennego antygenu. Przedziały endocytarne oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych streptawidyny (SA) przy użyciu przenikającego przez błonę bOVA jako wytwórcy. W tym oczyszczonym mikrosomie niektóre egzogennie dodane bOVA były nadal zachowane we frakcjach błonowych, ale zostały przetransportowane na zewnątrz mikrosomu, a następnie ubikwitynowane i przetworzone in vitro29. Ten oczyszczony mikrosom zawierał nie tylko białka specyficzne dla endocytarnych kompartmentów, ale także białka rezydujące w ER dla ERAD i kompleksu ładowania peptydów; sugerując, że przedział komórkowy jest prospektywnym przedziałem endocytarnym dla CP29. Protokół ten nie jest zależny od rodzaju egzogennych antygenów i ma również zastosowanie do innych podzbiorów DC i innych typów komórek, takich jak makrofagi, limfocyty B i komórki śródbłonka, w celu wyjaśnienia dokładnego mechanizmu molekularnego DC dla biegłego CP.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco by life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Equitech bio</td><td>SFB30</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>gibco by life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM endogenne aminokwasy</td><td>gibco by life technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco by life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>gibco firmy life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>gibco firmy life technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Penistycylina-sreptomycyna</td><td>gibco firmy life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco firmy life technologies</td><td>12100-46</td><td></td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-białko zestaw do etykietowania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F6347</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>laktacystyna</td><td>SIGMA</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce</td><td>IUCHI</td><td>131703</td><td></td></tr><tr><td>koktajle inhibitorów proteazy</td><td>SIGMA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>jodixanol</td><td>Cosmo bio</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne SA</td><td>New England Biolabs</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>kontrolne kulki magnetyczne</td><td>Chemagen</td><td>M-PVA012</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td> Zestawy do barwienia srebra <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cosmo bio</td><td>423413</td><td></td></tr><tr><td>Lysate retikulocytów</td><td>Promega</td><td></td><td></td>1730714</tr><tr><td>Flaga oznaczona ubikwityną</td><td>SIGMA</td><td>U5382</td><td></td></tr><tr><td>anty-albumina jaja kurzego (OVA,mysz)</td><td>Sklep z przeciwciałami</td><td>HYB 094-06</td><td></td></tr><tr><td>ant-multi-ubikwityna (mysz)</td><td>MBL</td><td>D058&minus; </td><td></td>3</tr><tr><td>antyflagowe (mysz)</td><td>SIGMA</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>SIGMA</td><td>85450C</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie przedziału błony w celu degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Komórki dendrytyczne (DC) są wysoce zdolne do przetwarzania i prezentowania zinternalizowanych egzogennych antygenów na głównych cząsteczkach klasy zgodności tkankowej (MHC) I, znanych również jako prezentacja krzyżowa (CP). CP odgrywa ważną rolę nie tylko w stymulacji naiwnych limfocytów T CD8 + i limfocytów T pamięci CD8 + w celu uzyskania odporności zakaźnej i nowotworowej, ale także w inaktywacji samoczynnych naiwnych limfocytów T przez anergię limfocytów T lub delecję limfocytów T. Chociaż krytyczny mechanizm molekularny CP pozostaje do wyjaśnienia, coraz więcej dowodów wskazuje, że antygeny egzogenne są przetwarzane przez degradację związaną z retikulum endoplazmatycznym (ERAD) po eksporcie z nieklasycznych kompartmentów endocytarnych. Do niedawna charakterystyka tych przedziałów endocytarnych była ograniczona, ponieważ nie było specyficznych markerów molekularnych innych niż antygeny egzogenne. Opisana tutaj metoda to nowy protokół izolacji pęcherzyków, który pozwala na oczyszczenie tych przedziałów endocytarnych. Używając tego oczyszczonego mikrosomu, odtworzyliśmy podobny do ERAD transport, ubikwitynację i przetwarzanie egzogennego antygenu in vitro, co sugeruje, że układ ubikwityna-proteasom przetworzył egzogenny antygen po eksporcie z tego przedziału komórkowego. Protokół ten można dalej zastosować do innych typów komórek w celu wyjaśnienia mechanizmu molekularnego CP.

Aby wyjaśnić mechanizm molekularny CP, konieczne jest zidentyfikowanie przedziałów komórkowych, w których egzogenne antygeny podlegają transportowi i przetwarzaniu typu ERAD. Choć obserwacje z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej lub elektronowej pozwoliły zidentyfikować przedziały komórkowe, w których gromadziły się egzogenne antygeny16,17,18,1<sup...

Opisana tutaj metoda to nowy protokół izolacji pęcherzyków, który pozwala na oczyszczanie przedziałów komórkowych, w których egzogenne antygeny są przetwarzane przez degradację związaną z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej.

Oczyszczanie przedziału błony w celu degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest oczyszczenie przedziału błoniastego, w którym odbywa się degradacja egzogennych antygenów w procesie prezentacji krzyżowej, przebiegająca na wzór ERAD. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii, takie jak wyjaśnienie roli przedziału komórkowego lub degradacji typu ERAD w prezentacji krzyżowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że oczyszczone pęcherzyki zawierają wszystkie komponenty molekularne. Umożliwia to degradację wszystkich antygenów egzogennych na wzór ERAD. W związku z tym metoda ta może dostarczyć wglądu w mechanizmy prezentacji krzyżowej. Przez komórki dendrytyczne, może ona zostać zastosowana również do innych typów komórek prezentujących antygen, które wykazują zdolność do prezentacji krzyżowej. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ niemożliwe jest całkowite wykluczenie niespecyficznego tła. Na dzień przed oczyszczaniem, rozsiej komórki DC2.4 do stężenia 0,1 miliona komórek na mL w płytce do hodowli tkanek w buforze RPMI. Unikaj doprowadzenia komórek do stanu konfluencji, aby zwiększyć prawdopodobieństwo wbudowania antygenu egzogennego. Zanim komórki DC2.4 osiągną stan półkonfluencji, dodaj biotynylaną owalbuminę (bOVA) jako antygen egzogenny. Następnie inkubuj przez dwie do czterech godzin. Zbierz komórki, delikatnie pipetując je z płytki do hodowli do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Centryfuguj komórki przy 1000 X G przez pięć minut w temperaturze 4

purification-membrane-compartment-for-endoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Ten artykuł opisuje protokół oczyszczania fragmentów zewnętrznych segmentów fotoreceptorów (POS) poprzez ultrawirowanie z siatkówki świni/bydła przy użyciu homogenizacji i wirowania w gradionym smaku sacharozy. Protokół ten pozwala na przygotowanie dużych zapasów porcji POS, oznakowanych lub nieoznakowanych, które mogą być następnie przechowywane w temperaturze -80 °C.

Oczyszczanie na dużą skalę zewnętrznych segmentów fotoreceptorów świń lub bydła do oznaczania fagocytozy na komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki

Ten protokół opisuje usuwanie endogennych lipidów z alergenów i zastępowanie ich określonymi przez użytkownika ligandami poprzez HPLC z odwróconą fazą w połączeniu z wyżarzaniem termicznym. Rozdział 31P-NMR i dichroizm kołowy pozwalają na szybkie potwierdzenie usunięcia/obciążenia liganda i odzyskanie natywnej struktury alergenu.

Usuwanie i zastępowanie endogennych ligandów z białek i alergenów związanych z lipidami

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół rekonstytucji aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami w zdefiniowanych proteoliposomach.

Rekonstrukcja aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Ten protokół opisuje ulepszoną metodę oczyszczania SERCA, która obejmuje trehalozę disacharydową w końcowym etapie wirowania. Węglowodan ten stabilizuje białka w trudnych warunkach. Oczyszczone SERCA było aktywne katalitycznie i wykazywało wysoką czystość, dzięki czemu nadawało się do badań strukturalnych i funkcjonalnych.

Oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej Ca2+-ATPazy z mięśni królika

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Przedstawiono modyfikację błony komórkowej czerwonych krwinek (RBC) za pomocą hiperrozgałęzionego poliglicerolu (HPG). Zmodyfikowane erytrocyty charakteryzowały się wodnym dwufazowym podziałem, kruchością osmotyczną i lizą za pośrednictwem dopełniacza. Kamuflaż białek powierzchniowych i antygenów oceniano za pomocą kart do fenotypowania krwi za pomocą cytometrii przepływowej i systemu mikrotypowania (MTS).

Antygeny chroniły funkcjonalne czerwone krwinki przez szczepienie błonowe zwartych, hiperrozgałęzionych poligliceroli

W przeciwieństwie do tego, co obserwuje się u eukariontów, istnieje niedostatek badań, które szczegółowo opisują depolaryzację błony i zmiany stężenia jonów u bakterii, przede wszystkim dlatego, że ich mały rozmiar utrudnia konwencjonalne metody pomiaru. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokoły monitorowania takich zdarzeń w znaczącym patogenie Gram-dodatnim Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem technik fluorescencyjnych.

Monitorowanie zmian polarności błony, integralności błony i stężeń jonów wewnątrzkomórkowych w Streptococcus pneumoniae przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Tutaj opisujemy metodę izolacji bakteryjnego RNA z bakterii Listeria monocytogenes rosnących wewnątrz mysich makrofagów. Technika ta może być stosowana z innymi patogenami wewnątrzkomórkowymi i komórkami gospodarza ssaków.

Oczyszczanie RNA z wewnątrzkomórkowych hodowanych Listeria monocytogenes w komórkach makrofagów

Poznaj protokół izolacji pęcherzyków do oczyszczania przedziałów błonowych w prezentacji krzyżowej. Ta metoda umożliwia badanie degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w komórkach dendrytycznych.

Oczyszczanie przedziału błony w celu degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie przedziału błony w celu degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej

Przeglądaj więcej filmów