Ilościowa lokalizacja białka Golgiego poprzez obrazowanie jego centrum masy fluorescencyjnej

Głównym celem tej metody obrazowania jest ilościowe zlokalizowanie białka Golgiego w rozdzielczości nanometrów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu aparatu Golgiego, takie jak organizacja aparatu Golgiego i jego działanie. Główną zaletą tej metody jest wykorzystanie konwencjonalnego mikroskopu świetlnego oraz narzędzi programowych.

Na początek hoduj komórki HeLa w kolbie T25 w DMEM z dodatkiem 10% FBS i inkubuj hodowlę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną około 80% współbycia, aspiruj pożywkę hodowlową i dodaj do kolby jeden mililitr 25% trypsyny EDTA. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Wyjmij komórki z inkubatora i dodaj jeden mililitr kompletnego nośnika, aby delikatnie przepłukać komórki ze ścianki kolby. Przenieś odłączone komórki do sterylnej rurki wirującej i obróć ją z mocą 500 g przez dwie minuty, aby rozpylić komórki. Po aspiracji supernatantu użyj jednego mililitra kompletnego medium do zawieszenia pelletu komórkowego.

Usuń podłoże z dołku z płyty z 24 dołkami zawierającą sterylną szklaną pokrywę i zasiej około 100 000 komórek do dołku. Użyj pełnego medium, aby uzupełnić objętość studni do 5 mililitrów. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla.

Gdy komórki osiągną 80% konfluencję, należy użyć 80 nanogramów GalT-mCherry oraz 320 nanogramów plazmidowego DNA TPST1-EGFP oraz odczynnika transfekcyjnego, aby transfekować komórki zgodnie z protokołem producenta. Po inkubacji komórek przez cztery do sześciu godzin zmień podłoże i przełóż je z powrotem do inkubatora na 12 godzin. Aspiruj podłoże w dołku i dodaj 5 mililitrów pełnokrwistego nośnika Nocodazolu zawierającego 33 mikroformy, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny.

Po wyczyszczeniu szkiełowych pokryw zgodnie z protokołem tekstowym, użyj jednego razu PBS zawierającego 1 mikrogram na mikrolitr BSA, aby rozcieńczyć 110-nanometrowe wielokolorowe fluorescencyjne kulki 80-krotnie. Krótko przewij rurę, aby rozproszyć kruszywa kulek. Używając końcówki pipety, rozłóż 60 mikrolitrów rozcieńczonych kulek na czystą pokrywę.

W ciemności umieść pokrywkę w misce o średnicy 35 mm i przykryj ją folią aluminiową. Susz pokrywę w ciemności w osuszacu podłączonym do pompy próżniowej. Następnie użyj 50 mikrolitrów medium montażowego, aby zamontować pokrywę na szklanym szkiełku.

Prawidłowo czyste pokrywy są niezbędne, aby wyeliminować fluorescencyjne zanieczyszczenia. Aby zobrazować wielokolorowe kulki w zielonym, czerwonym i dalekim czerwonym kanale, na początku sesji zdjęciowej należy uzyskiwać stosy 3D obrazów, wykonując trzy sekcje powyżej i poniżej najlepszej płaszczyzny ogniskowej. Zapisz stosy jako pliki TIFF.

Aby obrazować mini-stosy golgiego, użyj TPST1-EGFP i GalT-mCherry transfekowanych na fluorescencyjnych preparatach, aby znaleźć komórki wyrażające TPST1-EGFP oraz niskopoziomowy lub średni poziom GalT-mCherry. Zdobądź stosy obrazów 3D, jak właśnie pokazano. Aby przeanalizować obrazy, otwórz obraz J, wybierz Plik, Obraz, Otwórz , aby otworzyć zestaw obrazów koralików składający się z trzech plików TIFF.

Wybierz Obraz, Stosy, Projekt Z, aby uśrednić trzy kolejne sekcje wokół najlepiej ostrej sekcji w czerwonym kanale. Wprowadź liczbę sekcji początkowej i stopowej i spośród opcji typu projekcji wybierz średnią intensywność. Narysuj ROI w tle, które nie zawierają koralików na obrazie.

Następnie w Analize, Set Measurements sprawdź tylko średnią wartość szarości i odchylenie standardowe (SD). Wykonaj Analizuj, Mierz, aby uzyskać tło średniej intensywności i odchylenia standardowego. Wybierz Proces, Matematyka, Odjęcie, aby odejmować obraz o odpowiadających wartościach średniej intensywności tła plus sześciokrotności odchylenia standardowego. Następnie wprowadź obliczoną wartość odpowiadającą temu kanałowi.

Powtórz uśrednianie i odejmowanie dla stosów obrazów zielonych i czerwonych kanałów, używając tego samego fragmentu startu i stop oraz tego samego zwrotu z inwestycji w tle. Połącz trzy przetworzone obrazy za pomocą kanałów Obraz, Kolor, Połączenie, wybierając kanał R jako czerwony, kanał G jako zielony, a kanał B jako niebieski. Uruchom Menedżera ROI, wybierając Analizuj, Narzędzia, Menedżer ROI.

Narysuj kwadratowe zwroty z inwestycji wokół pojedynczych koralików. Następnie dodaj ROI do menedżera ROI, naciskając T na klawiaturze. W sekcji Analizuj, Ustali pomiary, sprawdź tylko środek masy.

W Menedżerze ROI wybierz kanał R i kliknij Mierz, aby uzyskać współrzędne X i Y centrów ROI w oknie wyników. Skopiuj i wklej te dwie kolumny do arkusza kalkulacyjnego. Uzyskaj współrzędne środkow ROI dla kanału G i kanału B. Zapisz arkusz kalkulacyjny jako beads.csv.

Na obrazie J użyj wtyczek instalowanych do instalacji dwóch makr, makro golgiego inspekcji zwrotu z inwestycji i makra do wyprowadzenia danych z trzech kanałów. Czyść okno ROI Manager i wyników. Otwórz zestaw obrazów mini-stosu golgiego składających się z trzech plików TIFF.

Generuj obrazy z odejmowaniem tła, jak pokazano wcześniej w tym filmie, do późniejszego wykorzystania. Następnie zduplikuj obrazy. W sekcji Proces, Kalkulator obrazów, dodaj tło odejmowane z kanału G, kanału R oraz obrazu z kanału B.

Aby uzyskać obraz w sekcji Obraz, Dostosuj, Próg, wybierz Ustaw na wprowadzenie jednego jako najniższy poziom progowy. W sekcji Analizuj, Analizuj cząstki wpisz zakres rozmiarów piksela. Wprowadź 50 do nieskończoności, sprawdź wykluczenia na krawędziach i dodaj do menedżera.

Następnie użyj kanałów Obraz, Kolor, Połączenie, aby połączyć trzy wcześniej wygenerowane obrazy z odjęciem tła, wybierając kanał R jako czerwony, kanał G jako zielony i kanał B jako niebieski. Następnie uruchom makro macro Golgi inspekcję ROI, wybierając Wtyczki, Makro, Golgi ROI Inspection. Ważne jest, aby wybrać jak najwięcej ROI, które zawierają pojedyncze mini-stacki golgiego w zestawie obrazów.

W sekcji Analizuj, Ustali pomiary, sprawdź tylko powierzchnię, średnią wartość szarości i środek masy. Uzyskaj dane, uruchamiając narzędzie makro, które wypisuje dane z trzech kanałów. Przepisz współrzędne ośrodków do arkusza kalkulacyjnego w kolejności podanej tutaj.

Następnie zapisz arkusz kalkulacyjny jako ministacks.csv. Przechodzimy do korekty przesunięcia chromatycznego centrów oraz obliczania ilorazu lokalizacji lub LQ zgodnie z protokołem tekstowym. Nowoczesny mikroskop świetlny klasy badawczej wyposażony w zwykłą soczewkę apochromatyczną, taki jak ten używany tutaj, wykazuje minimalne przesunięcie chromatyczne.

Jednak dokładne przyjrzenie się wielokolorowemu obrazowi koralika ujawnia to. Centra czerwonej fluorescencji definiuje się jako rzeczywiste pozycje kulek. Względne przesunięcia chromatyczne fluorescencji zielonej i dalekoczerwonej można przedstawić za pomocą wektorów.

Przesunięcie chromatyczne w obrębie płaszczyzny obrazowania ilustrowane jest przez zielony i niebieski wektor dla każdego koralika. Jak pokazano tutaj, korekcja przesunięcia chromatycznego znacząco zmniejsza przesunięcie chromatyczne. W komórkach ssaków kompleks Golgiego skupia się w okolicy jądrowej, co zwykle nie jest rozróżnialne pod konwencjonalnym mikroskopem optycznym.

Po leczeniu Nocodazolem kompleks okojądrowy Golgiego znika, a dziesiątki mini-stacków Golgiego gromadzą się w miejscach wyjścia siatkówki endoplazmatycznej w cytoplazmie. Przykładowy obraz wygenerowany na podstawie analizy przedstawionej w tym filmie jest przedstawiony tutaj. Za pomocą narzędzia do inspekcji zwrotu z inwestycji makro golgi wymieniano 40 mini-stacków golgiego.

Po zastosowaniu trzech kryteriów analizowano 21 mini-stosów Golgiego do obliczenia LQ TPST1-EGFP. Po opanowaniu techniki można ją wykonać w ciągu godziny po oznakowaniu fluorescencji. Po opracowaniu metoda ta utorowała drogę badaczom badającym aparat Golgiego do ilościowego lokalizowania białka Golgiego z rozdzielczością równą mikroskopii immunoelektronowej.