Name: Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Poznaj metodę wychwytywania interaktomu mRNA z protoplastów liści Arabidopsis thaliana. Technika UV crosslinkingu pozwala izolować białka wiążące mRNA bezpośrednio z fizjologicznego środowiska komórek roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laboratorium prof. Jorisa Winderickxa, który dostarczył urządzenie do sieciowania UV wyposażone w konwencjonalną lampę UV. K. G. jest wspierany przez fundusz badawczy KU Leuven i dziękuje za wsparcie z grantu FWO G065713N.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Z powodzeniem zastosowaliśmy wychwytywanie interaktomii mRNA, opracowane dla komórek drożdży i ludzi, do protoplastów mezofilu liści roślin. Komórki mezofilu liści są głównym rodzajem tkanki naziemnej w liściach roślin. Główną zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje ona sieciowanie in vivo do odkrywania białek ze środowiska fizjologicznego.
W niniejszym protokole przedstawiamy przede wszystkim szereg zoptymalizowanych warunków eksperymentalnych (np. liczbę protoplastów do ...

Eukarionty używają wielu szlaków regulacyjnych biogenezy RNA do utrzymania komórkowych procesów biologicznych. Wśród znanych typów RNA, mRNA jest bardzo zróżnicowane i posiada zdolność kodowania białek i ich izoform1. Szlak PTGR kieruje losami pre-mRNAs2,3. RBP z różnych rodzin genów kontrolują regulację RNA, a w PTGR specyficzne mRBP kierują mRNA przez bezpośrednie interakcje fizyczne, tworząc funkcjonalne mRNP. Dlatego identyfikacja i charakterystyka mRBP i ich mRNP ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia regulacji komórkowego metabolizmu mRNA2. W ciągu ostatnich trzech dekad różne metody in vitro – w tym testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej RNA (REMSA), systematyczna ewolucja ligandów za pomocą testów wzbogacania wykładniczego (SELEX) opartych na konstruktach pochodzących z biblioteki, RNA Bind-n-Seq (RBNS), znakowane radioaktywnie lub ilościowe testy wiązania fluorescencji RNA, krystalografia rentgenowska i spektroskopia NMR4,5,6,7,8,9 – są szeroko stosowane w badaniach RBP, głównie z komórek ssaków. Wyniki tych badań RBP ssaków można przeszukiwać za pośrednictwem bazy danych białek wiążących RNA (RBPDB), która gromadzi opublikowane obserwacje10.
Chociaż te podejścia in vitro są potężnymi narzędziami, określają związane motywy RNA z danej puli sekwencji RNA i dlatego mają ograniczoną zdolność do odkrywania nowych docelowych RNA. To samo dotyczy strategii obliczeniowych do przewidywania RBP w całym genomie, które opierają się na zachowaniu sekwencji i struktury białka15. Aby temu zaradzić, opracowano nową metodę eksperymentalną, która pozwala na identyfikację motywów RNA, z którymi wchodzi w interakcję RBP, a także na określenie dokładnej lokalizacji wiązania. Ta metoda, zwana "sieciowaniem i immunoprecypitacją" (CLIP), składa się z sieciowania in vivo UV, a następnie immunoprecypitacji11. Wczesne badania wykazały, że fotoaktywacja nukleotydów DNA i RNA może zachodzić przy wzbudzeniu fal UV o długości fali większej niż 245 nm. Reakcja przez tymidynę wydaje się być faworyzowana (ranga w kolejności zmniejszonej fotoreaktywności: dT ≥ dC > rU > rC, dA, dG)12. Wykorzystując światło UV o długości fali 254 nm (UV-C), zaobserwowano, że wiązania kowalencyjne między nukleotydami RNA a resztą białkową powstają, gdy znajdują się w zakresie zaledwie kilku angstremów (A). Zjawisko to nazywa się zatem sieciowaniem RNA i RBP "o zerowej długości". Po tym może nastąpić rygorystyczna procedura oczyszczania z niewielkim tłem13,14.
Strategia uzupełniająca CLIP polega na połączeniu sieciowania in vivo UV z identyfikacją białek w celu opisania krajobrazu RBP. Wiele takich proteomów związanych z mRNA w całym genomie zostało wyizolowanych z komórek drożdży, embrionalnych komórek macierzystych (ESC) i ludzkich linii komórkowych (tj. HEK293 i HeLa) przy użyciu tego nowatorskiego podejścia eksperymentalnego, zwanego "przechwytywaniem interaktomii mRNA"18,19,20,21. Metoda składa się z sieciowania UV in vivo, a następnie oczyszczania mRNP i proteomiki opartej na MS. Stosując tę strategię, odkryto wiele nowych RBP zawierających niekanoniczne RBD i stało się jasne, że więcej białek ma zdolność wiązania RNA, niż wcześniej sądzono15,16,17. Zastosowanie tej metody pozwala na nowe zastosowania i możliwość odpowiedzi na nowe pytania biologiczne podczas badania RBP. Na przykład w niedawnym badaniu zbadano zachowanie proteomu związanego z mRNA (rdzeń proteomu RBP) między komórkami drożdżowymi i ludzkimi22.
Stwierdzono już, że roślinne RBP są zaangażowane we wzrost i rozwój (np. w posttranskrypcyjną regulację czasu kwitnienia, zegara okołodobowego i ekspresji genów w mitochondriach i chloroplastach)24,25,26,27,28,29. Ponadto uważa się, że pełnią one funkcje w procesach komórkowych reagujących na stresy abiotyczne (np. zimno, susza, zasolenie i kwas abscysynowy (ABA))31,32,33,34. W genomie Arabidopsis thaliana znajduje się ponad 200 przewidywanych genów RBP, opartych na motywach sekwencji domeny RNA recognition motif (RRM) i K homology (KH); W ryżu odnotowano około 250 35,36. Warto zauważyć, że wiele przewidywanych RBP wydaje się być unikalnych dla roślin (np. brak ortologów metazoan dla około 50% przewidywanych RBP Arabidopsis zawierających domenę RRM)35, co sugeruje, że wiele z nich może pełnić nowe funkcje. Funkcje większości przewidywanych RBP pozostają niescharakteryzowane23.
Ostatnio zgłoszono izolację proteomów związanych z mRNA z siewek Arabidopsis etiolowanych, tkanek liści, hodowanych komórek korzeniowych i protoplastów mezofilu liści za pomocą wychwytywania interaktomii mRNA38,39. Badania te wskazują na duży potencjał systematycznego katalogowania funkcjonalnych RBP w roślinach w najbliższej przyszłości. W tym miejscu przedstawiamy protokół wychwytywania interaktomii mRNA z protoplastów roślinnych (tj. komórek bez ścian komórkowych). Protoplasty mezofilu liści Arabidopsis thaliana są głównym typem komórek liściowych. Wyizolowane protoplasty umożliwiają optymalny dostęp światła UV do komórek. Ten typ komórek może być używany w testach, które przejściowo eksprymują białka w celu charakterystyki funkcjonalnej40,41. Co więcej, protoplasting został zastosowany do kilku innych typów i gatunków komórek roślinnych42,43,44 (np. Petersson et al., 2009; Bargmann i Birnbaum, 2010; oraz Hong i in., 2012).
Metoda obejmuje w sumie 11 kroków (Rysunek 1A). Protoplasty mezofilu liści rzodkiewnika są najpierw izolowane (etap 1), a następnie naświetlane promieniami UV w celu utworzenia usieciowanych mRNP (etap 2). Gdy protoplasty są lizowane w warunkach denaturacji (etap 3), usieciowane mRNP są uwalniane w buforze do lizy/wiązania i ściągane w dół przez kulki oligo-d (T) 25 (etap 4). Po kilku rundach rygorystycznego mycia mRNP są oczyszczane i poddawane dalszej analizie. Zdenaturowane peptydy mRBP są trawione przez proteinazę K przed oczyszczeniem usieciowanych mRNA, a jakość RNA jest weryfikowana za pomocą qRT-PCR (kroki 5 i 6). Po traktowaniu RNazy i koncentracji białka (krok 7), jakość białka jest kontrolowana za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE) i barwienia srebrem (krok 8). Różnicę we wzorcach prążków białkowych można łatwo zwizualizować między próbką usieciowaną (CL) a próbką nieusieciowaną (non-CL; ujemna próbka kontrolna z protoplastów, która nie jest poddawana promieniowaniu UV). Identyfikacja białek odbywa się za pomocą proteomiki opartej na stwardnieniu rozsianym. Białka z próbki CL są rozdzielane za pomocą jednowymiarowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (1D-PAGE) w celu usunięcia ewentualnego zanieczyszczenia tła, są "trawione w żelu" do krótkich peptydów za pomocą trypsyny i oczyszczane (etap 9). Nanochromatografia cieczowa z odwróconymi fazami sprzężona ze spektrometrią mas (nano-LC-MS) pozwala na określenie ilości ostatecznych białek w proteomie związanym z mRNA (krok 10). Na koniec zidentyfikowane mRBP są charakteryzowane i katalogowane za pomocą analizy bioinformatycznej (krok 11).

<table><tbody><tr><td>ODCZYNNIKI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,8 M Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M1902-500G</td><td>Pierwszorzędowy roztwór enzymu izotonicznego i Roztwór MMg</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>MERCK</td><td>Art. 4935</td><td>Pierwszorzędowy roztwór enzymu izotonicznego & Bufor W5</td></tr><tr><td>0,2 M MES (pH 5,7) (kwas 4-morfolinoetanosulfonowy)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2933</td><td>Pierwszorzędowy izotoniczny roztwór enzymatyczny bufor W5 i roztwór MMg, Filtracja Sterylizacja</td></tr><tr><td>Celulaza R10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>CELULAZA " ONOZUKA" R-10, 10 g</td><td>Końcowy izotoniczny roztwór enzymatyczny</td></tr><tr><td>Macerozyme R10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>MACEROZYME R-10, 10g</td><td>Końcowy roztwór enzymu izotonicznego</td></tr><tr><td>10% (w/v) BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Końcowy roztwór enzymu izotonicznego i Filtracja Sterylizacja</td></tr><tr><td>1 M CaCl2</td><td>Chem-Lab NV</td><td>CL00.0317.1000</td><td>Końcowy izotoniczny roztwór enzymatyczny bufor W5 i Bufor mineralizacyjny</td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3160/60</td><td>W5 Bufor</td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td>MMg roztwór</td></tr><tr><td>1 M LiCl (chlorek litu)</td> <td>Acros</td><td>199885000</td><td>Bufor do lizy/wiązania, Bufor do płukania 1, Bufor do płukania 2 & Bufor o niskiej zawartości soli</td></tr><tr><td>5% (w/v) LiDS (Lithium Dodecyl Sulphate)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4632-25G</td><td>Bufor do lizy/wiązania, Bufor do płukania 1 i Filtracja Sterylizacja</td></tr><tr><td>1 M DTT (Dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific Bufor do płukania 1 & Bufor płuczący 2</td><td>307866</td><td>Bufor do lizy/wiązania,</td></tr> <tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7,5) (Tris(hydroksymetylo)aminometan, Kwas solny SG (HCl))</td><td>Acros & Fisher Chemical</td><td>167620010 & H/1200/PB15</td><td>Bufor do lizy/wiązania, Bufor do płukania 1, Bufor do płukania 2, Bufor o niskiej zawartości soli i Bufor elucyjny</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0) (kwas etylenodiaminotetraoctowy)</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>ED-500G</td><td>Bufor do lizy/wiązania, Bufor do płukania 1, Bufor do przemywania 2, Bufor o niskiej zawartości soli i Bufor elucyjny</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>8.22184.0500</td><td>Regeneracja kulek oligo-d(T)25</td></tr><tr><td>0,1 M NaOH</td><td>VWR PROLABO CHEMICALS</td><td>28244.295</td><td>Regeneracja kulek oligo-d(T)25</td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7,4) (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) zawierający (NaCl; Kcl; Na2HPO4; KH2PO4)</td><td>Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC</td><td>S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230</td><td>Regeneracja kulek oligo-d(T)25</td></tr><tr><td>Roztwór proteinazy K (2 &mu; g/&mu; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>Trawienie białek</td></tr><tr><td>Barwnik ładujący</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>qPCR master mix</td><td>Test Promega</td><td>A6001</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Koktajl RNaza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2286</td><td>Trawienie RNA</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>322415</td><td>Utrwalanie żelu i odbarwienie żelu</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-aldrich</td><td>537020</td><td>Utrwalanie i odbarwianie żelu</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20278</td><td>Barwienie żelem</td></tr><tr><td>1 M NH4HCO3 (wodorowęglan amonu) &nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>09830-500G</td><td>Żel nawilżający & Bufor do wytrawiania</td></tr><tr><td>CH3CN (Acetonitryl)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>34851-100ML</td><td>Odwodnienie żelu i Roztwór do rozpuszczania peptydów</td></tr><tr><td>IAA (Kwas jodooctowy)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>I4386-10G</td><td>Środek alkilujący</td></tr><tr><td>TFA (kwas trifluorooctowy)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>302031-10X1ML</td><td>Roztwór do rozpuszczania peptydów</td></tr><tr><td>FA (Kwas mrówkowy)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>06554-5G</td><td>Ekstrakcja peptydów</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny (6 ng/&mu; L)</td> <td>Promega</td><td>V5280</td><td>Bufor trawienny</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Peltracom</td><td>LP2D</td><td>Wzrost roślin</td></tr><tr><td>Wermikulit 3</td><td>Sibli AS</td><td>05VERMICULIET</td><td>Szalka Petriego do wzrostu roślin</td></tr><tr><td>(150 x 20 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>Nośnik do zawiesiny protoplastów</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtr</td><td>Millipore</td><td>SE2M229104</td><td>Homogenizacja końcowego izotonicznego roztworu enzymu</td></tr><tr><td>Razorblade</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>Paski liści rozety</td></tr><tr><td>35-75 &mu; m siatka nylonowa</td><td>SEFAR NITEX</td><td>74010</td><td>Filtracja zawiesiny Protoplast</td></tr><tr><td>50 ml rurki z okrągłym dnem</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1918-10EA</td><td>Nośnik do zawiesiny protoplastów</td></tr><tr><td>Hemocytometr (B&uuml; rker hemocytometr)</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td> Aparat do <td>sieciowania UV do zliczania komórek protoplastowych</td></tr><tr><td> (HL-2000 HybriLinker)</td><td>UVP, LLC</td><td>UVP95003101</td><td>in vivo</td></tr> Lampa UV sieciująca UV<tr><td> (Sankyo-Denki G8T5)</td><td>SANKYO DENKI</td><td>SD G8T5</td><td>in vivo Szklana strzykawka sieciująca</td></tr><tr><td>UV 50 ml</td><td>FORTUNA Optima</td><td>Z314560</td><td>Homogenizacja lizatu protoplastów</td></tr><tr><td>Wąska igła (0,9 x 25 mm)</td><td>Becton Dickinson microlance 3</td><td>2021-04</td><td>Homogenizacja lizatu protoplastów</td></tr><tr><td>Rotator Model L26</td><td>Labinco BV</td><td>26110912</td><td>Inkubacja próbki przez rotację</td></tr><tr><td>kulek magnetycznych Oligo-d(T)25 (5 mg/mL)</td><td>New England BioLabs</td><td>S1419S</td><td>mRNP i wiązanie mRNA i i pull-down</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td>wiązanie i ściąganie mRNP i mRNA</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe (filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4)</td><td>EMD Milipore</td><td>UFC800308</td><td>stężenie mRBP</td></tr><tr><td>Pierce Silver Stain</td><td>Kit Thermo Fisher Scientific</td><td>24612</td> Zestaw do oczyszczania RNA do <td>barwienia srebrem</td></tr><tr><td> (InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>Spektrofotometr do <td></td><td>oczyszczania 1064100300</td> <td>molekularnego RNA STRATEC</td></tr><tr><td>(spektrofotometr NanoDrop 1000)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Jakość i ilość RNA</td></tr><tr><td>Cykler Real-Time PCR (cykler StepOne Real-Time PCR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td>kwantyfikacja cDNA</td></tr> <tr><td>i kolumny mikro;-C18 (końcówka Millipore Zip i mikro;-C18 kolumny)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>720046-960EA</td><td>Oczyszczanie peptydów</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy (Q Exactive Hybrid Quadrupol-Orbitrap Mass Spectrometer)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Proteomika oparta na spektrometrii</td></tr><tr><td>mas Przyrząd do chromatografii cieczowej (przyrząd do ultra-wysokowydajnej chromatografii cieczowej Ultimate 3000 (UHPLC))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td>Proteomika oparta na spektrometrii mas</td></tr><tr><td>Kolumna C18 (kolumna Easy Spray Pepmap RSLC C18)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ES800</td><td>Proteomika oparta na spektrometrii</td></tr><tr><td>mas Prekolumna C18 (Acclaim Pepmap 100 C18 prekolumna)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td>Proteomika oparta na spektrometrii mas</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td> Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Startery do testu qRT-PCR</td><td>Sekwencje</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UBQ10 mRNA (Li et al., 2014)</td><td>Fw: AACTTTGGTGGTGTGTGTGTGTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA (Durut et al., 2014)</td><td>Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wychwytywanie interaktomu mrna z protoplastów roślinnych

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Białka wiążące RNA (RBP) decydują o losie RNA. Uczestniczą we wszystkich szlakach biogenezy RNA, a zwłaszcza przyczyniają się do potranskrypcyjnej regulacji genów (PTGR) informacyjnych RNA (mRNA). W ciągu ostatnich kilku lat udało się wyizolować szereg proteomów związanych z mRNA z linii komórkowych drożdży i ssaków dzięki zastosowaniu nowatorskiej metody zwanej "wychwytywaniem interaktomii mRNA", która pozwala na identyfikację białek wiążących mRNA (mRBP) bezpośrednio ze środowiska fizjologicznego. Metoda polega na sieciowaniu in vivo w ultrafiolecie (UV), ściąganiu i oczyszczaniu przekaźnikowych kompleksów rybonukleoproteinowych (mRNP) za pomocą kulek oligo(dT), a następnie identyfikacji usieciowanych białek za pomocą spektrometrii mas (MS). Całkiem niedawno, stosując tę samą metodę, zgłoszono jednocześnie kilka proteomów związanych z roślinnym mRNA z różnych źródeł tkanek Arabidopsis: etiolowanych siewek, tkanki liści, protoplastów mezofilu liści i hodowanych komórek korzeniowych. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę wychwytywania interaktomii mRNA dla protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana, typu komórki, który służy jako wszechstronne narzędzie do eksperymentów obejmujących różne testy komórkowe. Warunki optymalnej wydajności białka obejmują ilość tkanki wyjściowej i czas trwania promieniowania UV. W proteomie związanym z mRNA uzyskanym w eksperymencie na średnią skalę (107 komórek) stwierdzono, że RBP, u których zauważono, że mają zdolność wiązania RNA, są nadreprezentowane i zidentyfikowano wiele nowych RBP. Eksperyment można rozszerzyć (10-9 komórek), a zoptymalizowaną metodę można zastosować do innych typów i gatunków komórek roślinnych w celu szerokiej izolacji, skatalogowania i porównania proteomów związanych z mRNA w roślinach.

W kroku płukania 4.3 z użyciem buforu do płukania 2 zaobserwowaliśmy charakterystyczny halo otaczający granulę kulek w próbce CL (Rysunek 1B). Choć zjawisko to nie zostało zbadane, można je prawdopodobnie wyjaśnić interferencją sieciowanych kompleksów mRNP z agregacją kulek podczas wychwytu magnetycznego, co prowadzi do powstania bardziej rozproszonego agregatu. Wskazuje to na skuteczność wychwytu kulek oligo-d(T)2514.
<...

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Ogólnym celem tej zoptymalizowanej metody wychwytu interaktomu mRNA jest izolacja i identyfikacja proteomu związanego z mRNA w komórkach roślinnych. Metoda ta została zastosowana do protoplastów mezofila liści Arabidopsis thaliana, rodzaju komórek wykorzystywanego jako wszechstronne narzędzie w różnych testach komórkowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu potranskrypcyjnej regulacji genów, takie jak odkrycie i zrozumienie roli roślinnych białek wiążących mRNA.Główną zaletą tej techniki jest możliwość izolacji i identyfikacji roślinnego posłańca w związanym proteomie bezpośrednio z środowiska fizjologicznego. W związku z tym metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o białkach wiążących mRNA z protoplastów mezofilu liści arabidopsis. Może ona zostać zastosowana również w innych systemach, takich jak protoplasty lub tkanki innych roślin.Pomysł na tę metodę pojawił się u nas, gdy zauważyliśmy, że została ona z powodzeniem zastosowana w liniach komórkowych drożdży i ssaków. Wyizoluj protoplasty mezofylu liści arabidopsis dla dwóch różnych próbek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Próbkę kontrolną, która nie będzie poddana sieciowaniu UV (próbkę non-CL), przechowuj w lodzie.Przenieś zawiesinę protoplastów przeznaczoną do sieciowania lub próbkę CL do dużej szalki Petriego. Dodaj do szalki 30 mililitrów lodowatego roztworu MMG, aby pokryć powierzchnię, a następnie rozprowadź komórki poprzez delikatne pipetowanie. Przykryj szalkę Petriego folią aluminiową podczas przenoszenia do aparatury do sieciowania UV.Natychmiast umieść otwartą płytkę Petriego w aparacie do sieciowania promieniami UV. Upewnij się, że odległość między płytką a lampą UV wynosi 8 cm, a następnie naświetlaj próbkę przez 1 minutę. Po tym czasie szybko przenieś zawiesinę protoplastów z płytki Petriego do dwóch nowych probówek o okrągłym dnie o pojemności 50 ml.Przemyj dno naczynia dodatkowymi pięcioma mililitrami lodowatego roztworu MMG, aby zebrać pozostałe protoplasty. Podziel zawiesinę pomiędzy dwie probówki. Następnie odwiruj probówki z próbkami non-CL oraz dwiema próbkami CL przy 100 ×g w temperaturze czterech stopni celsius poza przez pięć minut.Po odlaniu supernatantu probówkę z osadem non-CL należy ponownie umieścić w lodzie. Do każdej probówki z próbką CL dodać 10 milliliters lodowatego roztworu MMG i delikatnie potrząsnąć probówkami, aby resuspender osady. Po połączeniu obu próbek w jednej probówce o okrągłym dnie o pojemności 50 milliliter, odwiruj próbkę przy 100 times g w temperaturze four degrees celsius przez five minutes.Po odlaniu supernatantu należy przechowywać osad na lodzie. Następnie do osadu komórkowego z każdej próbki należy dodać 9 mL lodowatego buforu wiążącego do lizy. Protoplasty należy zlizować, pipetując roztwór w górę i w dół około dwudziestu razy, aż do uzyskania jednorodnego, jasnozielonego koloru.W celu homogenizacji przepuść lizat protoplastów dwukrotnie przez szklaną strzykawkę o pojemności 50 ml z wąską igłą, a następnie inkubuj lizat w lodzie przez dziesięć minut. Zamroź próbki w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do trzech tygodni. Po rozmrożeniu probówki z zamrożonym lizatem protoplastów w temperaturze pokojowej, przechowuj probówkę w lodzie.Odmierz 1,8 ml kulek magnetycznych oligo-d(T) do sześciu nowych probówek do mikrocentryfugi o okrągłym dnie o pojemności dwóch ml, umieszczonych w lodzie. Przemyj zawiesinę kulek w każdej probówce za pomocą 600 µL buforu wiążącego do lizy, krótko pipetując w górę i w dół, a następnie delikatnie obracaj kulki na rotatorze przez dwie minuty. Przechowuj kulki w lodzie.Następnie wszystkie sześć probówek zawierających kuleczki należy umieścić w statywie magnetycznym na co najmniej trzy minuty, aby zapewnić wystarczający czas na całkowite wychwycenie magnetyczne. Gdy kuleczki zostaną całkowicie wychwycone, zawiesina stanie się klarowna. Następnie należy odlać nadsącz ze wszystkich sześciu probówek i bezzwłocznie dodać do nich po 9 mL lizatu protoplastów.Wymieszać kuleczki z lizatem za pomocą pipety, aż zawiesina stanie się brązowa i jednorodna. Inkubować probówki w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę przy łagodnym obrotowaniu. Po inkubacji ponownie umieścić probówki w statywie magnetycznym na trzy minuty.Gdy wszystkie kuleczki zostaną przyciągnięte do ścianek probówek, należy zebrać nadsącz zawierający lizat protoplastów do sześciu nowych okrągłodennych probówek do mikrowirówki o objętości 2 ml. Następnie do każdej probówki z kuleczkami należy dodać 1,5 ml schłodzonego w lodzie buforu piorącego 1 i resuspender kuleczki poprzez pipetowanie. Po delikatnym rotowaniu przez jedną minutę należy umieścić probówki z powrotem w statywie magnetycznym na trzy minuty.Odlej supernatant i powtórz ten etap płukania raz. Używając 1,5 millilitersz lodowatego buforu płuczącego dwa, powtórz tę samą procedurę płukania dwukrotnie. Jeśli mRNP zostały efektywnie wyizolowane z lizatu protoplastów, wokół osadu kulek w próbce CL powinna być widoczna otoczka.Na koniec powtórz procedurę płukania raz, używając 1,5 milliliters lodowatego buforu o niskim stężeniu soli. Po płukaniu dodaj 500 microliters buforu elucyjnego do każdej probówki i delikatnie resuspenduj kulki za pomocą pipetowania. Inkubuj w temperaturze 50 degrees celsius przez trzy minuty, aby uwolnić RNA z ogonami poli-A.Niezbyt gwałtownie resuspender kulki, pipetując je raz, a następnie umieścić probówki z powrotem w statywie magnetycznym w temperaturze 4°C na pięć minut. Przenieść i połączyć eluaty ze wszystkich sześciu probówek do probówki stożkowej o pojemności 15 ml umieszczonej na lodzie. Pozwoli to uzyskać około 3 mm eluatu.Jakość i ilość RNA można natychmiast określić za pomocą spektrofotometru. Przygotuj do ponownego użycia kulki oligo-d(T), płukząc je dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego buforu elucyjnego. Następnie przemyj je jednym mililitrem lodowatego buforu do lizy i wiązania, aby przywrócić stężenie soli do poziomu 500 mM.Użyj tych przemytych kulek oligo-d(T), aby powtórzyć procedury wiązania, przemywania i elucji w kolejnych dwóch rundach. Pozwoli to na usunięcie RNA z ogonem poly-A z lizatu protoplastów i uzyskanie łącznie dziewięciu mililitrów eluentu dla każdej próbki. Kulki można przechowywać i wykorzystać w kolejnym eksperymencie maksymalnie trzy razy.Aby sprawdzić jakość RNA, poddaj białka usieciowane promieniami UV trawieniu roztworem proteinazy K zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie oczyść RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia. Po oczyszczeniu próbki są gotowe do testu jakości RNA za pomocą qRT-PCR.Zacznij od potraktowania ośmiu mililitrów każdej próbki 100 jednostkami koktajlu RNaz zawierającego RNAzę A i RNAzę T1. Po krótkim wiroksowaniu inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Aby skoncentrować białka wiążące mRNA (mRBP), przefiltruj próbki za pomocą wirnikowych jednostek filtrujących. Z każdej próbki zostanie otrzymanych 75 µL zawierających dwie mikrogramy białka.Do długotrwałego przechowywania zamrozić próbki w temperaturze -80 °C. W celu przeprowadzenia elektroforezy SDS-PAGE wymieszać 25 µL każdej skoncentrowanej próbki z 15 µL 2X barwnika do nakładania i ogrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Nałożyć próbki oraz marker białek na żel SDS-PAGE z 5% żelem koncentrującym i 12% żelem rozdzielającym.Następnie dwa razy przemyj żel wodą ultrapurystyczną przez pięć minut podczas każdego płukania. Do barwienia żelu użyj komercyjnego zestawu do barwienia srebrem. Jeśli użyto odpowiedniej liczby protoplastów wyjściowych, prążki białkowe pojawią się w ciągu pięciu minut.Aby przeprowadzić dalsze testy mRBP, należy oczyścić peptydy z drugiego żelu 1D zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Oczyszczone peptydy mogą teraz zostać poddane analizie za pomocą nanotechnicznej chromatografii cieczowej w odwróconej fazie, spektrometrii mas oraz proteomice jakościowej i ilościowej. Po wychwycie za pomocą kulek oligo-d(T), analiza qRT-PCR wykazała znacznie wyższe poziomy mRNA referencyjnego poly ubiquitin 10 w porównaniu do 18S rRNA.Ponieważ kulki oligo-d(T) wiążą się wyłącznie z RNA z ogonem poly-A, sugeruje to, że w eluacie występuje wzbogacenie mRNA. Przechwytywanie mRBP przez kulki oligo-d(T) oceniono dodatkowo za pomocą żelu SDS-PAGE barwionego srebrem. Żel wykazuje znacznie większą ilość białka w próbce CL sieciowanej promieniami UV w porównaniu z próbką nie-CL niesieciowaną.Czas trwania naświetlania UV może wpływać na wydajność sieciowania. Ten żel SDS-PAGE barwiony srebrem potwierdza, że jedna lub trzy minuty naświetlania UV są warunkami optymalnymi, zapewniającymi największą intensywność prążków. Łącznie 325 białek zidentyfikowano za pomocą ilościowej analizy proteomicznej.225 z tych białek znajdowało się poniżej poziomu istotności ze względu na niską liczność peptydów obecnych dla każdego białka oraz wysoką zmienność intensywności peptydów. Jednakże, ponieważ wszystkie zostały wykryte jakościowo wyłącznie w próbkach CL, uznano je za wyniki pozytywne. Te 325 białek zostało następnie podzielonych na trzy kategorie: białka rybosomalne, główne RBP oraz kandydaci na RBP.Kandydaci na RBP nie posiadają konwencjonalnych domen wiążących RNA, a większość ich funkcji nie została jeszcze potwierdzona, co sugeruje możliwość istnienia nowych mechanizmów regulacji RNA. Po opanowaniu metoda ta może zostać przeprowadzona w ciągu jednego tygodnia, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się szlakami regulacji molekularnej u roślin do eksploracji proteomu związanego z mRNA w skali całego genomu w komórkach i tkankach roślin dwukalienskich i jednoliściennych.

mrna-interactome-capture-from-plant-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Poznaj metodę wychwytywania interaktomu mRNA z protoplastów liści Arabidopsis thaliana. Technika UV crosslinkingu pozwala izolować białka wiążące mRNA bezpośrednio z fizjologicznego środowiska komórek roślinnych.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Przeglądaj więcej filmów