Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie chimeryzmu w kontekście transplantacji komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii w dziedzinie transplantologii, takich jak przyjęcie się przeszczepu hematopoetycznych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Główną zaletą tej metody jest połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, analizy informacji kolumnowych oraz następującej po nich analizy krótkich powtórzeń w celu oceny proliferacji i różnicowania progenitorów w przedziale erytroidalnym.

Zastosowanie tej techniki wykracza poza terapię odrzutów przeszczepów, ponieważ może ona pomóc w identyfikacji pacjentów podatnych na nawroty choroby i wdrożeniu następujących po nich strategii immunomodulacyjnych. Ponadto może ona zostać wykorzystana w przyszłych badaniach klinicznych, badaniach nad komórkami macierzystymi oraz w projektowaniu prób terapeutycznych skóry. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ proces ten jest trudny do opanowania i musi być wykonywany przez przeszkolony personel.

Procedurę tę zaprezentuje Elisabeth Hoflehner, technik w moim laboratorium. Aby rozpocząć, należy przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z próbki szpiku kostnego do barwienia tłuszczów. W tym celu należy umieścić szpik kostny w sitku komórkowym i przykręcić je do probówki wirówkowej.

Za pomocą tłoka strzykawki przepchnij fragmenty tkanki przez siatkę. Aby zebrać cały materiał, przemyj go kilkoma mililitrami buforu do zawiesiny. Do probówki do wirowania dodaj trzy mililitry medium gradientowego, a następnie ostrożnie nałóż na nie zawiesinę pojedynczych komórek.

Wirować probówkę z prędkością 550 G w temperaturze 20 °C przez 30 minut, przy ustawieniu przyspieszenia na 9 i hamowania na 0. Za pomocą pipety usunąć górną warstwę zawierającą plazmę i płytki krwi, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórek mononuklearnych na styku faz. Przenieść tę warstwę komórek mononuklearnych do probówki do wirowania.

Następnie należy przemyć komórki 10 mililitrami buforu zawiesinowego. Wirować probówkę z prędkością 250 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach kompletnego medium Isokov's modified dulbecco's, pipetując.

Aby określić stężenie komórek za pomocą hemocytometru, należy nalać 95 µL 2% barwnika trypan blue do płytki 96-dołkowej. Dodać 5 µL zawiesiny komórkowej, dokładnie wymieszać i inkubować przez krótki czas w temperaturze pokojowej. Napełnić hemocytometr i obserwować go pod mikroskopem.

Należy policzyć wyłącznie zabarwione żywe komórki. Następnie zawiesinę komórkową odwiruj przy 250 G w temperaturze 25 °C przez 10 minut. W celu zablokowania receptorów FC należy użyć 2,5 µg blokera na 100 µl.

Inkubować na lodzie od 10 do 15 minut. Dodać kombinację uprzednio mianowanych przeciwciał monoklonalnych odpowiednią dla objętości użytej do barwienia komórek. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 20 minut.

Przemyj komórki trzema mililitrami buforu do barwienia, a następnie odwiruj je w wirówce. Po dostosowaniu stężenia komórek przenieś zawiesinę komórkową do standardowej probówki do cytometrii przepływowej, przelewając ją przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm w celu usunięcia agregatów. Następnie skonfiguruj i zoptymalizuj sorter komórkowy oraz oprogramowanie zgodnie z instrukcjami producenta.

Przygotuj szablon zawierający wykres bivariantny do wyświetlenia rozproszenia przedniego (FSC) oraz rozproszenia bocznego (SSC). Aby odpowiednio przeskalować populację komórek, przeprowadź analizę komórek na sorterze i dostosuj parametry FSC oraz SSC. Rozpocznij od zarejestrowania danych dla probówki z kontrolą negatywną, a następnie zarejestruj dane dla każdej probówki kontrolnej do kompensacji pojedynczego barwienia i oblicz wartość kompensacji.

Następnie nanieś próbki eksperymentalne na dwuwymiarowy wykres kropkowy FSC przeciwko SSC, aby objąć zarówno komórki limfocytarne, jak i mieloidalne. Porównując różne sygnały FSC, wyeliminuj dublety i agregaty. Następnie zwizualizuj pojedyncze komórki wykazujące ekspresję CD45 i CD36 na dwuwymiarowym wykresie kropkowym.

Zdarzenia dodatnie pod kątem CD45 reprezentują leukocyty i ich progenitory. Zdarzenia ujemne pod kątem CD45 i dodatnie pod kątem CD36 reprezentują progenitory erytroidalne. Aby zdefiniować komórki dodatnie pod kątem CD36 i CD45, należy użyć narzędzi bramkowania, a następnie zwizualizować zdarzenia dodatnie pod kątem CD45 oraz inny wykres kropkowy przedstawiający parametry CD34 i SSC.

Następnie należy użyć narzędzi do bramowania (gating), aby zdefiniować komórki CD34-dodatnie lub progenitorów leukocytów oraz komórki o wysokim SSC lub komórki mieloidalne na różnych etapach różnicowania. Po tym kroku należy wybrać bramki do sortowania do zewnętrznych probówek zbiorczych. Na koniec kontynuuj sortowanie komórek w temperaturze 4 °C aż do uzyskania pożądanej liczby komórek.

Rozcieńcz komórki, dodając pełną pożywkę IMDM uzupełnioną o ludzką rekombinowaną erytropoetynę lub EPO. Przenieś 300 µL rozcieńczonych komórek do 3 mL pożywki H4434 i inkubuj przy wytrząsaniu w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie wysiej zawiesinę komórkową w ilości 1 mL na każdą z trzech szalek 35 mm.

Umieść dwie szalki hodowlane wraz z trzecią wypełnioną wodą w płycie o średnicy 100 mm. Hoduj komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 przez 14 dni. Użyj mikroskopu odwróconego z powiększeniem 40x oraz szalki hodowlanej z naniesioną siatką pomiarową, aby ocenić kolonie pod kątem ich morfologii.

Zaklasyfikuj jednostki tworzące kolonie lub CFU na wielopotencjalne komórki progenitorowe, komórki progenitorowe granulocytów i monocytów, jednostki tworzące wybuchy erytroidalne oraz jednostki tworzące kolonie erytroidalne. Aby rozpocząć, odzyskaj komórki z fax lub płytki do testu CFU zgodnie z protokołem tekstowym i przystąp do ekstrakcji DNA. Po odwirowaniu komórek użyj zautomatyzowanego urządzenia do izolacji DNA z krwi, aby wyizolować kwasy nukleinowe z osadu.

Zmierz stężenie DNA przy użyciu fluorometru. Przygotuj próbki zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie umieść próbkę w komorze pomiarowej fluorometru. Aby przygotować reakcję PCR zgodnie z instrukcją, dodaj rozcieńczone DNA do mieszaniny polimerazy DNA, zestawu starterów oraz mieszaniny reakcyjnej.

Do analizy należy włączyć DNA pobrane przed przeszczepem od dawcy i biorcy, a także wodę wolną od nukleaz jako kontrolę negatywną oraz próbkę 9947A jako kontrolę pozytywną. W celu analizy wyników PCR należy dodać 10 µL zdenaturowanych próbek DNA do dołków płytki reakcyjnej z 96 dołkami. Płytkę należy szczelnie zamknąć, krótko odwirować i umieścić na lodzie.

Megakariocytarno-erytroidalne komórki progenitorowe wyselekcjonowano jako populację wykazującą ekspresję antygenu CD36 i brak ekspresji antygenu CD45. Dodatkowo, komórki CD45-dodatnie i CD34-dodatnie zidentyfikowano jako limfoidalno-mieloidalne komórki prekursorowe, a komórki CD45-dodatnie z wysokim sygnałem SSC jako dojrzałe komórki mieloidalne. Czystość erytroidalnych komórek progenitorowych po sortowaniu przekraczała 85%, a czystość komórek mieloidalnych przekraczała 95%. Komórki szpiku kostnego wyseparowane za pomocą magnetycznych kuleczek specyficznych dla CD34 hodowano przez 14 dni.

Niektóre z tych komórek wydają się proliferować, różnicować i tworzyć kolonie. Stymulacja różnymi stężeniami EPO zwiększyła tworzenie wyraźnie czerwonych kolonii erytroidalnych. Analiza PCR krótkich tandemowych powtórzeń (STR) specyficznych dla DNA biorcy i dawcy pozwala wykryć chimeryzm w komórkach.

Niniejsza metoda pozwoliła na pomyślne oznaczenie ilości DNA biorcy w stosunku do DNA dawcy w komórkach uzyskanych z sortowania komórek szpiku kostnego, a także w komórkach uzyskanych z testu klonogennego. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje cztery godziny. Przystępując do wykonania tej procedury, należy pamiętać, że technika ta wymaga standaryzacji i powinna być przeprowadzana przez odpowiednio przeszkolony personel.

Po przeprowadzeniu tej procedury można poddać dalszej analizie pozostałe erytroidalne komórki progenitorowe pochodzące od dawcy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak kwestia selektywnej przewagi genetycznie skorygowanych erytroidalnych komórek macierzystych. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie transplantacji komórek macierzystych do badania proliferacji i różnicowania progenitorów w komponencie erytroidalnym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat monitorowania engraftmentu po transplantacji komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami.