Name: Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj metody biotynylacji powierzchni komórkowej i puls-chase do badania ekspresji białek i szybkości endocytozy w astrocytach. Techniki te pozwalają analizować dynamikę Aquaporin-4 w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem PG#20R47867.

1. Określanie względnej ekspresji białek na powierzchni komórki w astrocytach za pomocą biotynylacji
UWAGA: Tutaj ilustrujemy zastosowanie tej techniki biotynylacji do badania wpływu cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej lamininy na lokalizację na powierzchni komórki przepuszczalnego dla wody kanału akwaporyny-4 (AQP4). Specjalistyczne materiały wymagane do tego testu obejmują sulfo-NHS-LC-biotynę i żywicę streptawidyno-agarozową (patrz tabela materiałów).
<ol>
	<li>Stosując metodę opisaną w Noel i wsp.12, przygotuj kultury astrocytów korowych około 2 tygodnie przed testem i hoduj je w 75 cm2 wentylowanych kolbach hodowlanych. Gdy astrocyty są zlewające się w 80 - 90%, należy je oderwać od powierzchni hodowli za pomocą 0,05% trypsyny, a następnie przejść je w stosunku 1:3.</li>
	<li>Po 48 godzinach przed badaniem, gdy komórki są ponownie zlewające się w 80 - 90%, astrocyty pasują 1:3 (uwzględniając zmianę formatu hodowli) na 60-milimetrowe szalki do hodowli komórkowych, tak aby w dniu, w którym ma się odbyć eksperyment, były w >70% zlewane. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone między naczyniami.</li>
	<li>Po 16 godzinach przed badaniem pipetować lamininę do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 24 nM i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Bezpośrednio przed oznaczeniem należy przygotować następujące substancje, a następnie umieścić je na lodzie lub wstawić do lodówki: CM-PBS (100 mg/L MgCl2∙6H2O i 100 mg/L CaCl2 w 1X PBS, pH 7,4), bufor biotyny (0,5 mg/ml sulfo-NHS-LC-biotyna w CM-PBS), bufor wygaszający (50 mM NH4Cl w CM-PBS), bufor do lizy (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glicyny, 150 mM NaCl i 5 mM EDTA, 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy), 3X bufor ładujący (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glicerol, 300 mM DTT i 0,01% błękitu bromofenolowego) i bufor do przemywania (10 mM Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, koktajl inhibitorów proteazy 1X).</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora szalki zawierające kultury astrocytów i wyrzucić pożywkę.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie schłodzonym CM-PBS o pojemności 4 ml i umieść naczynia na kruszonym lodzie.</li>
	<li>Odpipetuj 2 ml buforu biotyny do każdego dołka i delikatnie przechyl szalki kilka razy w przód i w tył, aby zapewnić pełne pokrycie. Pozostaw na lodzie na 30 minut.</li>
	<li>Usunąć bufor biotyny za pomocą aspiratora i zastąpić go 4 ml buforem hartującym. Pozostaw na lodzie na 10 minut.</li>
	<li>Zassać bufor hartowniczy i zastąpić go równoważną objętością. Ponownie pozostaw na lodzie na 10 minut.</li>
	<li>Odrzucić bufor hartowniczy i trzykrotnie przemyć komórki 4 ml schłodzonego CM-PBS.</li>
	<li>Zeskrobać komórki do 1 ml schłodzonego CM-PBS za pomocą podnośnika do komórek i przenieść zawiesinę do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Osadzać komórki przez odwirowanie w stężeniu 100 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu do lizy.</li>
	<li>Pozostawić próbki na lodzie na 30 minut, wirując co 5 minut, lub umieścić je na rotatorze typu "koniec do końca" w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować lizat przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wszelkich materiałów nierozpuszczalnych w detergentach. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
	<ol>
		<li>Zaoszczędź 50 μl tego lizatu i dodaj do niego bufor ładujący. Następnie poddać go denaturacji poprzez ogrzewanie w temperaturze 95 °C w suchej kąpieli; Jest to frakcja "wejściowa", zawierająca zarówno biotynylowane białka powierzchniowe komórek, jak i niebiotynylowane białka cytozolowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poszerz otwór końcówki pipety, odcinając około 0,5 cm materiału od jej końca za pomocą ostrych nożyczek. Za pomocą tej końcówki pipety przenieść 75 μl kulek streptawidyny-agarozy (normalnie przechowywanych w temperaturze 4 °C) do lizatu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 3 godziny na wytrząsarce/kołysce.
	<ol>
		<li>Ponieważ paciorkowcowo-agaroza jest często sprzedawana w postaci zawiesiny zawierającej 50% objętości kulek, zawieszonych w roztworze przeciwdrobnoustrojowym, należy rozprowadzić zawiesinę, aby zapewnić równomierne zawieszenie kulek, a następnie odpipetować 150 μl zawiesiny do każdej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Granulki streptawidyny-agarozy przez odwirowanie w temperaturze 1500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Zaoszczędź 50 μl supernatantu (dodaj bufor ładujący i denaturuj go w temperaturze 95 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym); reprezentuje on frakcję "wewnątrzkomórkową" i składa się głównie z niebiotynylowanych białek cytozolowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulowane kulki w 1 ml buforze do przemywania i kołysać go przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Granulki osadu (jak w kroku 1.16) i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces 4x, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych.</li>
	Granulki osadzać <li>przez odwirowanie (1500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C) i wyrzucić leżący nad nimi bufor do płukania. Dodać 50 μl 1X buforu ładującego (rozcieńczonego za pomocą buforu do lizy). Uwolnić biotynę i streptawidynę z kulek poprzez denaturację w temperaturze 95 °C; Frakcja ta powinna zawierać wyłącznie biotynylowane białka powierzchniowe (frakcja "powierzchnia komórki").
	<ol>
		<li>Oddziel frakcje wejściowe, powierzchniowe komórkowe i wewnątrzkomórkowe według SDS-PAGE 13 i analizuj według western blotting 14. 
		UWAGA: Podczas gdy w naszych eksperymentach użyliśmy 4 - 20% prefabrykowanego żelu gradientowego, 12 - 14% żel separujący z 4% warstwą układania (każda zawierająca 0,1% SDS) powinna wystarczyć dla białek będących przedmiotem zainteresowania w tym badaniu. Należy również stosować wzorzec masy cząsteczkowej o odpowiednim zakresie wielkości. Należy zauważyć, że czasami może wystąpić zauważalne przesunięcie w górę pozornych mas cząsteczkowych biotynylowanych białek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Określanie szybkości internalizacji białek powierzchniowych komórek w astrocytach za pomocą biotynylacji
UWAGA: Poniżej opisujemy typowy eksperyment biotynylacji z pogonią za impulsem, używany w tym przypadku do śledzenia endocytozy AQP4 w astrocytach. Metoda ta opiera się na metodzie zastosowanej przez Madrida i wsp.15. Wymagane specjalistyczne materiały to sulfo-NHS-SS-biotyna, żywica streptawidyno-agarozowa, zredukowany glutation i jodoacetamid (zobacz Tabelę Materiałów).
<ol>
	<li>Przygotuj kultury astrocytów korowych myszy w szalkach o średnicy 60 mm, stosując metody opisane w poprzednim rozdziale. Upewnij się, że komórki zlewają się w około 70% w dniu testu i że każda szalka zawiera równoważną liczbę komórek.</li>
	<li>Bezpośrednio przed badaniem należy przygotować następujące składniki i umieścić na lodzie lub w lodówce: CM-PBS (100 mg/L MgCl2∙6H2O i 100 mg/L CaCl2 w 1X PBS, pH 7,4), bufor biotyny (0,5 mg/ml sulfo-NHS-SS-biotyny w CM-PBS), bufor redukujący (50 mM zredukowany glutation, 75 mM NaCl i 75 mM NaOH), bufor gaszący (50 mM jodoacetamid, 1% BSA, w CM-PBS), bufor do lizy (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glicyny, 150 mM NaCl i 5 mM EDTA, 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy), 3X bufor ładujący (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glicerol, 300 mM DTT i 0,01% błękitu bromofenolowego) i bufor do przemywania (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% tryton X-100, 1X koktajl inhibitorów proteazy).</li>
	<li>Przygotuj świeże podłoże do hodowli komórkowych (DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydową (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy) i umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usuń kultury astrocytów z inkubatora i odessaj pożywkę za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie schłodzonym CM-PBS o pojemności 4 ml i umieść naczynia na kruszonym lodzie.</li>
	<li>Odpipetuj 3 ml buforu biotyny do każdego naczynia, przechyl naczynia kilka razy w przód i w tył, aby upewnić się, że bufor jest dobrze rozprowadzony, i pozostaw go na lodzie na 30 minut.</li>
	<li>Odessać bufor biotyny i zastąpić go 5 ml ciepłej pożywki. Inkubować szalkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a drugą szalkę w tej samej temperaturze przez 30 minut. Pozostawić inne naczynie w temperaturze 4 °C jako próbkę 0 min.</li>
	<li>Pod koniec okresu inkubacji wyrzucić pożywkę i trzykrotnie umyć komórki 4 ml schłodzonego CM-PBS. Odpipetować 6 ml buforu redukcyjnego na komórkach i pozostawić na lodzie na 15 minut.</li>
	<li>Usuń bufor redukcyjny, a następnie zastąp go 6 ml świeżym buforem redukującym. Umieść na lodzie na dodatkowe 15 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór redukujący i zastąpić go 6 ml buforu hartującego. Pozostaw na lodzie na 15 minut.</li>
	<li>Powtórz krok hartowania jeszcze raz.</li>
	<li>Odrzucić bufor gaszący i przemyć komórki trzykrotnie 4 ml schłodzonego PBS.</li>
	<li>Zeskrobać komórki do 1 ml schłodzonego PBS za pomocą podnośnika do komórek i przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Osadzać komórki przez odwirowanie przy 100 x g przez 3 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforze do lizy</li>.
	<li>Pozostaw to na lodzie na 30 minut i wiruj co 5 minut. Alternatywnie, umieść próbki na rotatorze typu end---end w temperaturze 4 °C na ten czas.</li>
	<li>Odwirować lizat przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia materiałów nierozpuszczalnych w detergentach, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Zachowaj 50 μl tego lizatu, dodaj do niego bufor ładujący i denaturuj w temperaturze 95 °C w suchej kąpieli; Jest to frakcja "wejściowa", zawierająca zarówno biotynylowane białka endocytozowane, jak i białka niebiotynylowane.</li>
	<li>Za pomocą odciętej końcówki pipety dodać 150 μl zawiesiny streptawidyny i agarozy do lizatu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 3 godziny na wytrząsarce/kołysce. Zobacz 1.15, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat tego kroku.</li>
	<li>Granulki streptawidyny i agarozy przez odwirowanie w temperaturze 1 500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 1 ml buforu do przemywania i kołysać przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Granulki (jak w kroku 2.18) i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces 4x, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych.</li>
	<li>Granulki osadkować przez odwirowanie w stężeniu 1 500 x g przez 30 s, w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić leżący nad nimi bufor do płukania. Dodać 50 μl 1X buforu ładującego (rozcieńczonego za pomocą buforu do lizy). Uwolnić biotynę i streptawidynę z kulek poprzez denaturację w temperaturze 95 °C; Frakcja ta powinna zawierać tylko zinternalizowane białka powierzchniowe komórki (frakcja "endocytozowana").</li>
	<li>Oddziel ułamki wejściowe, powierzchnię komórki i niezwiązane przez SDS-PAGE13 i analizuj według western blotting14. 
	UWAGA: Podczas gdy w naszych eksperymentach użyliśmy 4 - 20% prefabrykowanego żelu gradientowego, 12 - 14% żel separujący z 4% warstwą układania (każda zawierająca 0,1% SDS) powinna wystarczyć dla białek będących przedmiotem zainteresowania w tym badaniu. Należy również stosować wzorzec masy cząsteczkowej o odpowiednim zakresie wielkości. Należy zauważyć, że czasami może wystąpić zauważalne przesunięcie w górę pozornych mas cząsteczkowych biotynylowanych białek.</li>
</ol>

<ol><li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li>
<li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li>
<li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li>
<li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+family%3A+endocytosis+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li>
<li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li>
<li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation%3A+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+1.+the+use+of+%5B14-C%5Dbiotin+for+kinetic+studies+and+for+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li>
<li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin%2C+a+high+affinity+biotin-binding+protein%2C+as+a+tool+and+subject+of+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450(2012).</li>
<li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805(2014).</li>
<li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li>
<li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan%2C+Dynamin%2C+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439(2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Modyfikacje: Ponieważ metody te zostały zaprojektowane do stosowania z komórkami adherentnymi, określiliśmy użycie PBS zawierającego 100 mg/L MgCl2∙6H2O i
100 mg/l CaCl2 (CM-PBS) do etapów przemywania oraz jako podstawa niektórych, tak aby zapewnić, że komórki pozostają połączone z powierzchnią hodowli i że połączenia komórka-komórka nie są przerwane. Jednak protokoły mogą być również stosowane do nieprzylegających typów komórek, jeśli kom...

Białka na powierzchni komórki odgrywają różne role kluczowe dla utrzymania funkcji komórki. W wielu przypadkach ich aktywność jest zależna od procesów endocytarnych, które albo tymczasowo sekwestrują je w miejscach wewnątrzkomórkowych, albo kierują je w stronę szlaków degradacji1,2,3,4,5. W tym miejscu zwracamy uwagę na 2 podejścia oparte na biotynylacji, zaprojektowane tak, aby umożliwić użytkownikowi specyficzne znakowanie i izolowanie białek ulegających ekspresji w błonie plazmatycznej oraz tych nowo zinternalizowanych. Za pomocą tych metod można określić ilościowo ekspresję na powierzchni komórki i tempo endocytarne dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania, co pozwala na jaśniejszą ocenę jego regulacji.
Określanie względnej ekspresji białek na powierzchni komórki za pomocą biotynylacji
Biotyna, lub witamina B7, wcześniej znana jako witamina H6, to mała rozpuszczalna w wodzie cząsteczka, która może być używana do chemicznej modyfikacji reaktywnych grup aminowych, sulfhydrylowych i karboksylowych cząsteczek biologicznych. Obecny zbiór odczynników biotynylacji na powierzchni komórki składa się głównie z nieprzerobionych błonowo sulfonowanych sulfonowanych N-hydroksysukcynimidów (sulfo-NHS) biotyny lub jej pochodnych, zaprojektowanych do reagowania z aminami obecnymi w łańcuchach bocznych reszt lizyny białek ulegających ekspresji na powierzchni komórki, gdy ulegają one deprotonacji w warunkach podstawowych, w wyniku czego te ostatnie tworzą wiązanie amidowe z ugrupowaniem biotyny7. Tak zmodyfikowane białka powierzchniowe komórki mogą być następnie izolowane za pomocą awidyny, tetramerycznego białka o masie 66 - 69 kDa o dużym powinowactwie do biotyny, wiążącego się z tą ostatnią ze stałą dysocjacji około 10-15, co oznacza, że jest to jedno z najsilniejszych znanych oddziaływań niekowalencyjnych8,9.
W poprzednich badaniach stosowano wiele alternatywnych metod ilościowego określania ekspresji białek na powierzchni komórki. Znakowanie nieprzepuszczalnych komórek za pomocą znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał specyficznych dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, na przykład, jest powszechnie stosowanym podejściem, ale w dużym stopniu zależy od dostępności przeciwciał, które mogą wiązać się z epitopami zewnątrzkomórkowymi. Ostatnio z powodzeniem zastosowano również metody polegające na wykorzystaniu białek chimerycznych zawierających fluorofory wrażliwe na pH, które reagują na wystawienie na działanie kwaśnych mediów10. Jednak takie testy zwykle obejmują egzogenną ekspresję tych konstruktów w liniach komórkowych, w których białko będące przedmiotem zainteresowania nie występuje natywnie. Podejścia te są jednak w stanie dostarczyć cennych informacji na temat lokalizacji subkomórkowej i trasy egzocytarnej białka docelowego, a zatem powinny być stosowane w połączeniu z opisanymi tutaj podejściami opartymi na biotynylacji, jeśli dostępne są narzędzia.
W typowym teście biotynylacji, komórki są najpierw dokładnie myte w 4 °C PBS. Usuwa to wszelkie ślady białek surowicy wprowadzonych przez pożywkę hodowlaną, zapewniając w ten sposób, że nie będą one zużywać nadmiernych ilości biotyny w następnym etapie. Co ważniejsze, obniżenie temperatury powoduje znaczne spowolnienie endocytozy. Następnie dodaje się odczynnik do biotynylacji. Następnie komórki są ponownie myte, a następnie inkubowane z buforem wygaszającym zawierającym glicynę lub NH4Cl, którego celem jest dezaktywacja wszystkich pozostałych śladów nieprzereagowanej biotyny. Komórki są następnie poddawane lizie, po czym dodaje się streptawidynę unieruchomioną agarozą w celu wytrącenia biotynylowanych białek. Analiza jest zwykle przeprowadzana za pomocą western blot, co pozwala na ilościowe określenie względnej ekspresji różnych białek na powierzchni komórki.
Ze względu na podstawę tego testu, nadaje się on do stosowania tylko z białkami, których części są wystawione na działanie środowiska zewnątrzkomórkowego. Wieloprzebiegowe białka transbłonowe, które prawdopodobnie posiadają pewną liczbę reaktywnych lizyn w swoich regionach pętli, są najbardziej podatne na tę metodę, podczas gdy białka jednoprzebiegowe są mniej podatne na biotynylację. Nawet w takich przypadkach istnieje możliwość, że zmiany konformacyjne lub interakcje międzycząsteczkowe mogą blokować pewne miejsca reaktywne, co skutkuje niższą niż oczekiwano wydajnością biotynylacji.
Określanie szybkości internalizacji białek na powierzchni komórki za pomocą biotynylacji
Zasady tego testu są w dużej mierze podobne do zasad biotynylacji na powierzchni komórki, z wieloma wyjątkami, z których najważniejszym jest użycie odwracalnych odczynników do biotynylacji. Grupy biotyny (spośród nich) posiadają wiązania dwusiarczkowe w swoich strukturach, które są podatne na czynniki redukujące; Jest to wykorzystywane w celu zapewnienia, że tylko białka na powierzchni komórki pobrane do miejsc wewnątrzkomórkowych w okresie oznaczania pozostaną biotynylowane. Test zazwyczaj odbywa się w następujący sposób. Komórki są najpierw myte i biotynylowane zimnymi odczynnikami, następnie ponownie wprowadza się pożywkę do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, a komórki są zwracane do inkubatora; Powoduje to, że znakowane białka na powierzchni komórki ulegają endocytozie. Środek redukujący glutation - który nie może przeniknąć przez błonę - jest następnie dodawany w celu zerwania wiązań dwusiarczkowych ugrupowań biotyny przyłączonych do białek pozostających na powierzchni komórki. Na koniec zerwane wiązania dwusiarczkowe reagują z jodoacetamidem, zużywając labilne grupy tiolowe i zapobiegając reformowaniu wiązań. Tak jak poprzednio, komórki są następnie poddawane lizie, a znakowane białka są wytrącane za pomocą streptawidyny-agarozy.
Ograniczenia omówione w poprzedniej sekcji obowiązują również tutaj ze względu na podobieństwa między metodami. Ponadto warto pamiętać, że zmiany temperatury związane z tym testem uniemożliwiają dokładne określenie, ile białka jest endocytozowane w każdym kroku czasu, szczególnie w przypadku białek szybko internalizowanych lub szybko poddawanych recyklingowi. Test zapewnia zatem jedynie półilościowe oszacowanie wskaźników endocytarnych. Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem może być wykorzystana do śledzenia wychwytu każdego obciążonego pęcherzyka i zapewnienia bardziej precyzyjnego pomiaru kinetyki endocytozy. Może zatem stanowić bardzo użyteczne uzupełnienie tego testu, zakładając, że dostępny jest fluorescencyjnie znakowany chimeryczny konstrukt białka będącego przedmiotem zainteresowania11.

<table><tbody><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>cKompletny koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrat dihydratu etylenodiaminotetraoctanu ( EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Bio-Rad#</td><td>163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Laminina z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Rozmrażanie na lodzie.</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-&beta;-aktyny (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-&beta;-dystroglikanu (43DAG1/8D5)</td><td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Donkey anty-mysie IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Goat anty-królicza IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Zredukowany glutation</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Żywica agarozowa streptawidyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne anty-AQP4</td><td>Alomone</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris (zasada Trizma)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Białka na powierzchni komórki pośredniczą w szerokim zakresie funkcji. W wielu przypadkach ich aktywność jest regulowana przez procesy endocytarne, które modulują ich poziom na błonie plazmatycznej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły dla 2 metod, które ułatwiają badanie takich procesów, z których obie opierają się na zasadzie biotynylacji białek powierzchniowych komórek. Pierwszy z nich został zaprojektowany, aby umożliwić półilościowe określenie względnych poziomów określonego białka na powierzchni komórki. W nim reszty lizyny białek błony komórkowej komórek są najpierw znakowane ugrupowaniem biotyny. Po lizie komórek białka te mogą być następnie specyficznie wytrącone za pomocą streptawidyny immobilizowanej agarozą, wykorzystując naturalne powinowactwo tej ostatniej do biotyny. Wyizolowane w ten sposób białka mogą być następnie analizowane za pomocą standardowego podejścia western blotting. Druga metoda umożliwia określenie szybkości endocytarnej określonego celu na powierzchni komórki w pewnym okresie czasu. Białka na powierzchni komórki są najpierw modyfikowane pochodną biotyny zawierającą rozszczepialne wiązanie dwusiarczkowe. Komórki są następnie przenoszone z powrotem do normalnych warunków hodowli, co powoduje endocytarny wychwyt części biotynylowanych białek. Następnie wiązania dwusiarczkowe niezinternalizowanych grup biotyny są redukowane za pomocą nieprzepuszczalnego dla błony środka redukującego glutationu. Dzięki takiemu podejściu białka endocytozowane mogą być zatem izolowane i oznaczane ilościowo z wysokim stopniem swoistości.

Wykorzystanie biotinylacji powierzchni komórkowej do oceny ekspresji AQP4 w błonie plazmatycznej astrocytów 
Kultury astrocytów traktowane lamininą oraz nie traktowane komórki kontrolne poddano biotinylacji powierzchni komórkowej zgodnie z opisanymi metodami. Biotynilowane białka wytrącono za pomocą streptawidyny sprzężonej z agarozą, a następnie rozdzielono metodą SDS-PAGE. W frakcjach powierzchniowych komórek wyznaczono poziom AQP4 oraz β-dystroglikanu (β-DG) jako ko...

W tym raporcie przedstawiono dwie metody oparte na biotynylacji, przeznaczone do określania ekspresji na powierzchni komórki i szybkości endocytarnej białek wyrażanych na błonie plazmatycznej.

Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

W tym filmie zostaną przedstawione dwie metody: biotinylacja powierzchni komórek oraz biotinylacja typu pulse-chase. W poniższej demonstracji będziemy wykorzystywać astrocyty. Są to najliczniejsze typy komórek glejowych w mózgu, które wykazują ekspresję białka będącego przedmiotem naszych badań – akwaporyny-4.Metody opisane w niniejszej pracy mogą zostać zastosowane do wielu różnych typów komórek, w tym zarówno komórek w zawiesinie, jak i komórek adherentnych. Techniki te mogą być wykorzystywane do badania ekspresji powierzchniowej oraz internalizacji praktycznie każdego białka transbłonowego, o ile posiada ono domenę zewnątrzkomórkową dostępną dla biotyny. Ogólnym celem niniejszego testu biotinylacji powierzchni komórkowej jest określenie wpływu lamininy na ekspresję przepuszczalnego dla wody kanału Aquaporin-4 w błonie plazmatycznej astrocytów.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyjąć hodowle astrocytów z inkubatora i usunąć pożywkę za pomocą aspiratora. Komórki należy przemyć trzykrotnie czterema mililitrami schłodzonego CM-PBS, a następnie umieścić naczynia na kruszonym lodzie. Po usunięciu CM-PBS aspiratorem, do każdej studni należy nalać pipetą dwa mililitry buforu z biotyną.Delikatnie przechylaj naczynia w przód i w tył kilka razy, aby zapewnić całkowite pokrycie, przed umieszczeniem kultur na lodzie na 30 minut. Następnie usuń bufor z biotyną, zastąp go czterema mililitrami buforu gaszącego i pozostaw kultury na lodzie na 10 minut. Następnie odessaj bufor i zastąp go taką samą ilością buforu gaszącego, po czym pozostaw kultury na lodzie na 10 minut.Następnie należy usunąć bufor gaszący i trzykrotnie przemyć komórki czterema mililitrami schłodzonego CM-PBS. Po tym etapie komórki należy zebrać za pomocą skrobaka do jednego mililitra schłodzonego CM-PBS i przenieść zawiesinę do probówki do mikrocentryfugi. Następnie należy odwirować komórki przy 100 g przez trzy minuty w chłodzonej mikrocentryfudze ustawionej na cztery stopnie Celsiusz.Następnie odrzuć nadsącz i resuspendu komórki w 500 µL buforu lizującego. Potem pozostaw próbki na lodzie przez 30 minut, mieszając w vorteksie co pięć minut. Po tym czasie odwiruj lizat z prędkością 14 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby osadzić detergenty i substancje rozpuszczalne.Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfugi. Odstaw 50 µL lizatu i dodaj do niego 25 µL buforu do ładowania 3X. Następnie zdenaturuj próbkę, podgrzewając ją do 95 °C w bloku grzewczym.Jest to frakcja wejściowa, zawierająca zarówno biotynilowane białka powierzchniowe komórek, jak i niebiotynilowane białka cytozolowe. Używając odciętego końcówki pipety, przenieś 75 µL kulek agarozowych z streptawidyną do lizatu i inkubuj w temperaturze 4 °C przez trzy godziny na wytrząsarce. Następnie odwiruj kulki agarozowe z streptawidyną w wirowarce przy 1 500 g przez 30 s w temperaturze 4 °C.Odbierz 50 µL supernatantu i dodaj 25 µL trzykrotnego (3X) buforu do ładowania. Następnie poddaj próbkę denaturacji w temperaturze 95 °C w kąpieli wodnej lub w bloku grzejnym. Stanowi to frakcję wewnątrzkomórkową, składającą się głównie z niebiotynilowanych białek cytozolowych.Następnie resuspenduj osadzone kuleczki w jednym mililitrze buforu piorącego i inkubuj w wytrząsarce przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwiruj kuleczki i odrzuć supernatant. Powtórz ten proces jeszcze cztery razy, aby zminimalizować nieswoiste wiązanie niebiotynylowanych białek cytozolowych.Dodaj 50 µL buforu do nakładania rozcieńczonego do stężenia 1X za pomocą buforu do lizy. Uwolnij biotynę i streptawidynę z kulek poprzez ich denaturację w temperaturze 95 °C. Ta frakcja powinna zawierać wyłącznie biotynilowane białka powierzchniowe komórek.Następnie rozdziel frakcje wejściową, powierzchni komórkowej i wewnątrzkomórkowej za pomocą SDS-PAGE i przeanalizuj je metodą western blotting. Ogólnym celem eksperymentu biotinylacji typu pulse-chase jest określenie przybliżonej szybkości internalizacji akwaporyny-4 w astrocytach. Najpierw wyjmij hodowle astrocytów z inkubatora i odessij pożywkę.Następnie komórki należy przemyć trzykrotnie 4 ml schłodzonego CM-PBS i umieścić płytki na kruszonym lodzie. Odessać CM-PBS, a następnie do każdej płytki pipetować 3 ml buforu z biotyną. Przechylać płytki kilka razy w przód i w tył, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie buforu, i pozostawić je na lodzie na 30 minut.Następnie odessać bufor z biotyną i zastąpić go pięcioma mililitrami ciepłego medium. Inkubować jedną płytkę hodowlaną w temperaturze 37°C przez 15 minut, a drugą płytkę w tej samej temperaturze przez 30 minut. Kolejną płytkę pozostawić w temperaturze 4°C jako próbkę zerową.Po zakończeniu okresu inkubacji usunąć medium i trzykrotnie przemyć komórki czterema mililitrami schłodzonego CM-PBS. Następnie odessać CM-PBS, nanieść pipetą sześć mililitrów buforu redukującego na komórki i pozostawić próbkę w lodzie na 15 minut. Po tym czasie wymienić medium na sześć mililitrów świeżego buforu redukującego i ponownie umieścić próbkę w lodzie na kolejne 15 minut.Ten krok jest krytyczny, ponieważ glutation zawarty w buforze redukującym spowoduje odszczepienie biotyny pozostałej na powierzchni komórek. Dzięki temu znakowane biotyną zostaną tylko białka zinternalizowane. Następnie należy usunąć roztwór redukujący i zastąpić go sześcioma mililitrami buforu gaszącego.Pozostaw próbkę na lodzie przez kolejne 15 minut i powtórz etap gaszenia reakcji jeszcze raz. Następnie odlej bufor do gaszenia i przemyj komórki trzykrotnie czterema mililitrami schłodzonego PBS. Odsuń CM-PBS, a następnie zeskrob komórki do jednego mililitra schłodzonego PBS za pomocą skrobaka do komórek i przenieś zawiesinę do probówki do mikrowirówki.Ucedź komórki poprzez wirowanie z prędkością 100 g przez trzy minuty. Po trzech minutach odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 500 µL buforu lizującego. Pozostaw próbkę w lodzie na 30 minut, mieszając na wirówce typu vortex co pięć minut.Odwiruj lizat przy 14 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wytrącić detergent i materiały rozpuszczalne. Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfugi. Odstaw 50 µL tego lizatu i dodaj bufor do nakładania.Następnie zdenaturuj komórki w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym. Jest to frakcja wejściowa, zawierająca zarówno biotynilowane białka endocytowane, jak i białka niebiotynilowane. Za pomocą odciętej końcówki pipety dodaj 150 µL zawiesiny agarozy ze streptawidyną do lizatu i inkubuj w temperaturze 4 °C przez trzy godziny na wytrząsarce.Po trzech godzinach odwirować kuleczki agarozowe z streptawidyną w wirówce przy 1 500 g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Resuspendować kuleczki w jednym mililitrze buforu płuczącego i inkubować na wytrząsarce przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować kuleczki i odrzucić nadsącz.Powtórz ten proces jeszcze cztery razy, aby zminimalizować nieswoiste wiązanie niebiotynilowanych białek cytozolowych. Następnie osadź kuleczki poprzez wirowanie przy 1 500 g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odlej nadsącz z buforu piorącego i dodaj 50 µL 1x buforu do ładowania.Uwolnić biotynę i streptawidynę z kulek poprzez denaturację w temperaturze 95 °C. Frakcja ta powinna zawierać wyłącznie zinternalizowane białka powierzchni komórkowej. Następnie rozdzielić frakcje wejściową, powierzchni komórkowej oraz nie związanej za pomocą SDS-PAGE i przeanalizować je metodą Western blotting.Przedstawiono tutaj frakcje powierzchni komórkowej, wewnątrzkomórkowej i całkowitej z niepoddanych działaniu czynników astrocytów oraz astrocytów traktowanych 24 nM lamininy, poddane analizie w kierunku Aquaporin-4 oraz beta-dystroglycan. Ten histogram ilustruje różnice w poziomach powierzchniowych Aquaporin-4 w niepoddanych działaniu czynników i traktowanych lamininą astrocytach, znormalizowane względem beta-dytroglycan. Na tej figurze zanalizowano pod kątem Aquaporin-4 zinternalizowane frakcje białek pobrane w 0, 15 i 30 minucie.Ten histogram podsumowuje internalizację akwaporyny-4 dla czterech niezależnych doświadczeń, znormalizowaną względem wartości dla punktu czasowego zero minut. Gwiazdka oznacza statystycznie istotny wzrost ilości akwaporyny-4 poddanej endocytozie między 15 a 30 minutą. Po zastosowaniu glutationu w celu rozerwania wiązania dwusiarczkowego w rozszczepialnym analogu biotyny, udział akwaporyny-4 z powierzchni komórki w frakcji biotylowanej gwałtownie spada.Daje to wyraźną różnicę między próbkami z minuty zero a próbkami z 15 minuty. Gdy ten krok zostanie pominięty, sygnał pochodzący z puli powierzchniowej komórki sprawia, że zmiana między tymi dwoma punktami czasowymi jest niewykrywalna. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak immunofluorescencja i mikroskopia TIRF, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, w tym dotyczące fizycznego transportu ładunku.

determining-cell-surface-expression-endocytic-rate-proteins-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Ten film pokazuje izolację białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych z hodowli astrocytów. Hodowlę astrocytów umieszcza się na lodzie w celu zahamowania endocytozy, a następnie białka na powierzchni komórki znakuje się odczynnikiem biotynylacyjnym. Komórki są poddawane lizie w celu uwolnienia biotynylowanych białek powierzchniowych komórek i niebiotynylowanych białek wewnątrzkomórkowych. Wreszcie, kulki pokryte streptawidyną są używane do oddzielania biotynylowanych białek powierzchniowych...

Izolacja białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych z hodowli astrocytów

Ten film demonstruje metodę oceny internalizacji docelowego białka w astrocytach korowych myszy za pomocą biotynylacji, a następnie lizy komórek, ekstrakcji białka na bazie streptawidyny, denaturacji i analizy Western blot w celu potwierdzenia udanej internalizacji.

Ocena internalizacji docelowych białek powierzchniowych za pomocą pochodnej biotyny

Źródło: Creighton, B. A., et al. Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu ładunku w hodowanych astrocytach za pomocą fluorescencyjnej sondy kwasotropowej, która selektywnie znakuje kwaśne pęcherzyki endolizosomalne. Obrazowanie poklatkowe i akwizycja stosu Z za pomocą mikroskopu konfokalnego umożliwiają śledzenie fluorescencyjnie znakowanego ładunku w...

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu ładunku w hodowanych astrocytach

Transportowanie błony polega na transporcie białek z błony plazmatycznej do wnętrza komórki (np. endocytoza), a następnie transporcie do lizosomów w celu degradacji lub do błony plazmatycznej w celu recyklingu. Metody opisane w tym artykule mają na celu badanie endocytozy i recyklingu białek błony komórkowej.

Komórkowe testy ochrony L-glutationu do badania endocytozy i recyklingu białek błony komórkowej

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Prezentowany tutaj jest protokół, który łączy system kohodowli neuronalno-śródbłonkowej in vitro i metaboliczną inkorporację sialoglikanu z bioortogonalnymi grupami funkcyjnymi w celu rozszerzenia pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych oraz oznaczenia ich powierzchniowych sialoglykoprotein do obrazowania lub analizy spektrometrii mas markerów powierzchni komórki.

Identyfikacja markerów powierzchniowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez znakowanie metaboliczne sialoglikanu

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Poznaj metody biotynylacji powierzchni komórkowej i puls-chase do badania ekspresji białek i szybkości endocytozy w astrocytach. Techniki te pozwalają analizować dynamikę Aquaporin-4 w badaniach neurobiologicznych.

Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji (Wideo) | JoVE Journal

Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

Przeglądaj więcej filmów