Name: Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Poznaj metodę monitorowania chimerizmu po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Technika łączy cytometrię przepływową, hodowlę kolonii i analizę STR, umożliwiając ocenę proliferacji i różnicowania progenitorów erytroidalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.

1. Izolacja komórek hematopoetycznych szpiku kostnego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanego fluorescencją
<ol>
	<li>Barwienie próbki
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem procesu należy zebrać i przygotować następujące przedmioty:
		<ol>
			<li>Pożywka gradientowa do przygotowania komórek jednojądrzastych (GM), probówki stożkowe 50 ml</li>
			<li>Rurki przepływowe 12 x 75 mm do barwienia komórek</li>
			<li>Bufor barwiący: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 3% płodowa surowica cielęca (FCS)</li>
			<li>Pipety</li>
			<li>Przeciwciała blokujące i barwiące FC (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Dzięki tej kombinacji fluorochromu przenikanie do innych kanałów jest znikome, ale możliwa jest również każda inna odpowiednia kombinacja fluorochromu.</li>
			<li>Koraliki kompensacyjne (w razie potrzeby)</li>
			<li>Bufor zawiesiny: Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS</li>
			<li>Błękit trypanowy i hemocytometr</li>
			<li>Probówki do pobierania komórek: do pobierania posortowanych komórek można użyć dowolnej bogatej pożywki z probówkami o wysokiej zawartości surowicy (zawierającej 1 ml FCS + 25 mM HEPES).</li>
			<li>Próbka szpiku kostnego: zazwyczaj wymagana jest świadoma zgoda na biopsję szpiku kostnego z grzebienia biodrowego tylnej części kości biodrowej. Próbka szpiku kostnego jest następnie przechowywana w strzykawkach zawierających heparynę w temperaturze pokojowej do czasu barwienia. Poniższe kroki protokołu są wykonywane zgodnie z wytycznymi Komisji Etycznej ds. Badań Naukowych na Ludziach w Instytucji ds. Dobrostanu Człowieka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wygeneruj jednokomórkową zawiesinę próbki szpiku kostnego. Dodać 3 ml GM do probówki wirówkowej. Ostrożnie nałożyć 4 ml zawiesiny jednokomórkowej na roztwór GM. Wirować przy 550 g przez 30 minut w temperaturze 20 ° Celsjusza (C) (hamulec jest wyłączony). Narysuj górną warstwę zawierającą osocze i płytki krwi za pomocą sterylnej pipety, pozostawiając nienaruszoną warstwę komórek jednojądrzastych na granicy faz. Przenieść warstwę komórek jednojądrzastych do sterylnej probówki wirówkowej za pomocą sterylnej pipety.</li>
		<li>Po przemyciu 5 ml buforu barwiącego, ponownie zawiesić komórki w 2 ml buforze zawiesinowym i oznaczyć stężenie komórek. Umieścić 5 μl zawiesiny komórek w probówce z zakrętką. Dodać 95 μl 0,2% niebieskiej plamy trypanowej. Dokładnie wymieszaj. Odstawić na 5 minut w temperaturze pokojowej. Napełnij hemocytometr jak do liczenia komórek. Pod mikroskopem obserwuj, czy niezdolne do życia komórki są wybarwione i policz żywe komórki.</li>
		<li>Odwirować komórki w stężeniu 250 g przez 10 minut w temperaturze 20 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym w stężeniu do 1 x 10,6 na 100 μl.</li>
		<li>Blok FcR za pomocą 2,5 μg Fc Block na 1 x 106 komórek na lodzie przez 10 - 15 min.</li>
		<li>Dodać odpowiednią kombinację 10 μg mAb do barwienia 1 x 106 komórek i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4°C w ciemności, a następnie przejść do etapu przemywania z 3 ml buforu barwiącego. W celu prawidłowej kompensacji, małe podwielokrotności komórek (lub najlepiej kulki kompensacyjne) są barwione pojedynczymi przeciwciałami; Jedna podwielokrotność pozostaje niepoplamiona.</li>
		<li>Dostosuj stężenie do 20 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Skonfiguruj i zoptymalizuj sorter komórek. Proces konfiguracji cytometru przepływowego i oprogramowania jest ustandaryzowany na podstawie szczegółowej instrukcji dostarczonej przez firmę i musi być wykonywany przez odpowiednio przeszkolony personel.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sortowanie w sortowniku komórek
	<ol>
		<li>Przygotować probówki zbiorcze z kroku 1.1.1.9.</li>
		<li>Skonfiguruj szablon, który zawiera wykres dwóch zmiennych, aby wyświetlić punktowy do przodu (FSC) i punktowy boczny (SSC).</li>
		<li>Uruchom komórki i dostosuj FSC/SSC, aby umieścić interesującą populację na skali</li>
		<li>Nagrać probówkę kontroli ujemnej.</li>
		<li>Uruchomić pojedyncze probówki kontroli dodatniej; zapisać dane dla każdej probówki.</li>
		<li>Obliczanie wynagrodzenia jest ręczne lub automatyczne za pomocą funkcji zapewnianej przez oprogramowanie do akwizycji.</li>
		<li>Pobrać próbkę eksperymentalną i umieścić ją na dwuwymiarowym wykresie kropkowym FSC/SSC (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), aby uwzględnić zarówno komórki limfocytarne, jak i szpikowe. Wyklucz dublety i agregaty, porównując różne sygnały FSC (tj. wysokość, szerokość i obszar) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Wizualizuj komórki singletowe na dwuwymiarowym wykresie kropkowym wyświetlającym CD45 i CD36 (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C). Zdarzenia dodatnie dla CD45 to leukocyty (w tym ich przodki), te ujemne dla CD45 i dodatnie dla CD36 to erytroidalne komórki progenitorowe. Użyj narzędzi do bramkowania, aby zdefiniować CD36 + (w razie potrzeby komórki te można dalej podzielić na komórki o wysokiej i niskiej ekspresji CD36) i komórki CD45 +. Wizualizuj zdarzenia CD45+ na innym wykresie kropkowym wyświetlającym parametry CD34 i SSC. Użyj narzędzi do bramkowania, aby zdefiniować komórki CD34+ (progenitory leukocytów) i wysokie komórki SSC (komórki szpikowe na różnych etapach różnicowania).</li>
		<li>Po ustaleniu bramek można je wybrać do sortowania do zewnętrznych probówek zbiorczych.</li>
		<li>Sortować w temperaturze 4 °C aż do uzyskania wymaganej liczby komórek</li>
		<li>Wykonaj analizę po sortowaniu, aby określić czystość posortowanych populacji komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E, 1F).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test klonogeniczny
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników 
	Przed rozpoczęciem procesu należy zebrać i przygotować następujące przedmioty:
	<ol>
		<li>Pipety, płytki 100 mm</li>
		<li>Błękit trypanowy i hemocytometr</li>
		<li>Rekombinowaną ludzką erytropoetynę (EPO) rozpuszczoną w stężeniu 500 j./ml w sterylnym PBS zawierającym co najmniej 0,1% albuminy surowicy ludzkiej. Podzielić ten roztwór na małe porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby uniknąć powtarzających się zamrażania i rozmrażania.</li>
		<li>Przygotuj kompletną modyfikowaną pożywkę Dulbecco firmy Iscove (IMDM) o końcowych stężeniach 5% FCS, 2 mM glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny (PS). Dodać ludzką rekombinowaną erytropoetynę (EPO) w różnych stężeniach w oddzielnych studzienkach do kompletnego podłoża IMDM: 3 jednostki EPO/studzienkę, 6 jednostek EPO/studzienkę i 12 jednostek EPO/studzienkę (odpowiednio 1 x, 2 x, 4 x EPO).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek szpiku kostnego
	<ol>
		<li>10 ml próbki szpiku kostnego rozcieńczonej 20 ml PBS powoli nakłada się warstwami na 15 ml pożywki o gradiencie gęstości w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, zachowując wyraźną granicę faz między dwiema fazami i w sterylnych warunkach. Następnie odwirować stożkowe probówki o pojemności 15 ml przy 550 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) z przyspieszeniem ustawionym na 9 i opóźnieniem ustawionym na 0 (lub Hamulec wyłączony).</li>
		<li>Po odwirowaniu usunąć interfejs do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodać PBS do końcowej objętości 50 ml.</li>
		<li>Po odwirowaniu z 250 g przez 10 minut w temperaturze 10 °C usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w kompletnym podłożu IMDM w stężeniu około 0,5 x10,6 komórek/ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórkowej do mikroprobówki, wymieszać z tą samą objętością roztworu błękitu trypanowego (0,4%) i policzyć za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Opcjonalnie: ogniwa CD34+ są wzbogacane poprzez magnetyczne sortowanie ogniw za pomocą kulek Milteny CD34 zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Główną zaletą tego etapu wzbogacania jest wykrycie jakości hematopoetycznych komórek macierzystych, które są hodowane na półstałej matrycy z dodatkiem czynnika komórek macierzystych o stężeniu 50 ng/ml (SCF), czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów o stężeniu 20 ng/ml (GM-CSF), interleukiny-3 o stężeniu 20 ng/ml (IL-3), interleukiny-6 o stężeniu 20 ng/ml (IL-6), czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów o stężeniu 20 ng/ml (G-CSF), i 3 różne stężenia EPO, jak w 1.4.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki do 0,1 - 0,15 x 106 komórek jednojądrzastych/ml lub 2 x 103 komórek CD34+/ml, dodając kompletną pożywkę IMDM uzupełnioną EPO i przenieść 300 μl do 3 ml pożywki Methocult H4434. Po wymieszaniu i krótkiej inkubacji przez 5 minut rozlać płytkę trzy razy po 1,1 ml na szalce o średnicy 35 mm. Dwie z tych naczyń hodowlanych wraz z trzecią - wypełnioną wodą - umieszcza się na płytkach o średnicy 100 mm.</li>
		<li>Komórki hoduje się w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 14 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza kolonii
	<ol>
		<li>Kolonie są oceniane zgodnie z ich morfologią za pomocą odwróconego mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu w naczyniu hodowlanym oznaczonym siatką punktacji. Na potrzeby naszego testu jednostki tworzące kolonie (CFU) są klasyfikowane w 4 kategoriach: wielopotencjalne komórki progenitorowe (CFU-GEMM), komórki progenitorowe granulocytów-makrofagów (CFU-GM), jednostki tworzące pęknięcia-erytroidy (BFU-E) i jednostki tworzące kolonie-erytroidy (CFU-E). Zapoznaj się z instrukcjami producenta w celu dalszej podklasyfikacji kolonii.</li>
		<li>W celu dalszej analizy komórki z płytki testowej CFU są odzyskiwane oddzielnie zgodnie z 4 kategoriami przez zawieszenie w 4 ml PBS o temperaturze pokojowej zawierającej 2% FCS/IMDM. Po odwirowaniu w temperaturze 400 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, komórki są ponownie zawieszane w PBS, zliczane i przetwarzane w celu ekstrakcji DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza chimeryzmu
<ol>
	<li>Izolacja DNA
	<ol>
		<li>Granulować komórki przez odwirowanie z prędkością 400 g przez 10 minut.</li>
		<li>Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z krwi (zestaw do ekstrakcji krwi QIAmp DNA). Wstępnie podgrzać bufor elucyjny (AE) w temperaturze 37 °C, aby zwiększyć wydajność eluowanego DNA.</li>
		<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą fotometru widmowego Nanodrop ND-1000. Do dalszej analizy wykorzystuje się próbki o OD 260/280 między 1,8 - 2,0.</li>
		<li>Rozcieńczyć DNA za pomocą H2O wolnego od DNAaz do 0,1 ng/μL w całkowitej objętości 50 μL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza STR
	<ol>
		<li>Ustaw reakcję PCR, mieszając mieszaninę reakcyjną, polimerazę DNA AmplTaq Gold i zestaw starterów Profiler Plus z 20 μl genomowego DNA (0,1 ng/μL) zgodnie z instrukcją (zestaw starterów zawiera nieznakowane startery w buforze do amplifikacji loci STR D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 i D7S820, i marker płci amelogenina). Uwzględnij wodę wolną od nukleaz jako kontrolę ujemną i 9947A jako kontrolę pozytywną. Uwzględniono również DNA sprzed przeszczepu zarówno od dawcy, jak i biorcy.</li>
		<li>Przeprowadzić reakcję PCR przy użyciu gradientu mastercyklera Eppendorf w następujących warunkach: 95 °C przez 11 minut, 28 cykli amplifikacji po 95 °C przez 1 minutę, 59 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 1 minutę, a następnie 60°C przez 45 minut.</li>
		<li>Skonfiguruj reakcję analizy fragmentów, dodając 12 μl Hi-Di Formamid i 0,5 μl GeneScan 500 ROX Size Standard (wszystkie Applied Biosystems) do 1 μl produktu PCR. Na pierwszym i ostatnim stanowisku potrzebna jest drabinka alleliczna (Genotyper AmpFlSTR Blue, Green II i Yellow, Applied Biosystems).</li>
		<li>Rozpocznij elektroforezę i akwizycję za pomocą przyrządu do elektroforezy.</li>
		<li>Analizuj loci, allele i wysokości pików próbek i kontroli za pomocą oprogramowania13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Angelucci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+thalassemia+major+and+sickle+cell+disease%3A+indications+and+management+recommendations+from+an+international+expert+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel.</a> Haematologica. 99, 811-820 (2014).</li>
<li>Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+thalassemia+and+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825(2012).</li>
<li>Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+chimerism+in+haemoglobinopathies%3A+from+risk+of+graft+rejection+to+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance.</a> Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).</li>
<li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+mixed+chimerism+in+patients+transplanted+for+the+treatment+of+thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia.</a> Blood. 87, 3494-3499 (1996).</li>
<li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+of+ex-thalassemic+patients+with+persistent+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation.</a> Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).</li>
<li>Kumar, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+prophylactic+ex+vivo+costimulated+donor+leukocyte+infusion+after+reduced-intensity+conditioned+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).</li>
<li>Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+follow-up+studies+of+recipients+of+T-cell+depleted+allogeneic+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow.</a> Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).</li>
<li>McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemopoietic+chimerism+following+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation.</a> Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).</li>
<li>Dewald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter+investigation+with+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+using+X-+and+Y-chromosome+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes.</a> Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).</li>
<li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitatively+different+red+cell%2Fnucleated+cell+chimerism+in+patients+with+long-term%2C+persistent+hematopoietic+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplantation+for+thalassemia+major+or+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease.</a> Haematologica. 96, 128-133 (2011).</li>
<li>Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+chimerism+between+nucleated+and+red+blood+cells+after+bone+marrow+transplantation+for+haemoglobinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Chimerism%22%5BJournal%5D)">Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies.</a> Chimerism. 2, 21-22 (2011).</li>
<li>Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+management+of+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplant+in+beta-thalassemia+major%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major.</a> Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).</li>
<li>Kimpton, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+DNA+profiling+employing+multiplex+amplification+of+short+tandem+repeat+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci.</a> PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).</li>
<li>Centis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+erythroid+expansion+in+determining+the+extent+of+apoptosis+in+erythroid+precursors+in+patients+with+beta-thalassemia+major%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major.</a> Blood. 96, 3624-3629 (2000).</li>
<li>Miccio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+genetically+modified+erythroblastic+progenitors+leads+to+long-term+correction+of+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem niniejszego badania jest przedstawienie słuchaczom kombinacji dwóch podejść do analizy chimeryzmu dawcy/biorcy w erytroidalnych progenitorach po HSCT u pacjentów leczonych z powodu hemoglobinopatii: 1.) aktywowane fluorescencją sortowanie komórek progenitorowych hematopoetycznych w próbkach szpiku kostnego, a następnie analiza krótkich powtórzeń tandemowych i 2.) Wzrost komórek szpiku kostnego w jednostkach tworzących kolonie, klasyfikacja kolonii w różnych typach progenitorów, a następnie analiza krótkich powtórze...

Allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) jest jedynym dostępnym sposobem leczenia różnych wrodzonych zaburzeń genetycznych układu krwiotwórczego, osiągając wskaźniki przeżycia wolne od choroby na poziomie ponad 90% dla pacjentów z wysokim upośledzeniem i ograniczonym życiem1. Skuteczność tego ważnego narzędzia terapeutycznego została zoptymalizowana poprzez ograniczenie toksyczności schematów przed i po przeszczepie2, ale także poprzez interwencje mające na celu utrzymanie stabilnej funkcji przeszczepu, która jest określana ilościowo przez ścisłe monitorowanie komórek pochodzących od dawcy3,4,5.
Ogólnie rzecz biorąc, całkowity chimeryzm (CC) oznacza całkowite zastąpienie kompartmentu limfohematopoetycznego przez komórki pochodzące od dawcy, podczas gdy termin mieszany chimeryzm (MC) jest używany, gdy komórki pochodzące od dawcy i biorcy są jednocześnie obecne w różnych proporcjach. Chimeryzm rozdwojony (SC) oznacza współistnienie chimeryzmu mieszanego obserwowanego w liniach jednokomórkowych, takich jak przedział erytroidalny. Szybkie określenie statusu chimeryzmu po HSCT ma kluczowe znaczenie, ponieważ może pomóc w identyfikacji pacjentów podatnych na nawrót choroby i zainicjowaniu kolejnych strategii immunomodulacyjnych, takich jak infuzje limfocytów dawcy lub zmniejszenie terapii immunosupresyjnych6.
Opracowano kilka metod monitorowania wszczepienia po HSCT. Izotypowanie immunoglobulin i analiza cytogenetyki mają słabą czułość i ograniczoną zdolność do wykrywania polimorfizmu7,8. Wprowadzenie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) może zwiększyć czułość w monitorowaniu chimeryzmu po HSCT, ale jest ograniczone do niedopasowanych płciowo przeszczepów allogenicznych9. Obecnie reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest najbardziej rozpowszechnioną metodą stosowaną do wykrywania chimeryzmu i opiera się na konwencjonalnej elektroforezie w żelu agarozowo-akrylowym o zmiennej liczbie powtórzeń tandemowych (VNTR) lub krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Rutynowo stosowany ilościowy PCR jest w stanie wykryć bardzo mały odsetek pozostałych komórek dawcy po HSCT. Głównym ograniczeniem dotychczasowych badań jest to, że wykrywanie MC ogranicza się prawie wyłącznie do obecności komórek jądrzastych, a nie dojrzałych erytrocytów, czyli komórek, które są funkcjonalnie kluczowe dla pacjentów dotkniętych hemoglobinopatiami. U pacjentów z różnymi grupami krwi warto pamiętać, że analiza cytofluorometryczna jest w stanie zidentyfikować chimeryzm w czerwonych krwinkach poprzez wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenom erytrocytów ABO i C, c, D, E i e10,11. Innym, ale bardzo interesującym sposobem oceny chimeryzmu w linii erytroidalnej jest połączenie sortowania progenitorów erytroidalnych metodą cytometrii przepływowej i selekcji różnych typów progenitorów erytroidalnych poprzez hodowlę w testach klonogennych, a następnie analizę STR12. Podejście to jest w stanie określić ilościowo względne proporcje chimeryzmu dawca kontra biorca w przedziale erytroidalnym i może być wykorzystane w strategii utrzymania przeszczepu szpiku kostnego.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>GE17-1440-02&nbsp;</td><td>Usuń RBC</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Rurki przepływowe 12 x 75 mm</td><td>Sortowanie Falcon</td><td>352002</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000-044</td><td>FCS (inaktywowany termicznie)</td></tr><tr><td>CD34 APC</td><td>BD Bioscience</td><td>561209</td><td>FACS-Ab</td></tr><tr><td>CD36 FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>555454</td><td>FACS-Ab</td></tr><tr><td>CD45 V450</td><td>BD Bioscience</td><td>642275</td><td>FACS-Ab</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Automatyczne zliczanie komórek</td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Bufor zawiesinowy w analizie FACS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Składnik bufora zawiesinowego</td></tr><tr><td>FcR</td><td>BD Bioscience</td><td>564220</td><td>Blok FCR</td></tr><tr><td>FACS Aria I</td><td>BD Bioscience</td><td>23-11539-00</td><td>Sortownik FACS</td></tr><tr><td>Rekombinowana&nbsp; ludzka erytropoetyna</td><td>Affimetrix eBioscience</td><td>14-8992-80</td><td>EPO</td></tr><tr><td>Isocove" s Zmodyfikowany Dulbecco" s Medium</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>hodowlanej Kulki magnetyczne CD34+</td><td>Milteny Biotech</td><td>130-046-702</td><td>CD34+ oczyszczanie</td></tr><tr><td>Rekombinant&nbsp; ludzki G-CSF</td><td>Gibco</td><td>PHC2031</td><td>Test CFU</td></tr><tr><td>Rekombinant&nbsp; ludzki SCF</td><td>Gibco</td><td>CTP2113</td><td>Test CFU</td></tr><tr><td>Rekombinant&nbsp; ludzki GM-CSF</td><td>Gibco</td><td>PHC2015</td><td>Test CFU</td></tr><tr><td>Rekombinowany&nbsp; ludzki IL-3</td><td>BD Bioscience</td><td>554604</td><td>Test CFU</td></tr><tr><td>Rekombinowany&nbsp; ludzki IL-6</td><td>BD Bioscience</td><td>550071</td><td>Test CFU</td></tr><tr><td>Methocult H4434 Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4444</td><td>Test CFU</td></tr><tr><td>QiAmp DNA Zestaw do ekstrakcji krwi</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>Izolacja DNA</td></tr><tr><td>Nanodrop Fotometr widmowy ND-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND 1000</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Wolne od DNAazy H2O</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEREN0521</td><td>Preparat DNA</td></tr><tr><td>AmplTaq Gold Applied</td><td>Bioscience</td><td>N8080240</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Eppendorf mastercycler gradient</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td>PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamid</td><td>Applied Bioscience</td><td>4311320</td><td>PCR</td></tr><tr><td>GeneScan 500 ROX Rozmiar Standardowy</td><td>Applied Bioscience</td><td>4310361</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3130 Analizator genetyczny</td><td>Applied Bioscience</td><td>313001R</td><td>PCR</td></tr></tbody></table>

wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

Obecność niepełnego chimeryzmu jest zauważana u dużego odsetka pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego z powodu talasemii większej lub niedokrwistości sierpowatokrwinkowej. Obserwacja ta ma ogromne implikacje, ponieważ kolejne strategie immunomodulacji terapeutycznej mogą poprawić wyniki kliniczne. Konwencjonalnie, analiza oparta na reakcji łańcuchowej polimerazy krótkich powtórzeń tandemowych jest stosowana do identyfikacji chimeryzmu w komórkach krwi pochodzących od dawcy. Jednak ta metoda jest ograniczona do komórek jądrzastych i nie może rozróżnić zdysocjowanych linii jednokomórkowych. Zastosowaliśmy analizę krótkich powtórzeń tandemowych do krwiotwórczych komórek progenitorowych posortowanych cytometrią przepływową i porównaliśmy to z analizą krótkich powtórzeń tandemowych uzyskanych z wybranej jednostki tworzącej pęknięcia - kolonii erytroidalnych, pobranych ze szpiku kostnego. Dzięki tej metodzie jesteśmy w stanie wykazać różną proliferację i różnicowanie komórek dawcy w przedziale erytroidalnym. Technika ta kwalifikuje się do pełnego monitorowania chimeryzmu w warunkach przeszczepu komórek macierzystych, a tym samym może być stosowana w przyszłych badaniach klinicznych, badaniach nad komórkami macierzystymi i projektowaniu prób terapii genowej.

Separacja progenitorów limfohematopoetycznych za pomocą sortowania komórek FACS
Przedstawiamy tutaj wyniki sortowania populacji komórek niezbędnych do późniejszej analizy STR. Komórki szpiku kostnego barwiono przeciwciałami anty-CD45 sprzężonymi z V450, anty-CD36 sprzężonymi z FITC oraz anty-CD34 sprzężonymi z APC. Populacją docelową są megakariocytowo-erytroblastyczne komórki progenitorowe (MEP), czyli jądrowe ...

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie chimeryzmu w kontekście transplantacji komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii w dziedzinie transplantologii, takich jak przyjęcie się przeszczepu hematopoetycznych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Główną zaletą tej metody jest połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, analizy informacji kolumnowych oraz następującej po nich analizy krótkich powtórzeń w celu oceny proliferacji i różnicowania progenitorów w przedziale erytroidalnym.Zastosowanie tej techniki wykracza poza terapię odrzutów przeszczepów, ponieważ może ona pomóc w identyfikacji pacjentów podatnych na nawroty choroby i wdrożeniu następujących po nich strategii immunomodulacyjnych. Ponadto może ona zostać wykorzystana w przyszłych badaniach klinicznych, badaniach nad komórkami macierzystymi oraz w projektowaniu prób terapeutycznych skóry. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ proces ten jest trudny do opanowania i musi być wykonywany przez przeszkolony personel.Procedurę tę zaprezentuje Elisabeth Hoflehner, technik w moim laboratorium. Aby rozpocząć, należy przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z próbki szpiku kostnego do barwienia tłuszczów. W tym celu należy umieścić szpik kostny w sitku komórkowym i przykręcić je do probówki wirówkowej.Za pomocą tłoka strzykawki przepchnij fragmenty tkanki przez siatkę. Aby zebrać cały materiał, przemyj go kilkoma mililitrami buforu do zawiesiny. Do probówki do wirowania dodaj trzy mililitry medium gradientowego, a następnie ostrożnie nałóż na nie zawiesinę pojedynczych komórek.Wirować probówkę z prędkością 550 G w temperaturze 20 °C przez 30 minut, przy ustawieniu przyspieszenia na 9 i hamowania na 0. Za pomocą pipety usunąć górną warstwę zawierającą plazmę i płytki krwi, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórek mononuklearnych na styku faz. Przenieść tę warstwę komórek mononuklearnych do probówki do wirowania.Następnie należy przemyć komórki 10 mililitrami buforu zawiesinowego. Wirować probówkę z prędkością 250 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach kompletnego medium Isokov's modified dulbecco's, pipetując.Aby określić stężenie komórek za pomocą hemocytometru, należy nalać 95 µL 2% barwnika trypan blue do płytki 96-dołkowej. Dodać 5 µL zawiesiny komórkowej, dokładnie wymieszać i inkubować przez krótki czas w temperaturze pokojowej. Napełnić hemocytometr i obserwować go pod mikroskopem.Należy policzyć wyłącznie zabarwione żywe komórki. Następnie zawiesinę komórkową odwiruj przy 250 G w temperaturze 25 °C przez 10 minut. W celu zablokowania receptorów FC należy użyć 2,5 µg blokera na 100 µl.Inkubować na lodzie od 10 do 15 minut. Dodać kombinację uprzednio mianowanych przeciwciał monoklonalnych odpowiednią dla objętości użytej do barwienia komórek. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 20 minut.Przemyj komórki trzema mililitrami buforu do barwienia, a następnie odwiruj je w wirówce. Po dostosowaniu stężenia komórek przenieś zawiesinę komórkową do standardowej probówki do cytometrii przepływowej, przelewając ją przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm w celu usunięcia agregatów. Następnie skonfiguruj i zoptymalizuj sorter komórkowy oraz oprogramowanie zgodnie z instrukcjami producenta.Przygotuj szablon zawierający wykres bivariantny do wyświetlenia rozproszenia przedniego (FSC) oraz rozproszenia bocznego (SSC). Aby odpowiednio przeskalować populację komórek, przeprowadź analizę komórek na sorterze i dostosuj parametry FSC oraz SSC. Rozpocznij od zarejestrowania danych dla probówki z kontrolą negatywną, a następnie zarejestruj dane dla każdej probówki kontrolnej do kompensacji pojedynczego barwienia i oblicz wartość kompensacji.Następnie nanieś próbki eksperymentalne na dwuwymiarowy wykres kropkowy FSC przeciwko SSC, aby objąć zarówno komórki limfocytarne, jak i mieloidalne. Porównując różne sygnały FSC, wyeliminuj dublety i agregaty. Następnie zwizualizuj pojedyncze komórki wykazujące ekspresję CD45 i CD36 na dwuwymiarowym wykresie kropkowym.Zdarzenia dodatnie pod kątem CD45 reprezentują leukocyty i ich progenitory. Zdarzenia ujemne pod kątem CD45 i dodatnie pod kątem CD36 reprezentują progenitory erytroidalne. Aby zdefiniować komórki dodatnie pod kątem CD36 i CD45, należy użyć narzędzi bramkowania, a następnie zwizualizować zdarzenia dodatnie pod kątem CD45 oraz inny wykres kropkowy przedstawiający parametry CD34 i SSC.Następnie należy użyć narzędzi do bramowania (gating), aby zdefiniować komórki CD34-dodatnie lub progenitorów leukocytów oraz komórki o wysokim SSC lub komórki mieloidalne na różnych etapach różnicowania. Po tym kroku należy wybrać bramki do sortowania do zewnętrznych probówek zbiorczych. Na koniec kontynuuj sortowanie komórek w temperaturze 4 °C aż do uzyskania pożądanej liczby komórek.Rozcieńcz komórki, dodając pełną pożywkę IMDM uzupełnioną o ludzką rekombinowaną erytropoetynę lub EPO. Przenieś 300 µL rozcieńczonych komórek do 3 mL pożywki H4434 i inkubuj przy wytrząsaniu w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie wysiej zawiesinę komórkową w ilości 1 mL na każdą z trzech szalek 35 mm.Umieść dwie szalki hodowlane wraz z trzecią wypełnioną wodą w płycie o średnicy 100 mm. Hoduj komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 przez 14 dni. Użyj mikroskopu odwróconego z powiększeniem 40x oraz szalki hodowlanej z naniesioną siatką pomiarową, aby ocenić kolonie pod kątem ich morfologii.Zaklasyfikuj jednostki tworzące kolonie lub CFU na wielopotencjalne komórki progenitorowe, komórki progenitorowe granulocytów i monocytów, jednostki tworzące wybuchy erytroidalne oraz jednostki tworzące kolonie erytroidalne. Aby rozpocząć, odzyskaj komórki z fax lub płytki do testu CFU zgodnie z protokołem tekstowym i przystąp do ekstrakcji DNA. Po odwirowaniu komórek użyj zautomatyzowanego urządzenia do izolacji DNA z krwi, aby wyizolować kwasy nukleinowe z osadu.Zmierz stężenie DNA przy użyciu fluorometru. Przygotuj próbki zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie umieść próbkę w komorze pomiarowej fluorometru. Aby przygotować reakcję PCR zgodnie z instrukcją, dodaj rozcieńczone DNA do mieszaniny polimerazy DNA, zestawu starterów oraz mieszaniny reakcyjnej.Do analizy należy włączyć DNA pobrane przed przeszczepem od dawcy i biorcy, a także wodę wolną od nukleaz jako kontrolę negatywną oraz próbkę 9947A jako kontrolę pozytywną. W celu analizy wyników PCR należy dodać 10 µL zdenaturowanych próbek DNA do dołków płytki reakcyjnej z 96 dołkami. Płytkę należy szczelnie zamknąć, krótko odwirować i umieścić na lodzie.Megakariocytarno-erytroidalne komórki progenitorowe wyselekcjonowano jako populację wykazującą ekspresję antygenu CD36 i brak ekspresji antygenu CD45. Dodatkowo, komórki CD45-dodatnie i CD34-dodatnie zidentyfikowano jako limfoidalno-mieloidalne komórki prekursorowe, a komórki CD45-dodatnie z wysokim sygnałem SSC jako dojrzałe komórki mieloidalne. Czystość erytroidalnych komórek progenitorowych po sortowaniu przekraczała 85%, a czystość komórek mieloidalnych przekraczała 95%. Komórki szpiku kostnego wyseparowane za pomocą magnetycznych kuleczek specyficznych dla CD34 hodowano przez 14 dni.Niektóre z tych komórek wydają się proliferować, różnicować i tworzyć kolonie. Stymulacja różnymi stężeniami EPO zwiększyła tworzenie wyraźnie czerwonych kolonii erytroidalnych. Analiza PCR krótkich tandemowych powtórzeń (STR) specyficznych dla DNA biorcy i dawcy pozwala wykryć chimeryzm w komórkach.Niniejsza metoda pozwoliła na pomyślne oznaczenie ilości DNA biorcy w stosunku do DNA dawcy w komórkach uzyskanych z sortowania komórek szpiku kostnego, a także w komórkach uzyskanych z testu klonogennego. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje cztery godziny. Przystępując do wykonania tej procedury, należy pamiętać, że technika ta wymaga standaryzacji i powinna być przeprowadzana przez odpowiednio przeszkolony personel.Po przeprowadzeniu tej procedury można poddać dalszej analizie pozostałe erytroidalne komórki progenitorowe pochodzące od dawcy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak kwestia selektywnej przewagi genetycznie skorygowanych erytroidalnych komórek macierzystych. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie transplantacji komórek macierzystych do badania proliferacji i różnicowania progenitorów w komponencie erytroidalnym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat monitorowania engraftmentu po transplantacji komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami.

detection-residual-donor-erythroid-progenitor-cells-after

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Metoda cytometrii przepływowej do identyfikacji i analizy molekularnej mysich progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stadium różnicowania, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodowej myszy. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych CD71, Ter119 oraz wielkości komórek.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania konkurencyjnych eksperymentów z przeszczepem szpiku kostnego myszy w celu zbadania funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych bez wcześniejszego oczyszczania komórek macierzystych przez sortowanie komórek.

Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Modelowanie erytropoezy daje cenną szansę na zrozumienie biologicznego znaczenia aktorów w tym procesie i ocenę nowych podejść terapeutycznych, które mogą złagodzić wady różnicowania. W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę skutecznego różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ ex vivo.

Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

Poznaj metodę monitorowania chimerizmu po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Technika łączy cytometrię przepływową, hodowlę kolonii i analizę STR, umożliwiając ocenę proliferacji i różnicowania progenitorów erytroidalnych.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Przeglądaj więcej filmów