Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Ogólnym celem wytwarzania elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D za pomocą kriożelowania jest ułatwienie iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro. Ten film przedstawia protokoły wytwarzania wszechstronnych mikrotkanek 3D i stosowania ich w terapii regeneracyjnej i badaniach przesiewowych leków. Technika terapii regeneracyjnej poprawia retencję, przeżycie i funkcje terapeutyczne komórek macierzystych po wstrzyknięciu w miejsce rany.

Badania przesiewowe leków są również ulepszone ze względu na łatwość użycia i potencjał badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w kulturze 3D mają problemy ze skomplikowanymi protokołami. Technika ta upraszcza hodowlę 3D i oferuje naukowcom większą kontrolę nad powstałymi mikrotkankami 3D.

W demonstracji tych procedur pomogą Zhou Lyu, Liu Wei, Li Yaquian i You Zhifeng, czterej absolwenci z naszego laboratorium. Umyj chipy matrycy mikroszablonów PMMA wodą dejonizowaną, aby usunąć zanieczyszczenia pozostałe po grawerowaniu laserowym. Następnie wysusz chipy układu mikroszablonów w temperaturze 60 stopni Celsjusza.

Następnie potraktuj wysuszone wióry w czyszczalni plazmowej w grupach po cztery. Najpierw uruchom pompę próżniową na dwie minuty. Następnie użyj 18 watów mocy RF przez trzy minuty, aby zwiększyć hydrofilowość chipów.

Teraz przygotuj jeden mililitr roztworu prekursora żelatyny na każde pięć chipsów. Rozpuść żelatynę w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza i inkubuj roztwór na lodzie przez pięć minut. Po lekkim, ale nadal płynnym schłodzeniu, dokładnie wymieszaj aldehyd glutarowy z roztworem prekursora żelatyny do końcowego stężenia 0,3% aldehydu glutarowego.

Teraz odpipetuj 200 mikrolitrów przygotowanego roztworu na górną powierzchnię każdego chipa. Rozprowadź roztwór równomiernie na frytkach za pomocą wygiętego szklanego pręta. Następnie natychmiast przenieś obciążone roztworem chipy macierzy do zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 16 godzin w celu kriożelacji.

Następnego dnia schłodzić liofilizator do minus 40 stopni Celsjusza przez około 30 minut. Następnie załaduj chipy macierzy i liofilizuj je przez dwie godziny w próżni. W tych warunkach lód uszlachetni się, a wióry będą wtedy gotowe do użycia.

Zacznij od zebrania pojedynczych mikrokriożeli z wiórów. Zacznij od nałożenia sfabrykowanego układu macierzy mikrokriożelu na wyprodukowany układ pinów wypychacza PDMS. Wyrównaj każdy mikrokriożel z kołkiem wypychacza.

Następnie wciśnij chip mikrokriożelu do matrycy, aby przemieścić mikrokriożele z ich studzienek. Teraz zbierz wyrzucone mikrokriożele do łaźni wodnej i zbierz je za pomocą sitka do komórek. Użyj jednego sitka, aby zebrać wszystkie mikrokriożele z jednego chipa.

Następnie umyj mikrokriożele borowodorkiem sodu na lodzie. Pozostawić nieusieciowane pozostałości aldehydu do schłodzenia przez około 20 minut. Następnie wyrzuć borowodorek sodu i myj mikrokriożele pięcioma mililitrami wody dejonizowanej przez 15 minut.

Przed kontynuowaniem wykonaj w sumie od trzech do pięciu myć wodą. Po wyjęciu mikrokriożeli z ostatniego płukania wodą, za pomocą pęsety przenieś je z sitka komórkowego na 35-milimetrową szalkę Petriego. Każda kolekcja mikrokriożeli stanowi jeden klaster.

Teraz dodaj od 50 do 70 mikrolitrów wody dejonizowanej do każdej grupy mikrokriogeli i przykryj naczynie. Następnie delikatnie postukaj w naczynie, aby wyrównać ułożone w stos mikrokriogle. Następnie zamroź mikrokriożele w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na cztery do 16 godzin.

Później liofilizuj je przez dwie godziny, tak jak poprzednio. Kolejnym krokiem jest wykonanie mikrotkanek 3D. Najpierw wysterylizuj mikrokriogle.

Następnie zbierz komórki za pomocą trypsyny, określ ilościowo ich gęstość i ponownie zawieś je w ilości ośmiu milionów komórek na mililitr w pożywce wzrostowej. Następnie odpipetuj 60 mikrolitrów zawiesiny komórek na każdą grupę mikrokriomeli. Trzymaj naczynia w wilgotnej komorze i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby komórki wchłonęły się w żele.

Po inkubacji dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej do każdego naczynia i kontynuuj hodowlę, zmieniając pożywkę co drugi dzień. W ciągu dwóch dni uformują się mikrotkanki 3D. Aby wstrzyknąć mikrotkanki 3D do myszy, najpierw przenieś je do pięciomililitrowej pipety, a następnie załaduj je do sitka komórkowego w celu przefiltrowania pożywki hodowlanej.

Następnie ponownie zawieś mikrotkanki 3D w 15% roztworze żelatyny. Po przygotowaniu zwierzęcia do implantacji należy wstrzyknąć domięśniowo mikrotkanki w trzy miejsca mięśnia gracilis. Każde wstrzyknięcie powinno zawierać 150 mikrokriożeli w 150 mikrolitrach roztworu.

Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra z igłą o rozmiarze 23. Po zmontowaniu zestawu mikrokriożelu do hodowli komórek na chipie, ostrożnie umieść je w podgrzanej komorze wilgotnościowej, nie dopuszczając ich do zamoczenia. Następnie ostrożnie porcjować trzy mikrolitry dokładnie wymieszanej zawiesiny komórkowej bezpośrednio na każdą studzienkę mikrokriożelu.

Pozwól, aby końcówka pipety lekko dotknęła powierzchni mikrokriożelu przed wyrzuceniem roztworu. Nie obsiewaj dołków obwodowych. Po załadowaniu studzienek dodaj 10 mikrolitrów selektywnego podłoża do każdej studzienki i dodaj pożywkę do dołków obwodowych, aby spowolnić parowanie za pomocą 96-kanałowego dozownika cieczy.

Następnie hoduj wióry w komorze wilgotnościowej przez 24 godziny, aby utworzyć mikrotkanki 3D. Następnego dnia, korzystając z 96-kanałowego dozownika cieczy, dodaj 10 mikrolitrów leków do każdej studzienki w gradiencie stężeń cztery razy, aby zakończyć dodawanie wszystkich 384 dołków, w tym kontroli DMSO. Następnie kontynuuj hodowlę przez 24 godziny.

Po 24 godzinach leczenia farmakologicznego dodać cztery mikrolitry roztworu podstawowego rezazuryny do każdej studzienki i inkubować płytkę przez dwie godziny, pozwalając komórkom metabolizować rezazurynę. Aby oznaczyć metabolizm rezazuryny w komórkach, użyj czytnika płytkowego. Zebrane mikrokriożele żelatynowe miały z góry określone kształty i rozmiary.

Analiza przeprowadzona przez SEM wykazała, że mikrokriożele zawierały połączone ze sobą makroporowate struktury o rozmiarach porów w zakresie od 30 do 80 mikronów. Możliwość wstrzykiwania mikrokriożeli żelatynowych oceniano ilościowo poprzez ich hodowlę po wstrzyknięciu. 1 000 na mililitr wstrzyknięto przy sześciu niutonach mniejszych niż klinicznie dopuszczalna siła 10 niutonów.

Komórki macierzyste w mikrokriożelach zachowały wysoką żywotność i dużą zdolność proliferacyjną po wstrzyknięciu przez pięć dni hodowli. Za pomocą takich komórek leczono terapeutycznie model niedokrwienia kończyn myszy, a stan fizjologiczny kończyn niedokrwionych badano 28 dni po operacji. Leczenie mikrotkankami za pomocą 100 000 komórek macierzystych poprawiło ratowanie kończyn

Tylko 25% myszy wykazało spontaniczną amputację palca u nogi po 28 dniach. W innym zastosowaniu matryca mikrotkanek 3D została wykorzystana do wysokoprzepustowych testów leków. Komórki raka wątrobowokomórkowego leczono doksorubicyną, a komórki niedrobnokomórkowego raka płuc leczono IMMLG-8439.

W obu przypadkach oporność na leki została zwiększona przez hodowlę 3D. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać elastyczne mikroporowate mikrokriożele 3D do hodowli 3D poza chipem przy użyciu iniekcyjnej terapii regeneracyjnej lub wbudowanych w macierze hodowli komórkowych 3D do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią regeneracyjną opartą na komórkach i badaniami przesiewowymi leków, do wykorzystania hodowli komórek 3D, rozwijając w ten sposób obie dziedziny badań.

Nie zapominaj, że praca z aldehydem glutarowym i borowodorkiem sodu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej i praca pod kapturem laboratoryjnym.