Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

W tym filmie zostaną przedstawione dwie metody: biotynylacja na powierzchni komórki i biotynylacja w pogoni za impulsem. W poniższej demonstracji użyjemy astrocytów. Są to najliczniejsze typy komórek glejowych w mózgu i tak się składa, że wyrażają one nasze interesujące nas białko, którym jest Akwaporyna-4.

Metody, których używamy w tym artykule, mogą być stosowane do wielu różnych typów komórek, a te mogą obejmować komórki w zawiesinie lub komórki przylegające. Techniki te mogą być wykorzystywane do badania ekspresji i internalizacji powierzchni komórki praktycznie każdego białka transbłonowego, o ile posiada ono domenę zewnątrzkomórkową dostępną dla biotyny. Ogólnym celem tego testu biotynylacji powierzchni komórki jest określenie wpływu lamininy na ekspresję przepuszczalnego dla wody kanału Aquaporin-4 w błonie plazmatycznej astrocytów.

Aby rozpocząć tę procedurę, usuń kultury astrocytów z inkubatora i wyrzuć pożywkę przez aspirację. Umyj komórki trzykrotnie czterema mililitrami schłodzonego CM-PBS i umieść naczynia na pokruszonym lodzie. Usunąć CM-PBS przez aspirację, a następnie odpipetować dwa mililitry buforu biotyny do każdej studzienki.

Delikatnie przechyl naczynia kilka razy do przodu i do tyłu, aby zapewnić całkowite pokrycie, zanim umieścisz kultury na lodzie na 30 minut. Następnie usuń bufor biotyny, zastąp go czterema mililitrami buforu hartującego i trzymaj kultury na lodzie przez 10 minut. Następnie odessać i zastąpić taką samą ilością buforu hartowniczego przed pozostawieniem kultur na lodzie na 10 minut.

Następnie wyrzuć bufor hartowniczy i umyj komórki trzykrotnie czterema mililitrami schłodzonego CM-PBS. Następnie zeskrobać komórki do jednego mililitra schłodzonego CM-PBS i przenieść zawiesinę do probówki mikrowirówkowej. Następnie granuluj komórki przez odwirowanie z prędkością 100 g przez trzy minuty w schłodzonej mikrowirówce ustawionej na cztery stopnie Celsjusza.

Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach buforu do lizy. Następnie pozostaw próbki na lodzie na 30 minut, wirując co pięć minut. Następnie odwirować lizat w temperaturze 14 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać wszelkie detergenty i materiały rozpuszczalne.

Następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Zaoszczędź 50 mikrolitrów lizatu i dodaj do niego 25 mikrolitrów bufora ładującego trzy X. Następnie denaturuj go poprzez podgrzanie do 95 stopni Celsjusza w suchej kąpieli.

Jest to frakcja wejściowa, zawierająca zarówno biotynylowane białka powierzchniowe komórek, jak i niebiotynylowane białka cytozolowe. Za pomocą przeciętej końcówki pipety przenieś 75 mikrolitrów kulek agarozy streptawidyny do lizatu i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny na shakerze. Następnie granulować kulki agarozy streptawidyny przez odwirowanie w temperaturze 1 500 g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zaoszczędź 50 mikrolitrów supernatantu i dodaj 25 mikrolitrów bufora ładującego trzy X. Następnie denaturuj go w temperaturze 95 stopni Celsjusza w łaźni wodnej lub bloku grzewczym. Reprezentuje to frakcję wewnątrzkomórkową i składa się głównie z niebiotynylowanych białek cytozolowych.

Następnie ponownie zawieś granulowane kulki w jednym mililitrze bufora do płukania i kołysz je przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Granulki obrabiać i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces jeszcze cztery razy, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych.

Dodać 50 mikrolitrów buforu ładującego rozcieńczonego do jednego X za pomocą buforu do lizy. Uwolnij biotynę i streptawidynę z kulek, denaturując je w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Frakcja ta powinna zawierać wyłącznie biotynylowane białka powierzchniowe komórek.

Następnie oddziel wejście, powierzchnię komórki i frakcje wewnątrzkomórkowe za pomocą SDS-PAGE i przeanalizuj za pomocą western blot. Ogólnym celem eksperymentu biotynylacji w pogoni za impulsami jest określenie przybliżonego tempa internalizacji akwaporyny-4 w astrocytach. Najpierw wyjmij kultury astrocytów z inkubatora i odessaj pożywkę.

Następnie umyj komórki trzykrotnie czterema mililitrami schłodzonego CM-PBS i umieść naczynia na kruszonym lodzie. Odessać CM-PBS, a następnie odpipetować trzy mililitry buforu biotyny do każdego naczynia. Przechyl naczynia kilka razy w przód i w tył, aby upewnić się, że bufor jest dobrze rozprowadzony i pozostaw je na lodzie na 30 minut.

Następnie odessać bufor biotyny i zastąpić go pięcioma mililitrami ciepłej pożywki. Inkubuj jedną szalkę hodowlaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, a drugą naczynie w tej samej temperaturze przez 30 minut. Pozostaw inne naczynie w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako próbkę zero-minutową.

Pod koniec okresu inkubacji wyrzucić pożywkę i przemyć komórki trzykrotnie czterema mililitrami schłodzonego CM-PBS. Następnie odessać CM-PBS, a następnie odpipetować sześć mililitrów buforu redukującego na komórki i pozostawić próbkę na lodzie na 15 minut. Następnie zastąp pożywkę sześcioma mililitrami świeżego buforu redukującego i umieść próbkę na lodzie na dodatkowe 15 minut.

Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ glutation zawarty w buforze redukującym rozszczepi muazę biotyny pozostałą na powierzchni komórki. Gwarantuje to, że tylko zinternalizowane białka będą znakowane biotyną. Następnie usuń roztwór redukujący i zastąp go sześcioma mililitrami buforu hartującego.

Pozostawić próbkę na lodzie na kolejne 15 minut i powtórzyć etap hartowania jeszcze raz. Następnie wyrzuć bufor hartowniczy i trzykrotnie umyj komórki czterema mililitrami schłodzonego PBS. Zassać CM-PBS, a następnie zeskrobać komórki do jednego mililitra schłodzonego PBS za pomocą podnośnika do komórek i przenieść zawiesinę do probówki mikrowirówkowej.

Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 100 g przez trzy minuty. Po trzech minutach wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu do lizy. Pozostawić próbkę na lodzie na 30 minut i wirować co pięć minut.

Odwirować lizat w stężeniu 14 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby rozpylić detergent i materiały rozpuszczalne. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Zaoszczędź 50 mikrolitrów tego lizatu i dodaj bufor ładujący.

Następnie denaturuj komórki w temperaturze 95 stopni Celsjusza w suchej kąpieli. Jest to frakcja wejściowa, zawierająca zarówno biotynylowane białka endocytozowane, jak i białka niebiotynylowane. Za pomocą przeciętej końcówki pipety dodaj 150 mikrolitrów zawiesiny agarozy streptawidyny do lizatu i inkubuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny na shakerze.

Po trzech godzinach osadzać kulki agarozy streptawidyny przez odwirowanie w temperaturze 1 500 g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawieś kulki w jednym mililitrze bufora do mycia i kołysz je przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Granuluj kulki i wyrzuć supernatant.

Powtórz ten proces jeszcze cztery razy, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych. Następnie granulować kulki przez odwirowanie w temperaturze 1 500 g przez 30 sekund, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzuć leżący nad nim bufor do płukania i dodaj 50 mikrolitrów jednego x buforu ładującego.

Uwolnij biotynę i streptawidynę z kulek poprzez denaturację w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Ta frakcja powinna zawierać tylko zinternalizowane białka powierzchniowe komórki. Następnie oddziel dane wejściowe, powierzchnię komórki i frakcje niezwiązane za pomocą SDS-PAGE i przeanalizuj za pomocą Western blot.

Pokazano tutaj powierzchnię komórki, wewnątrzkomórkowe i całkowite frakcje z nieleczonych astrocytów oraz astrocyty potraktowane 24 nanomolową lamininą, sondowaną pod kątem akwaporyny-4 i beta-dystroglikanu. Ten histogram ilustruje różnice w poziomach powierzchni komórek akwaporyny-4 w astrocytach nieleczonych i traktowanych lamininą, znormalizowanych wobec beta-dytroglikanu. Na tym rysunku zinternalizowane frakcje białkowe zebrane po zero, 15 i 30 minutach zostały zbadane pod kątem Akwaporyny-4.

A ten histogram podsumowuje internalizację akwaporyny-4 dla czterech niezależnych eksperymentów, znormalizowanych względem wartości dla punktu czasowego zero minut. Gwiazdka wskazuje na statystycznie istotny wzrost ilości akwaporyny-4, endocytozowanej między 15 a 30 minutą. Gdy glutation jest używany do zerwania wiązania dwusiarczkowego w rozszczepialnym analogu biotyny, udział powierzchni komórki Akwaporyna-4 we frakcji biotynylowanej jest znacznie zmniejszony.

Daje to wyraźną różnicę między próbkami z minuty zerowej i 15 minut. Gdy krok zostanie pominięty, sygnał pochodzący z puli powierzchni komórki sprawia, że zmiana między dwoma punktami czasowymi jest niewykrywalna. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak immunofluorescencja i mikroskopia TIRF, mogą być stosowane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, w tym fizyczny transport ładunku.