Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych

Ogólnym celem tej metody obrazowania żywych komórek jest zbadanie krytycznych aspektów mechanizmów działania przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych w komórkach grzybów. Wraz z pojawieniem się zaawansowanych technik mikroskopii konfokalnej, obrazowanie żywych komórek stało się potężnym narzędziem do badania sposobów działania przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych. Wykorzystując tę technologię, przedstawiamy metodę, która pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytanie w zrozumieniu sposobów działania przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych.

Skupiamy się na tym, w jaki sposób te peptydy są internalizowane w komórkach grzybów i jak te peptydy są zlokalizowane w organellach komórkowych lub dyfundowane w cytoplazmie. Aby uzyskać konidialną zawiesinę szczepu PH-1 Fusarium graminearum, należy najpierw ustawić kultury szczepu na płytkach zawierających kompletną pożywkę. Hoduj je w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez pięć dni.

Aby wyprodukować konidia, zaszczepij cztery czopki pięciodniowej kultury o średnicy 10 milimetrów w 50 mililitrach pożywki karboksymetylocelulozowej. Hoduj te zatyczki przez cztery do siedmiu dni w temperaturze 28 stopni Celsjusza na wytrząsarce obrotowej ustawionej na 180 obr./min. Kiedy kultury mają czerwony kolor, uformowały się konidia.

Aby zebrać konidia w zawiesinie, należy odwirować płynną kulturę i przefiltrować jeden mililitr przez dwie warstwy materiału filtracyjnego do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej. Odwirować zawiesinę przez dwie minuty i wyrzucić supernatant. Następnie umyj granulki jednym mililitrem sterylnej wody i powtórz wirowanie.

Następnie ponownie zawieś granulat w jednym mililitrze 2x SFM. Następnie policz konidia za pomocą hemocytometru i dostosuj gęstość zawiesiny do 100 000 konidiów na mililitr. Aby uzyskać zawiesinę konidialną Neurospora crassa, przenieś konidia z kultur podstawowych do skośnej probówki zawierającej podłoże agarowe Vogela i inkubuj probówki w temperaturze pokojowej pod stałym światłem przez pięć dni.

Po pięciu dniach przenieś niewielką ilość uprawy, używając pętli inokulacyjnej, do probówki mikrowirówki zawierającej dwa mililitry płynnej pożywki Vogela. Pamiętaj, aby wymieszać konidia z pętli. Następnie przefiltruj zawiesinę, odwiruj ją i ponownie zawieś osad konidiów w pożywce Vogel's bez etapu mycia.

Na koniec dostosuj końcowe zawieszenie do 100 000 konidiów na mililitr. Aby przygotować kiełki do mikroskopii konfokalnej, należy odpipetować 50 mikrolitrów zawiesiny konidiów na 35-milimetrową miskę hodowlaną i pozostawić konidia do kiełkowania przez trzy do sześciu godzin w temperaturze pokojowej. W przypadku mikroskopii konfokalnej należy odpipetować 50 mikrolitrów zawiesiny konidialnej do 10-milimetrowej mikrostudzienki naczynia ze szklanym dnem.

Następnie, przy ustalonym z góry minimalnym stężeniu hamującym, dodać 50 mikrolitrów znakowanych fluorescencyjnie defensyn do zawiesiny i inkubować konidia z oznakowanymi defensynami przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodać dwa mikrolitry selektywnego barwnika membranowego FM4-64, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikromolowych. Następnie inkubuj kulturę przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed zbadaniem konidiów.

Aby skonfigurować mikroskop konfokalny, wybierz laser światła białego. Użyj laserów 488-nanometrowych i 550-nanometrowych, aby wzbudzić odpowiednio defensyny znakowane rodaminą i barwnik FM4-64. Ustaw te lasery na intensywność 1%Następnie ustaw długości fal wykrywania na 580 do 700 nanometrów dla defensyny znakowanej rodaminą i od 690 do 800 nanometrów dla barwnika FM4-64.

Teraz zbierz obrazy. W przypadku obrazowania poklatkowego dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny konidialnej do naczynia z mikrostudzienką ze szklanym dnem. Następnie zamontuj miskę mikrostudzienki na mikroskopie i znajdź ogniwa o niskiej mocy.

Następnie przełącz się na obiektyw ze 100x, olejem 1,44. Aby obserwować defensyny znakowane DyLight550, ustaw linię lasera na 550 nanometrów dla wzbudzenia i od 560 do 600 nanometrów dla detekcji. Następnie ustaw tryb skanowania na xyzt.

Następnie ustaw pozycję Z, powiększenie, częstotliwość przechwytywania obrazu i tak dalej, zgodnie z potrzebami. Teraz do zawiesiny konidialnej dodaj 50 mikrolitrów defensyn znakowanych fluoroforem o minimalnym stężeniu hamującym trzech mikromoli i dodaj dwa mikrolitry selektywnego barwnika błonowego FM4-64, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu mikromolowych. Następnie, w razie potrzeby, ponownie ustaw ostrość optyki.

Przed zrobieniem zdjęć umieść małe kawałki mokrej bibuły filtracyjnej w naczyniu mikrostudzienki, aby zapobiec parowaniu. Następnie przetwarzaj z przechwytywaniem obrazu co 3,5 minuty przez 2,5 godziny. Przeprowadzono obrazowanie żywych komórek w celu śledzenia i porównania internalizacji i lokalizacji subkomórkowej dwóch defensyn z Medicago truncatula.

Chemicznie syntetyzowana defensyna 4 znakowana rodaminą była inaczej sprzedawana w Neurospora crassa i Fusarium graminearum. FM4-64 oznaczył błony plazmatyczne obu grzybów. Jednak w Fusarium defensyna czwarta jest dyfundowana w cytoplazmie.

Natomiast w Neurospora jest transportowany do ciał pęcherzykowych. Dla porównania, defensynę 5 zwizualizowano za pomocą znacznika DyLight550 w Neurospora crassa, wraz z znakowaniem błony plazmatycznej przez FM4-64. Obrazowanie poklatkowe pokazuje, że ta defensyna dostaje się do komórek w ciągu 30 do 40 minut, a następnie dyfunduje przez cytoplazmę.

Różni się to od transportu defensyny cztery, która dostaje się do komórek i pozostaje uwięziona w ciałach pęcherzykowych nawet po trzech godzinach. Podsumowując, obrazowanie żywych komórek jest potężnym narzędziem pozwalającym lepiej zrozumieć sposoby działania różnic między roślinami przeciwgrzybiczymi. Wraz z innymi ważnymi barwnikami fluorescencyjnymi i markerami komórkowymi ma elastyczność modyfikacji pod kątem innych peptydów przeciwdrobnoustrojowych.

Ostatecznie technika ta może pomóc w opracowaniu nowych strategii stosowania peptydów przeciwdrobnoustrojowych jako środka przeciwgrzybiczego w rolnictwie i medycynie.