Name: Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek grzybów w celu zbadania mechanizmów działania przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych. Technika ta pozwala śledzić wnikanie i lokalizację subkomórkową peptydów w komórkach Fusarium graminearum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. R. Howardowi Bergowi, Dyrektorowi Zintegrowanego Ośrodka Mikroskopii w Centrum Nauki o Roślinach Donalda Danfortha, za jego wskazówki i pomoc w mikroskopii konfokalnej. Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

1. Znakowanie defensyn za pomocą fluoroforów
<ol>
	<li>Wybierz fluorofor, który ma minimalny wpływ na właściwości przeciwdrobnoustrojowe, a także na wychwyt i lokalizację defensyny wewnątrz żywej komórki. 
	UWAGA: Wybór optymalnego fluoroforu zależy od konkretnych celów eksperymentalnych. Należy również wziąć pod uwagę właściwości spektralne i chemiczne, fotostabilność, rozmiar i ładunek fluoroforu.</li>
	<li>Oznacz defensynę wybranym fluoroforem za pomocą odpowiedniego zestawu do znakowania peptydów dostępnego u dostawców komercyjnych. Alternatywnie, chemicznie syntetyzować defensyny znakowane fluoroforem. W tym badaniu oznaczono defensynę MtDef5 za pomocą DyLight550 przy użyciu komercyjnego zestawu do etykietowania zgodnie z protokołem producenta, a defensyna MtDef4 znakowana tetrametylo rodaminą (TAMRA) została chemicznie zsyntetyzowana komercyjnie. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie chemicznie syntetyzowanych peptydów znakowanych fluoroforem (szczególnie w przypadku krótkich peptydów zawierających 50 aminokwasów lub mniej), ponieważ fluorofor może być przyłączony do N- lub C-końcowej reszty peptydu, aby zapewnić minimalny wpływ na jego aktywność przeciwdrobnoustrojową. Synteza długich peptydów z więcej niż trzema wiązaniami dwusiarczkowymi jest trudna. W takim przypadku zaleca się, aby peptyd był znakowany optymalnym fluoroforem przy użyciu odpowiedniego dostępnego na rynku zestawu do znakowania peptydów.</li>
	<li>Zbadaj in vitro aktywność przeciwdrobnoustrojową znakowanej defensyny i określ minimalne stężenie hamujące (MIC) przeciwko badanym grzybom. 
	UWAGA: W tym badaniu wartość MIC DyLight550-MtDef5 i TMR-MtDef4 określono w stosunku do Neurospora crassa i Fusarium graminearum.</li>
</ol>
2. Kultury grzybów i podłoże wzrostowe
<ol>
	<li>Przenieś konidia z kultury podstawowej N. crassa do skośnej probówki zawierającej pożywkę z agarem Vogel's class21 i inkubuj w temperaturze pokojowej pod światłem przez 5 dni.</li>
	<li>Kultura szczepu F. graminearum PH-1 na płytkach zawierających kompletne podłoże (CM)22 w temperaturze 28 ºC przez 5 dni. Do produkcji konidiów należy zaszczepić 4 (o średnicy 10 mm) zatyczki 5-dniowej kultury F. graminearum PH-1 w 50 ml pożywki karboksymetylocelulozowej (CMC) (15 g karboksymetylocelulozy, 1 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g MgSO,4,7 H2O, 1 g NH4NO3 i 1 g KH2PO4) i hodować przez 4-7 dni w temperaturze 28 ºC w wytrząsarce obrotowej przy 180 obr./min.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny konidialnej
<ol>
	<li>Zawiesina konidialna F. graminearum
	<ol>
		<li>Odwirować płynną kulturę F. graminearum i zebrać konidia, filtrując 1,5 ml kultury grzybów przez dwie warstwy materiału filtracyjnego (takiego jak Miracloth) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Odwirować zawiesinę konidialną przy prędkości 13,226 x g w mikrowirówce przez 2 minuty.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i dodać 1 ml sterylnej wody, aby przemyć osad.</li>
		<li>Zawiesinę konidialną odwirować z prędkością 13 226 x g w mikrowirówce przez 2 minuty. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 2X SFM (Synthetic Fungimedia)23.</li>
		<li>Policz konidia za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym.</li>
		<li>Dostosuj zawiesinę konidialną do 105 konidii / ml za pomocą 2X SFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesina konidialna N. crassa
	<ol>
		<li>Przenieść niewielką ilość hodowli (5-dniowej) N. crassa za pomocą pętli inokulacyjnej do probówki mikrowirówkowej zawierającej 2 ml płynnej pożywki Vogela.</li>
		<li>Zwirować zawiesinę konidialną i przefiltrować przez materiał filtracyjny do nowej probówki mikrowirówkowej.</li>
		<li>Zawiesinę konidialną odwirować z maksymalną prędkością w mikrowirówce przez 2 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad konidialny w 1 ml płynnego podłoża Vogela.</li>
		<li>Policz konidia za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym.</li>
		<li>Dostosować zawiesinę konidialną do 105 konidii/ml za pomocą płynnego podłoża Vogel's.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki i mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Subkomórkowa lokalizacja defensyny MtDef4 w komórkach grzybów
	<ol>
		<li>Odpipetować 50 μl każdej zawiesiny konidialnej (105 konidiów/ml) do 10 mm mikrostudzienki z 35-milimetrowym dnem mikrodołkowym. W celu obserwacji konidiów należy bezpośrednio przejść do następnego etapu lub w celu przygotowania zarodków, odpipetować 50 μl konidiów N. crassa i F. graminearum do szalek hodowlanych o średnicy 35 mm i pozostawić do kiełkowania przez 3-6 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 50 μl znakowanej fluorescencyjnie defensyny w MIC do każdej płytki mikrostudzienki i inkubować przez 2,5 godziny. Wartość MIC zastosowanych tutaj defensyn znakowanych fluoroforem (krok 1.3) wynosi 3 μM zarówno dla N. crassa, jak i F. graminearum, a wartość MIC TMR-MtDef4 dla N. crassa i F. graminearum wynosiła odpowiednio 1 μM i 12 μM.</li>
		<li>Dodać 2 μl barwnika membranoselektywnego FM4-64 (końcowe stężenie: 5 μM) do naczynia hodowlanego i inkubować przez 30 minut, a następnie natychmiast zamontować pod mikroskopem konfokalnym w celu obrazowania.</li>
		<li>Wybierz laser światła białego (WLL). Użyj dwóch źródeł laserowych o długości fali 488 nm i 550 nm, aby wzbudzić odpowiednio barwnik TMR-MtDef4 i FM4-64. Wykrywanie fluorescencji TMR-MtDef4 przy 580-700 nm i wykrywanie barwnika FM4-64 przy 690-800 nm. 
		UWAGA: Mikroskopię konfokalną należy wykonać w ciemnym pomieszczeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie poklatkowe internalizacji defensyny MtDef5
	<ol>
		<li>Odpipetować 50 μl zawiesiny konidialnej N. crassa i F. graminearum (105 konidiów/ml) do 10 mm mikrodołka z 35-milimetrowymi naczyniami mikrodołkowymi ze szklanym dnem. Mikrostudzienka o średnicy 10 mm jest niepowlekana, a na dole znajduje się szkło osłonowe nr 1,5. Aby obserwować konidia, przejdź bezpośrednio do następnego kroku. W celu obserwacji kiełków należy inkubować konidia przez 3-6 godzin w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do mikroskopii.</li>
		<li>Włącz funkcję WLL. Wybierz linię lasera o długości fali 550 nm, aby wzbudzić zastosowane tutaj defensyny znakowane fluoroforem (krok 1.3) i FM4-64 z intensywnością 1,00% i aktywuj odpowiednie detektory. Zastosowane tutaj defensyny znakowane fluoroforem (krok 1.3) wykryto przy 560 - 600 nm, a barwnik FM4-64 przy 690 - 800 nm. 
		UWAGA: Do obrazowania żywych komórek należy używać lasera o niskiej intensywności, ponieważ wysoka intensywność lasera może spowodować uszkodzenie żywych komórek grzybów.</li>
		<li>Zamontuj miskę mikrostudzienki na mikroskopie. Znajdź komórki za pomocą początkowo obiektywów 10x, a następnie przełącz się na obiektyw 100x/1.44 OIL, aby uzyskać większe powiększenie. 
		UWAGA: Ustaw tryb skanowania na xyzt (kombinacja trybów Z-stack i time-lapse), pozycję Z, Zoom, częstotliwość przechwytywania obrazu itp. przed przejściem do następnego kroku.</li>
		<li>Dodać 50 μl defensyn znakowanych fluoroforem zastosowanych tutaj (krok 1.3) o wartości MIC 3 μM i 2 μl barwnika selektywnego membranowo FM4-64 (stężenie końcowe 5 μM) do każdej płytki mikrostudzienkowej i rozpocząć obrazowanie poklatkowe. Umieść małe kawałki mokrej bibuły filtracyjnej w naczyniach mikrostudzienki, aby zapobiec parowaniu. Częstotliwość wykonywania obrazu wynosiła 3 min 30 s, a całkowity okres 2 h 30 min. 
		UWAGA: Dodanie defensyny i fluoroforu po zamontowaniu czaszy mikrostudzienki w mikroskopie może spowodować rozogniskowanie obszaru zainteresowania. Dlatego po dodaniu defensyny i fluoroforu do mikrostudzienki, obszar zainteresowania musi zostać ponownie skoncentrowany, co może spowodować opóźnienie w akwizycji obrazu.</li>
		<li>Do wszystkich obrazowań konfokalnych należy używać mikroskopu konfokalnego i przeprowadzać mikroskopię w temperaturze pokojowej w ciemnym pomieszczeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jones, J. D. G., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v444/n7117/full/nature05286.html">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).</li>
<li>Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plant+Peptidome%3A+An+expanding+repertoire+of+structural+features+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions.</a> Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).</li>
<li>Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+mechanisms+of+action+of+naturally+occurring+antifungal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+and+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides.</a> Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).</li>
<li>Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Marilyn_Anderson/publication/257691605_Plant_defensins_Common_fold_multiple_functions/links/02e7e5269aee227c27000000.pdf">Plant defensins: Common fold, multiple functions.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).</li>
<li>De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1749461312000346">Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).</li>
<li>Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S174946131100042X">Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?</a> Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).</li>
<li>Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+plant+defensins%3A+Mechanisms+of+action+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production.</a> Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).</li>
<li>Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2012-1095.ch015">Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications.</a> ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).</li>
<li>Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+sphingolipids+as+targets+for+the+development+of+selective+antifungal+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics.</a> Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).</li>
<li>Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+antifungal+plant+and+insect+defensins%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins.</a> Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).</li>
<li>Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+antifungal+action+of+plant%2C+insect+and+human+defensins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).</li>
<li>Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+defensin%2C+NaD1%2C+enters+the+cytoplasm+of+Fusarium+oxysporum+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae.</a> J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).</li>
<li>Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+Pisum+sativum+Defensin+1+Interacts+with+Neurospora+crassa+Cyclin+F+Related+to+the+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle.</a> Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).</li>
<li>El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+mechanisms+of+a+plant+defensin+MtDef4+are+not+conserved+between+the+ascomycete+fungi+Neurospora+crassa+and+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum.</a> Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).</li>
<li>Baxter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tomato+Defensin+TPP3+Binds+Phosphatidylinositol+%284%2C5%29-Bisphosphate+via+a+Conserved+Dimeric+Cationic+Grip+Conformation+To+Mediate+Cell+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+and+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis.</a> Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).</li>
<li>Kvansakul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+phosphatidic+acid+by+NsD7+mediates+the+formation+of+helical+defensin-lipid+oligomeric+assemblies+and+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).</li>
<li>Poon, I. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+oligomerization+of+a+defensin+induces+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis.</a> eLife. 3, e01808(2014).</li>
<li>Muñoz, A., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+analysis+shed+light+on+the+complexity+and+dynamics+of+antimicrobial+Peptide+action%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action.</a> Front. Immunol. 3, 248(2012).</li>
<li>Hayes, B. M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+mechanism+of+action+of+the+plant+defensin+NaD1+as+a+new+member+of+the+antifungal+drug+arsenal+against+candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).</li>
<li>Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+mechanisms+of+cell+penetration+and+killing+by+the+de+novo+designed+antifungal+hexapeptide+PAF26%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26.</a> Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).</li>
<li>Eaton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+guanine+nucleotide+exchange+factor+RIC8+regulates+conidial+germination+through+G%CE%B1+proteins+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa.</a> PLoS One. 7 (10), e48026(2012).</li>
<li>Leslie, J. F., Summerell, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeslie%2C+JF+%22The+Fusarium.+laboratory+manual%22">The Fusarium. laboratory manual</a>. , Blackwell Professional. Ames, IA, USA. (2006).</li>
<li>Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6968.1990.tb04174.x/abstract">An automated quantitative assay for fungal growth inhibition.</a> FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).</li>
<li>Sagaram, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+studies+of+a+phosphatidic+acid-binding+antifungal+plant+defensin+MtDef4%3A+Identification+of+an+RGFRRR+motif+governing+fungal+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry.</a> PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+of+phenotypic+switching+and+the+cellular+response+to+antifungal+peptoids+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).</li>
<li>Nair, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+prediction+of+sub-cellular+localization+by+combining+evolutionary+and+structural+information%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins+Struct.+Funct.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information.</a> Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).</li>
<li>Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.0010066">Refining protein subcellular localization.</a> PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66(2005).</li>
<li>Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+sequence+of+interactions+of+PuroA+peptide+with+Candida+albicans+cells+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging.</a> Sci. Rep. 7, 43542(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu opisano wiarygodną metodologię obrazowania żywych komórek z wykorzystaniem znakowanych fluorescencyjnie defensyn przeciwgrzybiczych w celu zbadania kinetyki internalizacji tych peptydów do komórek grzyba i określenia ich celów subkomórkowych. Metoda ta jest potężnym narzędziem do wizualizacji dynamiki interakcji między defensynami a komórkami grzybów w czasie i przestrzeni.
Do badania internalizacji i wewnątrzkomórkowej lokalizacji defensyn roślinnych w komórkach grzybów zastosow...

Rośliny wykształciły wyrafinowany wrodzony układ odpornościowy do obrony przed mikrobiologicznymi patogenami roślin1. Wyrażają one liczne kodowane genowo peptydy obronne gospodarza o przypuszczalnej aktywności przeciwdrobnoustrojowej2. Rzeczywiście, wiele z tych peptydów wykazuje aktywność przeciwdrobnoustrojową in vitro3. Defensyny stanowią jedną z największych grup peptydów obronnych gospodarza w królestwie roślin4. Te bogate w cysteinę, kationowe peptydy wykazują silne działanie hamujące wzrost przeciwko patogenom grzybów i lęgniowców w stężeniach mikromolowych i stanowią jedną z pierwszych linii obrony przed tymi patogenami5,6. Ze względu na ich silne działanie przeciwgrzybicze, defensyny mogą być wykorzystywane w zastosowaniach agrobiotechnologicznych do generowania upraw odpornych na choroby. Wykazano, że konstytutywna nadekspresja kilku defensyn roślinnych zwiększa odporność na choroby w testach szklarniowych i polowych upraw transgenicznych6. Ważne jest, aby rozwikłać mechanizmy działania (MOA) tych peptydów przeciwgrzybiczych, aby w pełni wykorzystać ich potencjał jako skutecznych narzędzi ochrony roślin. Jednak MOA tych defensyn roślinnych jest słabo poznany. Obecne dowody sugerują, że wykazują one różne MOA5,6,7,8. Niektóre defensyny działają zewnątrzkomórkowo na grzyby i celują w sfingolipidy rezydujące w ścianie komórkowej/błonie komórkowej, zaburzają integralność błony i aktywują szlaki toksyczności komórkowej9,10,11. Ostatnio jednak odkryto przeciwgrzybicze defensyny, które przemieszczają się do komórek grzybów12,13,14. Niektóre z tych defensyn wiążą się z bioaktywnymi fosfolipidami rezydującymi w błonie, tworzą kompleksy oligomeryczne i przenikają błony plazmatyczne15,16,17. W ten sposób wyjaśniono niektóre aspekty MOA defensyn roślinnych. Jednak MOA defensyn roślinnych prawdopodobnie wiąże się ze złożonym zestawem zdarzeń, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane i zintegrowane w kompleksowy model. W szczególności pozostaje poważna luka w naszym zrozumieniu celów komórkowych tych peptydów.
Dzięki niedawnym postępom w technologiach mikroskopowych i rozwojowi nowych sond fluorescencyjnych, techniki obrazowania żywych komórek są obecnie często używane do badania MOA peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP). Techniki te uzupełniają szeroko stosowane metody, takie jak immunolokalizacja, mikroskopia elektronowa, mikroskopia sił atomowych lub tomografia rentgenowska18, które były stosowane głównie do analizy wpływu peptydów przeciwgrzybiczych na morfologię i wzrost komórek grzybów, w tym do badania integralności ściany komórkowej, zmian we wzorcach wzrostu/rozgałęziania komórek, a także przenikania i zabijania błony plazmatycznej. Niemniej jednak badania te ograniczały się do obrazowania komórek w pewnym punkcie czasowym po leczeniu peptydami, zamiast wykonywania obrazowania poklatkowego na tych samych komórkach w celu monitorowania ich dynamicznych zmian w odpowiedzi na prowokację defensyną. W ostatnich latach zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie peptydów w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej umożliwiło wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki interakcji AMP-mikroorganizmy. Zarówno naturalnie oczyszczone, jak i chemicznie syntetyzowane peptydy przeciwgrzybicze mogą być oznaczane znacznikami fluorescencyjnymi (np. barwnikami na bazie DyLight, rodaminy, BODIPY lub Alexa Fluor) i bezpośrednio obserwowane podczas ich interakcji z komórkami za pomocą poklatkowego obrazowania żywych komórek. Zastosowanie tych znakowanych peptydów znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat różnych aspektów ich MOA, w tym sposobu wnikania, lokalizacji subkomórkowej, transportu wewnątrzkomórkowego i miejsc działania przeciwgrzybiczego w żywych komórkach grzybów18.
Ostatnio, kilka badań wykazało, że różne peptydy przeciwgrzybicze, w tym defensyny roślinne, są internalizowane przez żywe komórki grzybów12,14,19,20. MOA tych defensyn prawdopodobnie wiąże się z interakcją z celami wewnątrzkomórkowymi. Niedawno informowaliśmy o przeciwgrzybiczym działaniu roślinnej defensyny MtDef4 u dwóch grzybów workowców, Neurospora crassa i Fusarium graminearum. Wykazano, że MtDef4 wykorzystuje różne szlaki do wnikania komórek grzybów i lokalizacji subkomórkowej u tych grzybów14. W badaniu tym wykorzystano chemicznie syntetyzowaną tetrametylo rodaminę (TAMRA) znakowaną MtDef4 w połączeniu z ważnymi barwnikami fluorescencyjnymi (barwnik selektywny membranowo, FM4-64; barwnik przepuszczalny przez błonę, SYTOX Green; barwnik reporterowy śmierci komórkowej, jodek propidyny) i inhibitorami metabolizmu. Analizy te wykazały kinetykę internalizacji MtDef4, jego mechanizmy transportu wewnątrzkomórkowego i jego cele subkomórkowe14.
Tutaj przedstawiono protokół obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie peptydy w połączeniu z ważnymi barwnikami fluorescencyjnymi do badania interakcji defensyna roślinna z grzybem, w szczególności szlaków translokacji i wewnątrzkomórkowych celów defensyn w komórkach grzybów.

<table><tbody><tr><td>FM4-64 Dye</td><td>Life Technologies</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 550 Zestaw do etykietowania przeciwciał</td><td>Thermo Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>Mata do naczyń Microwell ze szklanym dnem</td> Ściereczka <td>TeK</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Ściereczka</td><td>Mira EMD Millipore Corp</td><td>475855-1R</td><td></td></tr><tr><td>SP8-X Mikroskop konfokalny</td><td>Oprogramowanie Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>FiJi</td><td></td><td>do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>do analizy obrazu</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Małe defensyny bogate w cysteinę są jedną z największych grup peptydów obronnych gospodarza obecnych we wszystkich roślinach. Wiele defensyn roślinnych wykazuje silne działanie przeciwgrzybicze in vitro przeciwko szerokiemu spektrum patogenów grzybowych i dlatego mogą być stosowane jako środki przeciwgrzybicze w uprawach transgenicznych. Aby w pełni wykorzystać potencjał defensyn roślinnych w zwalczaniu chorób, kluczowe jest wyjaśnienie ich mechanizmów działania (MOA). Wraz z pojawieniem się zaawansowanych technik mikroskopowych, obrazowanie żywych komórek stało się potężnym narzędziem do zrozumienia dynamiki przeciwgrzybiczego MOA defensyn roślinnych. W tym artykule opisano metodę obrazowania żywych komórek opartą na mikroskopii konfokalnej przy użyciu dwóch znakowanych fluorescencyjnie defensyn roślinnych (MtDef4 i MtDef5) w połączeniu z ważnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta umożliwia wizualizację i analizę w czasie rzeczywistym dynamicznych zdarzeń internalizacji MtDef4 i MtDef5 w komórkach grzybów. Co ważne, test ten generuje bogactwo informacji, w tym kinetykę internalizacji, sposób wejścia i subkomórkową lokalizację tych peptydów. Wraz z innymi narzędziami biologii komórki, metody te dostarczyły krytycznych informacji na temat dynamiki i złożoności MOA tych peptydów. Narzędzia te mogą być również używane do porównywania MOA tych peptydów z różnymi grzybami.

Przeprowadzono obrazowanie żywych komórek w celu śledzenia i porównania internalizacji oraz lokalizacji subkomórkowej dwóch defensyn z Medicago truncatula, MtDef4 i MtDef5, w komórkach grzybów. TMR-MtDef4 została zsyntetyzowana chemicznie, natomiast MtDef5 została znakowana Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Konidia inkubowano z jedną z defensyn w połączeniu z barwnikiem selektywnym dla błon FM4-64. Rysunek 1 pokazuje, że TMR-MtDef4 posiada różne ścieżk...

Defensyny roślinne odgrywają ważną rolę w obronie roślin przed patogenami. Aby skutecznie wykorzystać te peptydy przeciwgrzybicze jako środki przeciwgrzybicze, zrozumienie ich sposobów działania (MOA) ma kluczowe znaczenie. W tym miejscu opisano metodę obrazowania żywych komórek w celu zbadania krytycznych aspektów MOA tych peptydów.

Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Ogólnym celem tej metody obrazowania żywych komórek jest badanie krytycznych aspektów mechanizmów działania przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych w komórkach grzybów. Dzięki pojawieniu się zaawansowanych technik mikroskopii konfokalnej, obrazowanie żywych komórek stało się potężnym narzędziem do badania sposobów działania przeciwgrzybicznych defensyn roślinnych. Wykorzystując tę technologię, przedstawiamy tutaj metodę, która pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w celu zrozumienia sposobów działania przeciwgrzybicznych defensyn roślinnych.Naszym celem jest zbadanie, w jaki sposób peptydy te są internalizowane do komórek grzybów oraz jak są one lokalizowane w organellach komórkowych lub dyfundują w cytoplazmie. Aby przygotować zawiesinę konidiów szczepu PH-1 Fusarium graminearum, najpierw należy przygotować hodowle tego szczepu na płytkach zawierających pożywkę kompletną. Inkubować je w temperaturze 28 °C przez pięć dni.Aby uzyskać konidia, zaszczep cztery krążki o średnicy 10 mm z pięciodniowej kultury do 50 ml pożywki z karboksymetylocelulozą. Inkubuj te krążki przez cztery do siedmiu dni w temperaturze 28 °C na wytrząsarce rotacyjnej ustawionej na 180 rpm. Gdy kultury nabiorą

live-cell-imaging-fungal-cells-to-investigate-modes-entry-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film pokazuje obrazowanie żywych komórek do analizy aktywności przeciwgrzybiczej u ludzkich neutrofili przy użyciu fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus. Początkowo w neutrofilach wykrywana jest zarówno czerwona, jak i purpurowa fluorescencja, podczas gdy czerwona fluorescencja zmniejsza się z czasem, co wskazuje na degradację konidiów i potwierdza aktywność przeciwgrzybiczą neutrofili.

Ocena w czasie rzeczywistym aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Tutaj opisujemy protokół oceny aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus w połączeniu z mikroskopią wideo żywych komórek i cytometrią przepływową. Wygenerowane dane dostarczają informacji na temat interakcji między komórką gospodarza a Aspergillus, takich jak działanie grzybobójcze, fagocytoza, migracja komórek i hamowanie wzrostu grzybów.

Obrazowanie na żywo aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek grzybów w celu zbadania mechanizmów działania przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych. Technika ta pozwala śledzić wnikanie i lokalizację subkomórkową peptydów w komórkach Fusarium graminearum.

Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych

Przeglądaj więcej filmów