Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Ogólnym celem tej procedury jest efektywne uzyskanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą episomalnego przeprogramowania z dwóch różnych rodzajów płodowych komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc w zapewnieniu źródła pluripotencjalnych komórek macierzystych do inżynierii tkankowej, modelowania chorób, badań podstawowych lub badań podłużnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że przeprogramowanie i dojrzewanie iPSC odbywa się w warunkach zdefiniowanych chemicznie, a jednocześnie jest wcześnie dostępne dla potencjalnych terapii opartych na komórkach pediatrycznych.

Tę procedurę zademonstruje Steven McClellan, główny badacz, i ja. Łożysko należy uzyskać jak najszybciej po urodzeniu. Wytnij dziewięciocentymetrowy segment owodni i umyj go w 50-milimetrowej probówce wirówkowej z 30 mililitrami PBS uzupełnionymi antybiotykiem, roztworem przeciwgrzybiczym.

Usuń skrzepy krwi z błon, a następnie użyj pary drobnych skalpeli, aby zmielić błony na drobne kawałki w sterylnym 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowych. Użyj ostrzy skalpela, aby przenieść zmieloną masę tkanki błonowej do jednej probówki dysocjacyjnej tkanek zawierającej 4,7 mililitra pożywki RPMI-1640. Wymieszać enzymy dysocjacyjne.

Zamontuj rurkę na dysocjatorze tkankowym i uruchom program h_tumor_01. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na bujanej platformie przez 30 minut. Następnie rozcieńczyć zawiesinę 35 mililitrami RPMI-1640 i nałożyć na 70-mikronowe sitko umieszczone nad 50-mililitrową probówką wirówkową.

Wirować przez pięć minut w temperaturze 200 razy g w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach RPMI-1640 i policz komórki za pomocą hemocytometru. Wysiewać komórki w skupiskach komórek o gęstości około 10 000 komórek na centymetr kwadratowy do kolb do hodowli tkankowych ze świeżo przygotowanym podłożem AFMC uzupełnionym antybiotykiem, roztworem przeciwgrzybiczym.

Zbierz płyn owodniowy o niskiej liczbie pasażowania i błonowe komórki macierzyste do przeprogramowania z jednej kolby T75, dodając dwa mililitry enzymu odłączającego komórki do arkusza komórek. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do ośmiu minut. Po odwirowaniu w ilości 200 razy g przez 45 minut, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS i dobrze wymieszać, aby zmyć składniki surowicy.

Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie dostosuj gęstość komórek do 100 000 komórek na mililitr PBS, a teraz umieść je w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych. Umieść probówki do mikrowirówek w pięciomililitrowych probówkach polistyrenowych, aby umożliwić odwirowanie w zwykłym sterze wahadłowym i odwiruj przy 200 gach przez cztery minuty w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu odwróć probówki i wyrzuć supernatant do pojemnika na odpady, a następnie wykonaj dodatkowy etap wirowania w temperaturze 200 razy g przez trzy minuty. Po odwirowaniu użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby ostrożnie zassać pozostały płyn z probówek. Umieść końcówki do transfekcji, probówkę, bufor do reprodukcji zawiesiny i bufor elektrolityczny w komorze do hodowli tkankowej.

Zbliż urządzenie do transfekcji, aby jego stację metrową można było umieścić bezpośrednio w szafce. Napełnij jedną probówkę transfekcyjną trzema mililitrami buforu elektrolitycznego i zamontuj rurkę w stacji, wciskając ją do końca do szczeliny. Wyjmij wcześniej przygotowane porcje roztworu plazmidu do przeprogramowania z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i pozwól im rozmrozić się w temperaturze pokojowej w komorze hodowlanej.

Ustaw parametry transfekcji w urządzeniu tak, aby dostarczały jeden impuls 40 milisekund przy napięciu 950 woltów. Zawiesić osad zawierający 100 000 komórek w 10 mikrolitrach buforu do resuspensji. Pracując szybko, dodaj 1/10 roztworu plazmidu przeprogramowującego do zawieszonych komórek.

Zamontuj końcówkę do transfekcji na pipecie do transfekcji. Następnie zassać zawiesinę komórkową do końcówki transfekcyjnej, ostrożnie, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Włóż pipetę do transfekcji do rurki do transfekcji.

I naciśnij przycisk start na ekranie urządzenia do transfekcji. Poczekaj na komunikat ekranowy dotyczący powodzenia transfekcji. Następnie natychmiast wyjmij pipetę z probówki.

Wyrzuć zawiesinę do jednego z docelowych sześciodołkowych płytek. Wymieszaj pożywkę z sąsiedniej studni i równomiernie rozprowadź zawiesinę w obu studzienkach. Powtórzyć transfekcję dla każdej probówki mikrowirówki z komórkami.

Zacznij od dodania 30 mikrolitrów 0,5 milimolowego EDTA i PBS do pięciu probówek PCR. Następnie załaduj końcówkę na pipetę o pojemności 10 mikrolitrów ustawioną na dwa mikrolitry. Trzymaj końcówkę pipety pod kątem na krawędzi kolonii i ostrożnie, stopniowo zeskrob całą kolonię z powierzchni.

Natychmiast odessać całą kolonię do końcówki pipety i przenieść ją do jednej z przygotowanych probówek PCR z EDTA. Po powtórzeniu procesu z czterema innymi koloniami inkubuj w temperaturze pokojowej przez cztery do sześciu minut. Użyj większej końcówki pipety, aby delikatnie pipetować każdą zawiesinę komórek w górę i w dół, aby rozbić kolonię na mniejsze grudki.

Należy unikać tworzenia zawiesiny jednokomórkowej. Następnie umieść zawiesinę bezpośrednio w dołku docelowym 24-dołkowej płytki pokrytej rekombinowaną witronektyną. Po powtórzeniu procesu dla pozostałych rodzin inkubować przez trzy do sześciu dni.

Po czterech do sześciu dniach, gdy kolonie urosną i staną się zwarte, umyj arkusze komórek 300 mikrolitrami 0,5 milimolowego EDTA i natychmiast odessać. Następnie dodaj kolejne 300 mikrolitrów i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po zassaniu EDTA ustaw pipetę o pojemności jednego mililitra na pojemność, zamontuj na końcówce o szerokości jednego mililitra i zasysaj pożywkę E8 z dołka docelowego sześciodołkowej płytki pokrytej witronektyną.

Wlej strumień pożywki do jednego dołka płytki źródłowej, aby zmyć kulturę iPSC. Następnie przenieś zawiesinę do dołka docelowego i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby rozbić kolonie na grudki po 20 do 40 komórek. Po posianiu wszystkich komórek upewnij się, że grudki są równomiernie rozłożone, delikatnie kołysząc i potrząsając płytką.

Następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora w celu przylegania grudek i wzrostu kolonii. Płyn owodniowy i błonowe komórki macierzyste, które reprezentują komórki źródłowe do przeprogramowania, wykazują typową mezenchymalną morfologię, wydłużoną i jasną fazowo. Komórki nabywają właściwości nabłonkowe po przejściu przejścia mezenchymalnego do nabłonkowego, co prowadzi do powstania kolonii z komórkami przypominającymi kostkę brukową.

Kolonie te namnażają się i tworzą nieregularne masy komórkowe komórek MET. Na późniejszych etapach przeprogramowania pojawiają się kolonie w pełni przeprogramowanych komórek, indywidualnie rozróżnialne komórki z dobrze zdefiniowanymi granicami. Te w pełni przeprogramowane komórki są obecne obok kolonii MET, które są liczniejsze.

Pokazano tutaj w pełni przeprogramowany, odizolowany dojrzały klon. Po wyprowadzeniu i dojrzewaniu iPSC można je poddać szczegółowej charakterystyce i skierować różnicowanie na różne typy komórek. Nie zapominaj, że praca z tkankami ludzkimi, które nie zostały przebadane pod kątem obecności patogenów, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej i praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować pluripotencję w płodowych komórkach macierzystych, jakich odczynników i sprzętu używać oraz jak rutynowo hodować pluripotencjalne komórki macierzyste.