Zmodyfikowana analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych do ilościowego określania długości telomerów za pomocą hybrydyzacji w żelu

Ogólnym celem tej procedury jest określenie długości telomerów w komórkach eukariotycznych przy użyciu zmodyfikowanej wersji procedury analizy fragmentów restrykcyjnych telomerów, opisanej przez lekarzy Jerry'ego W. Shay'a, Woodringa Wrighta i współpracowników. Dostarczając danych na temat długości telomerów, procedura może odpowiedzieć na pytania dotyczące biologii komórki, medycyny behawioralnej, epidemiologii i chorób zakaźnych, wpływu wieku, stresu, leczenia farmakologicznego i infekcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona bezpośredni pomiar średniej długości telomerów w kilozasadach w różnych komórkach.

Próbki genomowego DNA, które miały być analizowane, zostały wyekstrahowane z komórek przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, jak opisano w protokole tekstowym. Przeprowadź trawienie genomowego DNA w końcowej objętości od 20 do 40 mikrolitrów. Połącz następujące elementy w każdej probówce do mikrowirówki: trzy mikrogramy genomowego DNA; 10x bufor do trawienia DNA; jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego Rsa1; jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego Hinf1; i sterylna, dejonizowana woda do końcowej objętości.

Odwirować na krótko, aby upewnić się, że wszystkie składniki znajdują się na dnie probówki. Inkubować procesy trawienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 16 godzin. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania 0,6% roztworu agarozy zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przygotuj system elektroforezy żelowej do odlewania żelowego. Przymocuj zasuwki końcowe do tacki do odlewania żelu. Gdy roztwór żelu agarozowego ostygnie do 50 stopni Celsjusza, wlej go do tacki do odlewania żelu, umieść stożek w żelu i pozwól żelowi stwardnieć przez 45 minut bez przykrycia w temperaturze pokojowej.

Zdejmij zasuwki końcowe z tacki odlewniczej i wyjmij grzebień z żelu. Napełnij system elektroforezy żelowej buforem do elektroforezy do linii napełniania, upewniając się, że żel jest całkowicie zanurzony w buforze. Załaduj dołki żelu próbkami DNA, pozostawiając pustą studzienkę między próbkami.

Dodaj 10 mikrolitrów drabinki DNA do studzienek na przeciwległych końcach żelu. Uruchom elektroforezę żelu przy napięciu 150 woltów przez 30 minut, aby szybko przenieść DNA do żelu. Po 30 minutach dostosuj napięcie do 57 woltów i pracuj przez 18 do 24 godzin.

Po upływie 18 do 24 godzin żelu wyłącz źródło elektroforezy i wyjmij tackę do odlewania żelu z żelem z bufora elektroforezy. Plasterek w prawym górnym rogu żelu, aby służył jako odniesienie do orientacji żelu. Wytnij kawałek bibuły filtracyjnej do rozmiaru nieco większego niż żel.

Umieść bibułę filtracyjną na wierzchu żelu w tacy odlewniczej i pozwól, aby bibuła wchłonęła nadmiar roztworu na żelu. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza między bibułą filtracyjną a żelem, używając pipety jako wałka, aby wycisnąć pęcherzyki przez boki. Usuń żel z tacki odlewniczej, odwracając żel i bibułę filtracyjną tak, aby papier znalazł się pod żelem.

Przenieś żel wraz z bibułą filtracyjną do suszarki do żelu i przykryj żel folią. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza między folią a żelem za pomocą pipety jako wałka. Suszyć żel w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Po wyschnięciu żelu usuń folię i przenieś żel oraz bibułę filtracyjną do szklanego naczynia zawierającego 250 mililitrów wody dejonizowanej. Ostrożnie usuń bibułę filtracyjną i inkubuj żel w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Połóż żel na nylonowej siatce o wymiarach 12 na 12 cali.

Zwiń ze sobą nylonową siatkę i żel, upewniając się, że żel nie styka się ze sobą. Umieść siatkę i żel w tubce do hybrydyzacji. Połącz 100 mililitrów 5x SSC i 12 mikrolitrów zielonego fluorescencyjnego barwienia kwasem nukleinowym i umieść w probówce hybrydyzacyjnej.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji z rotacją. Chronić roztwór przed światłem. Po 30 minutach usuń nylonową siatkę i żel z probówki hybrydyzacyjnej.

Rozwałkuj i umieść płasko w szklanym naczyniu zawierającym 250 mililitrów wody dejonizowanej. Delikatnie usuń nylonową siatkę. Zobrazuj żel za pomocą luminowizora ze wskazanymi ustawieniami.

Przygotować radioaktywną sondę telomerową zgodnie z przepisami zakładu dotyczącymi postępowania z radioaktywnością. W probówce mikrowirówki połącz następujące elementy: dwa mikrolitry sondy telomerowej; 2,5 mikrolitra 10x buforu reakcyjnego kinazy polinukleotydowej; trzy mikrolitry do ATP znakowanego na grupie fosforanowej gamma za pomocą P32; cztery mikrolitry kinazy polinukleotydowej T4; i wolna od DNaz, sterylna, dejonizowana woda do końcowej objętości 20 mikrolitrów. Krótko odwirować probówkę.

Inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Krótko odwirować probówkę i inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby zatrzymać reakcję. Załadować radioaktywny roztwór sondy do przygotowanej kolumny chromatograficznej G25 i wirować przez dwie minuty w temperaturze 700 razy g.

Zachowaj filtrat, który zawiera radioaktywną sondę telomerową. Umieść żel w szklanym naczyniu zawierającym 250 mililitrów roztworu denaturującego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór denaturujący i zastąp go 250 mililitrami sterylnej, dejonizowanej wody.

Inkubować przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej. Usuń wodę dejonizowaną. Zastąp 250 mililitrami roztworu neutralizacyjnego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Zwiń żel w nylonową siatkę i umieść w probówce do hybrydyzacji. Dodać 20 mililitrów roztworu hybrydyzacyjnego i inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 10 minut z rotacją. Po 10 minutach usuń roztwór hybrydyzacyjny i zastąp go 20 mililitrami świeżego roztworu hybrydyzacyjnego.

Dodać całą sondę telomerową i inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 42 stopni Celsjusza z rotacją przez noc. Po zakończeniu hybrydyzacji z sondą telomerową wyjmij żel i siatkę z probówki hybrydyzacyjnej i umieść w szklanym naczyniu zawierającym 250 mililitrów 2x SSC. Rozwiń i wyjmij nylonową siatkę z naczynia.

Umieść szklane naczynie na wytrząsarce orbitalnej i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń 2x SSC, zastąp 250 mililitrami 0,1x SSC plus 0,1% roztwór SDS i inkubuj przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór 0,1x SSC plus 0,1%SDS.

Zastąp 250 mililitrami 2x SSC i inkubuj przez kolejne 15 minut na wytrząsarce orbitalnej. Wyjmij żel z 2x SSC i zawiń żel w folię spożywczą. Usuń wszystkie pęcherzyki i kieszenie powietrzne między żelem a folią.

Umieść żel w kasecie ekspozycyjnej z ekranem luminoforowym i wystawiaj ekran luminoforowy na działanie żelu przez noc. Następnego dnia użyj imagera luminoforowego, aby zobrazować odsłonięty ekran luminoforowy. Obrazy luminoforowe są następnie wykorzystywane do ilościowego określania długości telomerów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przeanalizowano trzy stężenia DNA wyizolowane z unieśmiertelnionej linii komórkowej fibroblastów ludzkiego napletka i ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pod kątem długości telomerów. Ten luminoforowy obraz wysuszonego żelu agerose zabarwionego zielonym fluorescencyjnym barwnikiem kwasu nukleinowego pokazuje położenie pasm drabiny DNA na pasach pierwszym i ósmym. Odległość mierzona od górnej części żelu do każdego wzorca masy cząsteczkowej jest oznaczona niebieskimi strzałkami.

Po hybrydyzacji z sondą telomerów, pasma telomerów pojawiają się jako smugi na każdym pasie. Siatki składające się ze 150 pól zostały obliczone dla każdego pasa plus jeden pas tła. Pokazane są wybrane obszary analizy dla każdego zestawu próbek.

Dla każdego zestawu próbek wybrano oddzielne pasy tła oznaczone literą B, aby upewnić się, że intensywność tła jest podobna dla każdego zestawu próbek. Obliczenia średniej długości telomerów wykazały wyższą średnią długość telomerów w unieśmiertelnionej linii komórkowej niż w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Wyniki te pokazują również, że ilość genomowego DNA analizowanego na każdym torze ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wykrywalnego sygnału po hybrydyzacji.

Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu 12 godzin rozłożonych na 2 1/2 dnia, z dwiema nocnymi inkubacjami, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby użyć co najmniej trzech mikrogramów DNA dla każdej próbki i zmierzyć każdą próbkę w dwóch egzemplarzach. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się starzeniem się do zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za utrzymanie długości telomerów u różnych gatunków zwierząt, w tym u ludzi.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak bezpośrednio określić średnią długość samych telomerów. Nie zapominaj, że praca z radioaktywnością może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie fartuchów i rękawic laboratoryjnych.