Name: Tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Poznaj metodę różnicowania chondrogenicznego komórek iPSC pochodzących z krwi pępowinowej w celu uzyskania pelletów chrzęstnych. Protokół umożliwia modelowanie chorób i badania nad regeneracją tkanki chrzęstnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z projektu badawczo-rozwojowego Korea Healthcare Technology, Ministerstwa Zdrowia, Opieki Społecznej i Spraw Rodzinnych, Republiki Korei (HI16C2177).

Ten protokół został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Katolickiego Uniwersytetu Korei (KC12TISI0861). CBMC używane do przeprogramowania zostały pozyskane bezpośrednio z Banku Krwi Pępowinowej Szpitala St. Mary's Hospital w Seulu.
1. Różnicowanie chondrogenne od iPSC
<ol>
	<li>Generacja CBMC-iPSC
	<ol>
		<li>Wygeneruj CBMC-hiPSC za pomocą protokołu pokazanego w naszym poprzednim work23.</li>
		<li>Zebrać komórki krwi do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i policzyć je za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Przygotować 3 x 105 komórek i odwirować je przez 5 minut przy 515 x g i RT. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml pożywki z krwinkami.</li>
		<li>Przenieść komórki do dołka na niepowlekanej płytce 24-dołkowej i dodać mieszaninę wirusa Sendai, postępując zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Odwirować płytkę przez 30 minut w temperaturze 1,150 x g i temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Po odwirowaniu inkubować komórki przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Następnego dnia przenieś transdukowane komórki do studzienki pokrytej matrycą. Odwirować płytkę o sile 1 150 x g przez 30 minut w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant, dodać 1 ml pożywki iPSC i utrzymać komórki O/N w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Utrzymać przyłączone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj podłoże codziennie, zastępując je nowym podłożem iPSC. 
		UWAGA: Kolonie pojawią się w dniach 14-21 po transdukcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie EB
	<ol>
		<li>Utrzymuj hiPSC na poziomie 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj podłoże codziennie, zastępując je świeżym podłożem Essential 8 (E8).</li>
		<li>Przygotuj 2 x 106 hiPSC w pokrytym witronektyną, 100-milimetrowym naczyniu w pożywce E8.</li>
		<li>Usunąć pożywkę E8 z naczynia hodowlanego i przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).</li>
		<li>Dodać 1 ml 1 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 minuty.</li>
		<li>Zbierz komórki z 3 ml pożywki E8 i przenieś je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 250 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 minuty.</li>
		<li>Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki E8.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj 2 x 106 komórek na każdą 100 mm szalkę Petriego. Ponownie zawiesić przygotowane komórki w 10-mililitrowej mieszaninie pożywki E8 i EB (1:1) z inhibitorem 10 μM kinazy związanej z rho (ROCK).</li>
		<li>Inkubować komórki O/N do agregacji w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 .</li>
		<li>Następnego dnia zebrać zagregowane EB przez pipetowanie. Odwirować komórki przy 250 x g przez 1 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić EB w 10 ml świeżej pożywki E8.</li>
		<li>Powiększaj wygenerowane EB przez 5 dni, wykonując codzienne zmiany za pomocą świeżej pożywki E8. W celu dalszego dojrzewania zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę E7. Utrzymuj EB na poziomie 37 °C i 5% CO2 przez kolejne 5 dni, wykonując codzienne zmiany pożywki za pomocą świeżej pożywki E7. 
		UWAGA: Pożywka E7 to pożywka E8 bez FGF2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja komórek wzrostu z EB
	<ol>
		<li>Dodać 6 ml 1% żelatyny do naczynia o średnicy 100 mm i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.</li>
		<li>Usuń żelatynę i całkowicie osusz naczynie przez 2-3 godziny przed użyciem.</li>
		<li>Przenieś EB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pozwól, aby EB osiadły na dnie stożkowej rurki. Usunąć supernatant bez naruszania EBs.</li>
		<li>Ponownie zawiesić EB w 10 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM) z 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Przenieś EB do pokrytego żelatyną naczynia o średnicy 100 mm. Dodać 10 μM inhibitora ROCK.</li>
		<li>Inkubować i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 dni. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień bez dodawania inhibitora ROCK.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie się osadów chondropennych
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę hodowlaną z naczynia i trzykrotnie umyć komórki PBS.</li>
		<li>Nałożyć 1 ml 1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 minuty.</li>
		<li>Zbierz komórki za pomocą 5 ml DMEM z 20% FBS i przenieś je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować komórki przez 2 minuty przy 250 x g i RT. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM z 20% FBS.</li>
		<li>Przefiltruj i odrzuć grudki komórek za pomocą sitka do komórek 40 μm i zbierz pojedyncze komórki. Policz pojedyncze komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Odwirować komórki przez 2 minuty przy 250 x g i RT. Usunąć supernatant i wysiać 3 x 105 komórek na granulkę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z 300 μl pożywki do różnicowania chondrogennego (CDM).</li>
		<li>W celu uzyskania osadu należy odwirowywać komórki przez 5 minut przy 680 x g i RT. 
		UWAGA: Granulki są utrzymywane w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml podczas różnicowania granulek chondrogennych.</li>
		<li>Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj CDM co 2-3 dni. W ciągu 3 dni granulki będą wykazywać spłaszczoną, sferoidalną morfologię. Utrzymuj pelety przez 21 dni w temperaturze 37°C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka chondrogenicznych osadów przez barwienie
<ol>
	<li>Osadzanie chondrogenne
	<ol>
		<li>Przed zatopieniem przygotować i rozpuść parafinę w temperaturze 58 °C.</li>
		<li>Utrwal granulki w 1 ml 4% paraformaldehydu przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w probówce o pojemności 1,5 ml. 
		Uwaga: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny. Unikać kontaktu z oczami, skórą lub błonami śluzowymi. Zminimalizuj narażenie i unikaj inhalacji podczas przygotowywania go.</li>
		<li>Umieść jedną warstwę gazy na kasecie i przenieś utrwalone granulki za pomocą pipety. Przykryj granulkę, składając gazę i zamknij pokrywę kasety.</li>
		<li>Rozpocznij odwodnienie w 100 ml 70% etanolu (EtOH) dwa razy po 10 minut. Odwodnić granulki poprzez sekwencyjne 10-minutowe płukanie w 80% i 95% EtOH.</li>
		<li>Przenieś granulki do 100% EtOH na 10 minut. Powtórz trzy razy ze świeżym EtOH.</li>
		<li>W celu "oczyszczenia" należy wymienić roztwór na 100 ml mieszaniny EtOH i ksylenu w proporcji 1:1, a następnie mieszaninę EtOH i ksylenu w proporcji 1:2 na 10 minut. Usuń pozostały EtOH, inkubując granulki dwukrotnie w 100% ksylenie, po 10 minut każdy.</li>
		<li>W celu infiltracji parafiny inkubować granulki w sekwencyjnych mieszaninach ksylenu i parafiny. Przeprowadzić cały proces infiltracji parafiny w temperaturze 58 °C. Inkubować granulki w 100 ml mieszaniny ksylenu i parafiny w proporcji 2:1 przez 30 minut.</li>
		<li>Zamień roztwór na 100 ml mieszaniny ksylenu i parafiny w stosunku 1:1 i inkubuj przez 30 minut.</li>
		<li>Zamień roztwór na 100 ml mieszaniny ksylenu i parafiny w stosunku 1:2 i inkubuj przez 30 minut.</li>
		<li>W celu końcowej infiltracji przenieść granulki do pierwszej kąpieli 100% parafiny i inkubować przez 2 godziny.</li>
		<li>Przenieść granulki do drugiej kąpieli 100% parafiny i inkubować O/N w temperaturze 58 °C.</li>
		<li>Następnego dnia delikatnie przenieś granulki do formy za pomocą pęsety. Dodaj parafinę do formy z dozownika parafiny. Zestalać parafinę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Pokrój sekcje na kawałki z prędkością 7 μm i przenieś je na szkiełko. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc i przechowuj je w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów
	<ol>
		<li>Odparafinować szkiełka, przesuwając je przez 100 ml 100%, 90%, 80% i 70% EtOH sekwencyjnie przez 5 minut każda.</li>
		<li>Umieść szkiełka w szklanym słoiku i płucz wodą z kranu przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie błękitem alcyjskim
	<ol>
		<li>Inkubować szkiełka w 50 ml 1% roztworu błękitu alcyjanowego przez 30 min. 
		UWAGA: Błękit alcian rozcieńcza się w 3% roztworze kwasu octowego. Dostosuj pH do 2,5 za pomocą kwasu octowego.</li>
		<li>Umieść szkiełka w szklanym słoiku i płucz wodą z kranu przez 2 minuty.</li>
		<li>Opłucz szkiełka w wodzie dejonizowanej (DW) i przebarwiaj je roztworem do trwałej czerwieni jądrowej przez 2 minuty.</li>
		<li>Umieść szkiełka w szklanym słoiku i płucz wodą z kranu przez 1 minutę.</li>
		<li>2.3.5)Przejdź do odwadniania i montażu zjeżdżalni w kroku 2.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie błękitem toluidynowym
	<ol>
		<li>Inkubować szkiełka w 50 ml roztworu błękitu toluidynowego przez 4 minuty.</li>
		<li>Umieść szkiełka w szklanym słoiku i płucz wodą z kranu przez 5 minut.</li>
		<li>Przejdź do odwadniania i montażu zjeżdżalni w kroku 2.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunohistochemiczne
	<ol>
		<li>Inkubować szkiełka w 3% H2O2przez 15 minut w celu zablokowania endogennej peroksydazy.</li>
		<li>Na szkiełka nanieść 200 μl pierwszorzędowego przeciwciała (anty-COL1A1 i -COL2A1) rozcieńczonego w stosunku 1:100 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) zawierającej 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 5% normalnej surowicy koziej (NGS) i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Następnego dnia umieść szkiełka w szklanym słoiku i umyj je 50 ml TBS zawierającego 0,1% polisorbatu 20 (TBST) trzy razy po 5 minut każde.</li>
		<li>Na szkiełka nanieść 200 μl przeciwciała drugorzędowego (kozie przeciwciało anty-królicze IgG, rozcieńczone w stosunku 1:200 w TBS zawierającym 1% BSA i 5% NGS) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut.</li>
		<li>Umieść szkiełka w szklanym słoiku i umyj je trzy razy po 50 ml każde, po 5 minut.</li>
		<li>W celu wzmocnienia sygnału nanieść sprzężony z HRP roztwór streptawidyny na szkiełka i inkubować przez 10 minut.</li>
		<li>Umieść szkiełka w szklanym słoiku i umyj je trzy razy po 50 ml każde, po 5 minut.</li>
		<li>Wymieszać roztwór substratu peroksydazy DAB, nanieść 200 μl roztworu na każde szkiełko i inkubować przez 1 minutę.</li>
		<li>Umieść szkiełka w szklanym słoiku i płucz wodą z kranu przez 5 minut.</li>
		<li>Barwienie przeciwstawne hematoksyliną Mayera przez 1 min.</li>
		<li>Umyj szkiełka za pomocą DW.</li>
		<li>Przejdź do odwadniania i montażu zjeżdżalni w kroku 2.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnienie i montaż
	<ol>
		<li>Odwodnić szkiełka, przesuwając je sekwencyjnie przez 100 ml 70%, 80%, 90% i 100% EtOH każda, po 30 s każda.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w dwóch zmianach ksylenu na 1 minutę każda.</li>
		<li>Dodaj 50 μl roztworu montażowego do szkiełek nakrywkowych i umieść szkiełka na wierzchu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten z powodzeniem wygenerował hiPSC z CBMC. Przeprogramowaliśmy CBMC na hiPSC za pomocą wektora wirusowego Sendai zawierającego czynniki Yamanaka24. Trzy przypadki wykorzystano do różnicowania, a wszystkie eksperymenty z powodzeniem wygenerowały chondrogenne granulki przy użyciu tego protokołu. W licznych badaniach opisano protokoły różnicowania hiPSC w chondrocyty 25,26,27,28.<sup cla...

Użycie hiPSC stanowi nową strategię badań przesiewowych leków i badań mechanistycznych różnych chorób. Z perspektywy regeneracyjnej hiPSC są również potencjalnym źródłem wymiany uszkodzonych tkanek, które mają ograniczoną zdolność gojenia, takich jak chrząstka stawowa1,2.
Regeneracja rodzimej chrząstki stawowej była wyzwaniem od kilkudziesięciu lat. Chrząstka stawowa to miękka, biała tkanka, która pokrywa koniec kości, chroniąc je przed tarciem. Ma jednak ograniczoną zdolność regeneracji po uszkodzeniu, co sprawia, że samodzielna naprawa jest prawie niemożliwa. W związku z tym badania ukierunkowane na regenerację chrząstki trwają już od kilkudziesięciu lat.
Poprzednio, różnicowanie in vitro do linii chondrogennej było zwykle przeprowadzane za pomocą BMSC lub natywnych chondrocytów wyizolowanych ze stawu kolanowego3. Ze względu na swój potencjał chondrogeneczny, BMSC i natywne chondrocyty mają wiele zalet wspierających ich zastosowanie w chondrogenezie. Jednak ze względu na ograniczoną ekspansję i niestabilny fenotyp, komórki te napotykają kilka ograniczeń w rekonstrukcji ubytków chrząstki stawowej. W warunkach hodowli in vitro komórki te mają tendencję do utraty własnych cech po 3-4 pasażach, co ostatecznie wpływa na ich zdolności różnicowania4. Również w przypadku natywnych chondrocytów dodatkowe uszkodzenie stawu kolanowego jest nieuniknione przy pozyskiwaniu tych komórek.
W przeciwieństwie do BMSC lub natywnych chondrocytów, hiPSC mogą się rozwijać in vitro w nieskończoność. Przy odpowiednich warunkach hodowli hiPSC mają ogromny potencjał jako źródło zastępcze dla różnicowania chondrogennego. Trudno jest jednak zmienić wewnętrzne cechy hiPSCs5. Co więcej, potrzeba kilku skomplikowanych etapów in vitro, aby skierować los hiPSC do określonego typu komórek. Pomimo tych powikłań, stosowanie hiPSC jest nadal zalecane ze względu na ich wysoką zdolność do samoodnawiania się i zdolność do różnicowania się w docelowe komórki, w tym chondrocyty6.
Różnicowanie chondrogenne odbywa się zazwyczaj za pomocą trójwymiarowych systemów hodowli, takich jak hodowla granulek lub hodowla mikromas, przy użyciu komórek progenitorowych podobnych do MSC. W przypadku stosowania hiPSC protokół generowania komórek progenitorowych podobnych do MSC różni się od istniejących protokołów. Niektóre grupy wykorzystują jednowarstwową hodowlę hiPSC do bezpośredniej konwersji fenotypu na komórki podobne do MSC7. Jednak większość badań wykorzystuje EB do generowania komórek wzrostu, które przypominają MSCs8,9,10,11.
Różne rodzaje czynników wzrostu są używane do indukowania chondrogenezy. Zwykle stosuje się białka z rodziny BMP i TGFβ, pojedynczo lub w połączeniu. Zróżnicowanie zostało również wywołane przez inne czynniki, takie jak GDF5, FGF2 i IGF112,13,14,15. Wykazano, że TGFβ1 stymuluje chondrogenezę w sposób zależny od dawki w MSCs16. W porównaniu z innym izotypem, TGFβ3, TGFβ1 indukuje chondrogenezę poprzez zwiększenie kondensacji komórek mezenchymalnych przed chrząstką. TGFβ3 indukuje chondrogenezę poprzez znaczne zwiększenie proliferacji komórek mezenchymalnych17. Jednak TGFβ3 jest częściej używany przez badaczy niż TGFβ17,10,18,19. BMP2 zwiększa ekspresję genów związanych ze składnikami macierzy chondrogennej w ludzkich chondrocytach stawowych w warunkach in vitro20. BMP2 zwiększa ekspresję genów krytycznych dla tworzenia chrząstki w MSCs w połączeniu z białkami TGFβ21. Wykazano również, że BMP2 synergistycznie wzmacnia działanie TGFβ3 poprzez szlaki Smad i MAPK22.
W tym badaniu, CBMC-hiPSC zostały zagregowane do EB za pomocą pożywki EB na szalce Petriego o niskim stopniu przyczepienia. Komórki przerostu indukowano poprzez przymocowanie EB do naczynia pokrytego żelatyną. Różnicowanie chondrogenne za pomocą komórek odrastających przeprowadzono za pomocą hodowli osadów. Leczenie zarówno BMP2, jak i TGFβ3 skutecznie zagęściło komórki i indukowało akumulację białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w celu utworzenia osadu chondrogennego. Badanie to sugeruje prosty, ale skuteczny protokół różnicowania chondrogennego z wykorzystaniem CBMC-hiPSC.

<table><tbody><tr><td><mocne>Wyroby z tworzywa sztucznego</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka rogowa</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Rurka rogowa</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta jednorazowa</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Jednorazowa pipeta</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Opis</td></tr><tr><td>E8 Medium Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 Medium (500 mL)</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 Medium (stężenie: 543 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 Medium&nbsp; (Stężenie: 14 ng/ml)</td></tr><tr><td>Ludzka transfferyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 Medium (stężenie: 10,7 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Basic FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 Średni&nbsp; (Stężenie: 100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 Pożywka (stężenie: 20 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Ludzkie TGF i beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 Medium (stężenie: 2 ng/mL)</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A8960</td><td>E8 Medium&nbsp; (Konk.: 64 i mu; g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Opis</td></tr><tr><td><mocny>Materiały do kontroli jakości< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Szkło osłonowe</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innowacja</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TRA-1-60</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TRA-1-81 Przeciwciało</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L)</td><td>Sonda molekularna</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Sonda molekularna</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Sonda molekularna</td> <td>DAPI</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innowacja</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Wektor Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antykolagenowe II</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Alcian blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>FCF Sigma Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear fast red</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ksylen</td><td>Duksan</td><td>115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny Mayera</td><td>dla czystego przemysłu chemicznego</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Szkło ślizgowe, powlekane</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA RevertAid</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td> Opis</td></tr><tr><td>Chondrogenic Differentiation Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>Składnik podłoża chondrogennego (500 ml)</td></tr><tr><td>Penicilina Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>Składnik podłoża chondrogennego (stężenie: 1%)</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Składnik pożywki chondrogennej (stężenie: 64 &mu; g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Składnik podłoża chondrogennego (Konc.: 100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D</td><td>355-BM-050</td><td>Składnik podłoża chondrogennego (stężenie: 100 ng / ml)</td></tr> <tr><td>Rekombinowany Hman TGF-beta3</td><td>R& D</td><td>243-B3-002</td><td>Składnik podłoża chondrogennego (Stężenie: 10 ng / ml)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Składnik podłoża chondrogennego (Stężenie: 1%)</td></tr><tr><td>ITS+ Premiks</td><td>BD</td><td>354352</td><td>Składnik podłoża chondrogennego (Konc.: 1%)</td></tr><tr><td>Deksametazon-Rozpuszczalny w wodzie&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>Składnik podłoża chondrogennego (Konc.:10-7 M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Składnik podłoża chondrogennego (Konc.: 1%)</td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>Składnik podłoża chondrogennego (stężenie: 1%)</td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Pożywka chondrogenna składnik (40 &mu; g/ml)</td></tr></tbody></table>

tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Ludzka chrząstka stawowa nie ma zdolności do samonaprawy. Zwyrodnienie chrząstki leczy się zatem nie za pomocą leczenia leczniczego, ale zachowawczego. Obecnie prowadzone są prace nad regeneracją uszkodzonej chrząstki za pomocą ekspandowanych chondrocytów ex vivo lub mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego (BMSC). Jednak ograniczona żywotność i niestabilność tych komórek ogranicza ich zastosowanie w odbudowie chrząstki. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) zyskały uwagę naukowców jako nowa alternatywa dla zastosowań regeneracyjnych. Dzięki nieograniczonej zdolności do samoodnawiania się i wielomocy, hiPSC zostały wyróżnione jako nowe zastępcze źródło komórek do naprawy chrząstki. Jednak uzyskanie dużej ilości wysokiej jakości granulek chondrogennych jest dużym wyzwaniem dla ich zastosowania klinicznego. W tym badaniu wykorzystaliśmy komórki wyrostka pochodzące z ciała embrionoidalnego (EB) do różnicowania chondrogennego. Pomyślną chondrogenezę potwierdzono za pomocą PCR i barwienia błękitem alcjanowym, błękitem toluidynowym oraz przeciwciałami przeciwko kolagenowi typu I i II (odpowiednio COL1A1 i COL2A1). Przedstawiamy szczegółową metodę różnicowania iPSC pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi pępowinowej (CBMC-hiPSC) w granulki chondrogenne.

W niniejszym badaniu wytworzono pellety chondrogenne z CBMC-hiPSCs poprzez indukcję komórek przerostu (outgrowth cells) z ciałek embrionoidalnych (EBs). Różnicowanie chondrogenne indukowano przy użyciu CBMC-hiPSCs o potwierdzonym wysokim stopniu pluripotencji11. Uproszczony schemat naszego protokołu przedstawiono na Rysunku 1A. Przed różnicowaniem kolonie iPSC poddano ekspansji (Rysunek 1B). Zekspandowane ...

Tutaj proponujemy protokół chondrogenicznego różnicowania od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej.

Tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie peletów chondrogennych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej. Dzięki temu protokołowi możliwe jest uzyskanie stosunkowo dużej ilości peletów chondrogennych. Wygenerowane pellety chondrogenne mogą być wykorzystywane w badaniach, modelowaniu chorób, przesiewaniu leków oraz w badaniach translacyjnych, aby pogłębić naszą wiedzę na temat natury chrząstki.Tkanka chrzestna u ludzi wykazuje w zeszłym roku opóźnioną zdolność do regeneracji. W związku z tym degeneracja chrząstki musi być leczona metodami zachowawczymi. Dzięki nieograniczonej zdolności do samoodnowy i wielopotencjalności, ludzkie iPSCs zostały wskazane jako nowe źródło komórek zastępczych w regeneracji chrząstki.Procedurę zademonstrują Eugene Nam i Arie Alice Ream, doktoranci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć protokół, należy pobrać komórki krwi do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i policzyć je za pomocą hemocytometru. Przygotować 3×10⁵ komórek i odwirować je przez 5 minut przy 515×g w temperaturze pokojowej.Odssać supernatant i resuspender komórki w 0,5 milliliters medium do komórek krwi. Następnie przenieść komórki do dołka na niepowlekanej płytce 24-dołkowej i dodać mieszaninę wirusa Sendai zgodnie z zaleceniami producenta. Wirować płytkę przez 30 minut przy 1 150 ×g i 30 °C.Po wirowaniu inkubować komórki przez noc. Następnego dnia przenieść komórki z przesięku do dołka z kodem matrycy. Odwirować płytkę.Po wirowaniu odlej nadsącz, dodaj 1 mL pożywki do iPSC i inkubuj komórki. Wymieniaj pożywkę codziennie, zastępując ją świeżą pożywką do iPSC. Hoduj ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (HIPSCs).Wymieniaj pożywkę codziennie, zastępując ją świeżą pożywką Essential Eight lub E8. Przygotuj 2×10⁶ HIPSC w 100 ml pożywki E8 w naczyniu pokrytym witronektyną. Następnie usuń pożywkę E8 z naczynia hodowlanego i przemyj komórki sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).Dodaj 1 mL 1 mM EDTA i inkubuj szalkę przez 2 minuty. Następnie zbierz komórki, dodając 3 mL pożywki E8, i przenieś je do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Wirowarkuj komórki z prędkością 250 ×g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.Odessać nadsącz, nie naruszając warstwy komórek, a następnie zawiesić komórki w pięciu mililitrach pożywki E8. Po policzeniu komórek za pomocą hemocytometru, przygotować 2 × 10⁶ komórek na każdą szalkę Petriego o średnicy 100 milimetrów. Zawiesić przygotowane komórki w 10 mililitrach mieszaniny pożywek E8 i EB w stosunku 1:1, z dodatkiem 10 µM ROCK inhibitora (inhibitora kinazy ROCK).Inkubować komórki przez noc w celu agregacji. Następnego dnia zebrać zagregowane ciała embroidalne (EB) za pomocą pipety. Usunąć nadsącz i ponownie zawiesić EB w 10 ml świeżego medium E8.Inkubować wygenerowane ciała embrionalne (EB) przez pięć dni, codziennie wymieniając pożywkę na świeżą pożywkę E8. W celu dalszego dojrzewania zmienić pożywkę hodowlaną na pożywkę E7. Utrzymywać EB w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez kolejne pięć dni, codziennie wymieniając pożywkę na świeżą pożywkę E7.Dodaj sześć mililitrów 1% żelatyny do szalki 100 milimetrowej i inkubuj szalkę przez 30 minut. Usuń żelatynę i całkowicie wysusz szalkę przez dwie do trzech godzin przed użyciem. Przenieś ciała embroidalne (EB) do stożkowej probówki 50 mililitrowej.Pozostaw ciała embrioidalne (EB), aby opadły na dno probówki stożkowej. Usuń nadsącz, nie naruszając EB. Następnie zawieś ponownie EB w 10 ml uprzednio ogrzanego zmodyfikowanego medium Eagle'a (DMEM) według Shilbecco z dodatkiem 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).Przenieś ciała embroidalne (EB) do 100 milimetrowej szalki pokrytej żelatyną. Dodaj 10 micromolar inhibitora ROCK. Inkubuj i utrzymuj komórki przez siedem dni.Wymieniaj pożywkę co drugi dzień, nie dodając inhibitora kalcyfikacji. Odessij pożywkę hodowlaną z szalki. Natychmiast nanieś na szalkę 1 mL 1 mM EDTA i inkubuj komórki przez dwie minuty.Następnie zebrać komórki, używając 5 ml DMEM z 20% FBS, i przenieść je do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Wirować komórki przez 2 min przy 250 ×g w temperaturze pokojowej. Odpiłować nadsącz i zawiesić osad w 10 ml DMEM z 20% FBS.Przefiltruj i odrzuć aglomeraty komórek, używając sita komórkowego o oczkach 40 µm, a następnie odzyskaj pojedyncze komórki. Policz pojedyncze komórki za pomocą hemocytometru. Odwiruj komórki.Usunąć nadsącz i zasiać 3 × 10⁵ komórek na pellet w 15 ml probówce stożkowej z 300 µL pożywki do różnicowania chondrogennego (CDM). W celu formowania pelletów odwirować komórki, a następnie inkubować je przez noc. W ciągu trzech dni pellety przyjmą spłaszczoną, sferoidalną morfologię.Przechowywać pellety przez 21 dni. Przed zatopieniem przygotować i roztopić parafinę w temperaturze 58 °C. Utrwalić pellety w 1 mL 4% paraformaldehydu przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w probówce o pojemności 1,5 mL.Na kasetkę należy położyć jedną warstwę gazy, a następnie za pomocą pipety przenieść utrwalone osady. Przykryć osad, składając gazę i zamykając pokrywę kasetki. Rozpocząć odwadnianie w 100 mililitrach 70% etanolu.Odwodnij osady poprzez sekwencyjne przemywanie w 80% i 95% etanolu. Przenieś osady do 100% etanolu na 10 minut. W celu przejaśnienia wymień roztwór na 100 ml mieszaniny etanolu i ksylenu w stosunku jeden do jednego na 10 minut.Następnie wymień roztwór w stosunku jeden do jednego na mieszaninę etanolu i ksylenu w stosunku jeden do dwóch na 10 minut. Usuń pozostały etanol, inkubując osady w 100% ksylenie. W celu infiltracji parafiną inkubuj osady w kolejnych mieszaninach ksylenu i parafiny.Cały proces infiltracji parafiną należy przeprowadzić w temperaturze 58 °C. Osady inkubować w 100 ml mieszaniny ksylenu i parafiny w stosunku dwa do jednego przez 30 minut. Następnie wymienić roztwór na 100 ml mieszaniny ksylenu i parafiny w stosunku jeden do jednego i inkubować przez 30 minut.Następnie wymienić roztwór na 100 ml mieszaniny ksylenu i parafiny w stosunku 1:2 i inkubować przez 30 minut. W celu końcowej infiltracji przenieść pellety do pierwszej kąpieli w 100% parafiny i inkubować pellet przez dwie godziny. Przenieść pellety do drugiej kąpieli w 100% parafiny i inkubować przez noc w temperaturze 58 °C.Następnego dnia za pomocą pęsety ostrożnie przenieś pellety do formy. Do formy dodaj parafinię z dozownika parafiny. Pozostaw parafinię do zastygnięcia na 30 minut w temperaturze 4 °C.Przygotować skrawki o grubości 7 µm i przenieść je na szkiełka przedmiotowe. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na noc, a następnie przechowywać je w temperaturze pokojowej do momentu użycia. Przed dyferencjacją dokonano ekspansji kolonii iPSC.Ekspandowane iPSC sformowano w ciałatka zarodkowe (EB), aby zainicjować różnicowanie. Powstałe EB przymocowano do naczyń pokrytych żelatyną w celu indukowania wzrostu komórek. Po 21 dniach różnicowania uzyskano małe, przypominające kuleczki pellety chondrogenne, które wykorzystano do dalszej charakterystyki.Jakość pelletów chondrogennych oceniono histologicznie w 21. dniu, przyjmując pellety chondrogenne z BMSC jako kontrolę pozytywną. Nagromadzenie białek ECM wydzielanych przez zróżnicowane chondrocyty potwierdzono barwieniem błękitem Alcyjanem oraz błękitem toluidynowym. Pellety chondrogenne wytworzone z CDMC HIPSCs wykazywały wyższą ekspresję COL2A1 niż pellety pochodzące z CBMSC HIPCs.Ekspresja kolagenu typu I, markera włóknistej chrząstki, była niższa w peletach pochodzących z CBMC HIPSC w porównaniu do ekspresji COL2A1. Ekspresja genów białek macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki w peletach chondrogennych w 21. dniu została potwierdzona za pomocą techniki real-time PCR. Ekspresja aggrecanu w peletach pochodzących z CBMC HIPSC była podobna do tej w peletach pochodzących z BMSC.Przedstawiliśmy szczegółową metodę różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) pochodzących z mononuklearnych komórek krwi pępowinowej w pellety chondrogenne. Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym przeprowadzeniu, proces ten można zrealizować w ciągu dwóch miesięcy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat generowania pelletów chondrogennych z iPSCs.

chondrogenic-pellet-formation-from-cord-blood-derived-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Stres mechaniczny może indukować chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych, dostarczając potencjalnego podejścia terapeutycznego do naprawy uszkodzonej chrząstki. Przedstawiamy protokół indukowania chondrogennego różnicowania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) za pomocą grawitacji odśrodkowej (CG). Indukowana przez CG regulacja w górę SOX9 powoduje rozwój fenotypów chondrogennych.

Indukcja różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przez grawitację odśrodkową

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Przedstawiamy protokół generowania linii chondrogennej z ludzkiej krwi obwodowej (PB) za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu metody bez integracji, która obejmuje tworzenie ciała zarodkowego (EB), ekspansję komórek fibroblastycznych i indukcję chondrogeneczną.

Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację chondrocytów, chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs) i migrujących chondroprogenitorów (MCP) z ludzkiej chrząstki stawowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne, adhezję fibronektyny i testy oparte na migracji w celu wyizolowania i scharakteryzowania tych komórek.

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania chondrogenicznego komórek iPSC pochodzących z krwi pępowinowej w celu uzyskania pelletów chrzęstnych. Protokół umożliwia modelowanie chorób i badania nad regeneracją tkanki chrzęstnej.

Tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej

Przeglądaj więcej filmów