Name: Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę przeprogramowania komórek macierzystych z płynu owodniowego i błon do iPSC przy użyciu nieintegrującego wektora episomalnego w warunkach w pełni zdefiniowanych chemicznie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fonds Medizinische Forschung na Uniwersytecie w Zurychu, Forschungskredit Uniwersytetu w Zurychu, SCIEX NMSCh w ramach stypendiów 10.216 i 12.176, Szwajcarskie Towarzystwo Kardiologiczne, Szwajcarską Narodową Fundację Nauki w ramach grantu [320030-122273] i [310030-143992], 7. program ramowy, Life Valve, Komisję Europejską w ramach grantu [242008], Fundację Olgi Mayenfisch, Fundacja EMDO, Start-up Grant 2012 Szpitala Uniwersyteckiego w Zurychu oraz wewnętrzne finansowanie Mitchell Cancer Institute.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Trounson, A., DeWitt, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+progressing+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells progressing to the clinic.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).</li>
<li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatally+fabricated+autologous+human+living+heart+valves+based+on+amniotic+fluid+derived+progenitor+cells+as+single+cell+source%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source.</a> Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).</li>
<li>Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatally+harvested+cells+for+cardiovascular+tissue+engineering%3A+Fabrication+of+autologous+implants+prior+to+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth.</a> Placenta. 32, S316-S319 (2011).</li>
<li>Weber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatally+engineered+autologous+amniotic+fluid+stem+cell-based+heart+valves+in+the+fetal+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation.</a> Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).</li>
<li>Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+living+cardiac+and+venous+valve+replacements%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects.</a> Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).</li>
<li>Slamecka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-integrating+episomal+plasmid-based+reprogramming+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).</li>
<li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Transgene-Free+Amniotic-Fluid-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Autologous+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy.</a> Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).</li>
<li>Pipino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trisomy+21+mid-trimester+amniotic+fluid+induced+pluripotent+stem+cells+maintain+genetic+signatures+during+reprogramming%3A+implications+for+disease+modeling+and+cryobanking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking.</a> Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+umbilical+cord+matrix+and+amniotic+membrane+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells.</a> J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).</li>
<li>Ge, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Amniotic+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+May+Generate+a+Universal+Source+of+Cardiac+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells.</a> Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).</li>
<li>Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPSCs+from+cells+of+fibroblastic+and+epithelial+origin+by+means+of+the+oriP%2FEBNA-1+episomal+reprogramming+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system.</a> Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).</li>
<li>Kang, N. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+antitumor+therapeutic+strategies+of+human+amniotic+membrane+and+amniotic+fluid-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells.</a> Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).</li>
<li>Moschidou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+Acid+Confers+Functional+Pluripotency+to+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cells+in+a+Transgene-free+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach.</a> Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Martí, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).</li>
<li>Chan, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).</li>
<li>Adewumi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).</li>
<li>Müller, F. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioinformatic+assay+for+pluripotency+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bioinformatic assay for pluripotency in human cells.</a> Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).</li>
<li>Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellNet%3A+Network+Biology+Applied+to+Stem+Cell+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering.</a> Cell. 158 (4), 903-915 (2014).</li>
<li>Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRA-1-60+and+TRA-1-81+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Markers+Are+Expressed+on+Podocalyxin+in+Embryonal+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma.</a> STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).</li>
<li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).</li>
<li>Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+to+standardize+teratoma+assays+used+to+define+human+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines.</a> Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Początkowa faza wytwarzania iPSC z płodowych komórek macierzystych polega na ekstrakcji komórek źródłowych z tkanek płodu, ich hodowli, ekspansji i wprowadzeniu plazmidów episomalnych przeprogramowujących. Po tej fazie następuje okres hodowli trwający około 14-18 dni, zanim pierwsze w pełni przeprogramowane kolonie będą mogły się rozmnożyć. Ostatnią fazą jest dojrzewanie klonów iPSC. Wstępna ekstrakcja komórek macierzystych błony owodniowej odbywa się poprzez połączone mechaniczne i enzymatyczne trawienie owodni. Odkryli...

Technologia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do potencjalnych terapii zastępczych komórek, modelowania chorób i rozwoju oraz badań przesiewowych leków i toksykologicznych1,2,3. Terapie zastępcze można koncepcyjnie osiągnąć poprzez wstrzyknięcie komórek, implantację tkanki zróżnicowanej in vitro (takiej jak plastry sercowe) lub sterowaną regenerację za pomocą inżynierii tkankowej. Płyn owodniowy (AFSC) i błonowe komórki macierzyste (AMSC) są doskonałym źródłem komórek do tych interwencji bezpośrednio4,5,6,7 lub jako początkowa populacja komórek do przeprogramowania na pluripotencję8,9,10,11, 12.
Wczesne podejścia wykorzystywały niezdefiniowane systemy hodowli lub metody przeprogramowywania, które wymagały genomowej integracji konstruktów9,10,11,12. W nowszym badaniu wykorzystano pożywkę wolną od ksenozy, mimo że zastosowano mniej zdefiniowaną macierz przyczepu błony podstawnej (BMM), do generowania iPSC z komórek nabłonka płynu owodniowego. Jednak test tworzenia potworniaków nie został uwzględniony w badaniu wraz z bogactwem danych in vitro i molekularnych. Stwierdzono, że komórki nabłonka płynu owodniowego mają około 8-krotnie wyższą wydajność przeprogramowania w porównaniu z fibroblastami noworodków13. W innym badaniu stwierdzono również, że mezenchymalne komórki macierzyste z płynu owodniowego są przeprogramowane do iPSC ze znacznie wyższą wydajnością12.
Pluripotencjalne komórki macierzyste mogą być zróżnicowane w tkanki reprezentatywne dla wszystkich 3 listków zarodkowych, a tym samym mają największy potencjał. Pacjenci pediatryczni mogą odnieść korzyści z prenatalnego pobrania, przeprogramowania i inżynierii tkankowej autologicznych komórek macierzystych płynu owodniowego i komórek macierzystych błony owodniowej w okresie okołoporodowym. Co więcej, stosunkowo niski poziom różnicowania płodowych komórek macierzystych (niższy niż w przypadku dorosłych komórek macierzystych14,15) może teoretycznie pomóc w rozwiązaniu zaobserwowanego zachowania uprzedzeń epigenetycznych od komórek źródłowych w iPSC16.
Tutaj prezentujemy protokół przeprogramowania płynu owodniowego i błonowych komórek macierzystych do pluripotencji w chemicznie zdefiniowanym pożywce E8 wolnej od kseno-ksenozyny na rekombinowanej witonektynie17 (VTN) przy użyciu plazmidów epizodycznych18. Główną zaletą płynu owodniowego i komórek błonowych jako źródła komórek do przeprogramowania jest ich dostępność przed i okołoporodowo, a zatem takie podejście przyniosłoby korzyści głównie badaniom nad inżynierią tkankową u dzieci.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do dysocjacji guza, ludzki</td> system dysocjacji tkanek <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>, zestaw odczynników, zawiera rurki do dysocjacji tkanek i enzymy dysocjacji tkanek</td></tr><tr><td>gentleMACS dysocjator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>system dysocjacji tkanek, dysocjator</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Shandon&handel; Skalpel jednorazowy nr 10, sterylny, pakowany pojedynczo, 5,75 (14,6cm)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3120032</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m sitka komórkowe</td><td>Corning</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni</td><td>Thermo-Fisher</td><td>32404014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>platforma wahadłowa</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 podłoże podstawowe</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>podłoże podstawowe do podłoża</td></tr><tr><td>AFMC FGF 2 Człowiek (wyrażony w E. coli, nieglikozylowany)</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-218</td><td>bFGF, suplement do podłoża AFMC</td></tr><tr><td>EGF Human, Pichia</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-332&nbsp;</td><td>EGF, suplement do podłoża AFMC</td></tr><tr><td>LR3 Insulinopodobny czynnik wzrostu-1 Ludzki rekombinowany</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-022</td><td>IGF, suplement do pożywki AFMC</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana do zarodkowych komórek macierzystych</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10439024</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100X)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15240062&nbsp;</td><td>dla pierwotnego AFSC/AMSC, dla rutynowego AFSC/AMSC nie powinno to być konieczne, nie stosować w pożywce dla transfekowanych komórek!</td></tr><tr><td>Rozwiązanie do odriewania komórek Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>07920</td><td>enzym odłączania komórek</td></tr><tr><td>CryoStor&trade; CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>07930</td><td>kompletna pożywka do zamrażania</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>10010023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>do izolacji plazmidu</td></tr><tr><td>pEP4 E02S EN2K</td><td>Addgene</td><td>20925</td><td>EN2K, czynniki przeprogramowujące Oct4+Sox2, Nanog+Klf4</td></tr><tr><td>pEP4 E02S ET2K</td><td>Addgene</td><td>20927</td><td>ET2K, czynniki przeprogramowania Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4</td></tr><tr><td>pCEP4-M2L</td><td>Addgene</td><td>20926</td><td>M2L, czynniki przeprogramowania c-Myc+LIN28</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop 2000c</td><td>Spektrofotometr</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000C</td></tr><tr><td>Neon&reg; System transfekcji</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MPK5000</td><td>system transfekcji, komponenty: Pipeta Neon - pipeta transfekcyjna Urządzenie Neon - urządzenie do transfekcji</td></tr><tr><td>Neon&reg; System transfekcji 10 i mikro; L Kit</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MPK1025</td><td>zestaw materiałów eksploatacyjnych do systemu transfekcji Neon, zawiera: Końcówka Neon - końcówka transfekcyjna Rurka neonowa - rurka transfekcyjna bufor R - bufor do zawieszania bufor E - bufor elektrolityczny</td></tr><tr><td>Stemolekula&handel; Maślan sodu</td><td>StemGent</td><td>04-0005</td><td>małocząsteczkowy wzmacniacz przeprogramowania</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>StemCell Technologies</td><td>05940</td><td>E8 pożywka</td></tr><tr><td>Witronektyna XF&trade;</td><td>StemCell Technologies</td><td>07180</td><td>VTN, stężenie magazynowe 250 &mikro; g/ml, stosowany do powlekania na poziomie 1 &mikro; g/cm2 bufor do rozcieńczania witronektyny (CellAdhere)</td></tr><tr><td>CellAdhere&trade; Bufor rozcieńczający</td><td>StemCell Technologies</td><td>07183</td><td>bufor do rozcieńczania witronektyny</td></tr><tr><td>UltraPure&trade; 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15575020</td><td>rozcieńczyć PBS do 0,5 mM przed użyciem</td></tr><tr><td>EVOS&reg; System obrazowania FL System mikroskopu</td> obrazowania <td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AMF4300</td><td>LCD</td></tr><tr><td>CKX53 Mikroskop odwrócony</td> Mikroskop <td>do hodowli komórek z kontrastem fazowym</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; 16% formaldehyd (w/v), bez metanolu</td><td>Thermo-Fisher</td><td>28908</td><td>rozcieńczyć do 4% z PBS przed użyciem, rozcieńczony można przechowywać w temperaturze 2-8 & stopni; C przez 1 tydzień</td></tr><tr><td>Perm Buffer III</td><td>BD Biosciences</td><td>558050</td><td>bufor przepuszczalny, schładzanie do -20 &deg; C przed użyciem</td></tr><tr><td>myszy IgG1, &kappa; Kontrola izotypu, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>557782</td><td>kontrolę izotypu dla Oct3/4A, Nanog</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 i kappa; Kontrola izotypu, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>557783</td><td>kontrolę izotypu dla myszy Sox2</td></tr><tr><td>anty-ludzkiej Oct3/4 (ludzka izoforma A), Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>561628</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka Nanog, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>560791</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka Sox-2, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>562139</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgGM, &kappa; Kontrola izotypu, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>401617</td><td>kontrolę izotypu dla TRA-1-60</td></tr><tr><td>IgGM myszy, &kappa; Kontrola izotypu, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>401618</td><td>kontrola izotypu dla TRA-1-81</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka TRA-1-60, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka TRA-1-81, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>330705</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG1, &kappa; Kontrola izotypu, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>400129</td><td>kontrolę izotypu dla myszy SSEA-1</td></tr><tr><td>IgG3, &kappa; Kontrola izotypu, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>401321</td><td>kontrola izotypu dla SSEA-4</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka SSEA-1, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>323010</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka SSEA-4, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>330407</td><td></td></tr><tr><td>Affinipure F(ab')2 Fragment kozy anty-mysi IgG+IgM, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-606-068</td><td>stosować w rozcieńczeniu 1:600 lub dalszym zoptymalizować</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-546-068</td><td>stosować w rozcieńczeniu 1:600 lub dalej zoptymalizować</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>D21490</td><td>roztwór podstawowy 10 mM, dalej rozcieńczyć do 1:12.000 w celu uzyskania roztworu roboczego</td></tr><tr><td>Corning&reg; Matrigel&reg; Obniżony czynnik wzrostu, Phenol Red-Free</td><td>Corning</td><td>356231</td> Base <td>Membrane Matrix (BMM)</td></tr><tr><td>myszy scid-beżowe, samica</td><td>Taconic</td><td>CBSCBG-F</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit (50)</td><td>Zestaw do izolacji RNA</td> <td>Qiagen</td><td>74134</td></tr><tr><td>Kolby T-25, kolby</td><td>Thermo-Fisher</td><td>156367</td><td></td>T-75 poddane obróbce kultur</tr><tr>tkankowych, <td>Thermo-Fisher</td> <td>poddane kulturze tkankowej</td><td></td><td></td>156499</tr><tr><td>Nunc&trade; naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-567-650&nbsp;</td><td>Naczynie do hodowli tkankowych 10 cm</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe, poddane hodowli tkankowej</td><td>Thermo-Fisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer komora licząca (hemacytometr)</td><td>VWR</td><td>15170-173</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade; Pojemnik mroźniczy</td><td>Thermo-Fisher</td><td>5100-0001&nbsp;</td><td>pojemnik do zamrażania</td></tr><tr><td>Probówki FACS, probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, 5 ml</td><td>Corning</td><td>352058</td><td>5 ml probówki polistyrenowe</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf, 1,5 ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>05-402-96</td><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td></tr><tr><td>Probówki do PCR, 200 i mikro; l</td> Końcówki do pipet <td>Thermo-Fisher</td><td>14-222-262</td><td></td></tr><tr><td>, 100 do 1250 i mikro; l</td><td>Thermo-Fisher</td><td>02-707-407</td><td>końcówki do pipet o wąskim otworze 1 ml</td></tr><tr><td>, końcówki do pipet, 5 do 300 i mikro; l</td> Końcówki do pipet <td>Thermo-Fisher</td><td>02-707-410</td><td></td></tr><tr><td>, 0,1 do 10 &mikro; l</td><td>Thermo-Fisher</td><td>02-707-437</td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet o szerokim otworze, 1000 i mikro; l</td><td>VWR</td><td>89049-166</td><td>końcówki o szerokim otworze 1 ml</td></tr><tr><td>szklane Pipety Pasteura</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>etanol, 200 proof</td><td>Thermo-Fisher</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>10153-842</td><td></td></tr><tr><td>komorowe szkło nakrywkowe, 8-dołkowe, szkło borokrzemianowe 1,5 mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>155409</td><td>konfokalne naczynia do hodowli ze szklanym dnem</td></tr><tr><td>Igły 22G</td> Strzykawki insulinowe <td>VWR</td><td>82002-366</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fisher</td><td>22-253-260</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>utrwalanie eksplantowanych potworniaków</td></tr><tr><td>Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip</td><td>Mikromacierz ekspresji Illumina</td><td>BD-103-0204</td><td>, obsługiwana przez PluriTest, wycofana przez producenta</td></tr><tr><td>PrimeView Human Genome U219 Array Plate</td> Mikromacierz <td>ekspresyjna</td><td>Thermo-Fisher</td><td>901605 (dawniej marka Affymetrix), wkrótce będzie obsługiwana przez PluriTest</td></tr><tr><td>GeneChip&trade; Human Genome U133 Plus 2.0 Array</td><td>Thermo-Fisher</td><td>902482</td><td>mikromacierz ekspresji (dawniej marka Affymetrix), obsługiwana przez CellNet, wkrótce obsługiwana przez PluriTest</td></tr><tr><td>PluriTest&reg;</td><td>Coriell Institute</td><td></td><td>www.pluritest.org, bezpłatna usługa do bioinformatycznej oceny pluripotencji, akceptuje dane z mikromacierzy - pliki *.idat z platformy HT-12 v4, wkrótce będą obsługiwać dane sekwencjonowania mikromacierzy U133, U219 i RNA</td></tr><tr><td>CellNet</td><td>Johns Hopkins University</td><td></td><td>cellnet.hms.harvard.edu, bezpłatna usługa do bioinformatycznej identyfikacji typu komórki, w tym plutipotencjalnych komórek macierzystych, na podstawie danych z mikromacierzy U133 - pliki *.cel, wkrótce będą obsługiwać RNA Sekwencjonowanie danych</td></tr></tbody></table>

przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologiczne terapie komórkowe zbliżyły się o krok do rzeczywistości dzięki wprowadzeniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Płodowe komórki macierzyste, takie jak płyn owodniowy i błonowe mezenchymalne komórki macierzyste, reprezentują unikalny typ niezróżnicowanych komórek, który jest obiecujący w inżynierii tkankowej i do przeprogramowania w iPSC na potrzeby przyszłych interwencji pediatrycznych i bankowania komórek macierzystych. Przedstawiony tutaj protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę ekstrakcji i hodowli pierwotnego płynu owodniowego i mezenchymalnych komórek macierzystych błony oraz generowania indukowanych episomalnie pluripotencjalnych komórek macierzystych z tych komórek w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach hodowli z wykorzystaniem ludzkiej rekombinowanej witronektyny i pożywki E8. Opisano również charakterystykę nowych linii poprzez zastosowanie rygorystycznych metod – cytometrii przepływowej, obrazowania konfokalnego, tworzenia potworniaków i profilowania transkrypcji. Nowo wygenerowane linie wyrażają markery embrionalnych komórek macierzystych – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – jednocześnie są ujemne dla markera SSEA-1. Linie komórek macierzystych tworzą potworniaki u myszy scid-beżowych w ciągu 6-8 tygodni, a potworniaki zawierają tkanki reprezentatywne dla wszystkich trzech listków zarodkowych. Profilowanie transkrypcyjne linii poprzez przesłanie danych z mikromacierzy o globalnej ekspresji do bioinformatycznego algorytmu oceny pluripotencji uznało wszystkie linie za pluripotencjalne i dlatego podejście to stanowi atrakcyjną alternatywę dla testów na zwierzętach. Nowe linie iPSC mogą być z łatwością wykorzystywane w dalszych eksperymentach obejmujących optymalizację różnicowania i inżynierię tkankową.

Przed pobraniem płynu owodniowego do celów testów genetycznych i przekazaniem niewielkiej alikwoty płynu do badań uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjentek. Wykorzystanie błony owodniowej w badaniach nie wymaga zgody, ponieważ łożysko jest traktowane jako odpad medyczny. Komórki macierzyste z płynu i błony owodniowej wykazują typowe właściwości mezenchymalne; morfologicznie komórki te mają kształt wrzecionowaty i są jasne w kontraście fazowym. Po przeprogramowaniu komórki przechodzą przej...

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywne uzyskanie indukowanych pluripotencyjnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie episomalne dwóch różnych rodzajów płodowych komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc w zapewnieniu źródła pluripotencyjnych komórek macierzystych do inżynierii tkankowej, modelowania chorób, badań podstawowych lub badań podłużnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że reprogramowanie i dojrzewanie iPSC odbywa się w warunkach chemicznie zdefiniowanych, przy jednoczesnej możliwości ich wczesnego wykorzystania w potencjalnych terapiach komórkowych w pediatrii.Procedurę tę zademonstrują Steven McClellan, główny badacz, oraz ja. Pozyskaj łożyska tak szybko, jak to możliwe po porodzie. Wytnij fragment błony owodniowej o wymiarach dziewięciu centymetrów kwadratowych i przemyj go w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml przy użyciu 30 ml PBS z dodatkiem roztworu antybiotyku i antymykotyku.Usuń skrzepy krwi z błon, a następnie za pomocą pary precyzyjnych skalpeli posiekaj błony na drobne kawałki w sterylnej 10-centymetrowej płytce do hodowli tkanek. Używając ostrzy skalpela, przenieś posiekaną masę tkanki błonowej do jednej probówki do dysocjacji tkanek zawierającej 4,7 milliliters medium RPMI-1640. Dodaj i wymieszaj enzymy dysocjujące.Zamocuj probówkę w dysocjatorze tkanek i uruchom program h_tumor_01. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 °C na platformie kołyszącej przez 30 minut. Dalsze rozcieńczenie zawiesiny przeprowadź za pomocą 35 mL RPMI-1640 i przelej przez sitko o rozmiarze oczek 70 µm umieszczone nad probówką wirówkową o pojemności 50 mL.Wirować przez pięć minut przy 200 ×g w temperaturze pokojowej. Po odlaniu nadsączu, zawiesić osad w pięciu mililitrach RPMI-1640, a następnie policzyć komórki za pomocą komory hemocytometrycznej. Wysiać komórki w formie skupisk z gęstością około 10 000 komórek na centymetr kwadratowy do kolb hodowlanych z aktualnie przygotowanym medium AFMC uzupełnionym o roztwór antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych.Zabierz komórki macierzyste z płynu i błony płodowej o niskim numerze pasażu do przeprogramowania z jednej kolby T75, dodając dwa mililitry enzymu odrywającego komórki do warstwy komórkowej. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć do ośmiu minut. Po wirowaniu przy 200 ×g przez 45 minut, resuspender osad w jednym mililitrze PBS i wymieszaj dokładnie, aby wypłukać składniki surowicy.Policz komórki przy użyciu hemocytometru. Następnie dostosuj gęstość komórek do poziomu 100 000 komórek na mililitr PBS i rozdziel je do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Umieść probówki do mikrocentryfugi w polistyrenowych probówkach o pojemności pięciu mililitrów, aby umożliwić wirowanie w zwykłym wirniku z koszyczkami, i wiruj przy 200 ×g przez cztery minuty w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu odwróć probówki, odlej supernatant do pojemnika na odpady, a następnie przeprowadź dodatkowy etap wirowania przy 200 ×g przez trzy minuty. Po wirowaniu użyj pipety 200 µL, aby ostrożnie odessać pozostałą ciecz z probówek. Umieść końcówki do transfekcji, probówkę, bufor do resuspensji oraz bufor elektrolityczny w komorze do hodowli tkanek.Przesuń urządzenie do transfekcji tak, aby jego stacja na probówki mogła zostać umieszczona bezpośrednio w komorze. Napełnij jedną probówkę do transfekcji trzema mililitrami buforu elektrolitycznego i zamontuj probówkę w stacji, wsuwając ją całkowicie do gniazda. Wyjmij wcześniej przygotowane alikwoty roztworu plazmidu do przeprogramowania z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozwól im rozmrozić się w temperaturze pokojowej w komorze inkubacyjnej.Ustaw parametry transfekcji na urządzeniu, aby podać jeden impuls trwający 40 milliseconds przy napięciu 950 volts. Resuspender pellet zawierający 100 000 komórek w 10 µL buforu do resuspensji. Szybko dodać 1/10 roztworu plazmidu do reprogramowania do zresuspendowanych komórek.Zamocuj końcówkę do transfekcji na pipecie do transfekcji. Następnie wciągnij zawiesinę komórkową do końcówki, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Włóż pipetę do transfekcji do probówki do transfekcji.Następnie naciśnij przycisk start na ekranie urządzenia do transfekcji. Poczekaj na komunikat ekranowy potwierdzający pomyślny przebieg transfekcji. Po tym następnie niezwłocznie wyjmij pipetę z probówki.Przenieś zawiesinę do jednej studni docelowej płytki sześciostudniowej. Wymieszaj ją z pożywką z sąsiedniej studni, a następnie równomiernie rozdziel zawiesinę pomiędzy obie studnie. Powtórz proces transfekcji dla każdej probówki do mikrocentryfugi zawierającej komórki.Zacznij od dodania 30 µL 0,5 mM EDTA oraz PBS do pięciu probówek PCR. Następnie załóż końcówkę do pipety 10-µL ustawionej na 2 µL. Przyłóż końcówkę pipety pod kątem do krawędzi kolonii, a następnie ostrożnie i stopniowo zeskrob całą kolonię z powierzchni.Natychmiast odessać całą kolonię do końcówki pipety i przenieść ją do jednej z przygotowanych probówek PCR z EDTA. Po powtórzeniu tego procesu z czterema kolejnymi koloniami inkubować w temperaturze pokojowej od czterech do sześciu minut. Używając większej końcówki pipety, delikatnie pipetować każdą zawiesinę komórkową w górę i w dół, aby rozbić kolonię na mniejsze grudki.Należy unikać tworzenia zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie zawiesinę wysiewa się bezpośrednio do docelowej studzienki płytki 24-dołkowej powlekanej rekombinowaną witronektyną. Po powtórzeniu tego procesu dla pozostałych kolonii, inkubować przez trzy do sześciu dni.Po czterech do sześciu dniach, gdy kolonie urosną i staną się zwarte, należy przemyć arkusze komórkowe 300 µL 0,5 mM EDTA i natychmiast odessać płyn. Następnie należy dodać kolejne 300 µL i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po odessaniu EDTA, należy ustawić pipetę 1 ml na maksymalną objętość, założyć szeroki końcówkę 1 ml i odessać pożywkę E8 z docelowej studzienki płytki sześciodołkowej pokrytej witronektyną.Wtryśnij strumień pożywki do jednego dołka płytki źródłowej, aby wypłukać hodowlę iPSC. Następnie przenieś zawiesinę do docelowego dołka i kilkakrotnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aby rozbić kolonie na skupki od 20 do 40 komórek. Po wysianiu wszystkich komórek upewnij się, że skupki są rozmieszczone równomiernie, delikatnie kołysząc i potrząsając płytką.Następnie należy ponownie umieścić płytkę w inkubatorze w celu adhezji skupisk i wzrostu kolonii. Komórki macierzyste z płynu i błony owocowej, które stanowią komórki źródłowe do reprogramowania, wykazują typową morfologię mezenchymalną, są wydłużone i jasne w świetle fazowym. Komórki nabywają właściwości nabłonkowych po przejściu przejścia mezenchymalno-nabłonkowego, co prowadzi do tworzenia kolonii złożonych z komórek o strukturze przypominającej brukową.Kolonie te proliferują i tworzą nieregularne masy komórkowe komórek MET. W późniejszych etapach reprogramowania pojawiają się kolonie w pełni przeprogramowanych komórek, będące indywidualnie rozróżnialnymi komórkami o dobrze zdefiniowanych granicach. Komórki te występują obok liczniejszych kolonii MET.Klon dojrzałej komórki wyizolowanej po pełnym przeprogramowaniu został przedstawiony tutaj. Po wyprowadzeniu iPSC oraz ich dojrzewaniu mogą one zostać poddane szczegółowej charakterystyce oraz ukierunkowanemu różnicowaniu w różne typy komórek. Należy pamiętać, że praca z tkankami ludzkimi, których nie przetestowano pod kątem obecności patogenów, może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej oraz praca w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak indukować pluripotencję w płodowych komórkach macierzystych, jakich odczynników i sprzętu należy użyć oraz jak rutynowo hodować pluripotentne komórki macierzyste.

reprogramming-primary-amniotic-fluid-membrane-cells-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

To badanie pokazuje przeprogramowanie komórek somatycznych w kierunku pluripotencji in vivo bez generowania potworniaków. Zastosowaliśmy hydrodynamiczne wstrzyknięcie do żyły ogonowej plazmidowego DNA kodującego czynniki Yamanka, aby indukować przeprogramowanie in vivo dorosłych hepatocytów na komórki o zwiększonej pluripotencji.

In vivo (in vivo) Przeprogramowanie dorosłych komórek somatycznych na pluripotencję przez nadekspresję czynników Yamanaka

Mysi fibroblast embrionalny może być przeprogramowany w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z niską wydajnością poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Rzadkimi produktami pośrednimi reakcji przeprogramowania są FACS izolowane przez znakowanie przeciwciałami przeciwko producentom powierzchni komórek Thy-1.2, Ssea-1 i Epcam.

Oczyszczanie za pośrednictwem markerów powierzchniowych komórek iPS z reprogramowalnego modelu myszy

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Poznaj metodę przeprogramowania komórek macierzystych z płynu owodniowego i błon do iPSC przy użyciu nieintegrującego wektora episomalnego w warunkach w pełni zdefiniowanych chemicznie.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Przeglądaj więcej filmów