Wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów T w superrozdzielczości przy użyciu madSTORM

Ogólnym celem niniejszego protokołu obrazowania jest wizualizacja wielu białek w aktywowanym limfocycie T przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie aktywacji limfocytów T, takie jak rozkład pojedynczych cząsteczek TCR lub składników mikroklastrów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na większy stopień multipleksowania niż osiągany za pomocą obecnych metod mikroskopii z nadzorowanym rozwiązaniem.

W pierwszej kolejności należy bezpośrednio skoniugować przeciwciała z barwnikiem Alexa 647, używając zestawu do znakowania przeciwciał Alexa 647, zgodnie z protokołem znakowania dostarczonym przez producenta. Przeciwciała oznakowane należy odwirować przez pięć minut przy 20 800 ×g. Po wirowaniu należy zebrać nadsącz, aby usunąć zagregowane przeciwciała. Następnie komory z szkiełkami okrywnymi A12 należy pokryć 250 µL 0,1% poli-L-lizyny na 15 minut.

Następnie odessać roztwór bez płukania i suszyć komory w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Przygotować rozcieńczenie 100 nm fluorescencyjnych nanodiamentów (FNDs) w PBS, testując różne stężenia, aby upewnić się, że w każdym polu widzenia będzie widoczna odpowiednia liczba FNDs. Mieszać rozcieńczone FNDs w wirówce typu vortex przez jedną minutę.

Następnie poddaj supernatant FND sonikacji przez 30 sekund przy wysokim ustawieniu mocy. Inkubuj sonikowany supernatant FND w komorze z laminką A12 pokrytą poli-L-lizyną przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po pięciokrotnym przemyciu komory roztworem 1x PBS, zwizualizuj komorę pokrytą FND, wykorzystując wzbudzenie laserem o długości fali 647 nanometrów na mikroskopie typu turf.

Użyj obiektywu 100x zapewniającego pole widzenia o wymiarach 61 na 61 mikronów. Przy odpowiednim rozcieńczeniu FND w polu widzenia powinno być widocznych od 4 do 10 pojedynczych FND, z co najmniej jednym FND w każdym kwadrancie pola obrazowania. Po osiągnięciu właściwej gęstości FND, dodaj 250 microliters przeciwciała anty-CD3 do każdego dołka.

Inkubować komorę przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C. Po inkubacji usunąć roztwór z dołków i dodać 1x PBS na 30 sekund. Powtórzyć ten etap płukania pięć razy.

Odwiruj jeden mililitr komórek T Jurkat przy 800 ×g przez sześć minut. Przed wirowaniem komórki T Jurkat powinny znajdować się idealnie w stężeniu od 0,5 do jednego miliona komórek na mililitr. Ponownie zawieś komórki w 300 µL roztworu 1x HBS.

W międzyczasie dodaj 150 µL roztworu 1x HBS do każdego dołka komory i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Następnie dodaj 50 µL resuspendowanych komórek T Jurkat do każdego dołka i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze 37 °C. W kolejnym kroku dodaj 300 µL 4% paraformaldehydu do każdego dołka i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

Po trzykrotnym przemyciu 1x PBS, przeprowadź permeabilizację komórek, dodając 250 µL 0,1% roztworu Triton x na pięć minut w temperaturze pokojowej. Po trzech kolejnych przemyciach 1x PBS, dodaj 250 µL 1% roztworu żelatyny rybiej do każdej studni na 30 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec przemyj komórki jeszcze trzy razy 1x PBS.

Do utrwalonych komórek dodać 200 µL znakowanego przeciwciała w stężeniu od 0,1 do 0,5 µg/mL i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po pięciokrotnym przemyciu komórek 1x PBS, dodać 1 mL buforu STORM i przykryć komorę szkiełkiem podstawowym, aby ograniczyć ekspozycję. Do utrzymania komory ze szkiełkiem w odpowiedniej pozycji na stoliku mikroskopu użyć zacisków.

Krok ten jest kluczowy dla wielkoskalowego multipleksowania, ponieważ po kilku rundach płukania i inkubacji w polu widzenia musi znajdować się ten sam obszar. Używając niskiej mocy lasera 647 nm w trybie turf, zlokalizuj w polu widzenia barwioną komórkę zawierającą co najmniej trzy FND. Zwiększ moc lasera 647 nm i wykonaj akwizycję obrazów.

Typowe parametry znajdują się w protokole tekstowym. Przemyj komórki pięciokrotnie 1x solą buforową z TRIS lub 1x TBS. Następnie dodaj jeden mililitr buforu elucyjnego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Powtórz elucję trzy razy. Zastosuj dokładnie takie warunki elucji oraz taką liczbę płukań elucyjnych, jakie są wymagane do usunięcia sygnału dla każdego przeciwciała. Następnie przemyj komórki trzy razy w 1x TBS i dodaj jeden mililitr 1x PBS.

Prawidłowe przeprowadzenie tego etapu elucji doprowadzi do usunięcia uprzednio związanych przeciwciał i zapewni wyższą wydajność w kolejnym etapie znakowania przeciwciał. Ważne jest stosowanie buforu TBS do przemywania, aby zminimalizować wytrącanie osadów pomiędzy etapami elucji. Należy poddać komórki fotowybielaniu za pomocą lasera 647 nm o wysokiej mocy, stosując jednocześnie laser 405 nm o mocy od 2 do 5 mW w celu fotoaktywacji barwników Alexa 647 znajdujących się w stanie ciemnym.

Należy poczekać, aż cały pozostały sygnał z nieeluowanego przeciwciała zostanie wybielony fotochemicznie. Zazwyczaj trwa to od dwóch do pięciu sekund ekspozycji laserowej. Należy pozyskać obrazy próbki, korzystając z ustawień STORM po elucji i wybieleniu fotochemicznym, aby potwierdzić usunięcie sygnału.

Następnie należy dodać 250 µL 4% paraformaldehydu na 15 minut. Zapobiega to odwrotnemu sieciowaniu utrwalonych cząsteczek w komórce. Komórki należy przemyć trzykrotnie 1x PBS.

Powtórz te kroki w celu sekwencyjnego znakowania wielu celów. Na koniec wykonaj korekcję dryftu i dopasowanie stosów obrazów multipleksowych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Metoda sekwencyjnej iluzji i stabilizacji (sequential illusion and standing method) została wykorzystana do uzyskania obrazu multipleksowego MET STORM mikroklastrów i innych struktur w aktywowanym limfocycie T Jurkat.

Końcowy obraz MET STORM został skorygowany pod kątem dryftu i wyrównania, przy użyciu średniej korekcji znaczników referencyjnych oraz markerów fiducjalnych FND. Przedstawiono tutaj obrazy z mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek pojedynczego FND zlokalizowanego w 30 000 klatkach obrazu przed i po korekcji dryftu za pomocą średniej korekcji znaczników referencyjnych. Analogicznie, tutaj znajdują się obrazy z mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek aktywowanej limfocyta T Jurkat, zabarwionej przeciwciałem przeciwko fosforylowanemu SLP76 i markerami fiducjalnymi FND, przed i po korekcji dryftu za pomocą średniej korekcji znaczników referencyjnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania multipleksowego obrazowania superrozdzielczego białek w aktywowanym limfocycie T przy użyciu metody MET STORM. Po opanowaniu techniki, każda runda multipleksowania może być zrealizowana w ciągu trzech godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu preparatu w tej samej pozycji na stoliku mikroskopu.

Można to wykonać za pomocą zacisków stolika. Należy pamiętać, że praca z naszym zmodyfikowanym buforem STORM może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak maski ochronne i gogle.