Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywne uzyskanie indukowanych pluripotencyjnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie episomalne dwóch różnych rodzajów płodowych komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc w zapewnieniu źródła pluripotencyjnych komórek macierzystych do inżynierii tkankowej, modelowania chorób, badań podstawowych lub badań podłużnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że reprogramowanie i dojrzewanie iPSC odbywa się w warunkach chemicznie zdefiniowanych, przy jednoczesnej możliwości ich wczesnego wykorzystania w potencjalnych terapiach komórkowych w pediatrii.

Procedurę tę zademonstrują Steven McClellan, główny badacz, oraz ja. Pozyskaj łożyska tak szybko, jak to możliwe po porodzie. Wytnij fragment błony owodniowej o wymiarach dziewięciu centymetrów kwadratowych i przemyj go w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml przy użyciu 30 ml PBS z dodatkiem roztworu antybiotyku i antymykotyku.

Usuń skrzepy krwi z błon, a następnie za pomocą pary precyzyjnych skalpeli posiekaj błony na drobne kawałki w sterylnej 10-centymetrowej płytce do hodowli tkanek. Używając ostrzy skalpela, przenieś posiekaną masę tkanki błonowej do jednej probówki do dysocjacji tkanek zawierającej 4,7 milliliters medium RPMI-1640. Dodaj i wymieszaj enzymy dysocjujące.

Zamocuj probówkę w dysocjatorze tkanek i uruchom program h_tumor_01. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 °C na platformie kołyszącej przez 30 minut. Dalsze rozcieńczenie zawiesiny przeprowadź za pomocą 35 mL RPMI-1640 i przelej przez sitko o rozmiarze oczek 70 µm umieszczone nad probówką wirówkową o pojemności 50 mL.

Wirować przez pięć minut przy 200 ×g w temperaturze pokojowej. Po odlaniu nadsączu, zawiesić osad w pięciu mililitrach RPMI-1640, a następnie policzyć komórki za pomocą komory hemocytometrycznej. Wysiać komórki w formie skupisk z gęstością około 10 000 komórek na centymetr kwadratowy do kolb hodowlanych z aktualnie przygotowanym medium AFMC uzupełnionym o roztwór antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych.

Zabierz komórki macierzyste z płynu i błony płodowej o niskim numerze pasażu do przeprogramowania z jednej kolby T75, dodając dwa mililitry enzymu odrywającego komórki do warstwy komórkowej. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez pięć do ośmiu minut. Po wirowaniu przy 200 ×g przez 45 minut, resuspender osad w jednym mililitrze PBS i wymieszaj dokładnie, aby wypłukać składniki surowicy.

Policz komórki przy użyciu hemocytometru. Następnie dostosuj gęstość komórek do poziomu 100 000 komórek na mililitr PBS i rozdziel je do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Umieść probówki do mikrocentryfugi w polistyrenowych probówkach o pojemności pięciu mililitrów, aby umożliwić wirowanie w zwykłym wirniku z koszyczkami, i wiruj przy 200 ×g przez cztery minuty w temperaturze pokojowej.

Po wirowaniu odwróć probówki, odlej supernatant do pojemnika na odpady, a następnie przeprowadź dodatkowy etap wirowania przy 200 ×g przez trzy minuty. Po wirowaniu użyj pipety 200 µL, aby ostrożnie odessać pozostałą ciecz z probówek. Umieść końcówki do transfekcji, probówkę, bufor do resuspensji oraz bufor elektrolityczny w komorze do hodowli tkanek.

Przesuń urządzenie do transfekcji tak, aby jego stacja na probówki mogła zostać umieszczona bezpośrednio w komorze. Napełnij jedną probówkę do transfekcji trzema mililitrami buforu elektrolitycznego i zamontuj probówkę w stacji, wsuwając ją całkowicie do gniazda. Wyjmij wcześniej przygotowane alikwoty roztworu plazmidu do przeprogramowania z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozwól im rozmrozić się w temperaturze pokojowej w komorze inkubacyjnej.

Ustaw parametry transfekcji na urządzeniu, aby podać jeden impuls trwający 40 milliseconds przy napięciu 950 volts. Resuspender pellet zawierający 100 000 komórek w 10 µL buforu do resuspensji. Szybko dodać 1/10 roztworu plazmidu do reprogramowania do zresuspendowanych komórek.

Zamocuj końcówkę do transfekcji na pipecie do transfekcji. Następnie wciągnij zawiesinę komórkową do końcówki, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Włóż pipetę do transfekcji do probówki do transfekcji.

Następnie naciśnij przycisk start na ekranie urządzenia do transfekcji. Poczekaj na komunikat ekranowy potwierdzający pomyślny przebieg transfekcji. Po tym następnie niezwłocznie wyjmij pipetę z probówki.

Przenieś zawiesinę do jednej studni docelowej płytki sześciostudniowej. Wymieszaj ją z pożywką z sąsiedniej studni, a następnie równomiernie rozdziel zawiesinę pomiędzy obie studnie. Powtórz proces transfekcji dla każdej probówki do mikrocentryfugi zawierającej komórki.

Zacznij od dodania 30 µL 0,5 mM EDTA oraz PBS do pięciu probówek PCR. Następnie załóż końcówkę do pipety 10-µL ustawionej na 2 µL. Przyłóż końcówkę pipety pod kątem do krawędzi kolonii, a następnie ostrożnie i stopniowo zeskrob całą kolonię z powierzchni.

Natychmiast odessać całą kolonię do końcówki pipety i przenieść ją do jednej z przygotowanych probówek PCR z EDTA. Po powtórzeniu tego procesu z czterema kolejnymi koloniami inkubować w temperaturze pokojowej od czterech do sześciu minut. Używając większej końcówki pipety, delikatnie pipetować każdą zawiesinę komórkową w górę i w dół, aby rozbić kolonię na mniejsze grudki.

Należy unikać tworzenia zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie zawiesinę wysiewa się bezpośrednio do docelowej studzienki płytki 24-dołkowej powlekanej rekombinowaną witronektyną. Po powtórzeniu tego procesu dla pozostałych kolonii, inkubować przez trzy do sześciu dni.

Po czterech do sześciu dniach, gdy kolonie urosną i staną się zwarte, należy przemyć arkusze komórkowe 300 µL 0,5 mM EDTA i natychmiast odessać płyn. Następnie należy dodać kolejne 300 µL i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po odessaniu EDTA, należy ustawić pipetę 1 ml na maksymalną objętość, założyć szeroki końcówkę 1 ml i odessać pożywkę E8 z docelowej studzienki płytki sześciodołkowej pokrytej witronektyną.

Wtryśnij strumień pożywki do jednego dołka płytki źródłowej, aby wypłukać hodowlę iPSC. Następnie przenieś zawiesinę do docelowego dołka i kilkakrotnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aby rozbić kolonie na skupki od 20 do 40 komórek. Po wysianiu wszystkich komórek upewnij się, że skupki są rozmieszczone równomiernie, delikatnie kołysząc i potrząsając płytką.

Następnie należy ponownie umieścić płytkę w inkubatorze w celu adhezji skupisk i wzrostu kolonii. Komórki macierzyste z płynu i błony owocowej, które stanowią komórki źródłowe do reprogramowania, wykazują typową morfologię mezenchymalną, są wydłużone i jasne w świetle fazowym. Komórki nabywają właściwości nabłonkowych po przejściu przejścia mezenchymalno-nabłonkowego, co prowadzi do tworzenia kolonii złożonych z komórek o strukturze przypominającej brukową.

Kolonie te proliferują i tworzą nieregularne masy komórkowe komórek MET. W późniejszych etapach reprogramowania pojawiają się kolonie w pełni przeprogramowanych komórek, będące indywidualnie rozróżnialnymi komórkami o dobrze zdefiniowanych granicach. Komórki te występują obok liczniejszych kolonii MET.

Klon dojrzałej komórki wyizolowanej po pełnym przeprogramowaniu został przedstawiony tutaj. Po wyprowadzeniu iPSC oraz ich dojrzewaniu mogą one zostać poddane szczegółowej charakterystyce oraz ukierunkowanemu różnicowaniu w różne typy komórek. Należy pamiętać, że praca z tkankami ludzkimi, których nie przetestowano pod kątem obecności patogenów, może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej oraz praca w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak indukować pluripotencję w płodowych komórkach macierzystych, jakich odczynników i sprzętu należy użyć oraz jak rutynowo hodować pluripotentne komórki macierzyste.