Name: Zmodyfikowana analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych do ilościowego określania długości telomerów za pomocą hybrydyzacji w żelu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę TRF do pomiaru długości telomerów w komórkach eukariotycznych za pomocą hybrydyzacji in situ z radiolabelowaną sondą. Technika zapewnia bezpośredni pomiar w kilobazach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Instytutu Onkologii Biobehawioralnej Uniwersytetu w Pittsburghu, który jest częściowo wspierany przez P30CA047904 z nagrodami.

1. Ekstrakcja genomowego DNA
<ol>
	<li>Wykonaj ekstrakcję genomowego DNA z komórek (tutaj linia komórkowa BJ-hTERT), która ma być analizowana za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Jeśli stężenie DNA jest mniejsze niż 100 μg/ml, wytrącić DNA etanolem i ponownie zawiesić w objętości buforu TE (10 mM Tris-Cl; 0,1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy); pH 8,0), aby zapewnić stężenie DNA 100-600 μg/ml).</li>
</ol>
2. Ocena integralności DNA
UWAGA: Ta część protokołu opisuje ocenę integralności DNA za pomocą systemu elektroforezy żelowej z żelem o wymiarach 11 cm x 14 cm. Można również stosować inne systemy i rozmiary żeli, ale napięcie i czas migracji DNA mogą się różnić.
<ol>
	<li>Przygotować 1% żel agarozowy, łącząc 1 g agarozy klasy elektroforetycznej w 100 ml 1x buforu TAE (40 mM Tris-zasada; 20 mM kwas octowy; 2 mM EDTA; pH 8,5) i mikrofalować, aż agaroza się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. Schłodzić roztwór w temperaturze pokojowej do osiągnięcia temperatury 50 °C (około 15 - 20 min).</li>
	<li>Podczas gdy roztwór agarozy stygnie, przygotuj tackę do odlewania żelu, dodając bramki końcowe odlewu do tacy odlewniczej. Aby zapobiec wyciekom agarozy, należy schłodzić zasuwki końcowe do 4 °C przed przymocowaniem do tacki odlewniczej.</li>
	<li>Gdy roztwór agarozy ostygnie do 50 °C, dodać 10 μl bromku etydyny (10 mg/ml w dH2O) i wlać roztwór agarozy do tacki do odlewania żelu. Dodaj grzebień do tacki odlewniczej.</li>
	<li>Pozostaw roztwór agarozy do stwardnienia przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj próbki DNA do elektroforezy, rozcieńczając 25 ng genomowego DNA za pomocą 1x buforu TE do końcowej objętości 9 μL i dodaj 1 μL 10x barwnika ładującego (0,25% (w/v) błękit bromofenolowy, 0,25% (w/v) ksylen-cyjanol FF, 30% (v/v) glicerol). Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Przygotuj system elektroforezy żelowej do migracji DNA, wypełniając system elektroforezy buforem 1x TAE tak, aby poziom buforu znajdował się kilka milimetrów powyżej żelu. Załaduj dołki żelu całością próbek DNA. Dodać 5 μl drabinki DNA do jednego dołka.</li>
	<li>Przeprowadzić migrację DNA pod napięciem 100 V przez około 2 godziny lub do momentu, gdy niebieski barwnik bromofenolowy znajdzie się mniej więcej w połowie żelu.</li>
	<li>Zobrazuj żel za pomocą transiluminatora światła ultrafioletowego lub jego odpowiednika. 
	UWAGA: Próbki DNA o dobrej integralności mają pasma o dużej masie cząsteczkowej bez rozmazywania (to jest spowodowane ściętym lub uszkodzonym DNA). Jeśli prążki DNA są rozmazane, mają niską integralność i nie nadają się do analizy Southern blot, a DNA musi zostać ponownie wyizolowane ze świeżymi komórkami.</li>
</ol>
3. Trawienie genomowego DNA
<ol>
	<li>Przeprowadzić trawienie genomowego DNA w końcowej objętości 20-40 μl. 
	UWAGA: Objętości większe niż 40 μl przeleją się przez studzienki żelu agarozowego.
	<ol>
		<li>Połącz 3 μg genomowego DNA i odpowiednią ilość 10x buforu trawiącego DNA (dostarczanego z enzymami restrykcyjnymi) tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1x, w mikroprobówce. Dodać 1 μl enzymu restrykcyjnego RsaI (10 000 U/ml) i 1 μl enzymu restrykcyjnego HinfI (10 000 U/ml) do każdej probówki. Dostosuj końcową objętość za pomocą sterylnego, dejonizowanegoH2O. Dobrze wymieszaj. Odwirować krótko (10 - 15 s przy 16 000 x g), aby upewnić się, że wszystkie składniki znajdują się na dnie probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować procesy trawienia w temperaturze 37 °C przez ≥16 godzin. Po mineralizacji przechowuj strawione DNA w temperaturze 4 °C lub -20 °C nie dłużej niż 2 dni, jeśli to konieczne17.</li>
</ol>
4. Elektroforeza żelowa genomowego DNA
UWAGA: Ta część protokołu opisuje procedurę korzystania z systemu do elektroforezy żelowej o wymiarach 20 cm x 25 cm. Można stosować różne systemy elektroforezy żelowej, ale w celu uzyskania optymalnych wyników może być konieczna modyfikacja kilku zmiennych, w tym napięcia, czasu migracji i ilości bufora elektroforetycznego dodanego do systemu.
<ol>
	<li>Przygotować 0,6% roztwór agarozy, łącząc 2,25 g agarozy klasy żelowej do elektroforezy z 375 ml buforu do elektroforezy, 1x TAE lub 0,5x TBE (110 mM zasada Tris; 90 mM kwas borowy; 2,5 mM EDTA; pH 8,3). 
	UWAGA: Dla telomerów mniejszych niż 8 000 kB zalecane jest 0,5x TBE, natomiast 1x TAE jest zalecane dla telomerów od 8 000 kB do 20 000 kB1.</li>
	<li>Roztwór należy podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. Pozostawić roztwór do ostygnięcia przez 15 - 20 minut w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy agaroza osiągnie 50 °C.</li>
	<li>Podczas schładzania roztworu agarozy należy przygotować system elektroforezy żelowej do odlewania żelu zgodnie z opisem w kroku 2.2. Wlej roztwór żelu agarozowego do tacki do odlewania żelu. Umieść grzebień w żelu. Pozostaw żel do stwardnienia na 45 minut bez przykrycia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj strawione próbki DNA do elektroforezy. Aby uzyskać reakcję o objętości 40 μl, dodaj 0,4 μl 10-krotnego barwnika ładującego do każdej próbki strawionego DNA. Krótko odwirować (10-15 s, 16 000 x g), aby upewnić się, że cały roztwór znajduje się na dnie probówki.</li>
	<li>Przygotuj system elektroforezy żelowej do migracji DNA. Zdejmij zasuwki końcowe i przeczesz z żelu. Napełnij system elektroforezy żelowej 1x TAE lub 0,5x TBE do linii napełniania, upewniając się, że żel jest całkowicie zanurzony w buforze.</li>
	<li>Załadować dołki żelu próbkami DNA w taki sposób, aby między próbkami znajdowała się ślepa studzienka. Unikaj powodowania pęcherzyków lub nakłuwania żelu. Dodać 10 μl drabinki DNA do studzienek na przeciwległych końcach żelu. 
	UWAGA: Rodzaj drabiny DNA będzie zależał od długości telomerów, która będzie się różnić w zależności od osoby i źródła komórek.</li>
	<li>Uruchom elektroforezę żelową przy napięciu 150 V przez 30 minut, aby szybko przenieść DNA do żelu, a następnie ustaw napięcie na 57 V i pracuj przez 18-24 godziny.</li>
</ol>
5. Obrazowanie fluorescencyjne żelu i hybrydyzacja
<ol>
	<li>Po 18-24 godzinach wyłącz źródło zasilania elektroforezy żelowej. Wyjmij tackę do odlewania żelu z żelem z buforu do elektroforezy. Odetnij prawy górny róg żelu, aby służył jako odniesienie do orientacji żelu.</li>
	<li>Przygotuj kawałek bibuły filtracyjnej, przycinając bibułę tak, aby miała nieco większy rozmiar niż żel. Umieść bibułę filtracyjną na żelu w tacy odlewniczej i pozwól, aby bibuła wchłonęła nadmiar roztworu na żelu. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza między bibułą filtracyjną a żelem za pomocą pipety jako wałka, aby wycisnąć pęcherzyki przez boki.</li>
	<li>Usuń żel z tacki odlewniczej, odwracając żel i bibułę filtracyjną tak, aby papier znalazł się pod żelem. Przenieś żel wraz z bibułą filtracyjną do suszarki do żelu i przykryj żel folią. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza między folią a żelem za pomocą pipety jako wałka.</li>
	<li>Suszyć żel przez 2 godziny w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Po wysuszeniu usuń folię spożywczą i przenieś żel oraz bibułę filtracyjną do szklanego naczynia zawierającego 250 ml wody dejonizowanej (wystarczającej do pokrycia żelu). Ostrożnie usunąć bibułę filtracyjną i inkubować żel w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Żel będzie cienki, twardy i łatwy w obsłudze bez rozdzierania.</li>
	<li>Przygotować 5 x roztwór SSC (750 mM NaCl; 75 mM cytrynian sodu) w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Połóż żel na nylonowej siatce (12 cali x 12 cali). Zwiń ze sobą nylonową siatkę i żel, upewniając się, że żel nie styka się ze sobą. Umieść siatkę i żel w probówce do hybrydyzacji (np. 12-calowej tubie o średnicy 1,5). 
	UWAGA: Po prawidłowym zwinięciu żel będzie stykał się z nylonową siatką po obu stronach.</li>
	<li>Połącz 100 ml 5x SSC i 12 μl zielonego fluorescencyjnego barwienia kwasem nukleinowym i umieść w probówce hybrydyzacyjnej. Chronić roztwór przed światłem i inkubować przez 30 minut w temperaturze 42 °C w piecu do hybrydyzacji z rotacją.</li>
	<li>Wyjmij nylonową siatkę/żel z probówki do hybrydyzacji, rozwiń i umieść płasko w szklanym naczyniu zawierającym 250 ml wody dejonizowanej i delikatnie usuń nylonową siatkę. Zobrazuj żel za pomocą phosphorimagera. Użyj ustawień świetlówek: 520 BP, 40 niebieskich i 488 nm. Ustaw tubus fotopowielacza (PMT) na 375, płaszczyznę ogniskową na +3 mm, a czułość na normalną. Zapisz obraz do pliku.</li>
</ol>
6. Hybrydyzacja
<ol>
	<li>Przygotuj radioaktywną sondę telomerową.
	<ol>
		<li>Połączyć 2 μl (2 ng) sondy telomerowej (5- (CCC TAA)4 3'), 2,5 μl 10x buforu reakcyjnego kinazy polinukleotydowej, 3 μl γ32P-dATP (6,000 Ci/mmol), 4 μl kinazy polinukleotydowej T4 i wolnej od DNaz, sterylnej wody dejonizowanej do końcowej objętości 20 μL w probówce do mikrowirówki. 
		Ostrzeżenie: Podczas korzystania z radioaktywności należy przestrzegać obowiązujących w obiektach przepisów i dotyczących radioaktywności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krótko odwirować (10-30 s przy 16 000 x g) i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Wirować przez 10-30 s przy 16 000 x g i inkubować w temperaturze 65 °C przez 20 minut, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Używając kolumny mikrowirowej do chromatografii G-25, wymieszać zawartość kolumny przez wirowanie, a następnie odwirować przez 1 minutę przy 700 x g w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat.</li>
	<li>Załadować roztwór sondy radioaktywnej do kolumny chromatograficznej G-25 i odwirować przez 2 minuty przy 700 x g. Zachować filtrat. 
	UWAGA: Zachowaj filtrat, ponieważ zawiera on radioaktywną sondę telomerową. W razie potrzeby sonda radioaktywna może być przechowywana w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 250 ml roztworu denaturującego składającego się z 1,5 M NaCl i 0,5 M NaOH w sterylnej wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Umieścić żel w szklanym naczyniu zawierającym 250 ml roztworu denaturującego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór denaturujący i zastąp go 250 ml sterylnej wody dejonizowanej. Inkubować przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej (40 - 50 obr./min) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 250 ml roztworu neutralizacyjnego składającego się z 1,5 NaCl i 0,5 M kwasu tris-solnego o pH 8,0 w sterylnej wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Usuń wodę dejonizowaną i zastąp ją 250 ml roztworu neutralizacyjnego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas inkubacji w roztworze neutralizacyjnym przygotować 50 ml roztworu hybrydyzacyjnego złożonego z 5x SSC, 5x roztworu Denhardta (0,1% niejonowego polimeru syntetycznego; 0,1% poliwinylopirolidyny; 0,1% albuminy surowicy bydlęcej), 10 mM fosforanu disodowego (Na2HPO4) i 1 mM tetraprymaku pirofosforanu sodu dekahydratu (Na4P2O7 . 10 H2O) w sterylnej wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Zwiń żel w nylonową siatkę i umieść w probówce do hybrydyzacji (krok 5.7). Dodać 20 ml roztworu do hybrydyzacji i inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 42 °C przez 10 minut z rotacją.</li>
	<li>Usuń roztwór hybrydyzacyjny i zastąp go 20 ml świeżego roztworu do hybrydyzacji. Dodać całą sondę telomerową i inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 42 °C przez noc z rotacją.</li>
</ol>
7. Mycie żelem, naświetlanie ekranem luminoforowym i obrazowanie radiowe
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml 2x roztwór SSC (300 mM NaCl; 30 mM cytrynian sodu) w sterylnej wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Przygotuj 250 ml 0,1 x SSC (15 mM NaCl; 1,5 mM cytrynianu sodu) i 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Usuń żel i siatkę z probówki hybrydyzacyjnej i umieść w szklanym naczyniu zawierającym 250 ml 2x SSC. Rozwiń i wyjmij nylonową siatkę z naczynia. Umieścić szklane naczynie na wytrząsarce orbitalnej i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć 2x SSC i zastąpić 250 ml 0,1x SSC i 0,1% roztworu SDS i inkubować przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas inkubacji naświetl ekran Phosphor na działanie gumki obrazu na 15 minut.</li>
	<li>Usuń roztwór 0,1x SSC i 0,1% SDS i zastąp 250 ml 2x SSC. Inkubować przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Wyjmij żel z 2x roztworu SSC i zawiń żel w folię spożywczą lub umieść w woreczku termozgrzewalnym. Usuń wszystkie pęcherzyki i kieszenie powietrzne między żelem a plastikową folią lub plastikową torebką. Umieść żel w kasecie naświetlającej z ekranem Phopshor. Wystaw ekran luminoforowy na działanie żelu przez noc.</li>
	<li>Zobrazuj odsłonięty ekran Phosphor za pomocą phosphorimager.</li>
</ol>
8. Kwantyfikacja długości telomerów
<ol>
	<li>Otwórz plik phosphorimager zawierający fluorescencyjny obraz zielonego fluorescencyjnego żelu barwionego kwasem nukleinowym (Rysunek 1).</li>
	<li>Wybierz "Narzędzia", a następnie "Odległość w pikselach". Za pomocą myszy narysuj linię od dołu żelu do środka pierwszego paska znacznika i zapisz odległość. Powtórz tę procedurę dla każdego pasma znaczników (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Odległości te zostaną użyte w programie do tworzenia wykresów, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Otwórz obraz fosforowy żelu znakowanego radioaktywnie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Wybierz "Menedżer obiektów", a następnie "Siatka". Ustaw siatkę na 1 kolumnę i 150 wierszy. Wyreguluj siatkę tak, aby rozciągała się od góry żelu do dołu żelu. Dostosuj szerokość siatki, aby była równa szerokości pasa ruchu, klikając krawędź siatki i przeciągając szerokość siatki, aby zrównać ją z szerokością pasa.</li>
	<li>Skopiuj tę siatkę (tak, aby szerokość i wysokość pól pozostały takie same) i przenieś drugą siatkę na pusty pas (na potrzeby tła). Kontynuuj kopiowanie i przesuwanie dodatkowych siatek dla dodatkowych pasów próbki. 
	UWAGA: Po zakończeniu, powinny być siatki dla każdego pasa próbki i jedna siatka pustego pasa dla tła (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Wybierz "Analiza", a następnie "Raport objętości". Zaznacz wszystkie siatki raportu. Po wyświetleniu raportu objętości kliknij dwukrotnie raport, aby aktywować program arkusza kalkulacyjnego. Zapisz plik arkusza kalkulacyjnego. Dane dla tego pliku będą znajdować się na ścieżce "Wolumin".</li>
	<li>Otwórz odpowiedni program do tworzenia wykresów i utwórz nowe dane oraz tabelę. Wybierz "Y: Wprowadź i wykreśl pojedynczą wartość Y dla każdego punktu", a następnie wybierz "Utwórz".</li>
	<li>Oznacz pierwszą kolumnę (kolumnę X) jako "Zmierzona odległość", a drugą kolumnę (kolumna Y) oznacz jako "Masa cząsteczkowa". Wprowadzić masę cząsteczkową markera dla każdego pasma znacznika w kolumnie Y. Wpisać odległości migracji uzyskane w kroku 8.2 odpowiadające każdemu markerowi masy cząsteczkowej.</li>
	<li>Przejdź do "Analiza" i wybierz "Analizuj", a następnie "Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej)" i wybierz "OK". Na następnym ekranie wybierz "Wykładniczy, a następnie "Zanik jednej fazy". Wybierz zakładkę 'Zakres' i wpisz '150' w 'liczbie punktów definiujących krzywą' i zaznacz 'Utwórz tabelę współrzędnych XY, aby wyeksportować lub skopiować krzywą do innego programu'. 
	UWAGA: Wynik, "nieliniowe dopasowanie danych 1", zawiera masę cząsteczkową dla każdej odległości w wierszu Y.</li>
	<li>Do analizy pasów próbki wybierz obszar analizy, który znajduje się powyżej i poniżej rzeczywistych pasm telomerów. Nie używaj całej długości pasa ruchu (Rysunek 5). Określ lokalizacje siatki dla obszaru analizy każdego pasa ruchu.</li>
	<li>Wybierz 'Plik', 'Nowy' 'Utwórz nową tabelę i wykres'. Wybierz "Y: Wprowadź i wykreśl pojedynczą wartość Y dla każdego punktu", a następnie wybierz "Utwórz". Skopiuj i wklej wartości głośności pasa tła (wartości intensywności) z pliku arkusza kalkulacyjnego do pierwszej kolumny (X), a wartości głośności (wartości intensywności) z pasa próbki do pierwszej kolumny Y. Jeśli istnieje wiele linii próbkowania, skopiuj każdy zestaw wartości objętości z pliku arkusza kalkulacyjnego do dodatkowych kolumn Y w pliku programu do tworzenia wykresów.</li>
	<li>Skreślić wartości z kolumny tła (X) i każdego pasa pobierania próbek (Y), które znajdują się poza obszarami analizy określonymi w kroku 8.8. 
	UWAGA: Tabela danych powinna zawierać tylko wartości w tych lokalizacjach siatki, które odpowiadają obszarom analizy.</li>
	<li>Wybierz Analiza, a następnie "Analizuj" i "Przekształć". Kliknij "OK". Wybierz opcję "Przekształć wartości Y przy użyciu Y=Y-X". Spowoduje to przekształcenie danych w Danych 2 (wartość przekształconej intensywności (Y) = intensywność próbki (Y) - intensywność tła (X)).
	<ol>
		<li>Wybierz Analiza, a następnie "Analizuj", "Analiza kolumn" i "Statystyki kolumn". Wybierz przycisk OK. Zakładka wyników "Col. Stats of Transform of Data 2" pokazuje się w wierszu "Suma" ∑(Inti).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz 'Plik', 'Nowy', 'Utwórz nową tabelę i wykres'. Wybierz "Y: Wprowadź i wykreśl pojedynczą wartość Y dla każdego punktu", a następnie wybierz "Utwórz". Skopiuj i wklej dane kolumny Y ze strony wyników "Dopasowanie nonliniowe danych 1, krzywa" do nowej kolumny X. Skopiuj i wklej dane kolumny Y ze strony wyników "Transformacja danych 2" do nowej kolumny Y. Wybierz Analiza, a następnie "Analizuj" i "Przekształć". Kliknij "OK". Wybierz opcję "Przekształć wartości Y przy użyciu Y=Y/X".
	<ol>
		<li>Wybierz Analiza, a następnie "Analizuj", "Analiza kolumn" i "Statystyki kolumn". Wybierz przycisk OK. Zakładka wyników 'Col. Stats of Transform of Data 3' pokazuje w wierszu 'Sum' ∑(Inti/MWi). MW = masa cząsteczkowa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby obliczyć średnią długość telomerów (TL) dla każdej próbki, użyj wzoru TL=∑(Inti)/ ∑(Inti/MWi).</li>
</ol>

<ol><li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="https://utsouthwestern.influuent.utsystem.edu/en/publications/analysis-of-telomeres-and-telomerase">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).</li>
<li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+Restriction+Fragment+%28TRF%29+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li>
<li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+Telomerase%3A+The+Means+to+the+End+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li>
<li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Discovery%3A+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li>
<li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Ends%3A+Just+the+Beginning+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li>
<li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres%2C+Aging%2C+and+Plants%3A+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li>
<li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres-Structure%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li>
<li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Regulation+from+Beginning+to+the+End%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Telomerase Regulation from Beginning to the End.</a> Genes (Basel). 7 (9), 64(2016).</li>
<li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).</li>
<li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li>
<li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere-Associated+Aging+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , Epub ahead of print 1568-1637 (2016).</li>
<li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li>
<li>Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Telomere+Biology%3A+A+Contributory+and+Interactive+Factor+in+Aging%2C+Disease+Risks%2C+and+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection.</a> Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).</li>
<li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length%3A+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li>
<li>Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+in+Molecular+Epidemiology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres in Molecular Epidemiology Studies.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TECHNICAL+ADVANCES%3A+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li>
<li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li>
<li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+telomere+sequences+in+birds%3A+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li>
<li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+%28flow+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li>
<li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+in+epidemiology%3A+a+biomarker+of+aging%2C+age-related+disease%2C+both%2C+or+neither%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li>
<li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Po elektroforezie rozmaz genomowego DNA jest wyższy niż 800 pz. Może się to zdarzyć, jeśli enzymy restrykcyjne są wadliwe lub jeśli potrzebne są dodatkowe enzymy (jak opisano powyżej). Drugim możliwym wyjaśnieniem jest to, że białko jest nadal przyłączone do DNA. Przy określaniu stężenia DNA za pomocą spektrofotometru stosunek 260/280 powinien wynosić około 1,8. Jeśli stosunek ten wynosi <1,5, występuje zanieczyszczenie białkiem, które może zakłócać trawienie enzymów restrykcyjnych. Albo próbka DNA musiałaby zostać ponow...

Telomery, znajdujące się na końcach chromosomów, są nukleotydowymi powtórzeniami sekwencji TTAGGG (na chromosomach ludzkich), które odgrywają kluczową rolę w ochronie komórkowej informacji genetycznej3,4,5. Telomery mają długość kilku tysięcy par zasad i służą do ochrony integralności reszty chromosomu podczas replikacji DNA. Replikacja chromosomów nie jest doskonała, co powoduje, że końce chromosomu nie są całkowicie skopiowane. Ta nieefektywność replikacji jest określana jako "problem z replikacją końcową" i powoduje utratę niektórych powtórzeń telomerów podczas każdej rundy replikacji6,7. Długość telomerów może zostać przywrócona po podziale komórki przez telomerazę, enzym, który zastępuje utracone sekwencje telomerów8,9. Telomeraza nie jest jednak aktywowana w większości ludzkich komórek somatycznych, w wyniku czego z czasem telomery ulegają skróceniu, co ostatecznie prowadzi do starzenia się komórek10. Ze względu na skracanie telomerów, telomery są uważane za biomarker starzenia się i ryzyka chorób związanych z wiekiem11,12. Ponadto na długość telomerów mogą wpływać czynniki genetyczne, środowiskowe i styl życia oraz inne bodźce, takie jak stres oksydacyjny, co wskazuje, że długość telomerów może odgrywać rolę jako biomarker w badaniach toksykologicznych, epidemiologicznych i behawioralnych13,14,15.
Ten artykuł demonstruje technikę pomiaru długości telomerów za pomocą zmodyfikowanej analizy fragmentu restrykcyjnego terminalu (TRF) zaadaptowanej z Mendera i Shay'a2 oraz Kimura et al.16, i podobne do Herbert, Shay and Wright1 oraz Haussmann i Mauck17. Tradycyjnie, analiza TRF obejmuje procedurę Southern blot. Southern blot jest uważany za "złoty standard" w badaniu długości telomerów i jest aktywnie wykorzystywany do badania długości telomerów leukocytów w badaniach epidemiologicznych18. Ta analiza TRF wykorzystuje strawione genomowe DNA, pozostawiając powtórzenia telomerów. Fragmenty DNA są następnie rozdzielane za pomocą elektroforezy żelowej, denaturowane i przenoszone do membrany nitrocelulozowej. Sekwencje telomerów są hybrydyzowane z sondą oligonukleotydową telomerów. Zamiast przenosić oddzielone telomery do błony, inne techniki TRF wykorzystują techniki hybrydyzacji w żelu z denaturacją DNA i bez niej. Uwzględnienie denaturacji jest ważne, gdy rozważa się wykrycie telomerów śródmiąższowych, które zostały zgłoszone u niektórych gatunków19. Procedury, które nie mają etapów denaturacji, wykrywają tylko jednoniciowe nawisy DNA w końcowych telomerach i nie wiążą się z śródmiąższowymi sekwencjami telomerów18.
Oprócz analizy TRF, istnieje kilka innych technik pomiaru długości telomerów, z których każda ma swoje zalety i wady. Technika Flow-FISH umożliwia pomiar średniej długości telomerów w poszczególnych komórkach odrębnego typu komórki za pomocą cytometrii przepływowej16,20. Chociaż może dokładnie oznaczać telomery za pomocą wysoce specyficznych sond i redukować błędy ludzkie poprzez automatyzację, Flow-FISH jest drogi, mniej wydajny i wymaga świeżych próbek oraz wysoko wykwalifikowanego technika, co ogranicza jego zdolność do badań epidemiologicznych16. Ponadto metoda ta nie uwzględnia potencjalnych zmian w liczbie chromosomów w populacji komórek. Inna technika, qPCR, jest powszechnie akceptowana jako sposób pomiaru długości telomerów w badaniach epidemiologicznych16 ze względu na wysoką przepustowość, niski koszt i wymóg niewielkich ilości DNA w porównaniu z innymi metodami. Jednak qPCR może mierzyć tylko średnią zawartość telomerowego DNA w stosunku do pojedynczej kopii genu, a zatem jest pośrednim oszacowaniem średniej długości telomerów. Daje to również wysoki współczynnik wariancji w badaniach porównawczych w porównaniu z południowymi plamami, co prowadzi do wątpliwej dokładności21.
Procedura TRF ma swoje własne braki, które ograniczają jej zastosowanie w niektórych badaniach. Techniki TRF wymagają dużej ilości DNA w porównaniu z innymi metodami (od 2 do 3 μg na próbkę). Ogranicza to zastosowania tej techniki do badania długości telomerów w próbkach klinicznych, dla których można pobrać wystarczającą ilość genomowego DNA i nie można go użyć na próbkach zdegradowanego DNA. Dodatkowo analiza TRF jest kosztowna i pracochłonna, a jej wyniki wymagają 4-5 dni. Jednak TRF daje niski współczynnik wariancji, co zapewnia jego odtwarzalność. Chociaż protokół ten różni się od tradycyjnego Southern blot (wykorzystującego hybrydyzację żelu in situ), te dwie techniki są zasadniczo takie same.
Technika przedstawiona tutaj to połączenie Southern blot i hybrydyzacji w żelu; powiązanie etapu denaturacji DNA z Southern blot z hybrydyzacji w żelu. Ta kombinacja ma dodatkową zaletę w postaci lepszej siły sygnału sondy w porównaniu z Southern blot i konsekwentnie daje wymierne wyniki w naszym laboratorium. Dodatkowo, zastosowanie sond radioaktywnych zamiast sond chemiluminescencyjnych daje wyższą intensywność sygnału i pozwala na wizualizację i kwantyfikację za pomocą luminowizora, dzięki czemu analizy TRF są przyjazne dla użytkownika.

<table><tbody><tr><td>Biologics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rsa1, enzym restrykcyjny</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0167S</td><td>10 000 U/mL, trawienie DNA.&nbsp; W zestawie Cutsmart Buffer (bufor trawienny)</td></tr><tr><td>Hinf1, enzym restrykcyjny</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0155S</td><td>10 000 U/mL, trawienie DNA.&nbsp; W zestawie Cutsmart Buffer (bufor do wytrawiania)</td></tr><tr><td>Seakem GTG Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50071</td> klasa <td>elektroforezy agaroza</td></tr><tr><td>Optikinaza&nbsp;</td><td>affymetrix</td><td>78334X 500 UN</td><td>T4 Kinaza polinukleotydowa</td></tr><tr><td>SYBR Zielone barwienie kwasem nukleinowym I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7567</td><td>Syber Green</td></tr><tr><td>exactGene DNA Ladder 24- kB</td><td>Sonda</td> nici C Fisher Scientific <td>BP2580100</td><td></td></tr><tr><td>(3'-(G3AT2)4-'5)</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>Oligonukleotyd DNA na zamówienie</td></tr><tr><td>Gamma-ATP-P32</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z</td><td>Radioizotop</td></tr><tr><td>Qiagen Hodowla krwi i komórek DNA Mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>13323</td><td>Zestaw do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>GE Illustra Microspin G-25 kolumna</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-5325-01</td><td>Do oczyszczania readioaktywnej sondy oligo</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td></td><td></td><td>niejonowy syntetyczny polimer</td></tr><tr><td>Sprzęt/Oprogramowanie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Owl A5 System do elektroforezy żelowej (20 cm x 25 cm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Horizon 11.4 System elektroforezy żelowej (11 cm x 14 cm)</td><td>Corel Life Sciences</td><td>11068020</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Siatka nylonowa, 50, 12" x 12"</td> <td>Ted Pellam, Inc</td><td>41-12105</td><td></td></tr><tr><td>GE Ekrany fosforowe do przechowywania</td><td>GE Healthcare Nauki Przyrodnicze</td><td>28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta naświetlania ekranu fosforowego</td><td>GE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator hybrydyzacji izotemperaturowej</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-20Q</td><td></td></tr><tr><td>Cylindryczne rurki hybrydyzacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna Belly Dancer</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z768499-1EA</td><td>Wytrząsarka orbitalna</td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>ABI</td><td></td><td>Do obrazowania żeli i ekranów luminoforowych</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td> Program <td>do tworzenia wykresów</td><td>GraphPad</td><td>w wersji 6.05</td></tr><tr>Program <td>do tworzenia wykresów</td><td>Microsoft Excel</td><td></td> Microsoft <td>Office 365</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td> <td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrp 2000</td></tr></tbody></table>

zmodyfikowana analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych do ilościowego określania długości telomerów za pomocą hybrydyzacji w żelu

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Istnieje kilka różnych technik pomiaru długości telomerów, z których każda ma swoje zalety i wady. Tradycyjne podejście, analiza fragmentów restrykcyjnych telomerów (TRF), wykorzystuje technikę hybrydyzacji DNA, w której próbki genomowego DNA są trawione enzymami restrykcyjnymi, pozostawiając powtórzenia DNA telomerów i niektóre subtelomerowe DNA. Są one rozdzielane przez elektroforezę w żelu agarozowym, przenoszone do membrany filtracyjnej i hybrydyzowane z sondami oligonukleotydowymi oznaczonymi chemiluminescencją lub radioaktywnością w celu wizualizacji fragmentów restrykcyjnych telomerów. Podejście to, choć wymaga większej ilości DNA niż inne techniki, takie jak PCR, może mierzyć rozkład długości telomerów w populacji komórek i umożliwia pomiar wyrażony w bezwzględnych kilozasadach. Manuskrypt ten demonstruje zmodyfikowaną procedurę hybrydyzacji DNA w celu określenia długości telomerów. Genomowe DNA jest najpierw trawione przez enzymy restrykcyjne (które nie przecinają telomerów) i rozdzielane przez elektroforezę w żelu agarozowym. Żel jest następnie suszony, a DNA jest denaturowane i hybrydyzowane in situ do znakowanej radioaktywnie sondy oligonukleotydowej. Ta hybrydyzacja in situ pozwala uniknąć utraty telomerowego DNA i poprawia intensywność sygnału. Po hybrydyzacji żele są obrazowane za pomocą ekranów luminoforowych, a długość telomerów jest określana ilościowo za pomocą programu do tworzenia wykresów. Procedura ta została opracowana przez laboratoria doktorów Woodringa Wrighta i Jerry'ego Shaya z University of Texas Southwestern1,2. Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis tej procedury, z pewnymi modyfikacjami.

Analizie długości telomerów poddano trzy stężenia DNA (1, 2 i 3 µg) wyizolowanego z linii komórkowej BJ-hTERT (unieśmiertelnione telomerazą ludzkie fibroblasty napletka)22 oraz z ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC). Tabela 1 przedstawia przypisanie ścieżek dla każdej próbki DNA. Rysunek 1 przedstawia żel po barwieniu fluorescencyjnym kwasów nukleinowych. Standardy masy cząsteczkowej są wyraźnie widoc...

W tym artykule omówiono szczegółowy protokół do ilościowego określania długości telomerów za pomocą zmodyfikowanej analizy fragmentów restrykcyjnych na końcu, który zapewnia szybki i efektywny bezpośredni pomiar długości telomerów. Technika ta może być stosowana do różnych źródeł komórkowych DNA w celu ilościowego określenia długości telomerów.

Zmodyfikowana analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych do ilościowego określania długości telomerów za pomocą hybrydyzacji w żelu

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie długości telomerów w komórkach eukariotycznych przy użyciu zmodyfikowanej wersji procedury analizy fragmentów restrykcyjnych telomerów, opisanej przez dr Jerry'ego W. Shaya, Woodringa Wrighta i współpracowników. Dostarczając danych na temat długości telomerów, procedura ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na pytania z zakresu biologii komórki, medycyny behawioralnej, epidemiologii oraz chorób zakaźnych, a także na badanie wpływu wieku, stresu, leczenia farmakologicznego i infekcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośredni pomiar średniej długości telomerów w kilobazach w różnych typach komórek.Próbki genomowego DNA do analizy wyekstrahowano z komórek przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przeprowadź trawienie genomowego DNA w objętości końcowej od 20 do 40 µL. W każdej probówce do mikrocentryfugi połącz następujące składniki: trzy µg genomowego DNA; bufor do trawienia DNA 10x; jeden µL enzymu restrykcyjnego Rsa1; jeden µL enzymu restrykcyjnego Hinf1; oraz sterylną, dejonizowaną wodę do uzyskania objętości końcowej.Krótko odwiruj próbki, aby upewnić się, że wszystkie składniki znajdują się na dnie probówki. Inkubuj trawienia w temperaturze 37°C przez co najmniej 16 godzin. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania 0,6% roztworu agarozy zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przygotuj system elektroforezy żelowej do odlewania żelu. Przymocuj bramki końcowe do formy do odlewania żelu. Gdy roztwór agarozy ostygnie do 50 °C, wlej go do formy, umieść w żelu stożek i pozostaw żel do utwardzenia na 45 minut bez przykrycia w temperaturze pokojowej.Zdejmij bramki końcowe z tacy do odlewania i wyjmij grzebień z żelu. Napełnij system elektroforezy żelowej buforem do elektroforezy do linii napełnienia, upewniając się, że żel jest całkowicie zanurzony w buforze. Nanieś próbki DNA do dołków żelu, pozostawiając pusty dołek pomiędzy próbkami.Do studni na przeciwległych końcach żelu nanieś 10 µL drabinki DNA. Przeprowadź elektroforezę żelową przy napięciu 150 V przez 30 minut, aby szybko wprowadzić DNA w głąb żelu. Po 30 minutach zmniejsz napięcie do 57 V i kontynuuj elektroforezę przez 18 do 24 godzin.Po prowadzeniu elektroforezy przez 18 do 24 godzin należy wyłączyć zasilacz i wyjąć tackę z żelem z buforu elektroforetycznego. Odciąć prawy górny róg żelu, aby służył on jako punkt odniesienia dla orientacji żelu. Wyciąć kawałek papieru filtracyjnego o rozmiarze nieco większym niż żel.Umieść papier filtracyjny na wierzchu żelu w formie do odlewania i pozwól papierowi wchłonąć nadmiar roztworu z żelu. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza znajdujące się pomiędzy papierem filtracyjnym a żelem, używając pipety jako wałka w celu wypchnięcia pęcherzyków przez boki. Wyjmij żel z formy do odlewania, odwracając żel i papier filtracyjny tak, aby papier znalazł się pod żelem.Przenieś żel wraz z papierem filtrowacyjnym do suszarki do żeli i przykryj go folią plastikową. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza znajdujące się między folią a żelem, używając pipety jako wałka. Susz żel w temperaturze 50 °C przez dwie godziny.Po wyschnięciu żelu należy zdjąć folię plastikową i przenieść żel wraz z papierem filtrowanym do szklanego naczynia zawierającego 250 milliliters wody dejonizowanej. Ostrożnie usuwamy papier filtrowany i inkubujemy żel w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Żel należy położyć na nylonowej siatce o wymiarach 12 by 12 inch.Zwinąć siatkę nylonową wraz z żelem, upewniając się, że żel nie styka się z samym sobą. Umieścić siatkę i żel w probówce do hybrydyzacji. Połączyć 100 milliliters 5x SSC oraz 12 µL zielonego barwnika do kwasów nukleinowych o fluorescencji i wlać do probówki do hybrydyzacji.Inkubować przez 30 minut w temperaturze 42 °C w piecu do hybrydyzacji z rotacją. Chronić roztwór przed światłem. Po 30 minutach wyjąć siatkę nylonową i żel z probówki do hybrydyzacji.Rozwinąć i położyć płasko w szklanym naczyniu zawierającym 250 mililitrów wody dejonizowanej. Delikatnie usunąć siatkę nylonową. Wykonać obraz żelu za pomocą fosforyobrazowacza przy użyciu wskazanych ustawień.Przygotować radioaktywną sondę telomerową zgodnie z przepisami placówki dotyczącymi obchodzenia się z substancjami promieniotwórczymi. W probówce do mikrocentryfugi połączyć następujące składniki: 2 µL sondy telomerowej; 2,5 µL 10x buforu do reakcji z polinukleotydową kinazą; 3 µL ATP znakowanego P32 w grupie gamma-fosforanowej; 4 µL polinukleotydowej kinazy T4 oraz sterylną, dejonizowaną wodę wolną od DNaz do uzyskania objętości końcowej 20 µL. Probówkę krótko odwirować.Inkubuj probówkę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Krótko odwiruj probówkę, a następnie inkubuj w temperaturze 65 °C przez 20 minut, aby zatrzymać reakcję. Nanieś roztwór radioaktywnej sondy na przygotowaną kolumnę chromatograficzną G25 i wiruj przez dwie minuty przy 700 ×g.Zachowaj filtrat zawierający radioaktywną sondę telomerową. Umieść żel w szklanym naczyniu zawierającym 250 mililitrów roztworu denaturującego i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór denaturujący i zastąp go 250 mililitrami sterylnej, dejonizowanej wody.Inkubować przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej. Odlać wodę dejonizowaną. Zastąpić ją 250 mililitrami roztworu neutralizującego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Zwiń żel w siatkę nylonową i umieść w probówce do hybrydyzacji. Dodaj 20 ml roztworu do hybrydyzacji i inkubuj w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 42 °C przez 10 minut w rotacji. Po 10 minutach usuń roztwór do hybrydyzacji i zastąp go 20 ml świeżego roztworu do hybrydyzacji.Dodaj całą objętość sondy telomerowej i inkubuj w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 42 °C z rotacją przez noc. Po zakończeniu hybrydyzacji z sondą telomerową wyjmij żel i siatkę z probówki do hybrydyzacji i umieść je w szklanym naczyniu zawierającym 250 ml 2x SSC. Rozwiń i usuń siatkę nylonową z naczynia.Umieść szalkę szklaną na wytrząsarce orbitalnej i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń 2x SSC, zastąp go 250 mililitrami roztworu 0,1x SSC z dodatkiem 0,1% SDS i inkubuj przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór 0,1x SSC z dodatkiem 0,1% SDS.Zastąp roztworem 250 ml 2x SSC i inkubuj przez kolejne 15 minut na wytrząsarce orbitalnej. Wyjmij żel z 2x SSC i owiń go folią spożywczą. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza znajdujące się pomiędzy żelem a folią.Umieść żel w kasecie naświetlaniowej z ekranem fosforowym i naświetlaj ekran fosforowy żelem przez noc. Następnego dnia użyj obrazownika fosforowego do obrazowania naświetlonego ekranu fosforowego. Uzyskane obrazy fosforowe są następnie wykorzystywane do kwantyfikacji długości telomerów zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przeanalizowano długość telomerów w trzech stężeniach DNA wyizolowanego z unieśmiertelnionej linii komórkowej fibroblastów skóry sromowej człowieka oraz z mononuklearnych komórek krwi obwodowej człowieka. Ten obraz fosforoobrazowy wysuszonego żelu agarozowego, barwionego zielonym fluorescencyjnym barwnikiem kwasów nukleinowych, przedstawia położenie prążków drabinki DNA w ścieżkach pierwszej i ósmej. Odległość zmierzona od górnej krawędzi żelu do każdego standardu masy cząsteczkowej jest zaznaczona niebieskimi strzałkami.Po hybrydyzacji z sondą telomerową prążki telomerowe widoczne są jako rozmycia w każdej ścieżce. Dla każdej ścieżki oraz jednej ścieżki tła obliczono siatki składające się ze 150 pól. Przedstawiono wybrane obszary analizy dla każdego zestawu próbek.Dla każdego zestawu próbek wybrano osobne ścieżki tła oznaczone jako B, aby zapewnić podobną intensywność tła dla każdego zestawu próbek. Obliczenia średniej długości telomerów wykazały większą średnią długość telomerów w unieśmielonej linii komórkowej niż w ludzkich monocytach i limfocytach krwi obwodowej. Wyniki te wykazują również, że ilość analizowanego DNA genomowego w każdej ścieżce ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wykrywalnego sygnału po hybrydyzacji.Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu 12 godzin rozłożonych na 2 i 1/2 dnia, z dwiema inkubacjami nocnymi, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby użyć co najmniej trzech mikrogramów DNA dla każdej próbki i zmierzyć każdą próbkę w dublecie. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie starzenia się do zgłębiania mechanizmów odpowiedzialnych za utrzymanie długości telomerów u różnych gatunków zwierząt, w tym u ludzi.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak bezpośrednio wyznaczyć średnią długość samych telomerów. Pamiętaj, że praca z substancjami promieniotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie fartuchów laboratoryjnych i rękawiczek.

modified-terminal-restriction-fragment-analysis-for-quantifying

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Telomery są niezbędne dla stabilności chromosomów, a struktura nawisu G telomeru jest kluczowa dla utrzymania telomerów za pośrednictwem telomerazy. Wprowadziliśmy niedawno dwie metody wykrywania struktury nawisu G telomeru w Trypanosoma brucei, którymi są natywna hybrydyzacja w żelu oraz wydłużanie startera za pomocą ligacji, które zostaną w niniejszym opracowaniu opisane.

Badanie struktury G-overhangu telomerów w Trypanosoma brucei

Opisana jest dokładna, krótka, wyrafinowana i tania metoda, która ocenia długość telomerów w wielu tkankach i gatunkach za pomocą qRT-PCR. Ponadto opiszemy prosty test do oceny aktywności telomerazy jako uzupełniający test szkieletowy dla długości telomerów.

długość telomerów i aktywność telomerazy; Yin i Yang starzenia się komórek

Opisujemy zwięzłą procedurę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gonadzie i zarodkach Caenorhabditis elegans w celu obserwacji i ilościowego określenia powtarzających się sekwencji. Z powodzeniem zaobserwowaliśmy i określiliśmy ilościowo dwie różne powtarzające się sekwencje, powtórzenia telomerów i szablon alternatywnego wydłużania telomerów (TALT).

Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans

Ludzka odwrotna transkryptaza telomerazy (TERT) syntetyzuje nie tylko telomeryczne DNA, ale także dwuniciowe RNA poprzez aktywność polimerazy RNA zależnej od RNA. W tym miejscu opisujemy nowo opracowany test do wykrywania zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA endogennego TERT.

Półilościowe wykrywanie zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy

Tutaj prezentujemy protokół generowania klonów komórek rakowych zawierających znacznik sekwencji MS2 na pojedynczym subtelomerze. Podejście to, oparte na systemie MS2-GFP, umożliwia wizualizację endogennych transkryptów telomerowego RNA zawierającego powtórzenia (TERRA) wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach.

Generowanie klonów komórek rakowych w celu wizualizacji telomerowego RNA TERRA zawierającego powtórzenia wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach

Tutaj szczegółowo opisujemy protokół ilościowego oznaczania długości telomerów za pomocą nieradioaktywnej detekcji chemiluminescencyjnej, koncentrując się na optymalizacji różnych parametrów wydajności zestawu do oznaczania długości telomerów TAGGG, takich jak ilości i stężenia w próbce.

Optymalizacja parametrów wydajnościowych testu długości telomerów TAGGG

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru względnej długości telomerów (TL) za pomocą monochromatycznego multipleksowego ilościowego testu łańcuchowego polimerazy (MMqPCR). Test MMqPCR jest powtarzalną, wydajną i opłacalną metodą pomiaru TL z ludzkiego DNA w badaniach populacyjnych.

Monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów PCR

Ten protokół demonstruje użycie pęsety magnetycznej do badania interakcji między telomerowymi białkami wiążącymi DNA (Telomer Repeat-binding Factor 1 [TRF1] i TRF2) a długimi telomerami ekstrahowanymi z komórek ludzkich. Opisano w nim etapy przygotowawcze do telomerów i telomerowych czynników wiążących powtórzenia, wykonywanie eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach oraz metody gromadzenia i analizy danych.

Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej

Laparoskopowa pankreatoduodenctomia (LPD) może oferować korzyści w porównaniu z otwartą pankreatoduodenektomią, w tym wczesną mobilizację pooperacyjną, mniej opóźnione opróżnianie żołądka i krótszy pobyt w szpitalu. Jednak LPD jest technicznie trudne i nie jest dobrze ustandaryzowane, zwłaszcza w odniesieniu do zespolenia trzustki. Opisujemy standaryzowaną technikę zespolenia trzustki podczas LPD: zmodyfikowaną pankreatynojejunostomię Blumgart.

Laparoskopowa pankreatodenektomia ze zmodyfikowaną pankreatykojejunostomią Blumgart

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Poznaj zmodyfikowaną metodę TRF do pomiaru długości telomerów w komórkach eukariotycznych za pomocą hybrydyzacji in situ z radiolabelowaną sondą. Technika zapewnia bezpośredni pomiar w kilobazach.

Zmodyfikowana analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych do ilościowego określania długości telomerów za pomocą hybrydyzacji w żelu (Wideo) | JoVE Journal

Zmodyfikowana analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych do ilościowego określania długości telomerów za pomocą hybrydyzacji w żelu

Przeglądaj więcej filmów