Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis
4 sierpnia 2017
Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.
Ogólnym celem tej metody jest scharakteryzowanie wzorca formowania się zarodków podczas embriogenezy roślin przy użyciu organizmu modelowego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie materii roślinnej, takie jak embriogeneza u rzodkiewnika. Główną zaletą tej techniki jest to, że tworzenie wzoru zarodka w roślinie modelowej Arabidopsis można scharakteryzować za pomocą zalecanej operacji.
Procedurę demonstruje Jinlin Feng, doktorantka z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 100 nasion do 1,5 mililitrowej probówki. Dodaj jeden mililitr podchlorynu sodu, aby wysterylizować nasiona.
Odwróć probówkę kilka razy, aby upewnić się, że nasiona i roztwór są dobrze wymieszane. Po pięciu minutach odwirować probówkę o sile 1200 g przez 30 sekund. Usunąć sklarowany osad i przemyć nasiona sterylną wodą cztery razy, aby usunąć wszelkie pozostałości podchlorynu sodu.
Następnie dodaj 4,4 grama mieszaniny soli podstawowej MS i 10 gramów sacharozy do jednego litra ultra czystej wody. Mieszaj, aby rozpuścić sól i sacharozę. Używając wodorotlenku potasu o stężeniu jednego mola, dostosuj pH roztworu do 5,8.
Następnie dodaj trzy gramy środka żelującego i sterylizuj roztwór w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Wlej 30 mililitrów powstałej pożywki MS do 12-centymetrowego naczynia hodowlanego. Umieść wysterylizowane nasiona na talerzu MS.
Przenieś talerz do lodówki i trzymaj go w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy dni, aby rozwarstwić nasiona. Następnie trzymaj płytkę w komorze wzrostowej w warunkach długiego dnia przez osiem dni. Następnie przenieś rośliny do gleby na tacy.
Przykryj tacę przezroczystą białą pokrywką, aby zapobiec utracie wody. Pozostawienie niewielkiej szczeliny, aby uniknąć witryfikacji roślin. Po pięciu dniach zdejmij pokrywkę i uprawiaj rośliny w komorze walk-in w warunkach długiego dnia.
Po około 20 dniach wzrostu za pomocą nici zaznacz od 10 do 15 pąków kwiatowych w miejscu łodyg nasiennych i kwiatostanu o godzinie 20:00. Określ początek zapylania zalążka, kiedy zaznaczone pąki otwierają się do kwitnienia, na godzinę 8:00 następnego ranka. Aby rozpocząć przygotowywanie roztworu Hoyera, dodaj 24 gramy chlorohydratu do 50-mililitrowej probówki. Owiń tubę całkowicie folią aluminiową, upewniając się, że folia uszczelnia całe światło.
Dodaj dziewięć mililitrów ultra czystej wody i trzy mililitry glicerolu. Wstrząsnąć probówką, aby rozpuścić chlorhydrat. Następnie pozostaw przygotowany roztwór Hoyera na noc w temperaturze pokojowej, aby wyeliminować wszelkie pęcherzyki.
Aby rozpocząć, przymocuj kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szkiełka mikroskopowego. Umieść krzemionkę, rosnącą przez żądaną liczbę dni po zapyleniu, po stronie z przegrodą rzekomą prostopadłą do powierzchni. Za pomocą igły strzykawkowej rozłup nadgarstki po obu stronach przegrody rzekomej.
Następnie przymocuj dwa wypreparowane nadgarstki do szkiełka tak, aby zalążki i krzemionka były widoczne pod stereoskopem. Dozować 70 mikrolitrów roztworu Hoyera na szkiełko podstawowe. Następnie zanurz pęsetę z cienką końcówką w roztworze, aby zwilżyć końcówkę.
Za pomocą stereoskopu i pęsety przenieś zalążki do roztworu Hoyera, aby oczyścić zarodki. Następnie delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na szkiełko, uważając, aby nie wytworzyć żadnych pęcherzyków. Gotowe szkiełko umieszczono w pudełku w ciemnym pomieszczeniu na dwie do 12 godzin w temperaturze pokojowej.
Po upływie niezbędnego czasu użyj funkcji DIC mikroskopu, aby zbadać oczyszczone zalążki. Umieść zarodki w polu o niskim natężeniu, a następnie zmień je na pole o dużej mocy, aby obserwować wzorzec komórkowy w rozwiniętych zarodkach. Następnie zbadaj zarodki na różnych etapach rozwoju.
Na początek przygotuj plazmid DR5 GFP i wprowadź go do roślin typu dzikiego przez transformację za pośrednictwem agrobacterium do metasów, jak opisano w protokole tekstowym. Wybierz rośliny T1 za pomocą pożywki MS zawierającej hydrolizynę. Następnie przenieś i uprawiaj rośliny zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby uzyskać rośliny T3.
Za pomocą nici zaznacz pąki kwiatowe homozygotycznej rośliny T3 w miejscu, w którym łodygi nasienne znajdują się w kwiatostanie o godzinie 20:00. Następnie wymieszaj trzy mililitry glicerolu z 47 mililitrami ultra czystej wody, aby uzyskać 6% roztwór glicerolu. Następnie przymocuj kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szkiełka mikroskopowego. Umieść krzemionkę rośliny T3 na szkiełku z przegrodą rzekomą prostopadłą do powierzchni.
Za pomocą igły strzykawkowej rozłup nadgarstki po obu stronach przegrody rzekomej. Przymocuj dwa wypreparowane nadgarstki do szkiełka tak, aby zalążki i krzemionka były widoczne pod stereoskopem. Następnie nałóż 30 mikrolitrów 6% glicerolu na szkiełko.
Zanurz pęsetę z cienką końcówką w roztworze, aby zwilżyć końcówkę. Za pomocą stereoskopu i pęsety przenieś zalążki do roztworu glicerolu. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku.
Następnie szybko i delikatnie dotknij szkiełka, aby wyciągnąć zarodek z zalążka. Następnie użyj konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, aby zbadać szkiełko pod kątem fluorescencji białek zielonej fluorescencji. Znajdź wyizolowane zarodki pod polem o niskim natężeniu mocy i zapisz ich lokalizację.
Zmień pole na pole o dużej mocy i ustaw źródło światła wzbudzenia na 488 nanometrów, aby obserwować ekspresję GR5 GFP w zarodkach. Następnie wykryj ekspresję GFP i scharakteryzuj tworzenie się wzorca zarodka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu embriogenezę u Arabidopsis obserwuje się poprzez klirens zalążka, jak widać.
Po usunięciu zalążka zarodki w różnych stadiach rozwoju można rozróżnić za pomocą mikroskopii kontrastowej z różnicową interferencją. Wzorzec ekspresji GR5 GFP podczas embriogenezy jest następnie rejestrowany pod konfokalną laserową mikroskopią skaningową. Obserwuje się, że DR5 ulega ekspresji w biegunie korzeniowym zarodków kulistych i sercowych typu dzikiego.
DR5 ulega ekspresji w zarodkowych końcach liścieni oraz w unaczynieniu dojrzałych zarodków typu dzikiego. Następnie badana jest rola naa10 w Arabidopsis podczas embriogenezy. Zaobserwowano nieprawidłowy podział, z podziałem skośnym i pionowym w naa10 w porównaniu z poprzecznym podziałem asymetrycznym u roślin typu dzikiego.
Woły mają prawie równomierny rozkład w większości zarodków naa10 w stadium kulistym i zachowują szerszy sygnał w hipotezach w porównaniu z zarodkami typu dzikiego. Wyniki te wskazują, że naa10 jest niezbędny do embriogenezy i że może być wywoływany przez szlak sygnałowy wołów u Arabidopsis. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, jak uprawiać rzodkiewnik jako materiał roślinny.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne środki, takie jak hybrydyzacja in-situ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ekspresja genów specyficznych dla komórki. Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się embriogenezą do zbadania mechanizmu molekularnego, za pomocą którego określone geny pośredniczą w embriogenezie rzodkiewnika. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak scharakteryzować embriogenezę u Arabidopsis.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół charakterystyki formowania się wzorców podczas embriogenezy u Arabidopsis z wykorzystaniem technik mikroskopowych. Metoda ta umożliwia badaczom obserwację morfologii zarodka, liczby komórek i etapu rozwoju, a także monitorowanie ekspresji białek markerowych, takich jak konstrukty znakowane GFP, co ułatwia badanie funkcji genów w procesie wzorcowania zarodka roślin.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju roślin
- Embriogeneza
- Mikroskopia
Wstęp
- Arabidopsis zarodki stanowią model do badania morfogenezy roślin ze względu na ich przewidywalny rozwój.
- Zarodki roślin we wczesnych stadiach są małe i zawierają niewiele komórek, co utrudnia ich analizę.
- Techniki mikroskopowe pozwalają na ujawnienie szczegółów komórkowych i molekularnych rozwoju zarodka.
- Białka markerowe, takie jak GFP, umożliwiają wizualizację wzorców ekspresji genów podczas embriogenezy.
Cel badania
- Aby zapewnić powtarzalną metodę obserwacji i analizy tworzenia wzorów w embrionach Arabidopsis.
- Aby umożliwić badanie specyfikacji tożsamości komórek i funkcji genów podczas embriogenezy.
- Aby porównać embriony typu dzikiego oraz mutanty w celu uzyskania informacji o roli genów w rozwoju.
Zastosowane metody
- Sterylizacja i stratyfikacja nasion Arabidopsis, a następnie wzrost na podłożu MS oraz w glebie.
- Disekcjatorek i zalążków, a następnie wyjaśnianie embrionów przy użyciu roztworu Hoyera.
- Mikroskopia kontrastowa interferencyjna (DIC) w celu obserwacji morfologii i etapów rozwoju embrionów.
- Generowanie i analiza roślin transgenicznych wykazujących ekspresję białek markerowych znaczonych GFP (np. DR5::GFP) z wykorzystaniem konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej.
Główne wyniki
- Oczyszczone zalążki umożliwiają wizualizację embrionów na różnych etapach rozwoju przy użyciu mikroskopii DIC.
- Wzorce ekspresji GFP (np. DR5::GFP) ujawniają rozkład auksyny i tożsamość komórek podczas embriogenezy.
- Embriony typu dzikiego wykazują specyficzną ekspresję DR5 w biegunie korzeniowym, wierzchołkach liści zasłoniętych oraz w układzie naczyniowym.
- Embriony mutanta naa10 wykazują nieprawidłowe wzorce podziałów komórkowych i zmieniony rozkład auksyny, co wskazuje na rolę NAA10 w embriogenezie poprzez szlak sygnalizacyjny auksyn.
Wnioski
- Opisana metoda umożliwia szczegółową analizę komórkową i molekularną embriogenezy Arabidopsis.
- Ułatwia ona badanie funkcji genów w kształtowaniu wzorca zarodka poprzez porównanie zarodków typu dzikiego i mutantów.
- Podejście to można rozszerzyć o dodatkowe techniki, takie jak hybrydyzacja in situ, w celu przeprowadzenia dalszych badań molekularnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia precyzyjną obserwację embriogenezy u Arabidopsis, wspierając walidację celów w badaniach nad biofarmaceutykami roślinnymi. Poprzez charakteryzację formowania wzorców na poziomie komórkowym i molekularnym, pomaga w mechanistycznym ograniczaniu ryzyka w badaniach nad funkcjami genów istotnymi dla agrigenomiki i platform terapeutycznych opartych na rozwiązaniach biologicznych. Podejście to zapewnia pewność prognostyczną dla dalszych zastosowań w syntetycznej biologii roślin oraz w procesach rozwoju cech.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację wad embriogenezy u mutantów genowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez korelację przerwania ekspresji genu z aberracyjnymi wzorcami podziałów komórkowych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów badawczych poprzez identyfikację genów niezbędnych dla embriogenezy, co pozwala na priorytetyzację celów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do przesiewowego badania fenotypowego związków modulujących embriogenezę.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie standaryzacji testu poprzez powtarzalne oczyszczanie zalążków i odczyty z mikroskopii DIC.
- Skalowalność: Wsparcie ponownego wykorzystania platformy w liniach typu dzikiego oraz zmutowanych w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje embriogenezy w fazie odkryć z przedkliniczną walidacją funkcji genów w systemach roślinnych.
- Dopasowanie biomarkerów: Wykorzystuje ekspresję DR5-GFP jako biomarker translacyjny dla specyfikacji bieguna korzenia i układu naczyniowego podczas wzorowania.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o konserwację fenotypów embriogenezy w różnych tłach genetycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację leadów w systemach roślinnych, wspierając zrozumienie mechanizmów przed screeningiem związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie obserwacji formowania się wzorców embriogenezy w embrionach typu dzikiego oraz mutantach.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość do analizy poprzez zstandaryzowaną izolację embrionów i mikroskopię konfokalną w celu detekcji reporterów opartych na GFP.
- Analityka: Wyróżnia wyniki ilościowe, takie jak liczba komórek, morfologia i wzorce ekspresji GFP, co umożliwia porównawczą analizę warunków.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez konserwatywne etapy embriogenezy i ekspresję biomarkerów w Arabidopsis.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako platformę wielokrotnego użytku do oceny funkcji genów w wielu tła genetycznych w systemach roślinnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celów, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach funkcji genów.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność procesów przygotowania embrionów oraz obrazowania.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone ryzyko biologiczne w wyborze celów dla syntetycznej biologii roślin.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące dalszego rozwoju oparte na stopniu nasilenia fenotypu embriogenezy.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna w zakresie wzrostu roślin, etapowania kwitnienia oraz technik preparatyki zalążków.
- Konieczność zastosowania stereoskopu, mikroskopii DIC, konfokalnej mikroskopii laserowej oraz narzędzi do analizy obrazu.
- Wymogi standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia spójności przygotowania odczynnika Hoyera i czasów przejaśniania.
- Uwagi dotyczące adaptacji metody do różnych ekotypów Arabidopsis lub linii mutantów o zróżnicowanej przezroczystości zarodka.
- Ograniczenia praktyczne obejmują rozmiar zarodka ograniczający rozdzielczość oraz zależność od linii transgenicznych w celu uzyskania odczytów molekularnych.
Często zadawane pytania dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Preparation of Plant Material and Hoyer's Solution
3:40
Ovule Separation and Clearance
5:18
Characterization of Embryo Patterning and Cell Identity via the Observation of Marker Protein Expression
7:46
Results: Embryogenesis Characterization in Arabidopsis
9:17
Conclusion
