Name: Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T11:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania elastycznych mikrokriogeli 3D do terapii regeneracyjnej i badań przesiewowych leków. Technika ta upraszcza hodowlę komórkową 3D i poprawia przeżywalność komórek macierzystych po iniekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była finansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Granty: 81522022, 51461165302). Autorzy pragną podziękować wszystkim członkom laboratorium Du za ogólną pomoc.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Medycyna regeneracyjna i modele in vitro do badań przesiewowych leków to dwa ważne zastosowania w inżynierii tkankowej 5,6,7,8,9. Chociaż te dwie aplikacje mają bardzo różne potrzeby, ich wspólną płaszczyzną jest potrzeba bardziej biomimetycznych warunków hodowli w celu poprawy funkcji komórek19. Tylko dzięki poprawie funkcji k...

Tradycyjna hodowla komórkowa na spłaszczonych dwuwymiarowych (2D) powierzchniach, takich jak szalka hodowlana lub płytki wielodołkowe, z trudem może wywołać zachowanie komórek zbliżone do ich rodzimych stanów. Dokładna rekapitulacja natywnych mikrośrodowisk komórkowych, które składają się z różnych typów komórek, macierzy zewnątrzkomórkowych i bioaktywnych czynników rozpuszczalnych w architekturach trójwymiarowych (3D)1,2,3,4, jest niezbędna do konstruowania tkanek biomimikujących in vitro Do zastosowań w inżynierii tkankowej, medycynie regeneracyjnej, badaniach biologii podstawowej i odkrywaniu leków5,6,7,8,9.
Zamiast hodowli komórkowej 2D, hodowla komórkowa 3D jest szeroko stosowana do rozwoju biomimetycznych mikroarchitektur i funkcjonalnych cech komórek hodowanych in vitro. Popularną metodą hodowli komórkowej 3D jest agregowanie komórek w sferoidy7,8,9,10. Sferoidy komórkowe mogą być wstrzykiwane do uszkodzonych tkanek ze zwiększoną retencją komórkową i przeżyciem w porównaniu z wstrzykiwaniem komórek rozproszonych. Jednak niejednorodne rozmiary sferoid i nieuniknione uszkodzenia mechaniczne nałożone na komórki przez siłę ścinającą płynu podczas wstrzykiwania prowadzą do słabych efektów terapeutycznych komórek11,12,13. Podobnie, nieodłączna niejednorodność podczas agregacji sferoid sprawiła, że ich translacja na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków w 3D oparta na komórkach stała się wyzwaniem10.
Inna metoda hodowli komórek 3D jest osiągana za pomocą biomateriałów, które zazwyczaj zamykają komórki w wodnych hydrożelach lub porowatych rusztowaniach. Pozwala to na większą elastyczność w konstruowaniu architektur 3D. W przypadku terapii komórki zamknięte w rusztowaniach są zwykle dostarczane do organizmu zwierzęcia poprzez implantację chirurgiczną, która jest inwazyjna i traumatyczna, co ogranicza jej szerokie przenikanie do łóżka pacjenta. Z drugiej strony, hydrożele wodne umożliwiają minimalnie inwazyjną terapię poprzez wstrzykiwanie komórek zawieszonych w roztworze prekursora hydrożelu do ciał zwierząt, umożliwiając żelowanie in situ poprzez sieciowanie termiczne, chemiczne lub enzymatyczne11. Ponieważ jednak komórki są dostarczane, gdy prekursory hydrożelu są jeszcze w stanie wodnym, są one również narażone na mechaniczne ścinanie podczas wstrzykiwania. Co więcej, chemiczne lub enzymatyczne sieciowanie podczas żelowania hydrożelu in situ może również spowodować uszkodzenie komórek w środku. W przypadku badań przesiewowych leków, hodowle komórkowe wspomagane biomateriałem napotykają problemy z jednorodnością, sterowalnością i przepustowością. Używając hydrożeli, komórki są zwykle zaangażowane w żelowanie, przez co proces ten może wpływać na żywotność i funkcję komórek. Żelowanie podczas wysiewu komórek utrudnia również użycie przez większość urządzeń o wysokiej przepustowości, ponieważ hydrożel może wymagać przechowywania na lodzie, aby zapobiec żelowaniu przed wysiewem komórek, a hydrożel może zaciąć końcówki dozujące, które są zwykle bardzo cienkie, aby zapewnić dokładność przesiewania o wysokiej przepustowości. Wstępnie uformowane rusztowania mogą potencjalnie oddzielić procedury wytwarzania biomateriałów od hodowli komórkowych, jednak większość produktów opartych na rusztowaniach jest dostępna jako materiały masowe o stosunkowo niższej przepustowości14.
Aby przezwyciężyć niektóre niedociągnięcia obecnych metod hodowli 3D, opracowaliśmy zintegrowaną technologię mikrofabrykacji i kriożelacji, aby stworzyć gotowy i przyjazny dla użytkownika chip do mikrokriożelu15. W tym protokole żelatyna została wybrana jako przykład techniki wytwarzania mikrokriożelu, ponieważ jest biokompatybilna, degradowalna, opłacalna i nie jest wymagana dalsza modyfikacja do łączenia komórek. Inne polimery pochodzenia naturalnego lub syntetycznego mogą być również używane do produkcji, w zależności od zastosowania. Dzięki tej technologii możemy wytwarzać zminiaturyzowane i wysoce elastyczne mikrokriożele o kontrolowanym rozmiarze, kształcie i układzie. Po załadowaniu różnymi typami komórek, mikrotkanki 3D mogą być formowane do różnych zastosowań. Te unikalne cechy umożliwiają pożądaną wstrzykiwalność, ochronę komórek i retencję ukierunkowaną na miejsce po wstrzyknięciu in vivo w celu zwiększenia efektów terapeutycznych. Co więcej, mikrokriożele mogą być dalej przetwarzane w celu utworzenia matryc mikrotkanek 3D, które są kompatybilne z powszechnym sprzętem laboratoryjnym i instrumentami w celu realizacji wysokoprzepustowej hodowli komórkowej do wszechstronnych badań przesiewowych leków i innych testów komórkowych. W tym miejscu szczegółowo omówimy proces wytwarzania mikrokriożeli i ich obróbkę końcową jako pojedyncze mikrotkanki 3D lub matryce mikrotkanek 3D do dwóch ważnych zastosowań, odpowiednio, terapii komórkowej i badań przesiewowych leków10,15.

<table><tbody><tr><td>Żelatyna</td><td>sigma</td><td>G7041</td><td>Wszystkie inne odczynniki zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), chyba że wskazano inaczej.</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy&nbsp;</td><td>J& K</td><td>902042</td><td>Stosowany jako środek sieciujący w przygotowaniu materiału.</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe szklane (24 x 50 mm)</td><td>CITOGLASS, Chiny</td><td>10212450C</td><td>Do zeskrobywania roztworu prekursora na chipy matrycy mikroszablonów.</td></tr><tr><td>Sód&nbsp; borowodorek, NaBH4</td><td>Beijing Chemical Works</td><td>116-8</td><td>Do wypłukiwania pozostałego aldehydu glutarowego po żelowaniu.</td></tr><tr><td>Słoik próżniowy</td><td>asperts, Chiny</td><td>VC8130</td><td>Do przechowywania mikrożeli w próżni.</td></tr><tr><td>Płyty z polimetakrylanu metylu (PMMA)&nbsp;</td><td>Sunjin Electronics Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td>Zwykłe arkusze PMMA.</td></tr><tr><td>System laserowy Rayjet</td><td>Rayjet, Australia</td><td>Rayjet 50 C30</td><td>Do grawerowania arkuszy PMMA w celu formowania dołków.</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy</td><td>Mycro Technologies, USA</td><td>PDC-32G</td><td>Aby PMMA był hifofilny.</td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Boyikang, Chiny</td><td>SC21CL</td><td>Do liofilizacji materiałów.</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)</td><td>Zhongkekeao, Chiny</td><td>DA0065</td><td>Do barwienia mikrożeli.</td></tr><tr><td>Chlorowodorek doksorubicyny</td><td>ENERGY CHEMICAL, Chiny</td><td>A01E0801360010</td><td>Do badania lekooporności komórek w mikrożelu 2D lub 3D.</td></tr><tr><td>Test żywy/martwy</td><td>Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japonia)</td><td>CS01-10</td><td>Do rozróżniania żywych i martwych komórek.</td></tr><tr><td>Miano komórki-Blue</td><td>Promega (Wisconsin, Stany Zjednoczone).</td><td>G8080</td><td>Do testowania żywotności ogniw.</td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>BD Biosciences, USA</td><td>352360</td><td>Do zbierania mikrożeli.</td></tr><tr><td>D-Lucyferyna</td><td>SYNCHEM (Niemcy)</td> <td>s039</td><td>Do sczepiania komórek.</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>FEI, USA</td><td>Quanta 200</td><td>Do charakteryzowania morfologii mikrożeli.</td></tr><tr><td>&nbsp; Mechaniczna maszyna wytrzymałościowa</td><td>Bose, USA</td><td>3230</td><td>Do pomiaru cech mechanicznych.</td></tr><tr><td>Programowalna pompa strzykawkowa&nbsp;</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>ALADINI 1000</td><td>Do testowania injactabiliy.</td></tr><tr><td>Cyfrowy miernik siły</td><td>HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., Chiny</td><td>H-50&nbsp;</td><td>Aby przetestować injactabiliy.</td></tr><tr><td>System sterylizacji tlenkiem etylenu</td><td>Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC</td><td>AN74i</td><td>Do sterylizacji mikrożeli gazowym tlenkiem etylenu.</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne, USA</td><td>M5</td><td>Do pomiaru intensywności fluorescencji w mikroukładzie.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon, Japonia</td><td>A1Rsi</td><td>Do obserwacji rozmieszczenia komórek w 3D.</td></tr><tr><td>Ksenogen&nbsp; System obrazowania Lumina II</td><td>Caliper Life Sciences, USA</td><td>IVIS</td><td>Do śledzenia komórek u zwierząt.</td></tr><tr><td>Płynna praca stataion</td><td>Morelowy wzór, amerykańska</td><td>pipeta S</td><td>Do wysokiego obciążenia zawiesiny średniej lub komórkowej.</td></tr></tbody></table>

mikrotkanki 3d do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Aby przekształcić tradycyjną hodowlę komórkową 2D do hodowli komórek 3D, zintegrowaliśmy mikrofabrykację z technologią kriożelowania do produkcji makroporowatych kriożeli w mikroskali (mikrokriogeli), które mogą być ładowane różnymi typami komórek, tworząc mikrotkanki 3D. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół wytwarzania wszechstronnych mikrotkanek 3D i ich zastosowania w terapii regeneracyjnej i badaniach przesiewowych leków. Mikrokriożele o kontrolowanej wielkości i kształcie mogą być wytwarzane na chipie matrycowym, który może być zbierany poza chipem jako pojedyncze nośniki komórkowe do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej lub dalej montowany na chipie w matryce mikrotkanek 3D w celu wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Ze względu na wysoką elastyczność tych krioweli w mikroskali, mikrotkanki 3D wykazują dużą zdolność do wstrzykiwania w minimalnie inwazyjnej terapii komórkowej, chroniąc komórki przed mechaniczną siłą ścinającą podczas wstrzykiwania. Zapewnia to zwiększoną przeżywalność komórek i efekt terapeutyczny w modelu niedokrwienia kończyn myszy. Z kolei montaż matryc mikrotkanek 3D w standardowym formacie wielodołkowym 384 ułatwia korzystanie ze wspólnych urządzeń i sprzętu laboratoryjnego, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków na tej wszechstronnej platformie hodowli komórkowych 3D.

Wytwarzanie i charakterystyka mikrokriogeli do formowania trójwymiarowych mikrotkanek.
Zgodnie z niniejszym protokołem, mikrokriogele zostały wytworzone w celu sformowania 3D mikrotkanek oraz pojedynczych mikrokriogeli lub macierzy mikrokriogeli, a następnie zastosowano je odpowiednio w terapii regeneracyjnej i przesiewaniu leków (Rycina 1). Do wykonania macierzy mikrokriogeli wykor...

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Ogólnym celem wytwarzania elastycznych makroporowatych mikrokriogeli 3D za pomocą kriozelowania jest ułatwienie iniekcyjnej terapii regeneracyjnej oraz wysokoprzepustowego przesiewu leków in vitro. Niniejsze wideo przedstawia protokoły wytwarzania wszechstronnych mikrotykanek 3D oraz ich zastosowania w terapii regeneracyjnej i przesiewie leków. Technika terapii regeneracyjnej poprawia retencję, przeżywalność i funkcje terapeutyczne komórek macierzystych po wstrzyknięciu w miejsce rany.Przesiewanie leków uległo również poprawie dzięki łatwości użycia oraz potencjałowi do analiz wysokoprzepustowych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z hodowlami 3D mają trudności ze względu na skomplikowane protokoły. Ta technika upraszcza hodowlę 3D i oferuje badaczom większą kontrolę nad powstającymi mikrotkankami 3D.W demonstracji tych procedur pomogą Zhou Lyu, Liu Wei, Li Yaquian oraz You Zhifeng, czteroro doktorantów z naszego laboratorium. Przemyj chipy z matrycą mikro szablonów PMMA wodą dejonizowaną, aby usunąć zanieczyszczenia pozostałe po grawerowaniu laserowym. Następnie wysusz chipy z matrycą mikro szablonów w temperaturze 60 °C.Następnie poddaj wysuszone chipy działaniu oczyszczacza plazmowego w grupach po cztery sztuki. Najpierw uruchom pompę próżniową na dwie minuty. Następnie zastosuj moc RF 18 W przez trzy minuty, aby zwiększyć hydrofilowość chipów.Następnie należy przygotować jeden mililitr roztworu prekursora żelatyny na każde pięć chipów. Żelatynę należy rozpuścić w łaźni wodnej o temperaturze 60°C, a następnie inkubować roztwór na lodzie przez pięć minut. Po lekkim schłodzeniu, gdy roztwór pozostaje w stanie ciekłym, należy dokładnie wymieszać glutaraldehyd z roztworem prekursora żelatyny do końcowego stężenia 0,3% glutaraldehydu.Następnie nanieś pipetą 200 µL przygotowanego roztworu na górną powierzchnię każdego chipa. Równomiernie rozprowadź roztwór po chipach za pomocą wygiętej szklanej rurki. Następnie niezwłocznie przenieś chipy macierzy z naniesionym roztworem do zamrażarki w temperaturze -20 °C na 16 godzin w celu kriogelacji.Następnego dnia schłodzić liofilizator do -40 °C w czasie około 30 minut. Następnie załadować chipy macierzowe i liofilizować je przez dwie godziny w próżni. W tych warunkach lód ulegnie sublimacji, a chipy będą gotowe do użycia.Zacznij od odzyskania pojedynczych mikrokriogeli z chipów. Rozpocznij od nałożenia wykonanego chipu z macierzą mikrokriogeli na wykonaną macierz wypychaczy PDMS. Dopasuj każdy mikrokriogel do odpowiedniego wypychacza.Następnie dociśnij chip z matrycą mikrokriogeli do matrycy, aby wypchnąć mikrokriogele z ich dołków. Teraz zbierz wyrzucone mikrokriogele do kąpieli wodnej i odfiltruj je za pomocą sitka do komórek. Użyj jednego sitka do zebrania wszystkich mikrokriogeli z jednego chipa.Następnie przemyj mikrokriogele borowodorkiem sodu w lodzie. Pozostaw nieusieciowane reszty aldehydowe do zgaszenia na około 20 minut. Następnie odlej borowodorek sodu i przemyj mikrokriogele pięcioma mililitrami wody dejonizowanej przez 15 minut.Przed kontynuacją należy przeprowadzić łącznie od trzech do pięciu przemyć wodą. Po wyjęciu mikrokryożeli z ostatniego przemycia, za pomocą pęsety przenieść je z sitka do komórek do 35-milimetrowej szalki Petriego. Każdy zgromadzony zbiór mikrokryożeli stanowi jeden klaster.Następnie dodaj od 50 do 70 µL wody dejonizowanej do każdego skupiska mikrokriogeli i przykryj szalkę. Następnie delikatnie stuknij szalką, aby wyrównać warstwę nakładających się na siebie mikrokriogeli. Potem zamroź mikrokriogele w temperaturze -20 °C przez okres od 4 do 16 godzin.Następnie liofilizuj je przez dwie godziny, tak jak poprzednio. Kolejnym krokiem jest utworzenie trójwymiarowych mikrotkanek. Najpierw wysterylizuj mikrokriogele.Następnie zebrać komórki za pomocą trypsyny, określić ich gęstość i resuspendować w pożywce wzrostowej do stężenia ośmiu milionów komórek na mililitr. Dalej, nanieść pipetą 60 µL zawiesiny komórkowej na każdy skup mikrokryożeli. Płytki przechowywać w komorze wilgotnościowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez dwie godziny, aby komórki wniknęły w żele.Po inkubacji do każdej foremki należy dodać dwa mililitry pożywki hodowlanej i kontynuować hodowlę, wymieniając pożywkę co drugi dzień. Po dwóch dniach uformują się mikrotkanki 3D. Aby wstrzyknąć mikrotkanki 3D myszy, należy je najpierw przenieść do pipety o pojemności pięciu mililitrów, a następnie umieścić w sitku do komórek w celu odfiltrowania pożywki hodowlanej.Następnie resuspenduj mikrotkanki 3D w 15% roztworze żelatyny. Po przygotowaniu zwierzęcia do implantacji, wstrzyknij mikrotkanki domięśniowo w trzech miejscach mięśnia smukłego. Każda iniekcja powinna zawierać 150 mikrokriogeli w 150 µL roztworu.Należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 23 G. Po zmontowaniu matrycy mikrokriogeli do hodowli komórek na chipie, należy je ostrożnie umieścić w wstępnie podgrzanej komorze wilgotnościowej, dbając o to, aby nie zostały zmoczone. Następnie należy ostrożnie nanieść 3 µL dokładnie wymieszanej zawiesiny komórek bezpośrednio do każdego otworu mikrokriogelu.Należy pozwolić, aby końcówka pipety lekko dotknęła powierzchni mikrokryożelu przed wydmuchaniem roztworu. Nie należy wysiewać komórek do studzienek peryferyjnych. Po napełnieniu studzienek, do każdej z nich należy dodać 10 µL pożywki selektywnej, a do studzienek peryferyjnych dodać pożywkę w celu spowolnienia parowania, używając 96-kanałowego dyspensera cieczy.Następnie inkubuj chipy w komorze wilgotnościowej przez 24 godziny w celu utworzenia mikrotkanek 3D. Następnego dnia, używając 96-kanałowego dozownika cieczy, dodaj 10 µL leków do każdej studzienki w gradiencie stężeń, powtarzając tę czynność cztery razy, aby wypełnić wszystkie 384 studzienki, w tym kontrole DMSO. Następnie kontynuuj hodowlę przez kolejne 24 godziny.Po 24 godzinach leczenia lekiem dodać cztery mikrolitry roztworu stokowego rezazuryny do każdej studzienki i inkubować płytkę przez dwie godziny, aby komórki mogły zmetabolizować rezazurynę. Do analizy metabolizmu rezazuryny przez komórki należy użyć czytnika płytek. Zebrane żelatynowe mikrokriogele miały zdefiniowane kształty i rozmiary.Analiza metodą SEM wykazała, że mikrokriogele zawierały połączone struktury makroporowate o rozmiarach porów w zakresie od 30 do 80 mikronów. Zdolność do wstrzykiwania mikrokriogeli żelatynowych oceniono ilościowo poprzez ich hodowlę po iniekcji. Wstrzyknięto 1 000 na mililitr przy sile wynoszącej sześć niutonów, co jest wartością niższą od klinicznie dopuszczalnej siły 10 niutonów.Komórki macierzyste w mikrokriogelach zachowały wysoką żywotność i dużą zdolność proliferacyjną po wstrzyknięciu podczas pięciodniowej hodowli. Wykorzystując takie komórki, przeprowadzono terapię w modelu niedokrwienia kończyny myszy, a stan fizjologiczny niedokrwionych kończyn zbadano 28 dni po operacji. Leczenie mikrotkanką zawierającą 100 000 komórek macierzystych poprawiło przeżywalność kończyn.Tylko 25% myszy wykazało spontaniczną amputację palców po 28 dniach. W innym zastosowaniu macierz mikrotekanek 3D została wykorzystana do wysokoprzepustowych testów lekowych. Komórki raka hepatokomórkowego poddano działaniu doksorubicyny, a komórki niedrobnokomórkowego raka płuca poddano działaniu IMMLG-8439.W obu przypadkach hodowla 3D zwiększyła oporność na leki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat tego, jak wytwarzać elastyczne 3D mikroporowate mikrokriogele do hodowli 3D poza układem (off-chip) z wykorzystaniem wstrzykiwalnej terapii regeneracyjnej lub do macierzy hodowli komórkowej 3D na układzie (on-chip) w celu wysokoprzepustowego screeningu leków in vitro. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie komórkowych terapii regeneracyjnych oraz screeningu leków do wykorzystania hodowli komórkowej 3D, co przyczyniło się do rozwoju obu tych dziedzin badawczych.Należy pamiętać, że praca z glutaraldehydem i borowodorkiem sodu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej i praca pod wyciągiem laboratoryjnym.

3d-microtissues-for-injectable-regenerative-therapy-high-throughput

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W przeszłości wiele systemów hodowli in vitro – głównie hodowle monowarstwowe – często obarczonych było wadą polegającą na tym, że zróżnicowane komórki pierwotne miały stosunkowo krótki czas życia i ulegały dedyferencjacji podczas hodowli. W konsekwencji większość ich funkcji swoistych dla danego organu była szybko utracona. Aby zatem odtworzyć lepsze warunki dla tych komórek in vitro, wprowadzono modyfikacje i adaptacje do konwencjonalnych hodowli monowarstwowych.

Wywiad: Bioreaktory i rusztowania 3D z modyfikowaną powierzchnią w badaniach nad komórkami macierzystymi

Tworzenie mikrotkanek przy użyciu cylindrycznych żeli kolagenowych, nazywanych modułami, które zawierają zatopione komórki, a ich powierzchnia jest pokryta komórkami śródbłonka.

Wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

Przedstawiamy procedurę wykonania i obsługi urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza heterogeniczne mikrośrodowiska nowotworowe in vitro. Zmienność apoptozy w obrębie tkanki nowotworowej została określona ilościowo przy użyciu barwników fluorescencyjnych, a następnie oceniono efektywny współczynnik dyfuzji leku chemioterapeutycznego, doksorubicyny, do tkanki nowotworowej.

Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

Ta technologia druku mikroprzepływowego 3D drukuje tablice komórek na zanurzonych powierzchniach.  Opisujemy, w jaki sposób układy komórek są dostarczane mikroprzepływowo w komórkach przepływowych 3D na zanurzone powierzchnie.  Drukując na zanurzonych powierzchniach, stworzono mikromacierze komórkowe, które umożliwiają badania przesiewowe leków i ocenę cytotoksyczności w wielu obszarach.

Zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem

Proponujemy protokół ekspansji komórek na makroporowatych mikronośnikach i ich wykorzystanie jako systemu dostarczania w bioreaktorze perfuzyjnym do tworzenia zdecelularizowanej matrycy tkankowej. Uwzględniamy również różne techniki określania proliferacji komórek i żywotności komórek hodowanych na mikronośnikach. Ponadto wykazujemy funkcjonalność komórek po hodowlach w bioreaktorach.

Rekombinowane mikronośniki peptydowe kolagenu I do ekspansji komórek i ich potencjalne zastosowanie jako system dostarczania komórek w modelu bioreaktora

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Ten protokół dostarcza metod generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych w inżynierii 3D oraz opisuje ich zastosowanie w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków. Opisane metody wykorzystują system detekcji magnetycznej, aby ułatwić jednoczesną ocenę 24 tkanek równolegle.

Przedkliniczne testy leków w skalowalnych tkankach mięśniowych modyfikowanych w 3D

Poznaj metodę wytwarzania elastycznych mikrokriogeli 3D do terapii regeneracyjnej i badań przesiewowych leków. Technika ta upraszcza hodowlę komórkową 3D i poprawia przeżywalność komórek macierzystych po iniekcji.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Przeglądaj więcej filmów