Name: Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis z wykorzystaniem mikroskopii DIC i konfokalnej. Technika umożliwia obserwację morfologii zarodka oraz wizualizację markerów GFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Jessice Habashi za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Dziękujemy dr Xianyong Shengowi z Centrum Obrazowania, Kolegium Nauk Przyrodniczych, Capital Normal University (Pekin, Chiny), za przeprowadzenie lokalizacji testu DR5-GFP. Prace te były wspierane przez granty z Fundacji Naukowej Samorządu Miejskiego Pekinu (CIT&TCD20150102) oraz z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31600248).

UWAGA: Ten protokół składa się z trzech części: 1) obserwowanie formowania się wzorca w zarodkach Arabidopsis typu dzikiego za pomocą mikroskopii DIC; 2) scharakteryzowanie powstawania wzorca zarodka poprzez obserwację ekspresji białka markerowego za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej; oraz 3) określenie roli konkretnego genu w embriogenezie (na przykładzie mutanta NAA10).
1. Oczyszczanie zalążka
<ol>
	<li>Przygotowanie materiału roślinnego 
	UWAGA: Opisany tutaj protokół jest przykładem, jak uprawiać zdrowe rośliny; Działają również inne sposoby uprawy zdrowych roślin.
	<ol>
		<li>Dodaj 100 nasion do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie dodaj 1 ml 1,5% podchlorynu sodu (zmieszaj 15 ml 10% chloru z 85 ml wody), aby sterylizować nasiona przez 5 minut. Odwróć probówkę kilka razy, aby upewnić się, że nasiona i roztwór są dobrze wymieszane, aby całkowicie wysterylizować nasiona powierzchniowe.</li>
		<li>Wyciśnij nasiona na dno probówki przez wirowanie przez 30 s przy 1,200 x g, usuń supernatant i umyj nasiona sterylną wodą cztery razy na stole w celu usunięcia pozostałości podchlorynu sodu.</li>
		<li>Dodać 4,4 g mieszaniny soli podstawowej Murashige i Skoog (MS) oraz 10 g sacharozy do 1 l ultraczystej wody. Wymieszaj mieszaninę, aby rozpuścić sole i sacharozę. Doprowadzić roztwór do pH 5,8 za pomocą 1 M KOH, dodać 3 g środka żelującego, takiego jak Phytagel, do roztworu MS-sacharozy i sterylizować roztwór w temperaturze 121 °C przez 15 minut, aby uzyskać pożywkę MS.</li>
		<li>Wlej 30 ml pożywki MS do 12-milimetrowego naczynia hodowlanego, aby uzyskać płytki z pożywką MS.</li>
		<li>Umieść wysterylizowane nasiona na talerzu MS. Przenieść szalkę do komory wzrostowej i przechowywać ją w warunkach długiego dnia (22 °C przez 16 godzin w świetle i 18 °C przez 8 godzin w ciemności) po stratyfikacji nasion (3 dni w temperaturze 4 °C w ciemności).</li>
		<li>Po 8 dniach wzrostu przenieś rośliny do gleby (wymieszaj glebę bogatą w składniki odżywcze i wermikulit w stosunku 1:1) na tacy, przykryj tacę białą, przezroczystą pokrywką na 5 dni, aby uniknąć utraty wody, i pozostaw szczelinę, aby uniknąć zeszklenia roślin.</li>
		<li>Zdejmij pokrywkę z tacki i uprawiaj rośliny w komorze typu walk-in w warunkach długiego dnia (patrz 1.1.5). Włącz światło o 6:00 i wyłącz o 22:00. Po około 20 dniach wzrostu w komorze walk-in rośliny zakwitną i wytworzą krzemionki.</li>
		<li>Zaznacz pąki kwiatowe nitką w miejscu łodyg nasiennych w kwiatostanie o godzinie 20:00 (nie używaj pierwszych do trzecich pąków kwiatowych; krzemionki powstałe z tych pąków kwiatowych zwykle rozwijają kilka poronionych nasion, co może zmienić proporcję normalnych do nieprawidłowych zalążków). Zdefiniuj początek zapylania zalążka jako moment, w którym zaznaczony pączek otwiera się do kwitnienia o 8:00 rano następnego ranka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu Hoyera
	<ol>
		<li>Dodaj 24 g hydratu chloralu do probówki o pojemności 50 ml i owiń probówkę całkowicie folią aluminiową (roztwory hydratu chloralu nie są stabilne w świetle).</li>
		<li>Następnie dodaj 9 ml ultraczystej wody i 3 ml glicerolu do powyższego roztworu i wstrząśnij probówką, aby rozpuścić hydrat chloralu. Aby przygotować roztwór Hoyera, odstaw probówkę na noc w temperaturze pokojowej, aby wyeliminować wszelkie pęcherzyki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separacja i klirens zalążków
	<ol>
		<li>Przymocuj kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szkiełka mikroskopowego. Umieść krzemionkę uprawianą przez żądaną liczbę dni po zapyleniu (DAP) na szkiełku z przegrodą rzekomą prostopadłą do powierzchni; ułatwi to dzielenie słupków (<silna klasa="xfig">Rysunki 1A i 1B).</li>
		<li>Podziel owocolistki po obu stronach przegrody rzekomej za pomocą igły strzykawkowej i przymocuj dwa wypreparowane owocolistki do szkiełka tak, aby zalążki w krzemionce były widoczne pod stereoskopem (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1C i 1D).</li>
		<li>Dozować 70 μl roztworu Hoyera na szkiełko podstawowe, a następnie zwilżyć końcówkę pęsety z cienką końcówką roztworem Hoyera, zanurzając ją. Za pomocą stereoskopu przenieś zalążki do roztworu Hoyera na szkiełku za pomocą pęsety, aby oczyścić zarodki. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na szkiełko, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Gotowe szkiełko wkładamy do pudełka w ciemnym pomieszczeniu na 2 - 12 godzin (im bardziej dojrzały jest zalążek, tym więcej czasu będzie potrzebne) w temperaturze pokojowej. Zarodki w stadium 2/4 komórki (1 - 2 DAP) można obserwować mikroskopowo po 2 godzinach, natomiast zarodki między stadiami oktanowymi i wczesnymi kulistymi (3 DAP) można obserwować po 4 godzinach. Bardziej dojrzałe zarodki (4 - 8 DAP) można zaobserwować po 12 godzinach.</li>
		<li>Zbadaj oczyszczone zalążki za pomocą funkcji DIC mikroskopu. Umieść zarodki w polu o niskiej mocy (10X), a następnie zmień na pole o dużej mocy (soczewka olejkowa 100X), aby obserwować wzór komórkowy w rozwiniętych zarodkach.</li>
		<li>Zbadaj zarodki na różnych etapach rozwoju.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka wzorca zarodka i tożsamości komórki poprzez obserwację ekspresji białka markerowego
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów roślinnych
	<ol>
		<li>Sklonuj sekwencję promotora i kodującą gen markera lub element odpowiedzi hormonalnej, a następnie połącz go z białkiem fluorescencyjnym (takim jak GFP); następnie wprowadź konstrukt do wektora binarnego (takiego jak pCambia1300). Tutaj element odpowiedzi auksyny DR5 jest przedstawiony jako przykład10.</li>
		<li>Wprowadź otrzymany plazmid DR5-GFP do roślin typu dzikiego za pomocą transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens11. Wybierz rośliny T1 za pomocą pożywek MS zawierających higromycynę (50 mg/ml roztworu macierzystego, rozcieńczonego w stosunku 1:1000). Rośliny transgeniczne będą miały długie korzenie i będą wytwarzać dwa liście rozety po 8 dniach wzrostu w warunkach opisanych w ppkt 1.1.5.</li>
		<li>Przenieść rośliny transgeniczne do gleby i uprawiać je zgodnie ze wskazaniami w ppkt 1.1.6 i 1.1.7.</li>
		<li>Zbierz nasiona T2 z niezależnych linii T1. Wysiewaj nasiona na płytkach MS-higromycyny, wybierz rośliny posiadające jedną kopię insercji DR5-GFP (stosunek roślin odpornych do wrażliwych wyniesie około 3:1) i przenieś je do gleby.</li>
		<li>Uprawiać rośliny T2 zgodnie z ppkt 1.1.6 i 1.1.7.</li>
		<li>Zbierz nasiona T3 z roślin T2. Wysiewaj nasiona na płytkach MS-higromycyny, wybierz homozygotyczne rośliny transgeniczne (wszystkie rośliny z jednej linii będą wykazywać odporność na higromycynę) i przenieś je do gleby.</li>
		<li>Zaznacz pąki kwiatowe homozygotycznych roślin T3, jak wskazano w 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja sygnału GFP
	<ol>
		<li>Wymieszaj 3 ml glicerolu z 47 ml ultraczystej wody, aby uzyskać 6% roztwór glicerolu.</li>
		<li>Przymocować kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szklanego szkiełka mikroskopowego i przymocować krzemionkę, jak wskazano w ppkt 1.3.1.</li>
		<li>Rozciąć owocolistki po obu stronach przegrody rzekomej za pomocą igły strzykawkowej i przymocować dwa wypreparowane słupki do szkiełka pod stereoskopem, jak wskazano w ppkt 1.3.2.</li>
		<li>Dozuj 30 μl 6% glicerolu na szkiełko podstawowe i umieść wszystkie zalążki z wypreparowanych owocolistków w roztworze za pomocą pęsety z cienką końcówką. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku.</li>
		<li>Ponieważ okrywa nasienna i bielmo w każdym zalążku mogą uniemożliwić obserwację sygnałów GFP w zarodku, należy wyekstrahować zarodek z zalążka. Postukaj w szkiełko szybko i delikatnie, aby wysunąć zarodek z zalążka (im bardziej dojrzały jest zalążek, tym mniejszą siłę należy przyłożyć do szkiełka).</li>
		<li>Zbadaj szkiełko pod kątem fluorescencji GFP za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Znajdź izolowane zarodki w polu o niskiej mocy (10X) i zarejestruj ich lokalizację, a następnie zmień na pole o dużej mocy (soczewka immersyjna olejowa 100X), aby obserwować ekspresję DR5-GFP w zarodkach, ustawiając źródło światła wzbudzającego na 488 nm w celu wykrycia sygnału GFP.</li>
		<li>Wykryj ekspresję GFP w zarodkach, aby wybrać odpowiednią linię T3 do dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka tworzenia się wzorca zarodka u zarodkowo-letalnego mutanta poprzez klirens zalążka i obserwację białka markerowego: Naa10 jako przykład
<ol>
	<li>Modelowanie zarodków w roślinach z mutacją naa10
	<ol>
		<li>Przygotuj materiał roślinny, jak wskazano w ppkt 1.1.1-1.1.7.</li>
		<li>Zidentyfikuj rośliny naa10 +/- metodą PCR za pomocą starterów specyficznych dla genu 5, a następnie zaznacz pąki kwiatowe roślin naa10 +/- , jak wskazano w 1.1.8.</li>
		<li>Przeprowadzić klirens zalążków i badanie mikroskopowe zarodków naa10+/- zgodnie ze wskazaniami w ppkt 1.2 i 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza białek markerowych z wykorzystaniem zarodków naa10
	<ol>
		<li>Uzyskać odpowiednie linie transgeniczne DR5-GFP stosując procedurę opisaną w ppkt 2.1 - 2.2.</li>
		<li>Skrzyżowanie homozygotycznej linii transgenicznej DR5-GFP z rośliną naa10 +/- , aby uzyskać rośliny naa10 +/- , które są homozygotyczne pod względem markera fluorescencji GFP w pokoleniu F2 (zidentyfikowanego przez PCR specyficzny dla genu), aby scharakteryzować naa10 +/- <sup class="xref">5 i obserwować sygnał GFP pod mikroskopem przy użyciu homozygotycznej linii DR5-GFP.</li>
		<li>Zaznacz pąki kwiatowe roślin naa10 +/- , które są homozygotyczne pod względem DR5-GFP, jak wskazano w 2.1.7.</li>
		<li>Poszukiwania sygnału GFP w zarodkach naa10, które są homozygotyczne pod względem DR5-GFP, jak wskazano w 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li>
<li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+flowering+plants%3A+setting+up+the+basic+body+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li>
<li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li>
<li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+plant%3A+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li>
<li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/genetics/abstract/0168-9525(93)90246-E">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li>
<li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li>
<li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aux%2FIAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li>
<li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li>
<li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li>
<li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Klirens zalążka jest przydatną metodą wykrywania podziału komórek i oceny morfologii podczas embriogenezy u Arabidopsis; przy użyciu tej techniki zarodki można obserwować bezpośrednio pod mikroskopią DIC 5,12. Krytycznym etapem usuwania zalążka jest krok 1.3.4. Czas potrzebny do usunięcia zalążka w kroku 1.3.4 jest zmienny. Zarodki w stadium 2/4-komórkowym można wyraźnie zaobserwować po 2 godzinach w roztworze Hoyera, natomiast po 12 godzinach wyglądają ...

Embriogeneza jest najwcześniejszym wydarzeniem w rozwoju roślin wyższych. Dojrzały zarodek powstaje z zygoty poprzez podział i różnicowanie komórek pod ścisłą kontrolą genetyczną1,2. Zarodki rzodkiewnika są użytecznym modelem do badania kontroli morfogenezy, ponieważ sekwencja podziałów komórkowych podczas embriogenezy jest zgodna z oczekiwanym wzorcem3,4. Jednak zarodek Arabidopsis zawierający od jednej do kilku komórek jest zbyt mały, aby można go było zaobserwować i przeanalizować. Ponadto mutacja niektórych genów może powodować śmiertelność zarodka5, co wskazuje na kluczową rolę tych genów w embriogenezie. Charakterystyka tworzenia się wzorców u mutantów letalnych dla zarodków stanowi podstawę do zrozumienia mechanizmu molekularnego, za pomocą którego niezbędne geny regulują rozwój zarodka.
Szczegółowa metoda jest tutaj opisana do charakterystyki tworzenia się wzoru zarodka u modelowej rośliny Arabidopsis poprzez bezpośrednią obserwację mikroskopową. Metoda polega na usunięciu zalążka, a następnie obserwacji mikroskopowej zarodka. Opisano również charakterystykę mutanta śmiertelnego dla zarodka.
Morfologia zarodków na różnych etapach rozwoju może być bezpośrednio określona za pomocą mikroskopii przy użyciu zalążków, które zostały oczyszczone roztworem Hoyera6,7. Takie zalążki wykazują wysoki współczynnik załamania światła; w związku z tym ta metoda oczyszczania zalążków jest szczególnie korzystna w przypadku próbek, które muszą być obserwowane za pomocą mikroskopii kontrastu różnicowego interferencyjnego (DIC).
Ponadto, geny, które ulegają ekspresji w określonej komórce lub ograniczonej liczbie komórek podczas embriogenezy, mogą być używane jako markery do identyfikacji komórek w embrionie. W związku z tym specyfikację tożsamości komórki podczas embriogenezy można oznaczyć poprzez monitorowanie ekspresji białek markerowych znakowanych GFP za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. I odwrotnie, obserwacja wzorca ekspresji nieznanej funkcjonalnej fuzji genu z GFP podczas embriogenezy może zapewnić związek między wzorcem zarodka a ekspresją tego genu i ułatwić identyfikację nowych genów, które są wymagane do embriogenezy u Arabidopsis.
Opisana tutaj metoda może być również użyta do scharakteryzowania fenotypu zarodkowo-letalnego mutanta oraz do określenia wpływu uszkodzonego genu na embriogenezę na poziomie komórkowym. Ponadto, w połączeniu z porównaniem wzorca ekspresji genów markerowych podczas embriogenezy między roślinami typu dzikiego i zmutowanym, metoda może dostarczyć wskazówek na temat mechanizmów molekularnych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w embriogenezę8,9. Rzeczywiście, metoda została zastosowana do roślin naa10 i stwierdzono, że nieprawidłowy podział przysadki mózgowej u mutanta może być spowodowany zmianą dystrybucji auksyny podczas embriogenezy5.

<table><tbody><tr><td>Hydrat chloralu</td><td>Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Medium Sigma</td><td></td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Komora wzrostowa</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>aparat: AxioCam 506 kolorowa</td></tr><tr><td>konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>filtry: BP 495 - 555 nm</td></tr><tr><td>stereoskop</td><td>Aparat Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>: AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>bogata w składniki odżywcze</td><td>gleba KLASMANN, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka 50 ml</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka 1,5 ml</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór</td><td></td><td></td> podchlorynu sodu <td>Krajowy odczynnik analityczny</td></tr><tr><td>sacharoza</td><td></td><td></td><td>Krajowy odczynnik analityczny</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>Krajowy odczynnik analityczny</td></tr><tr><td>glicerol</td><td></td><td></td> Domowe <td></td></tr><tr><td>naczynie</td><td></td><td></td> do hodowli odczynników analitycznych <td>Krajowe dostawy</td></tr><tr><td>wermikulitu</td><td></td><td></td><td>Artykuły gospodarstwa</td></tr><tr><td></td><td></td> domowego szkiełko szkiełko <td></td><td></td> Artykuły domowe</tr><tr><td>igła strzykawki</td><td>Artykuły domowe</td>pęseta z cienką końcówką Artykuły gospodarstwa domowego super czysta ławka Sprzęt gospodarstwa domowego <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda charakteryzowania embriogenezy u arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Biorąc pod uwagę wysoce przewidywalną naturę ich rozwoju, zarodki Arabidopsis były używane jako model do badań morfogenezy roślin. Jednak zarodki roślin we wczesnym stadium rozwoju są małe i zawierają niewiele komórek, co utrudnia ich obserwację i analizę. Opisano tutaj metodę charakteryzowania tworzenia się wzorców w zarodkach roślinnych pod mikroskopem przy użyciu organizmu modelowego Arabidopsis. Po usunięciu świeżych zalążków za pomocą roztworu Hoyera można było zaobserwować liczbę komórek i morfologię zarodków, a ich stadium rozwojowe można było określić za pomocą mikroskopii kontrastowej interferencyjnej różnicowej przy użyciu soczewki immersyjnej ze 100-krotnym olejkiem. Ponadto monitorowano ekspresję specyficznych białek markerowych oznaczonych białkiem zielonej fluorescencji (GFP) w celu adnotacji specyfikacji tożsamości komórki podczas modelowania zarodków za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. W związku z tym metoda ta może być stosowana do obserwacji tworzenia się wzorców w zarodkach roślin typu dzikiego na poziomie komórkowym i molekularnym oraz do scharakteryzowania roli określonych genów w tworzeniu się zarodków poprzez porównanie tworzenia wzorców w zarodkach z roślin typu dzikiego i mutantów letalnych dla zarodków. Dlatego metoda może być stosowana do charakterystyki embriogenezy u Arabidopsis.

Metoda opisana w tym artykule może być wykorzystana do bezpośredniej obserwacji embriogenezy pod mikroskopem, oznaczania specyfikacji tożsamości komórek podczas embriogenezy za pomocą specyficznych znaczników oraz scharakteryzowania roli określonego genu podczas embriogenezy.
Przykładowe wyniki analizy modelowania zarodka (od etapu wydłużonego zigoty do etapu dojrzałego zarodka przypominającego kijanka) u dzikiego typu Arabi...

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Ogólnym celem tej metody jest charakterystyka formowania się wzorców zarodków podczas embriogenezy roślin z wykorzystaniem organizmu modelowego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu botaniki, takie jak przebieg embriogenezy u Arabidopsis. Główną zaletą tej techniki jest możliwość charakterystyki formowania się wzorców zarodków u modelowej rośliny Arabidopsis zgodnie z zalecaną procedurą.Procedurę demonstruje Jinlin Feng, student studiów magisterskich z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 100 nasion do probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie należy dodać 1 ml podchlorynu sodu w celu sterylizacji nasion.Kilka razy odwróć probówkę, aby upewnić się, że nasiona i roztwór są dobrze wymieszane. Po pięciu minutach odwiruj zawartość probówki przy 1200 Gs przez 30 sekund. Usuń nadsącz i czterokrotnie przemyj nasiona sterylną wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości podchlorynu sodu.Następnie do jednego litra wody ultrapure dodać 4,4 g mieszaniny soli podstawowych MS oraz 10 g sacharozy. Mieszać do czasu rozpuszczenia soli i sacharozy. Przy użyciu wodorotlenku potasu w stężeniu 1 mol dostosować pH roztworu do wartości 5,8.Następnie należy dodać trzy gramy środka żelującego i wysterylizować roztwór w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Do 12-centymetrowej szalki hodowlanej wlać 30 ml otrzymanego medium MS. Na płytce z medium MS umieścić wysterylizowane nasiona.Przenieś płytkę do lodówki i przechowuj ją w temperaturze 4 °C w ciemności przez trzy dni, aby przeprowadzić stratyfikację nasion. Następnie pozostaw płytkę w komorze wzrostowej w warunkach długiego dnia przez osiem dni. Po tym czasie przenieś rośliny do gleby w tacy.Przykryj tackę przezroczystą białą pokrywą, aby zapobiec utracie wody, pozostawiając niewielką szczelinę w celu uniknięcia witryfikacji roślin. Po pięciu dniach zdejmij pokrywę i hoduj rośliny w komorze klimatycznej w warunkach długiego dnia.Po około 20 dniach wzrostu, o godzinie 20:00, należy za pomocą nici zaznaczyć od 10 do 15 pąków kwiatowych w miejscu szypułek nasion i kwiatostanu. Moment otwarcia się zaznaczonych pąków i zakwitnięcia, uznany za początek zapylania zalążka, wyznacza się na godzinę 8:00 następnego ranka. Aby rozpocząć przygotowanie roztworu Hoyera, należy dodać 24 g chlorowodorku do probówki o pojemności 50 ml. Probówkę należy całkowicie owinąć folią aluminiową, upewniając się, że folia całkowicie odcina dopływ światła.Dodaj dziewięć mililitrów wody ultraczystej oraz trzy mililitry glicerolu. Wstrząśnij probówką, aby rozpuścić chlorowodorek. Następnie pozostaw przygotowany roztwór Hoyera na noc w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.Aby rozpocząć, przyklej kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szkiełka przedmiotowego. Umieść silik, hodowany przez pożądaną liczbę dni po zapyleniu, tak aby pseudoseptum znajdowało się prostopadle do powierzchni. Używając igły strzykawki, rozdziel listki owocni po obu stronach pseudoseptum.Następnie przymocuj oba wypreparowane nadgarstki do szkiełka przedmiotowego w taki sposób, aby zalążki i strąk były widoczne pod stereomikroskopem. Nanieś 70 µl roztworu Hoyera na szkiełko przedmiotowe. Następnie zanurz końcówki pęsety precyzyjnej w roztworze, aby je zwilżyć.Za pomocą stereomikroskopu i pęsety przenieś zalążki do roztworu Hoyera w celu oczyszczenia embrionów. Następnie ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na preparat, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Gotowy preparat umieść w pudełku w ciemnym pomieszczeniu na okres od 2 do 12 godzin w temperaturze pokojowej.Po upływie wymaganego czasu należy użyć funkcji DIC mikroskopu, aby zbadać przejaśnione zalążki. Należy zlokalizować embriony przy użyciu małego powiększenia, a następnie przełączyć na duże powiększenie, aby zaobserwować wzór komórkowy w rozwiniętych embrionach. Następnie należy zbadać embriony na różnych etapach rozwoju.W pierwszej kolejności należy przygotować plazmid DR5 GFP i wprowadzić go do roślin typu dzikiego za pomocą transformacji pośredniczonej przez agrobacterium, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rośliny T1 należy wyselekcjonować, wykorzystując płytki z pożywką MS zawierającą hydrolizynę. Następnie rośliny należy przenieść i hodować zgodnie z protokołem tekstowym w celu uzyskania roślin T3.Za pomocą nici zaznacz pąki kwiatowe rośliny homozygotycznej T3 w miejscu łodyg nasiennych w kwiatostanie o godzinie 20:00. Następnie zmieszaj 3 ml glicerolu z 47 ml ultra czystej wody, aby przygotować 6% roztwór glicerolu. Przyklej kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szkiełka przedmiotowego. Umieść silik rośliny T3 na szkiełku tak, aby pseudoseptum było prostopadłe do powierzchni.Używając igły strzykawki, rozdzielcie listki w obu stronach pseudoseptum. Przymocujcie oba rozdzielone listki do szkiełka tak, aby zalążki i strączek były widoczne pod stereomikroskopem. Następnie nanieście 30 µL 6% glicerolu na szkiełko.Zanurz końcówkę pęsety z cienkimi końcówkami w roztworze, aby ją zwilżyć. Używając stereomikroskopu i pęsety, przenieś zawiązki do roztworu glicerolu. Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na preparat.Następnie szybko i delikatnie stuknij w szkiełko, aby wypchnąć zarodek z zalążni. Po tym wykonaj konfokalną mikroskopię skaningową, aby zbadać szkiełko pod kątem fluorescencji białka GFP. Zlokalizuj wyizolowane zarodki przy użyciu małego powiększenia i zapisz ich położenie.Przełącz na pole o dużym powiększeniu i ustaw źródło światła wzbudzenia na 488 nanometrów, aby zaobserwować ekspresję GR5 GFP w embrionach. Następnie wykryj ekspresję GFP i scharakteryzuj formowanie się wzorca embrionu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W niniejszym badaniu embriogeneza w Arabidopsis jest obserwowana poprzez przejaśnianie zalążków, co można zobaczyć.Po oczyszczeniu zalążków, embriony na różnych etapach rozwoju są rozróżnialne przy użyciu mikroskopii kontrastowej z interferencją różnicową. Następnie wzór ekspresji GR5 GFP podczas embriogenezy jest rejestrowany za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej. Stwierdzono, że DR5 ulega ekspresji w biegunie korzeniowym globularnych i sercowatych embrionów typu dzikiego.Ekspresja DR5 jest widoczna w wierzchołkach embrionalnych liści zasłonowych oraz w układzie naczyniowym dojrzałych embrionów typu dzikiego. W związku z tym badano rolę genu naa10 w Arabidopsis podczas embriogenezy. Postawiono hipotezę, że w mutancjach naa10 podziały komórkowe przebiegają nieprawidłowo, przyjmując kierunek skośny lub pionowy, w przeciwieństwie do poprzecznych podziałów asymetrycznych występujących u roślin typu dzikiego.Jak widać tutaj, białko oxen wykazuje niemal jednolity rozkład w większości embrionów naa10 na etapie globularnym i utrzymuje silniejszy sygnał w hipotezach w porównaniu z embrionami typu dzikiego. Wyniki te wskazują, że naa10 jest niezbędne do embriogenezy i może być zaangażowane poprzez szlak sygnałowy oxen w Arabidopsis. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o sposobie hodowli Arabidopsis jako materiału roślinnego.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak hybrydyzacja in situ, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące ekspresji genów specyficznych dla danych komórek. Po opracowaniu ta technika otwiera przed badaczami w dziedzinie embriogenezy możliwość zbadania mechanizmów molekularnych, poprzez które specyficzne geny pośredniczą w embriogenezie Arabidopsis. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat charakterystyki embriogenezy u Arabidopsis.

a-method-for-characterizing-embryogenesis-in-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Przedstawiamy procedurę składania testu na ściółkę nasienną (SCBA) z nasion Arabidopsis thaliana. Wykazano, że aparat oddechowy jest potężnym narzędziem do genetycznego i in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion w uśpionych nasionach i w odpowiedzi na sygnały świetlne. Aparat oddechowy ma zasadniczo zastosowanie w każdej sytuacji, w której podejrzewa się, że bielmo wpływa na wzrost zarodka.

Test ściółki nasiennej do genetycznego zbadania in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion u Arabidopsis thaliana

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Celem jest zilustrowanie, że modelowa roślina strączkowa Medicago truncatula może być łatwo wykorzystana do zbadania regulacji wczesnej embriogenezy roślin, aby uzupełnić model rzodkiewnika nie-strączkowego. Morfologia strąków jest powiązana z etapami embriogenezy zygotycznej, a także opracowano protokół pobierania zarodków za pomocą hodowli tkankowej.

Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

Pokazujemy metodę określania udanego lub nieudanego zapłodnienia na podstawie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Tutaj opisujemy zaawansowane narzędzie przeznaczone do monitorowania biosyntezy chlorofilu podczas wczesnych etapów deetiolacji siewek rzodkiewnika. Nowatorska metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie fluorescencji chlorofilu w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Nieinwazyjny test do oznaczania kinetyki biosyntezy chlorofilu we wczesnych stadiach deetiolacji rzodkiewnika

Poznaj metodę charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis z wykorzystaniem mikroskopii DIC i konfokalnej. Technika umożliwia obserwację morfologii zarodka oraz wizualizację markerów GFP.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Przeglądaj więcej filmów