Name: Wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów T w superrozdzielczości przy użyciu madSTORM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę madSTORM do wysoce multipleksowanego obrazowania limfocytów T w superrozdzielczości. Technika ta umożliwia wizualizację wielu białek w aktywowanych komórkach T z rozdzielczością pojedynczych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Xufeng Wu za dostęp do mikroskopu STORM. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program Centrum Badań nad Rakiem National Cancer Institute (NCI) oraz National Heart, Lung and Blood Institute (NHLBI).

Uwaga: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Kilka substancji chemicznych użytych w tym protokole jest toksycznych i rakotwórczych. Podczas wykonywania protokołu należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, w tym stosowanie kontroli technicznych (wyciąg, komora podręczna) i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, spodnie na całej długości, buty z zakrytymi palcami).
1. Multipleksowane obrazowanie aktywowanych limfocytów T
<ol>
	<li>Bezpośrednio sprzężone przeciwciała z barwnikiem Alexa-647 (A647) za pomocą zestawu do znakowania przeciwciał Alexa 647. Postępuj zgodnie z protokołem etykietowania dostarczonym przez producenta. 
	UWAGA: Przed tym krokiem zaleca się dializę roztworu przeciwciał w 1x PBS w celu zwiększenia skuteczności znakowania przeciwciał.</li>
	<li>Wiruj znakowane przeciwciała przez 5 minut w temperaturze 20 800 rcf i zbierz supernatant w celu usunięcia zagregowanych przeciwciał.</li>
	<li>Przygotowanie fluorescencyjnych szkiełek nakrywkowych pokrytych nanodiamentami
	<ol>
		<li>Pokryj 8-dołkowe komory nakrywkowe (patrz lista odczynników/materiałów) 250 μl 0,01% poli-L-lizyny (PLL) przez 15 minut, aspirować i suszyć w temperaturze 65 °C przez 30 minut. (bez spłukiwania przed suszeniem).</li>
		<li>Przygotować rozcieńczenie 100 nm FND w 1x PBS. Przetestuj różne rozcieńczenia, aby upewnić się, że w każdym polu widzenia widoczna jest wystarczająca ilość FND w kroku 1.2.7 (używamy rozcieńczenia FND 1:200 dostarczonego przez producenta).</li>
		<li>Wirować rozcieńczone FND przez 1 minutę.</li>
		<li>Sonikować supernatant FND przez 30 s przy ustawieniu wysokiej mocy.</li>
		<li>Inkubować sonikowany supernatant FND w 8-dołkowej komorze nakrywkowej pokrytej PLL przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj 5x za pomocą 1x PBS i uwidocznij komorę pokrytą FND za pomocą wzbudzenia laserowego 647 nm na mikroskopie TIRF. Idealnie byłoby, gdyby 4-10 pojedynczych FND było widocznych w polu widzenia, biorąc pod uwagę odpowiednie rozcieńczenie FND w kroku 1.2.2 (używamy obiektywu 100X z ustawieniem pikseli kamery 256 x 256, aby uzyskać pole widzenia 61 x 61 μm), z co najmniej jednym FND obecnym w każdym kwadrancie pola obrazowania. Jeśli FND wydają się być zgrupowane (tj. FND o znacznie wyższym sygnale niż otaczające FND i funkcji rozproszenia punktowego większej niż 200 nm), odwirować FND przy 6,800 rcf przez 1 minutę i powtórzyć procedurę powlekania przy użyciu supernatantu FND.</li>
		<li>Dodać 250 μl przeciwciała anty-CD3 (10 μg/ml) do każdego dołka i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usuń roztwór i dodaj 1x PBS na 30 sek. Powtórz ten krok prania 5 razy (umyj 5x).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja limfocytów T Jurkat
	<ol>
		<li>Wirować 1 ml limfocytów T Jurkat w temperaturze 800 rcf przez 6 minut i ponownie zawiesić w 300 μl 1x roztwór HBS. Limfocyty T Jurkata powinny mieć stężenie 0,5-1,0 x 106 komórek/ml przed wirowaniem. 1x roztwór HBS składa się z buforu soli fizjologicznej HEPES z 1% albuminą surowicy bydlęcej, jak opisano wcześniej22.</li>
		<li>Dodać 150 μl 1x roztworu HBS do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać 50 μl zawieszonych limfocytów T Jurkat do każdego dołka i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 300 μl 4% paraformaldehydu do każdego dołka i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umyć 3x za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Przepuszczalność komórek przez dodanie 250 μl 0,1% roztworu Triton-X przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć 3x za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Dodaj 250 μl 1% roztworu żelatyny rybnej w 1x PBS do każdego dołka przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć 3x za pomocą 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie aktywowanych limfocytów T Jurkat za pomocą madSTORM
	<ol>
		<li>Dodaj 200 μl znakowanego przeciwciała w stężeniu 0,1-0,5 μg/ml do utrwalonych komórek przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj 5x z 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu STORM i przykryć komorę szklanym szkiełkiem nakrywkowym, aby ograniczyć kontakt z powietrzem. Bufor STORM został opisany wcześniej10. Zalecamy utworzenie nowego bufora STORM dla każdej rundy obrazowania i obracanie bufora STORM na 20 800 rcf przez 2 minuty w celu usunięcia osadów.</li>
		<li>Używając niskiej mocy lasera 647 nm w trybie TIRF, zlokalizuj wybarwioną komórkę z co najmniej 3 FND w polu view. Aby pomóc w zlokalizowaniu FND, można zastosować jednoczesne wzbudzenie laserem 568 nm w celu zwiększenia jasności sygnału FND. 
		UWAGA: Wydajność uśrednionej korekty referencyjnej opisanej w sekcji 2.1 poprawia się wraz z włączeniem większej liczby FND.</li>
		<li>Zwiększ moc lasera 647 nm i uzyskuj obrazy. Zazwyczaj uzyskujemy 10 000 klatek przy ekspozycji 200 ms, laser 125 mW 647 nm, soczewkę obiektywu TIRF 100X (1,49 NA), 100-krotne wzmocnienie EM (5 MHz przy 16 bitach, wzmocnienie konwersji 1). Szczegóły dotyczące naszej konfiguracji obrazowania zostały opisane wcześniej10.</li>
		<li>Umyj 5x z 1x TBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu elucyjnego (3,5 M MgCl2, 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min.</li>
		<li>Powtórz elucję 3 razy. (dokładne warunki elucji i liczba płukań elucyjnych potrzebnych do usunięcia sygnału muszą być sprawdzone dla każdego użytego przeciwciała).</li>
		<li>Przemyć 3x z 1x TBS i dodać 1 ml 1x PBS.</li>
		<li>Fotowybielacz za pomocą lasera 647 nm o dużej mocy (125 mW) z laserem o długości fali 405 nm o mocy 2-5 mW do fotoaktywacji barwników A647 w stanie ciemnym. Poczekaj, aż cały pozostały sygnał z nieeluowanego przeciwciała zostanie fotowybielany. Zazwyczaj zajmuje to 2-5 sekund ekspozycji na laser. Pobieranie przykładowych obrazów (~100 klatek) przy użyciu ustawień STORM w wersji 1.3.5 po elucji i fotowybielaniu jest zalecane w celu potwierdzenia usunięcia signal. 
		Zazwyczaj usuwamy 99,8% sygnału za pomocą tej metody. Zalecamy przetestowanie skuteczności elucji każdego przeciwciała przed użyciem w madSTORM, jak pokazano wcześniej10.</li>
		<li>Dodaj 250 μl 4% paraformaldehydu przez 15 min. Zapobiega to odwrotnemu sieciowaniu utrwalonych cząsteczek w komórce.</li>
		<li>Umyć 3x za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.3.1-1.3.12, aby sekwencyjnie etykietować wiele celów. Rysunek 1 przedstawia złożony obraz wielu cząsteczek w aktywowanym limfocytie T Jurkat uzyskany za pomocą madSTORM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Korekcja dryfu i wyrównanie multipleksowanych stosów obrazów
<ol>
	<li>Korekcja dryfu stosów obrazów madSTORM
	<ol>
		<li>Otwórz obrazy za pomocą ImageJ. Zalecamy konwersję plików graficznych do formatu TIFF przed otwarciem w ImageJ. Użyj prostokąta ROI, aby wybrać pojedynczy FND. Odtwórz film poklatkowy, aby upewnić się, że FND jest widoczny w każdej klatce stosu obrazów. Użyj opcji Uruchom analizę we wtyczce ThunderSTORM, aby zlokalizować FND. Dla metody uśrednionej korekcji odniesienia opisanej w ppkt 2.1.5 ważne jest, aby w każdej klatce obrazu zlokalizowany był pojedynczy FND (tj. liczba zidentyfikowanych pików powinna być równa liczbie klatek).</li>
		<li>Jeśli FND nie jest identyfikowany w każdej klatce, wybierz inny FND. Jeśli w jednej klatce znajduje się wiele pików, usuń szczyt, który najbardziej odbiega od poprzednich szczytów.</li>
		<li>Powtórz 2.1.2 dla każdego FND w stosie obrazów. Należy pamiętać, że niektóre FND nie powinny być uwzględniane w procesie korekcji dryftu, aby mogły służyć jako niezależny miernik precyzji korekcji dryftu, jak opisano w kroku 2.1.7.</li>
		<li>Aby uzyskać szybszą, mniej precyzyjną korekcję dryfu, użyj algorytmów korelacji krzyżowej lub korekcji odniesienia zawartych w ThunderSTORM, aby skorygować obrazy FND. Zazwyczaj używamy 100 przedziałów, 5 powiększeń i współczynnika wygładzania trajektorii 0,1 do korelacji krzyżowej i 10 maksymalnej odległości, współczynnika widoczności znacznika 0,1 min i współczynnika wygładzania trajektorii 0,01 do korekty odniesienia. Korelacja krzyżowa i korekta odniesienia dadzą plik korekcyjny, który można zastosować do innych FND w celu przetestowania precyzji korekcji dryftu.</li>
		<li>Aby uzyskać bardziej rygorystyczną i precyzyjną korektę dryfu, należy użyć algorytmu uśrednionej korekty odniesienia (AFC), jak opisano wcześniej10. Proces ten nie wymaga optymalizacji parametrów i daje wyższą precyzję lokalizacji niż przewiduje to algorytmy lokalizacji SMLM. Jednak uśredniona korekcja dryfu wymaga co najmniej 4 FND i aby FND były zlokalizowane w każdej klatce stosu obrazów. Korekcja dryftu AFC działa lepiej po włączeniu większej liczby FND, ponieważ duża liczba zlokalizowanych FND zmniejszy efekt zniekształceń wartości odstającej w danej klatce.</li>
		<li>Zlokalizuj wszystkie funkcje rozrzutu punktów w stosie obrazów za pomocą ThunderSTORM, jak opisano wcześniej10. Zazwyczaj używamy rozmiaru piksela 100 nm, fotoelektronów na liczbę A/D 4,28, liczby A/D na poziomie podstawowym 100, wzmocnienia EM 100, PSF: Zintegrowana lokalizacja Gaussa, promień dopasowania 5 pikseli, metoda dopasowania maksymalnego prawdopodobieństwa i początkowa sigma 1,3 piksela.</li>
		<li>Zastosuj współczynnik korekcji dryfu uzyskany z FND do lokalizacji z całego stosu obrazów. Sprawdź wzrokowo końcowy obraz, aby upewnić się, że korekcja dryfu jest prawidłowa (Rysunek 2). Uzyskany w ten sposób współczynnik korekcji dryftu powinien zostać poddany niezależnym badaniom na FND nieobjętych procedurą AFC w celu zmierzenia poziomu precyzji korekcji dryftu. Precyzja niezależnych FND z korekcją dryftu powinna być zbliżona do średniej wartości precyzji/niepewności obliczonej na podstawie algorytmu lokalizacji zastosowanego w kroku 2.1.6.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.1.1-2.1.7 dla stosów obrazów madSTORM sekwencyjnie znakowanych przeciwciał. Należy pamiętać, że lokalizacja tego samego zestawu FND w każdym stosie obrazów madSTORM ma kluczowe znaczenie dla poniższej procedury wyrównywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównanie obrazów madSTORM
	<ol>
		<li>Oblicz położenie środka ciężkości FND skorygowanych o dryf na każdym obrazie madSTORM. Aby to zrobić, znajdź średnie pozycje osi x i y dla każdego zlokalizowanego FND i uśrednij średnie pozycje x i y wszystkich FND na każdym obrazie madSTORM. Szczegółowy algorytm dla tego kroku został opisany wcześniej10. Wyrównywanie sekwencyjnych obrazów madSTORM przy użyciu pozycji środka ciężkości znaczników odniesienia FND. Aby wykonać wyrównanie, należy obliczyć przesunięcie między dwoma zlokalizowanymi obrazami madSTORM, odejmując położenie środka ciężkości FND na drugim obrazie madSTORM od pierwszego. Następnie odejmij wartość przesunięcia od wszystkich lokalizacji na drugim obrazie madSTORM.</li>
		<li>Zalecamy użycie pierwszego obrazu madSTORM jako obrazu referencyjnego i powtórzenie tego kroku wyrównania między pierwszym a trzecim, pierwszym i czwartym itd. Przetestuj precyzję wyrównania, mierząc przesunięcie między FND, które nie są uwzględnione w procesie wyrównywania. Duże przesunięcia mogą wskazywać, że przy obliczaniu pozycji środka ciężkości sekwencyjnych obrazów madSTORM użyto różnych zestawów FND.</li>
		<li>Jeśli tak, kroki 2.2.1-2.2.2 należy powtórzyć, używając tego samego zestawu FND do wykonania wyrównania. 
		UWAGA: Dostępne są niestandardowe kody zarówno dla procedury korekcji dryftu AFC, jak i wyrównywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Rieger, B., Stallinga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lateral+and+axial+localization+uncertainty+in+super-resolution+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy.</a> Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).</li>
<li>Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnanometre+single-molecule+localization%2C+registration+and+distance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements.</a> Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).</li>
<li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%3A+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((madSTORM%3A+a+superresolution+technique+for+large-scale+multiplexing+at+single-molecule+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+super-resolution+imaging+with+photo-switchable+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Erdelyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+chromatic+offset+in+multicolor+super-resolution+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy.</a> Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).</li>
<li>Gerdes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+single-cell+analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tomographic+super-resolution+fluorescence+imaging+of+serially+sectioned+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples.</a> PLoS One. 7 (5), e38098(2012).</li>
<li>Schubert, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+proteome+topology+and+function+by+automated+multidimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy.</a> Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).</li>
<li>Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk-free+multi-color+STORM+imaging+using+a+single+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore.</a> PLoS One. 9 (7), e101772(2014).</li>
<li>Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+superresolution+imaging+of+multiple+targets+using+a+single+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore.</a> PLoS One. 10 (4), e0123941(2015).</li>
<li>Hoebe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+light-exposure+microscopy+reduces+photobleaching+and+phototoxicity+in+fluorescence+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging.</a> Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).</li>
<li>Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multitarget+super-resolution+microscopy+with+high-density+labeling+by+exchangeable+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes.</a> Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).</li>
<li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li>
<li>Sarkar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+in+vivo+background+free+imaging+by+selective+magnetic+modulation+of+nanodiamond+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence.</a> Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Sekwencyjne procedury multipleksowania, korekcji dryfu i wyrównania w madSTORM umożliwiają precyzyjną, wysoce multipleksowaną wizualizację heterogenicznych struktur w komórkach. 10 Ponadto madSTORM pozwala uniknąć ograniczeń wielokolorowych barwników STORM, takich jak aberracja chromatyczna i nieoptymalne właściwości fotoprzełączania/emisji barwników innych niż dalekie czerwone 9,12. Ponieważ etap elucji znacznie zmniejsza interferencję st...

Opracowano różne techniki mikroskopii super-rozdzielczej, aby przezwyciężyć granicę dyfrakcji mikroskopii świetlnej (~200 nm). Wśród nich znajduje się kategoria technik zwanych mikroskopią lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM), która obejmuje mikroskopię lokalizacji fotoaktywacyjnej (PALM) i stochastyczną mikroskopię rekonstrukcji optycznej (STORM). Techniki SMLM polegają na wykorzystaniu fluoroforów, które można przełączać między stanami włączonymi (fluorescencyjnymi) i wyłączonymi (ciemnymi/przełączanymi foto), co pozwala na sekwencyjną lokalizację fluorescencji z pojedynczych cząsteczek1,2,3.
Ze względu na kompatybilność z dostępnymi na rynku barwnikami i mikroskopami, bezpośrednia STORM (dSTORM) stała się powszechnie stosowaną techniką SMLM4. dSTORM może rutynowo osiągnąć ~10 nm precyzję lokalizacji, zdefiniowaną jako niepewność w obliczeniach środka funkcji rozproszonego dyfrakcyjnie (PSF). Jednak pomimo wysokiej precyzji oszacowanej za pomocą algorytmów lokalizacji5,6,7, dokładne określenie rzeczywistej lokalizacji pojedynczych cząsteczek było utrudnione przez szereg problemów. Po pierwsze, mechaniczny ruch stolika mikroskopu podczas akwizycji obrazu zwiększa znaczną niepewność co do precyzji lokalizacji. Ponieważ obrazy SMLM są uzyskiwane w tysiącach klatek poklatkowych, ruchy stolika mikroskopu w skali nano mogą znacznie zagrozić precyzji końcowego obrazu o wysokiej rozdzielczości8. Aby skompensować ruch stołu montażowego podczas akwizycji obrazu, dryf etapu jest zwykle szacowany na podstawie dopasowania na podstawie regresji lokalizacji binowanych na podstawie samego obrazu (korelacja krzyżowa) lub lokalizacji sekwencyjnych na podstawie znaczników odniesienia (korekcja odniesienia)1,9. Metody te wymagają jednak optymalizacji wielu parametrów dla każdego stosu obrazów i nie mogą uwzględniać ruchów stołu montażowego w krótkich skalach czasowych, takich jak drgania mechaniczne. Nanocząstki złota i wielokolorowe kulki fluorescencyjne zostały użyte jako znaczniki odniesienia w SMLM, ale nie są one fotostabilne i skutkują znacznie niższą precyzją po korekcji dryfu niż fluorescencyjne nanodiamenty (FND) w centrum wakancji azotu stosowane w madSTORM10.
Oprócz limitu dyfrakcji, mikroskopia świetlna jest dodatkowo ograniczona przez limity spektralne. Jednoczesna wizualizacja wielu celów wymaga sond fluorescencyjnych o nienakładających się profilach spektralnych, co generalnie ogranicza mikroskopię świetlną opartą na fluorescencji do 6 kolorów, a SMLM do 2-3 kolorów4,11,12. Co więcej, nieliniowa aberracja chromatyczna powoduje niewspółosiowość obrazów wielokolorowych, które wymagają obszernych procedur wyrównywania przy użyciu wielokolorowych znaczników odniesienia8,13. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, poprzednie badania obrazowały wiele celów za pomocą powtarzającego się fotowybielania lub chemicznego gaszenia sekwencyjnie związanych fluoroforów14,15,16,17,18,19. Podczas gdy te metody mogą przezwyciężyć ograniczenia spektralne mikroskopii, bielenie fluorescencyjne jest znane jako proces toksyczny20, a długotrwałe wybielanie lub hartowanie może powodować niepożądane skutki uboczne, takie jak utrata sieciowania. Co więcej, nagromadzenie sond fluorescencyjnych może prowadzić do sterycznego blokowania miejsc wiązania w próbce, zapobiegając multipleksowaniu na dużą skalę i solidnemu celowaniu w epitopy. Aby uniknąć takich zakłóceń sterycznych, w niedawnym badaniu osiągnięto multipleksowanie za pomocą stochastycznej wymiany swobodnie dyfuzujących fragmentów białek21. Podczas gdy metoda ta pozwala na gęste znakowanie struktur komórkowych, wymaga rozległego przygotowania biochemicznego do wyizolowania fragmentów peptydów, nie może zlokalizować pozycji pojedynczych cząsteczek i nie ułatwia multipleksowania na dużą skalę przy użyciu dostępnych na rynku sond. Przedstawiamy szczegółowy protokół wideo opisujący sekwencyjne wiązanie i elucję przeciwciał fluorescencyjnych do multipleksowanego obrazowania dSTORM (madSTORM) o ograniczonej wielkości przeciwciał (madSTORM) oraz zastosowanie fluorescencyjnych nanodiamentów w celu uzyskania precyzyjnej korekcji dryfu i wyrównania.

<table><tbody><tr><td>8-dołkowa komora nakrywkowa</td><td>Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>0,1% roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>NV-100 nm Fluorescencyjny nano-diament</td><td>Adamas</td><td>Red FND</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD3 i epsilon; przeciwciało</td><td>BD Biosciences</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V</td><td>KSE Scientific</td><td>98-100P</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10% Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>15712</td><td>Rakotwórczość</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry ryb słodkowodnych</td> Zestaw do znakowania przeciwciał <td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Wysoce toksyczny, wrażliwy na powietrze</td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>cyklooktatetraen 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td>Wysoce toksyczny, wrażliwy na powietrze</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>KD Medyczny</td><td>RGF-3210</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>KD Medyczny</td><td>RGF-3385</td><td></td></tr></tbody></table>

wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów t w superrozdzielczości przy użyciu madstorm

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Obrazowanie heterogenicznych struktur komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek zostało utrudnione przez niewystarczającą precyzję lokalizacji i zdolność multipleksowania. Korzystając z fluorescencyjnych nano-diamentowych markerów odniesienia, opisujemy procedury korekcji dryfu i wyrównania wymagane do uzyskania wysokiej precyzji w mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Ponadto opisano nową strategię multipleksowania, madSTORM, w której wiele cząsteczek jest celowanych w tę samą komórkę za pomocą sekwencyjnego wiązania i elucji przeciwciał fluorescencyjnych. Projekt madSTORM zademonstrowano na aktywowanym limfocytie T w celu wizualizacji lokalizacji różnych składników w połączonej z błoną, wielobiałkowej strukturze zwanej mikroklastrem receptorów limfocytów T. Ponadto omówiono zastosowanie madSTORM jako ogólnego narzędzia do wizualizacji struktur wielobiałkowych.

Metodę sekwencyjnego eluowania i barwienia zastosowano do uzyskania obrazu multiplex madSTORM mikroklastrów oraz innych struktur w aktywowanej limfocycie T Jurkat (Rysunek 1, sprawdź dopasowanie ryciny). Każdy obraz w pseudokolorach reprezentuje jedną rundę obrazowania madSTORM przeprowadzoną w krokach od 1.1.1 do 1.3.13. Jak opisano wcześniej10, pole widzenia powinno być monitorowane pod kątem sygnału resztkowego z poprzednich, nieelu...

Demonstrujemy metodę obrazowania wielu cząsteczek w heterogenicznych nanostrukturach z dokładnością do pojedynczej cząsteczki, wykorzystując sekwencyjne wiązanie i elucję fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów T w superrozdzielczości przy użyciu madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu obrazowania jest wizualizacja wielu białek w aktywowanym limfocycie T przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie aktywacji limfocytów T, takie jak rozkład pojedynczych cząsteczek TCR lub składników mikroklastrów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na większy stopień multipleksowania niż osiągany za pomocą obecnych metod mikroskopii z nadzorowanym rozwiązaniem.W pierwszej kolejności należy bezpośrednio skoniugować przeciwciała z barwnikiem Alexa 647, używając zestawu do znakowania przeciwciał Alexa 647, zgodnie z protokołem znakowania dostarczonym przez producenta. Przeciwciała oznakowane należy odwirować przez pięć minut przy 20 800 ×g. Po wirowaniu należy zebrać nadsącz, aby usunąć zagregowane przeciwciała. Następnie komory z szkiełkami okrywnymi A12 należy pokryć 250 µL 0,1% poli-L-lizyny na 15 minut.Następnie odessać roztwór bez płukania i suszyć komory w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Przygotować rozcieńczenie 100 nm fluorescencyjnych nanodiamentów (FNDs) w PBS, testując różne stężenia, aby upewnić się, że w każdym polu widzenia

highly-multiplexed-super-resolution-imaging-of-t-cells-using-madstorm

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Opisujemy przygotowanie trzech próbek testowych i jak można je wykorzystać do optymalizacji i oceny wydajności mikroskopów STORM. Na tych przykładach pokazujemy, jak pozyskiwać surowe dane, a następnie przetwarzać je w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości w komórkach o rozdzielczości około 30-50 nm.

Próbki testowe do optymalizacji mikroskopii superrozdzielczej STORM

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Poznaj metodę madSTORM do wysoce multipleksowanego obrazowania limfocytów T w superrozdzielczości. Technika ta umożliwia wizualizację wielu białek w aktywowanych komórkach T z rozdzielczością pojedynczych cząsteczek.

Wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów T w superrozdzielczości przy użyciu madSTORM

Przeglądaj więcej filmów