Name: In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Poznaj metodę hodowli zalążków in vitro do obrazowania żywych komórek polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia śledzenie dynamiki embriogenezy w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mikroskopia w tej pracy została przeprowadzona w Instytucie Transformacyjnych Bio-Molekuł (WPI-ITbM) Uniwersytetu w Nagoi i wspierana przez Japan Advanced Plant Science Network. Praca ta została wsparta grantami z Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (projekt ERATO dla T.H. i M.U.) oraz z Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (nr JP24113514, JP26113710, JP15H05962 i JP15H05955 dla M.U. oraz nr JP16H06465, JP16H06464 i JP16K21727 dla T.H.), Grant-in-Aid dla Młodych Naukowców (B, nr JP24770045 i JP26840093 dla M.U.) oraz Grant-in-Aid dla ambitnych badań eksploracyjnych (nr JP16K14753 dla M.U.).

1. Przygotowanie pożywki do hodowli zalążków in vitro
<ol>
	<li>Przygotować płynną pożywkę do hodowli zalążków in vitro („pożywka N5T”) zawierającą 1x mieszaninę soli podstawowych Nitscha, 5% (w/v) trehalozy dwuwodnika, 0,05% (w/v) kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES)-KOH (pH 5,8) oraz 1x roztwór witamin Gamborga.</li>
	<li>Dostosować pH do wartości 5,8 za pomocą KOH.</li>
	<li>Sterylizować pożywkę poprzez autoklawowanie (121 °C, 20 min) lub filtrowanie przez filtr 0,2-µm. 
	UWAGA: Sterylna pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 2 - 3 miesiące.</li>
</ol>
2. Przygotowanie urządzenia z macierzą mikrosłupków z PDMS
<ol>
	<li>Dotnij urządzenie z mikropilarami z PDMS za pomocą noża, żyletki lub nożyczek, aby pasowało do szklanej części (14 mm φ) szalki z dna szklanego o średnicy 35 mm. 
	UWAGA: Pełna procedura konstrukcji urządzenia z PDMS została opisana w poprzednich publikacjach8,9, dlatego szczegóły zostały tutaj pominięte. Szalki z dna szklanego o mniejszej objętości, takie jak płytki 4-dołkowe lub 96-dołkowe, mogą być używane do obrazowania krótkoterminowego bez użycia urządzenia.</li>
	<li>Sterylizuj górną stronę urządzenia z PDMS pod światłem UV przez 15 min.</li>
	<li>Odwróć urządzenie z PDMS za pomocą pęsety z płaskimi końcami i pozostaw pod światłem UV przez 15 min w celu sterylizacji spodu.</li>
	<li>Przenieś wysterylizowane urządzenie z PDMS do szalki hodowlanej o średnicy 35 mm i dodaj pożywkę N5T, aż urządzenie zostanie całkowicie zanurzone w pożywce (około 5 - 7 mL).</li>
	<li>Umieść szalkę w komorze próżniowej i zmniejsz ciśnienie, aby odgazować układ. Kontynuuj odsysanie przez 3 h lub przez noc, aż powietrze w urządzeniu zostanie zastąpione pożywką. 
	UWAGA: Pod wpływem silnej próżni urządzenie może zostać odklejone przez pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Wyjmij urządzenie z szalki, trzymając je pęsetą z płaskimi końcami, i połóż na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar pożywki z bocznych krawędzi i spodu. 
	UWAGA: Pożywka na matrycy mikropilarów (powierzchnia górna) nie powinna być usuwana, ponieważ będzie ona wykorzystywana do hodowli przyrodek.</li>
	<li>Przenieś urządzenie na szkiełko przedmiotowe o wymiarach 76 mm x 26 mm, upewniając się, że część z mikropilarami znajduje się na górze, a następnie przykryj urządzenie pokrywką od szalki hodowlanej 35 mm, aby zapobiec wysychaniu pożywki podczas następnego etapu ekstrakcji przyrodek.</li>
</ol>
3. Disekcja strąka i ekstrakcja zalążków
<ol>
	<li>Zesterylizować igłę (0,40 mm G) oraz precyzyjną pęsetę, przecierając je 70% etanolem. Dla łatwiejszej obsługi igłę można przymocować do strzykawki lub drewnianego patyczka.</li>
	<li>Należy sprawdzić kwiatostan rośliny i wybrać odpowiednie strąki do eksperymentu. Strąki o długości około 5 mm zawierają zygoty, natomiast strąki o długości 8–10 mm zawierają młode embriony w stadium globularnym.</li>
	<li>Wyciąć strąki za pomocą pęsety i umieścić je na dwustronnej taśmie na szkiełku przedmiotowym o wymiarach 76 x 26 mm. Jeden strąk zawiera około 40–60 zalążków, a 3–4 strąki (t. j., 120 – 240 czopków) jest wystarczająca dla jednego urządzenia.</li>
	<li>Otwórztorewkę (ścianę zalążni), aby zobaczyć znajdujące się wewnątrz zalążki, używając sterylnej igły i pęsety pod stereomikroskopem. Przetnij wyłącznie ścianę zalążni, tak aby nie uszkodzić zalążków.</li>
	<li>Przenieś otwartątątątątą strączkę do pożywki N5T na urządzeniu PDMS (przygotowanym w kroku 2.7), a następnie za pomocą igły lub pęsety uwolnij zalążki do pożywki.</li>
	<li>Nałóż małe szkiełko nakrywkowe (18 mm x 18 mm) na urządzenie z PDMS, aby wcisnąć przyleknie w przestrzenie w obrębie macierzy mikropillarów.</li>
	<li>Zdejmij szkiełko okrywek, przesuwając je poziomo pęsetą lub palcami, aby usunąć nadmiar medium.</li>
	<li>Odwróć urządzenie z PDMS do góry dnem, umieść je w naczyniu z szklanym dnem o średnicy 35 mm, a następnie lekko dociśnij urządzenie za pomocą pęsety z płaskim końcem, aby przylgnęło do szkła.</li>
	<li>Ostrożnie wlej pożywkę N5T do szalki z szklanym dnem, przelewając zawartość z butelki z pożywką, aż urządzenie PDMS zostanie całkowicie zanurzone w pożywce, a następnie szczelnie zamknij szalkę folią parafinową. 
	UWAGA: Urządzenie z PDMS może być używane ponownie, jednak urządzenia zbyt stare łatwo odrywają się od szklanego dna. Ponadto urządzenie może wypłynąć, jeśli nie zostało całkowicie odgazowane w kroku 2.5 lub jeśli medium zostało wlane zbyt szybko.</li>
</ol>
<img alt="Urządzenie z mikropilarsami z PDMS do hodowli zalążków in vitro, schemat przedstawia krok po kroku konfigurację mikroskopową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat procedury przygotowania próbek. 
Ten schematycznemu przepływowi odpowiadają kroki od 3.5 do 4.1. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
4. Obrazowanie poklatkowe
<ol>
	<li>Umieść naczynie z szklanym dnem przygotowane w kroku 3.9 na mikroskopie odwróconym i wybierz odpowiednie przylecie do ustawienia ostrości. 
	UWAGA: Ponieważ przylecie różnią się stadiumm, położeniem i kierunkiem, odpowiednie okazy należy zlokalizować, sprawdzając fluorescencję ich markerów.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie na żywo zgodnie z instrukcją obsługi systemu mikroskopowego dostarczoną przez producenta. 
	UWAGA: Sprzęt mikroskopowy i parametry są zróżnicowane, dlatego użytkownicy powinni dobrać odpowiednie ustawienia dopasowane do celu eksperymentu. Przykładowo, ustawienia zastosowane w niniejszym opracowaniu wymieniono w Tabeli 1.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sprzęt/konfiguracja</td>
			<td>Rycina 3 (A) oraz filmy uzupełniające 1 i 4</td>
			<td>Rycina 3 (B) oraz Wideo uzupełniające 2</td>
			<td>Wideo uzupełniające 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikroskop</td>
			<td>odwrócony mikroskop skaningowy z detekcją laserową (A1R MP)</td>
			<td>odwrócony mikroskop konfokalny z dyskiem wirującym (CSU-W1)</td>
			<td>system odwróconego mikroskopu konfokalnego typu box z stabilną komorą inkubacyjną (CV10)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>femtosekundowy laser impulsowy Ti:szafir</td>
			<td>lasery LD 488 nm i 561 nm</td>
			<td>lasery LD 48 nm i 561 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obiektyw </td>
			<td>obiektyw imersyjny 40X (NA = 1,15) z medium imersyjnym</td>
			<td>obiektyw imersyjny z olejem silikonowym 60x (NA = 1,30), zamontowany na piezoelektrycznym napędzie ogniskowania</td>
			<td>obiektyw 40X (NA = 0,95)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor</td>
			<td>zewnętrzny detektor PMT z GaAsP bez skanowania wstępnego</td>
			<td>Kamera EMCCD</td>
			<td>Kamera EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lustro dichroiczne</td>
			<td>DM495 i DM560</td>
			<td>DM48/561</td>
			<td>DM40-410/48/561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtr</td>
			<td>filtry pasmowe; 534/30 nm i 578/105 nm</td>
			<td>filtry przepustowe; 520/35 nm oraz 593/46 nm</td>
			<td>filtry przepustowe pasmowych; 520/50 nm i 617/73 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przekrój wzdłuż osi z</td>
			<td>31 stosów z-stack z 1-µm interwały</td>
			<td>17 stosów z (z-stacks) z 3-µm interwały</td>
			<td>7 stosów z-stack z 5-µm przedziały</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odstęp czasowy</td>
			<td>20 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>10 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Systemy mikroskopowe i ustawienia użyte w niniejszej pracy. 
Mikroskopy i parametry są zróżnicowane, dlatego każdy użytkownik powinien dobrać odpowiedni system do przeprowadzanego eksperymentu.
<ol start="3">
	<li>Sprawdź pozyskaną sekwencję obrazów i przekonwertuj ją na ogólny format filmowy, taki jak .avi lub .mov, w celu prezentacji. 
	UWAGA: Jeśli oprogramowanie mikroskopu nie pozwala na eksport obrazów w formacie filmowym, można zapisać obrazy w formacie .tif, a następnie otworzyć je w programie ImageJ – programie o otwartym kodzie źródłowym zainspirowanym przez NIH Image – aby zmienić typ pliku. Program ImageJ jest dostępny pod adresem: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ może być również wykorzystany do tworzenia filmów z serii Z (Z-stack), np. poprzez projekcję maksymalnej intensywności, zgodnie z opisem pod adresem: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol><li>Natesh, S., Rau, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatesh%2C+S+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).</li>
<li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li>
<li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li>
<li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970000063">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li>
<li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00497-004-0233-9">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li>
<li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li>
<li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li>
<li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li>
<li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400513011015">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li>
<li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li>
<li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li>
<li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy manuskrypt przedstawia prosty protokół hodowli zalążków in vitro, który jest efektywny w obrazowaniu żywych komórek rozwijających się zygot i embrionów.
Projekt urządzenia z PDMS może wymagać optymalizacji w zależności od stopnia rozwoju zarodka. Pierwszym opracowanym urządzeniem była macierz mikroklatek służąca do regulacji orientacji i ustalenia pozycji przyląków9, a następnie skonstruowano urządzenie z mikropillarami, aby skuteczniej chwytać przylą...

Podstawowy plan budowy organizmu rozwija się z jednokomórkowej zygoty. U większości roślin kwitnących podział zygoty prowadzi do powstania komórki apikalnej i bazalnej, z których rozwijają się odpowiednio pęd i korzeń1. Dlatego istotne jest zrozumienie, w jaki sposób ciało rośliny formuje się podczas embriogenezy, jednak do tej pory brakowało skutecznego narzędzia do bezpośredniej obserwacji dynamiki żywych zygot i embrionów, ponieważ rozwijają się one głęboko w kwiecie. U kilku gatunków jednoliściennych, takich jak kukurydza i ryż, opracowano metodę zapłodnienia in vitro2,3. W tej metodzie izolowane komórki plemników i komórki jajowe są łączone elektrycznie lub chemicznie, a powstała komórka może rozwinąć się w płodną roślinę. Jednak w przypadku roślin dwuliściennych nie istnieje metoda zapłodnienia in vitro, która pozwalałaby na wytworzenie prawidłowych embrionów, prawdopodobnie ze względu na niezsynchronizowany stan cyklu komórkowego gamet męskich i żeńskich4,5. Ponadto tkanka otaczająca embrion (endosperm) odgrywa istotną rolę w rozwoju embrionu6.
W modelowym gatunku dwuliściennych, A. thaliana, opracowano metodę hodowli in vitro koncentrującą się na całej zalążni, która zawiera zarówno embrion, jak i endosperm7. System ten został z powodzeniem wykorzystany do analizy wpływu różnych odczynników chemicznych na embriogenezę, jednak nie nadaje się on do obrazowania poklatkowego ze względu na niską przeżywalność. W związku z tym opracowano nowy system hodowli zalążni in vitro, aby umożliwić rozpoczęcie obserwacji już na etapie zygoty i uzyskać płodne rośliny z wysoką wydajnością8. Po licznych próbach stwierdzono, że pożywka Nitscha oraz trehaloza znacząco poprawiają przeżywalność zalążni8. Ponadto, ponieważ zalążnia powiększa się w miarę wzrostu i w konsekwencji często przemieszcza się poza pole widzenia mikroskopu, opracowano urządzenie z PDMS służące do unieruchomienia zalążni w pożywce9. Urządzenie PDMS umożliwiło długoterminowe obrazowanie przez 3 – 4 dni, co jest wystarczające do śledzenia rozwoju od zygoty do embrionu w stadium serca. Dzięki zastosowaniu tej metody możliwe staje się wizualizowanie dynamiki polaryzacji zygoty i wzorca rozwoju embrionu nie tylko w warunkach normalnych, ale także w obecności inhibitorów chemicznych lub w różnych liniach mutantów8,10,1.
<img alt="Proces zapylania kwiatu; schemat rozwoju zalążka od zygoty do zarodka w stadium kulistym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat specyficznych markerów fluorescencyjnych wykorzystanych do wizualizacji zygot i zarodków wewnątrz zalążka. 
The Arabidopsis zygota rozwija się w embrion w zalążku, który powstaje głęboko wewnątrz kwiatu. W tym in vitro systemie hodowli zygota i zarodek są obserwowane poprzez zalążnię, dlatego ważne jest stosowanie specyficznych markerów fluorescencyjnych, które nie wykazują ekspresji w innych tkankach zalążni. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>

<table><tbody><tr><td>Nitsch podstawowa mieszanka soli</td><td>Duchefa</td><td>N0223</td><td></td></tr><tr><td>trehaloza dwuwodna</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>206-18455</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg' s roztwór witamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>35-milimetrowe naczynie ze szklanym dnem</td><td>Matsunami Szklane</td><td>naczynie</td> hodowlane D111300 <td></td></tr><tr><td>35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>76 &times; 26 mm slide glass</td><td>Matsunami Glass</td><td>S1225</td><td></td></tr><tr><td>18 &times; 18 mm slide glass</td><td>Matsunami Glass</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>igła (rozstaw 0,40 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Medium zanurzeniowe Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>A1R MP</td><td>Nikon</td><td>A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>Jest to sprzęt niestandardowy, dlatego numer katalogowy nie jest dostępny.</td></tr><tr><td>CV1000</td><td>Yokogawa Electric</td><td>CV1000-SP84</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

U większości roślin kwitnących, zygota i zarodek są ukryte głęboko w tkance matki, dlatego od dawna pozostaje tajemnicą, jak rozwijają się dynamicznie; na przykład, jak zygota polaryzuje się, aby ustalić oś ciała i jak zarodek określa różne losy komórek podczas tworzenia organów. Manuskrypt opisuje metodę hodowli zalążków in vitro w celu wykonania obrazowania żywych komórek rozwijających się zygot i zarodków Arabidopsis thaliana. Zoptymalizowane podłoże uprawowe pozwala zygotom lub wczesnym zarodkom wyrosnąć na płodne rośliny. Łącząc go z urządzeniem z poli(dimetylosiloksanem) (PDMS) z matrycą mikrofilarową, zalążek jest utrzymywany w ciekłym podłożu w tej samej pozycji. To utrwalenie jest niezbędne do obserwacji tego samego zalążka pod mikroskopem przez kilka dni od podziału jarzmowego do późnego stadium zarodka. Uzyskane w ten sposób obrazowanie żywych komórek może być wykorzystane do monitorowania dynamiki polaryzacji zygoty w czasie rzeczywistym, takiej jak migracja jądra i rearanżacja cytoszkieletu, a także czasu podziału komórki i specyfikacji losu komórki podczas modelowania zarodka. Co więcej, ten system hodowli zalążków może być łączony z leczeniem inhibitorami w celu analizy wpływu różnych czynników na rozwój zarodka oraz z manipulacjami optycznymi, takimi jak przerywanie laserowe, w celu zbadania roli komunikacji komórka-komórka.

Dzięki zastosowaniu tego systemu hodowli zalążków, metoda ta pozwala na śledzenie dynamiki żywych procesów polaryzacji zygoty i wzorowania zarodka. Jest to istotne osiągnięcie, ponieważ wcześniej nie istniała technika umożliwiająca wizualizację w czasie rzeczywistym zachowania zygoty i zarodka, które są ukryte głęboko w tkance macierzystej. Rycina 3A oraz Wideo uzupełniające 1 pokazują, że mikrotubule (MTs) w młodej zygocie gromadzą się w pos...

Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie obrazowania żywych komórek zygot i embrionów Arabidopsis w celu wizualizacji dynamiki ich embriogenezy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju roślin dotyczące sposobu powstawania asymetrii zygoty oraz morfologii embrionu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość śledzenia żywej dynamiki polaryzacji zygoty i wzorcowania embrionu.Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ przygotowanie urządzenia z mikrofilarami oraz przyleczków jest trudne do wyjaśnienia w samym tekście. Aby przygotować urządzenie z macierzą mikrofilarów PDMS, należy najpierw dociąć urządzenie tak, aby pasowało do szalki z szklanym dnem o średnicy 35 mm, a następnie wysterylizować górną i dolną stronę urządzenia poprzez 15-minutową ekspozycję na światło UV z każdej strony. Po wysterylizowaniu wszystkich stron należy przenieść urządzenie PDMS do nowej szalki hodowlanej o średnicy 35 mm i dodać do szalki od pięciu do siedmiu mililitrów świeżego medium N5T, aż urządzenie zostanie całkowicie zanurzone.Następnie umieść szalkę w komorze próżniowej i obniż ciśnienie, pozostawiając urządzenie w próżni do czasu, aż całe powietrze w urządzeniu zostanie zastąpione pożywką. Po odgazowaniu urządzenia użyj pęsety z płaskimi końcówkami, aby osuszyć urządzenie za pomocą ręcznika papierowego, usuwając nadmiar pożywki z boków i spodu. Następnie umieść urządzenie na szkiełku przedmiotowym o wymiarach 76 na 26 mm i przykryj je pokrywką od szalki hodowlanej o średnicy 35 mm, aby zapobiec wysychaniu urządzenia.Przed rozpoczęciem sekcji należy wysterylizować igłę o grubości 0,40 mm oraz precyzyjną pęsetę za pomocą 70% etanolu. Następnie należy sprawdzić kwiatostan rośliny, aby wybrać odpowiednie torebki do eksperymentu. Torebki o długości około 5 mm zawierają zygoty, natomiast torebki o długości od 8 do 10 mm zawierają młode embriony w stadium globularnym.Za pomocą pęsety przenieś trzy do czterech wybranychtorebek na kawałek dwustronnej taśmy klejącej na szkiełku przedmiotowym o wymiarach 76 na 26 milimetrów. Następnie umieść szkiełko pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą igły oraz pęsety otwórz ściany zalążni. Przenieś otwarte torebki na macierz mikropilar urządzenia PDMS i uwolnij zawiązki do medium.Następnie należy położyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 na 18 milimetrów na urządzeniu, aby wtłoczyć zawiązkie w przestrzenie macierzy mikrosłupków. Gdy zawiązkie znajdą się na swoim miejscu, należy użyć pęsety lub palców, aby przesunąć szkiełko nakrywkowe poziomo z urządzenia w celu usunięcia nadmiaru pożywki, a następnie umieścić urządzenie odwrócone do góry dnem w nowej szalce z szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów. Za pomocą końcówki pęsety płaskiej należy lekko docisnąć urządzenie do dna szalki i wlać do niej świeżą pożywkę N5T, aż urządzenie zostanie całkowicie zanurzone.Następnie szczelnie zamknąć szalkę za pomocą parafilmu. W celu obrazowania zapłodników w trybie time-lapse, przenieść szalkę na stolik mikroskopu odwróconego i wykorzystać fluorescencję markera do wyboru zapłodników do obrazowania. Po zlokalizowaniu optymalnych zapłodników, rozpocząć obrazowanie próbek na żywo zgodnie z zaleceniami producenta.Ten system hodowli zalążków pozwala na śledzenie żywej dynamiki polaryzacji zygoty oraz wzorowania embrionu. Przykładowo, tutaj można obserwować akumulację mikrotubul w postaci pierścienia poprzecznego, a następnie ich formowanie w wrzeciono. Komórki embrionalne dzielą się następnie w sposób kwartalny, tworząc radialnie symetryczny kształt kulisty.Traktowanie hodowanych zalążków inhibitorem polimeryzacji aktyny hamuje jednak migrację jąder polarnych, co prowadzi do bardziej symetrycznego podziału zygoty i sugeruje rolę filamentów aktynowych w polaryzacji zygoty. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu dwóch godzin. Po przeprowadzeniu tego procesu można zastosować zaburzenie laserowe w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące roli komunikacji międzykomórkowej w procesie wzorcowania zarodka.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wizualizować kluczowe zdarzenia podczas embriogenezy.

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Celem jest zilustrowanie, że modelowa roślina strączkowa Medicago truncatula może być łatwo wykorzystana do zbadania regulacji wczesnej embriogenezy roślin, aby uzupełnić model rzodkiewnika nie-strączkowego. Morfologia strąków jest powiązana z etapami embriogenezy zygotycznej, a także opracowano protokół pobierania zarodków za pomocą hodowli tkankowej.

Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Pokazujemy metodę określania udanego lub nieudanego zapłodnienia na podstawie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis

Tutaj opisujemy ulepszenie metody semi-in vitro (SIV) do obserwacji naprowadzania i odbioru łagiewki pyłkowej u Arabidopsis thaliana, co zwiększa podatność zalążków. Wysokoprzepustowa metoda SIV cum septum może być połączona z liniami markerowymi gametofitów i genetycznie kodowanymi biosensorami w celu monitorowania dynamicznego procesu zapłodnienia.

Obrazowanie na żywo odbioru łagiewki pyłkowej rzodkiewnika i podwójnego zapłodnienia metodą semi-in vitro cum septum

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Poznaj metodę hodowli zalążków in vitro do obrazowania żywych komórek polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia śledzenie dynamiki embriogenezy w czasie rzeczywistym.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

Przeglądaj więcej filmów