Name: Ilościowa lokalizacja białka Golgiego poprzez obrazowanie jego centrum masy fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Poznaj metodę ilościowej lokalizacji białek Golgiego z rozdzielczością nanometryczną przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej i komórek HeLa. Technika ta pozwala badaczom analizować organizację aparatu Golgiego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować D. Stephensowi (Uniwersytet w Bristolu, Bristol, Wielka Brytania) za plazmid DNA TPST1-EGFP, a także Lakshmi Narasimhan Govindarajan za pomoc w optymalizacji oprogramowania. Prace te były wspierane grantami od National Medical Research Council (NMRC/CBRG/007/2012), Ministerstwa Edukacji (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 i RG132/15 oraz AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) dla L.L.

<ol><li>Glick, B. S., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+Golgi+traffic%3A+a+critical+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Models for Golgi traffic: a critical assessment.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215(2011).</li>
<li>Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mammalian+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mammalian Golgi.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).</li>
<li>Lu, L., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+endosomes+to+the+trans-Golgi+network%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From endosomes to the trans-Golgi network.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li>
<li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exiting+the+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exiting the Golgi complex.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).</li>
<li>Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Tie, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+imaging+method+for+quantitative+Golgi+localization+reveals+differential+intra-Golgi+trafficking+of+secretory+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes.</a> Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).</li>
<li>Trucco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+traffic+triggers+the+formation+of+tubular+continuities+across+Golgi+sub-compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).</li>
<li>Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+dispersal+during+microtubule+disruption%3A+regeneration+of+Golgi+stacks+at+peripheral+endoplasmic+reticulum+exit+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites.</a> Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).</li>
<li>Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+microtubule+assembly+status+on+the+intracellular+processing+and+surface+expression+of+an+integral+protein+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).</li>
<li>Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nocodazole+and+taxol+affect+subcellular+compartments+but+not+secretory+activity+of+GH3B6+prolactin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells.</a> Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).</li>
<li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+cis-Golgi+matrix+protein%2C+GM130%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130.</a> J Cell Biol. 131, 6 Pt 2 1715-1726 (1995).</li>
<li>Roth, J., Berger, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+galactosyltransferase+in+HeLa+cells%3A+codistribution+with+thiamine+pyrophosphatase+in+trans-Golgi+cisternae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae.</a> J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).</li>
<li>Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+sulfation+is+a+trans-Golgi-specific+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification.</a> J Cell Biol. 105 (6), Pt 1 2655-2664 (1987).</li>
<li>Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Arf-1+to+the+early+Golgi+by+membrin%2C+an+ER-Golgi+SNARE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE.</a> J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).</li>
<li>Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapled+Golgi+cisternae+remain+in+place+as+cargo+passes+through+the+stack%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack.</a> Elife. 2, 00558(2013).</li>
<li>Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+large+ADP-ribosylation+factor-guanine+nucleotide+exchange+factors+to+different+Golgi+compartments%3A+evidence+for+distinct+functions+in+protein+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).</li>
<li>Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy-based+linescan+methodologies+for+intra-Golgi+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins.</a> J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).</li>
<li>Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-independent+secretion+requires+functional+maturation+of+Golgi+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements.</a> J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).</li>
<li>Volchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Countercurrent+distribution+of+two+distinct+SNARE+complexes+mediating+transport+within+the+Golgi+stack%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack.</a> Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).</li>
<li>Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+budding+within+the+Golgi+stack%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">COPI budding within the Golgi stack.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231(2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych.

Wcześniej lokalizacja białka Golgiego pod mikroskopem świetlnym była głównie mierzona przez stopień korelacji lub nakładania obrazu białka z obrazem markera Golgiego o znanej lokalizacji 15,16,17. Powstała korelacja lub współczynnik nakładania się odzwierciedla, jak blisko przestrzennie znajduje się białko testujące do markera Golgiego. Istnieją co najmniej trzy zastrzeżenia dotyczące tego podejścia. Po pierwsze, korelacja lub w...

Kompleks Golgiego odgrywa istotną rolę w przewozie białek i lipidów (dalej cargo i wydzielniczych) w komórkach ssaków 1,2,3. W Golgim ładunki są nie tylko sortowane do różnych przedziałów podkomórkowych, ale także modyfikowane przez różne rodzaje glikozylacji. Kompleks Golgiego u ssaków składa się z licznych bocznie połączonych stosów Golgiego, które zazwyczaj składają się z 4–11 ściśle przylegających i płaskich worków błonowych zwanych cisternae. Szeregowo ułożone cisterny Golgiego są dalej klasyfikowane, od jednego końca do drugiego, jako cis, środkowe i trans-cisternee. Po stronie poprzecznej stosu Golgiego pęcherzyk błonowy rozwija się w sieć błonową rurkowo-siatkowatą zwaną siecią trans-Golgiego (TGN)4. W szlaku wydzielniowym ładunki pochodzące z siatkówki endoplazmatycznej (ER) trafiają do stosu Golgiego po stronie cis-side, a następnie kolejno przechodzą przez warstwy przyśrodkowe i transcisterne. Ładunki ostatecznie opuszczają Golgiego na przejściu Golgiego lub TGN, kierując się do błony plazmatycznej, endosomów lub ziaren wydzielniczych.
Molekularne i komórkowe mechanizmy przejścia ładunków przez stos Golgiego oraz jak Golgi utrzymuje swoją strukturę cysternalną pozostają tajemnicą i obecnie są przedmiotem gorącej debaty1. Jedną z trudności w tej dziedzinie jest to, że cisternae Golgiego można rozróżnić tylko pod mikroskopią elektronową (EM), ponieważ rozdzielczość mikroskopu optycznego (~ 200 nm) jest niewystarczająca do rozdzielenia pojedynczych cisternae Golgiego (< 100 nm zarówno w grubości cysterny, jak i odległości). Dlatego sub-Golgiego lokalizacja białek rezydentnych i ładunków tranzytujących jest konwencjonalnie określana przez immuno-złoty EM. Jednak immuno-gold EM jest bardzo wymagający technicznie i przekracza możliwości większości laboratoriów biologii komórki. Chociaż rozdzielczość EM może być poniżej nanometrów, rozdzielczość zapewniana przez immuno-złotą EM jest znacznie ograniczona przez rozmiar kompleksu przeciwciał (pierwotnego plus przeciwciało wtórne) oraz cząstki złota, a może być gorsza niż 20 nm. Ponadto obrazy EM są uzyskiwane z cienkich przekrojów 2D zamiast z trójwymiarowego globalnego widoku Golgiego, co może prowadzić do błędnych wniosków w zależności od względnej pozycji i orientacji sekcji5 2D. Na przykład badanie pojedynczego przekroju EM nie jest w stanie wiarygodnie odróżnić pęcherzyka od ortogonalnego widoku tubuli, ponieważ obie mogą wykazywać identyczne profile błon okrągłych. Niedawne pojawienie się technik mikroskopii superrozdzielczej, takich jak mikroskopia iluminacji 3D strukturalnej (3D-SIM), stymulowane redukcje emisji (STED), mikroskopia lokalizacyjna fotoaktywowana (PALM) oraz stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), umożliwia rozróżnienie struktur sub-Golgiego pod mikroskopami świetlnymi6. Jednak istnieją co najmniej cztery wady, które mogą znacząco ograniczyć ich zastosowanie w badaniach biologicznych komórek Golgiego. 1) Obecne techniki superrozdzielczości wymagają kosztownej i specjalnej konfiguracji sprzętowej, która wykracza poza większość laboratoriów biologii komórkowej. 2) Dla niektórych technik superrozdzielczości potrzebne są specjalne protokoły znakowania fluorescencji. 3) Chociaż w najlepszych warunkach techniki te deklarują rozdzielczość przestrzenną 20-110 nm, praktyczna rozdzielczość uzyskana w rzeczywistych próbkach może być znacznie gorsza. 4) W porównaniu z konwencjonalną mikroskopią, te techniki superrozdzielczości nadal mają trudności z prowadzeniem obrazowania wielokolorowego, 3D lub żywych komórek, zarówno pojedynczo, jak i w kombinacji. Prawdopodobnie najważniejsze jest to, że zarówno immuno-złota EM, jak i techniki mikroskopii superrozdzielczej dostarczają danych jakościowych, a nie ilościowych.
Próbując częściowo rozwiązać wspomniane powyżej problemy, niedawno opracowaliśmy konwencjonalną metodę opartą na mikroskopii świetlnej, nazwaną lokalizacją białka Golgiego za pomocą centrów masy obrazowania (GLIM), która systematycznie i ilościowo lokalizuje białko Golgiego z rozdzielczością równą immuno-złotemu EM7. W tej metodzie Golgi w hodowanych komórkach ssaków jest rozpraszany jako mini-stacki Golgiego przez leczenie nocodazolem, lekiem depolimeryzującym mikrotubule. Szeroko zakrojone badania wykazały, że mini-stacki Golgiego indukowane nokodazolem (dalej mini-stacki Golgiego) bardzo przypominają rodzime stacki Golgiego zarówno pod względem organizacji, jak i funkcji komórkowych 8,9,10,11. Iloraz lokalizacji (LQ) białka testowego można uzyskać za pomocą GLIM i oznacza ilościową lokalizację sub-Golgiego. Można porównać wartości numeryczne LQ i dostępna jest baza danych LQ z ponad 25 markerami Golgiego.
W GLIM mini-stacki Golgiego są potrójnie znakowane przez endogenne lub egzogennie ekspresowane GM130, GalT-mCherry oraz białko testowe (x). GM130 i GalT-mCherry, czyli markery cis- i trans-Golgiego odpowiednio12,13, stanowią punkty odniesienia. Potrójna fluorescencja, czerwona (R), zielona (G) i dalekoczerwona (B), jest sztucznie wyświetlana jako czerwono, zielona i niebieska. Do uzyskania rozdzielczości subpikselowej przyjmuje się środek masy fluorescencyjnej (dalej środek). Oś Golgiego definiowana jest jako wektor od środka GM130 do osi GalT-mCherry. Mini-stos Golgiego jest modelowany jako cylindryczna struktura o nieskończonej symetrii obrotowej wokół osi Golgiego. Dlatego mini-stos Golgiego można dalej modelować jako jednowymiarową strukturę wzdłuż osi Golgiego. LQ białka testowego x definiuje się jako dx/d1, gdzie dx to odległość od środka x do GM130, natomiast d1 to odległość od środka GalT-mCherry do GM130. Jeśli środek x jest poza osią, do obliczeń używa się jego odległości aksialnej projekcji. Zmienne, w tym oś Golgiego, kąt osiowy, dx, d1, kąt α i kąt β, dla GLIM są schematycznie zilustrowane na Rysunku 1. LQ jest niezależny od kąta osiowego Golgiego, choć mini-stacki Golgiego orientują się losowo w komórce.
Mini-stosy Golgiego na obrazach wydają się niejednorodne. Opracowaliśmy trzy kryteria wyboru analizowalnych mini-stosów Golgiego dla GLIM. 1) Kryterium stosunku sygnału do szumu, w którym stosunek całkowitej intensywności mini-stacka Golgiego do odchylenia standardowego (SD) tła wynosi ≥ 30 w każdym kanale. Kryterium to ma zapewnić dokładność pozycjonowania środka masy, która zależy od stosunku sygnału do szumu mini-stosów Golgiego. 2) Kryterium kąta osiowego lub odległości, które wymaga d1≥ 70 nm. d1 maleje wraz ze wzrostem kąta osiowego Golgiego. Gdy kąt osiowy zbliża się do 90° lub pionowy, mini-stos staje się nierozwiązywalny, gdy d1 zbliża się do zera. d1≥ 70 nm może skutecznie wykluczyć niemal pionowe mini-stosy Golgiego. 3) Kryterium koliniowości, w którym albo |tan α| lub |tan β| to ≤ 0,3. To kryterium zapewnia, że trzy centra mini-stosu są wystarczająco współliniowe dla naszego jednowymiarowego modelu mini-stosu Golgiego. Wszystkie mikroskopy świetlne cierpią na aberrację chromatyczną, która może poważnie zniekształcać względne położenie czerwonych, zielonych i dalekoczerwonych centrów fluorescencji. Chromatyczna aberracja systemów mikroskopowych jest eksperymentalnie kalibrowana poprzez obrazowanie kulek o średnicy 110 nm, które są potrójnie oznakowane przez czerwoną, zieloną i dalekoczerwoną fluorescencję. Dla każdego obrazu koralika środek czerwieni definiuje się jako rzeczywistą pozycję koralika, a przesunięcia chromatyczne środkowego zielonego i dalekoczerwonego są dopasowywane przez funkcje wielomianów pierwszego rzędu. Centra mini-stosów Golgiego są poddawane funkcjom wielomianowym, aby skorygować przesunięcia chromatyczne w zielonym i dalekoczerwonym kanale.
Dzięki GLIM możemy osiągnąć rozdzielczość ~ 30 nm wzdłuż osi Golgiego w warunkach standardowych. Co ważne, zapewnia systematyczną metodę ilościowego mapowania dowolnego białka Golgiego. GLIM można wykonać za pomocą konwencjonalnych mikroskopów, takich jak mikroskopy szerokokątowe lub konfokalne, przy użyciu powszechnych protokołów znakowania fluorescencyjnego. Obrazowanie i przetwarzanie danych może zająć nawet godzinę. Dzięki GLIM bezpośrednio zademonstrowaliśmy stopniowe przejście ładunku sekretoryjnego z cis-strony na poprzecznąGolgi 7.

<table><tbody><tr><td>Kulki fluorescencji. Nazwa handlowa: koraliki TetraSpeck</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td>Jako wielokolorowe koraliki do kalibracji przesunięcia chromatycznego mikroskopu</td></tr><tr><td>Szklana pokrywka i Phi; 12 mm (nr 1,5)</td><td>Menzel</td><td>CB00120RAC</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pokrywka i Phi; 25 mm (nr 1,5)</td><td>Menzel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Capricon</td><td>DMEM-HPA-P50</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Merck</td><td>487928</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik transfekcyjny. Nazwa handlowa: Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Medium transfekcyjne. Nazwa handlowa: OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TPST1-EGFP</td><td>Addgene</td><td>66617</td><td>Dar od D. Stephensa (Uniwersytet w Bristolu, Bristol, Wielka Brytania)</td></tr><tr><td>GalT-mCherry</td><td></td><td></td><td>Stworzone w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>poli (alkohol winylowy) (Mw ~31 000). Nazwa handlowa: Mowiol-488</td><td>CALBIOCHEM</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-GM130</td><td>BD Biosciences</td><td>610823</td><td>Główne przeciwciało dla człowieka GM130</td></tr><tr><td>IgG u kozy sprzężone fluorescencyjne o sprzęcie dalekoczerwonym. Nazwa handlowa: Alexa Fluor 647 sprzężony kozy antymyszy IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>Przeciwciało wtórne sprzężone z fluorescencją w dalekiej czerwieni</td></tr></tbody></table>

ilościowa lokalizacja białka golgiego poprzez obrazowanie jego centrum masy fluorescencyjnej

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

Kompleks Golgiego składa się z seryjnie ułożonych membranowych cistern, które można dalej klasyfikować na obszary podgolgiego, w tym sieć cis-Golgiego, medialną, trans-Golgiego i trans-Golgiego. Funkcje komórkowe Golgiego determinuje charakterystyczny rozkład jego białek rezydentskich. Rozdzielczość przestrzenna konwencjonalnej mikroskopii świetlnej jest zbyt niska, by rozróżnić struktury sub-Golgiego lub cisternae. Dlatego immuno-złota mikroskopia elektronowa jest metodą wyboru do lokalizacji białka na poziomie sub-Golgiego. Jednak technika i przyrząd wykraczają poza możliwości większości laboratoriów biologii komórkowej. Opisujemy tutaj naszą niedawno opracowaną metodę superrozdzielczości zwaną lokalizacją białek Golgiego za pomocą centrów masy obrazowania (GLIM), mającej na celu systematyczną i ilościową lokalizację białka Golgiego. GLIM opiera się na standardowych protokołach znakowania fluorescencyjnego oraz konwencjonalnych mikroskopach szerokokątnych lub konfokalnych. Obejmuje kalibrację aberracji przesunięcia chromatycznego układu mikroskopowego, akwizycję obrazu oraz analizę po akwizycji. Sub-Golgiego lokalizacja białka testowego wyraża się ilościowo jako iloraz lokalizacji. Istnieją cztery główne zalety GLIM; jest szybki, oparty na konwencjonalnych metodach i narzędziach, wynik lokalizacji jest ilościowy, a w praktyce zapewnia rozdzielczość ~ 30 nm wzdłuż osi Golgiego. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół GLIM do lokalizacji testowego białka Golgiego.

Nowoczesny mikroskop świetlny klasy badawczej wyposażony w soczewkę planową apochromatyczną, taki jak ten używany w naszym laboratorium, wykazuje minimalne aberrację chromatyczną (Rysunek 2A). Jednak dokładna analiza wielokolorowego obrazu fluorescencyjnego koralika może ujawnić przesunięcia różnych kolorów tego samego koralika (Rysunek 2B). Definiujemy, że czerwony kanał jest wolny od aberracji ...

Precyzyjna lokalizacja mieszkańców Golgi jest kluczowa dla zrozumienia funkcji komórkowych Golgiego. Jednak konwencjonalna mikroskopia optyczna nie jest w stanie rozstrzygnąć struktury sub-Golgiego. Tutaj opisujemy protokół dla konwencjonalnej metody superrozdzielczości opartej na mikroskopii, mającej na celu ilościowe określenie sub-Golgiego lokalizacji białka.

Ilościowa lokalizacja białka Golgiego poprzez obrazowanie jego centrum masy fluorescencyjnej

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

Głównym celem tej metody obrazowania jest ilościowe zlokalizowanie białka Golgiego w rozdzielczości nanometrów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu aparatu Golgiego, takie jak organizacja aparatu Golgiego i jego działanie. Główną zaletą tej metody jest wykorzystanie konwencjonalnego mikroskopu świetlnego oraz narzędzi programowych.Na początek hoduj komórki HeLa w kolbie T25 w DMEM z dodatkiem 10% FBS i inkubuj hodowlę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną około 80% współbycia, aspiruj pożywkę hodowlową i dodaj do kolby jeden mililitr 25% trypsyny EDTA. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.Wyjmij komórki z inkubatora i dodaj jeden mililitr kompletnego nośnika, aby delikatnie przepłukać komórki ze ścianki kolby. Przenieś odłączone komórki do sterylnej rurki wirującej i obróć ją z mocą 500 g przez dwie minuty, aby rozpylić komórki. Po aspiracji supernatantu użyj jednego mililitra kompletnego medium do zawieszenia pelletu komórkowego.Usuń podłoże z dołku z płyty z 24 dołkami zawierającą sterylną szklaną pokrywę i zasiej około 100 000 komórek do dołku. Użyj pełnego medium, aby uzupełnić objętość studni do 5 mililitrów. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla.Gdy komórki osiągną 80% konfluencję, należy użyć 80 nanogramów GalT-mCherry oraz 320 nanogramów plazmidowego DNA TPST1-EGFP oraz odczynnika transfekcyjnego, aby transfekować komórki zgodnie z protokołem producenta. Po inkubacji komórek przez cztery do sześciu godzin zmień podłoże i przełóż je z powrotem do inkubatora na 12 godzin. Aspiruj podłoże w dołku i dodaj 5 mililitrów pełnokrwistego nośnika Nocodazolu zawierającego 33 mikroformy, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny.Po wyczyszczeniu szkiełowych pokryw zgodnie z protokołem tekstowym, użyj jednego razu PBS zawierającego 1 mikrogram na mikrolitr BSA, aby rozcieńczyć 110-nanometrowe wielokolorowe fluorescencyjne kulki 80-krotnie. Krótko przewij rurę, aby rozproszyć kruszywa kulek. Używając końcówki pipety, rozłóż 60 mikrolitrów rozcieńczonych kulek na czystą pokrywę.W ciemności umieść pokrywkę w misce o średnicy 35 mm i przykryj ją folią aluminiową. Susz pokrywę w ciemności w osuszacu podłączonym do pompy próżniowej. Następnie użyj 50 mikrolitrów medium montażowego, aby zamontować pokrywę na szklanym szkiełku.Prawidłowo czyste pokrywy są niezbędne, aby wyeliminować fluorescencyjne zanieczyszczenia. Aby zobrazować wielokolorowe kulki w zielonym, czerwonym i dalekim czerwonym kanale, na początku sesji zdjęciowej należy uzyskiwać stosy 3D obrazów, wykonując trzy sekcje powyżej i poniżej najlepszej płaszczyzny ogniskowej. Zapisz stosy jako pliki TIFF.Aby obrazować mini-stosy golgiego, użyj TPST1-EGFP i GalT-mCherry transfekowanych na fluorescencyjnych preparatach, aby znaleźć komórki wyrażające TPST1-EGFP oraz niskopoziomowy lub średni poziom GalT-mCherry. Zdobądź stosy obrazów 3D, jak właśnie pokazano. Aby przeanalizować obrazy, otwórz obraz J, wybierz Plik, Obraz, Otwórz , aby otworzyć zestaw obrazów koralików składający się z trzech plików TIFF.Wybierz Obraz, Stosy, Projekt Z, aby uśrednić trzy kolejne sekcje wokół najlepiej ostrej sekcji w czerwonym kanale. Wprowadź liczbę sekcji początkowej i stopowej i spośród opcji typu projekcji wybierz średnią intensywność. Narysuj ROI w tle, które nie zawierają koralików na obrazie.Następnie w Analize, Set Measurements sprawdź tylko średnią wartość szarości i odchylenie standardowe (SD). Wykonaj Analizuj, Mierz, aby uzyskać tło średniej intensywności i odchylenia standardowego. Wybierz Proces, Matematyka, Odjęcie, aby odejmować obraz o odpowiadających wartościach średniej intensywności tła plus sześciokrotności odchylenia standardowego. Następnie wprowadź obliczoną wartość odpowiadającą temu kanałowi.Powtórz uśrednianie i odejmowanie dla stosów obrazów zielonych i czerwonych kanałów, używając tego samego fragmentu startu i stop oraz tego samego zwrotu z inwestycji w tle. Połącz trzy przetworzone obrazy za pomocą kanałów Obraz, Kolor, Połączenie, wybierając kanał R jako czerwony, kanał G jako zielony, a kanał B jako niebieski. Uruchom Menedżera ROI, wybierając Analizuj, Narzędzia, Menedżer ROI.Narysuj kwadratowe zwroty z inwestycji wokół pojedynczych koralików. Następnie dodaj ROI do menedżera ROI, naciskając T na klawiaturze. W sekcji Analizuj, Ustali pomiary, sprawdź tylko środek masy.W Menedżerze ROI wybierz kanał R i kliknij Mierz, aby uzyskać współrzędne X i Y centrów ROI w oknie wyników. Skopiuj i wklej te dwie kolumny do arkusza kalkulacyjnego. Uzyskaj współrzędne środkow ROI dla kanału G i kanału B. Zapisz arkusz kalkulacyjny jako beads.csv.Na obrazie J użyj wtyczek instalowanych do instalacji dwóch makr, makro golgiego inspekcji zwrotu z inwestycji i makra do wyprowadzenia danych z trzech kanałów. Czyść okno ROI Manager i wyników. Otwórz zestaw obrazów mini-stosu golgiego składających się z trzech plików TIFF.Generuj obrazy z odejmowaniem tła, jak pokazano wcześniej w tym filmie, do późniejszego wykorzystania. Następnie zduplikuj obrazy. W sekcji Proces, Kalkulator obrazów, dodaj tło odejmowane z kanału G, kanału R oraz obrazu z kanału B.Aby uzyskać obraz w sekcji Obraz, Dostosuj, Próg, wybierz Ustaw na wprowadzenie jednego jako najniższy poziom progowy. W sekcji Analizuj, Analizuj cząstki wpisz zakres rozmiarów piksela. Wprowadź 50 do nieskończoności, sprawdź wykluczenia na krawędziach i dodaj do menedżera.Następnie użyj kanałów Obraz, Kolor, Połączenie, aby połączyć trzy wcześniej wygenerowane obrazy z odjęciem tła, wybierając kanał R jako czerwony, kanał G jako zielony i kanał B jako niebieski. Następnie uruchom makro macro Golgi inspekcję ROI, wybierając Wtyczki, Makro, Golgi ROI Inspection. Ważne jest, aby wybrać jak najwięcej ROI, które zawierają pojedyncze mini-stacki golgiego w zestawie obrazów.W sekcji Analizuj, Ustali pomiary, sprawdź tylko powierzchnię, średnią wartość szarości i środek masy. Uzyskaj dane, uruchamiając narzędzie makro, które wypisuje dane z trzech kanałów. Przepisz współrzędne ośrodków do arkusza kalkulacyjnego w kolejności podanej tutaj.Następnie zapisz arkusz kalkulacyjny jako ministacks.csv. Przechodzimy do korekty przesunięcia chromatycznego centrów oraz obliczania ilorazu lokalizacji lub LQ zgodnie z protokołem tekstowym. Nowoczesny mikroskop świetlny klasy badawczej wyposażony w zwykłą soczewkę apochromatyczną, taki jak ten używany tutaj, wykazuje minimalne przesunięcie chromatyczne.Jednak dokładne przyjrzenie się wielokolorowemu obrazowi koralika ujawnia to. Centra czerwonej fluorescencji definiuje się jako rzeczywiste pozycje kulek. Względne przesunięcia chromatyczne fluorescencji zielonej i dalekoczerwonej można przedstawić za pomocą wektorów.Przesunięcie chromatyczne w obrębie płaszczyzny obrazowania ilustrowane jest przez zielony i niebieski wektor dla każdego koralika. Jak pokazano tutaj, korekcja przesunięcia chromatycznego znacząco zmniejsza przesunięcie chromatyczne. W komórkach ssaków kompleks Golgiego skupia się w okolicy jądrowej, co zwykle nie jest rozróżnialne pod konwencjonalnym mikroskopem optycznym.Po leczeniu Nocodazolem kompleks okojądrowy Golgiego znika, a dziesiątki mini-stacków Golgiego gromadzą się w miejscach wyjścia siatkówki endoplazmatycznej w cytoplazmie. Przykładowy obraz wygenerowany na podstawie analizy przedstawionej w tym filmie jest przedstawiony tutaj. Za pomocą narzędzia do inspekcji zwrotu z inwestycji makro golgi wymieniano 40 mini-stacków golgiego.Po zastosowaniu trzech kryteriów analizowano 21 mini-stosów Golgiego do obliczenia LQ TPST1-EGFP. Po opanowaniu techniki można ją wykonać w ciągu godziny po oznakowaniu fluorescencji. Po opracowaniu metoda ta utorowała drogę badaczom badającym aparat Golgiego do ilościowego lokalizowania białka Golgiego z rozdzielczością równą mikroskopii immunoelektronowej.

quantitative-localization-golgi-protein-imaging-its-center

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Tutaj opracowano nowatorski ilościowy test fluorescencyjny do pomiaru zmian poziomu białka szczególnie w centrosomach poprzez normalizację intensywności fluorescencji tego białka do odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania jednego lub więcej białek plazmy i/lub błony wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii superrozdzielczej GSD (Ground State Depletion) w komórkach ssaków. W tym miejscu omawiamy korzyści i rozważania dotyczące stosowania takich podejść do wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych.

Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

SUMO to niezbędne i wysoce konserwatywne, małe białko modyfikujące podobne do ubikwityny. W tym protokole opisujemy zastosowanie odpornego na stres rekombinowanego białka pułapkującego SUMO (kmUTAG) do wizualizacji natywnych, nieoznakowanych koniugatów SUMO i ich lokalizacji w różnych typach komórek.

Lokalizacja białek modyfikowanych SUMO za pomocą fluorescencyjnych białek pułapkujących sumo

Ten protokół opisuje różne metody, które mogą pomóc w badaniu biologii ATG9A, w tym immunofluorescencję, po której następuje analiza obrazu, rozważania dotyczące przejściowej nadekspresji i badanie statusu glikozylacji ATG9A za pomocą western blot.

Obrazowanie ATG9A, wielozakresowego białka błonowego

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół obrazowania i kwantyfikacji czasu trwania mitozy w żywych komórkach ssaków hodowlanych po transfekcji siRNA.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Poznaj metodę ilościowej lokalizacji białek Golgiego z rozdzielczością nanometryczną przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej i komórek HeLa. Technika ta pozwala badaczom analizować organizację aparatu Golgiego.

Ilościowa lokalizacja białka Golgiego poprzez obrazowanie jego centrum masy fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów