Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Ogólnym celem tego zoptymalizowanego wychwytywania interaktomu mRNA jest wyizolowanie i zidentyfikowanie proteomu związanego z mRNA z komórek roślinnych. Metodę tę stosuje się do protoplastów mezofilnych z liści rzodbyszu pospolitego, typu komórek używanego jako wszechstronne narzędzie w różnych testach komórkowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie implantów potranskrypcyjnej regulacji genów, takie jak odkrycie i zrozumienie roli białek wiążących RNA przekaźników roślinnych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona wyizolować i zidentyfikować roślinnego posłańca na związanym proteomie bezpośrednio ze środowiska fizjologicznego. Tak więc ta metoda może dostarczyć wglądu w informacyjne białko związane z RNA z protoplastów mezofilów liści aribidopsis. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak protoplasty lub tkanki innych roślin

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że została ona z powodzeniem zastosowana do linii komórkowych drożdży i ssaków. Wyizoluj protoplasty mezofilów z liści rzodkiewnika dla dwóch różnych próbek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Próbkę kontrolną, która nie będzie usieciowana promieniami UV, lub próbkę inną niż CL należy przechowywać na lodzie.

Przenieść zawiesinę protoplastów do usieciowania lub próbkę CL na dużą szalkę Petriego. Dodaj 30 mililitrów lodowatego roztworu MMG do naczynia, aby pokryć powierzchnię i rozprowadzić komórki przez delikatne pipetowanie. Przykryj szalkę Petriego folią aluminiową podczas transportu do aparatu sieciującego UV.

Otwartą szalkę Petriego należy natychmiast umieścić w aparacie sieciującym UV. Upewnij się, że odległość między naczyniem a lampą UV wynosi osiem centymetrów, a następnie naświetlaj próbkę przez jedną minutę. Następnie szybko podziel zawiesinę protoplastów z szalki Petriego na dwie nowe 50-mililitrowe rurki okrągłodenne.

Umyj dno naczynia dodatkowymi pięcioma mililitrami lodowatego roztworu MMG, aby zebrać pozostałą część protoplastów. Podziel zawieszenie między dwie rurki. Następnie odwirować probówki z próbkami innymi niż CL i dwie probówki z CL o temperaturze 100 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Po odrzuceniu supernatantu umieścić probówkę z granulkami innymi niż CL z powrotem na lodzie. Dodaj 10 mililitrów lodowatego roztworu MMG do każdej probówki z próbką CL i delikatnie potrząśnij probówkami, aby ponownie zawiesić granulki. Po połączeniu dwóch próbek w jedną 50-mililitrową probówkę okrągłodenną, wirować przy 100 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Po odrzuceniu supernatantu należy trzymać osad na lodzie. Następnie dodaj dziewięć mililitrów lodowatego buforu wiążącego lizę do osadu komórkowego każdej próbki. Poddać protoplasty lizie, pipetując w górę i w dół około dwadzieścia razy, aż roztwór uzyska jednorodny jasnozielony kolor.

W celu homogenizacji przepuść lizat protoplastu dwa razy przez 50-mililitrową szklaną strzykawkę z wąską igłą, a następnie inkubuj lizat na lodzie przez dziesięć minut. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do trzech tygodni. Po rozmrożeniu probówki z zamrożonym lizatem protoplastów w temperaturze pokojowej trzymaj probówkę na lodzie.

Porcjować 1,8 mililitra kulek magnetycznych oligo-d(T) do sześciu nowych dwumililitrowych mikroprobówek wirówek z okrągłym dnem umieszczonych na lodzie. Przemyć zawiesinę kulek w każdej probówce 600 mikrolitrami buforu wiążącego lizę, krótko pipetując w górę iw dół i delikatnie obracaj kulki na rotatorze przez dwie minuty. Trzymaj koraliki na lodzie.

Następnie umieść wszystkie sześć probówek zawierających koraliki w stojaku magnetycznym na co najmniej trzy minuty, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na pełne wychwycenie magnetyczne. Gdy koraliki zostaną całkowicie uchwycone, zawieszenie stanie się przezroczyste. Następnie wyrzuć supernatant ze wszystkich sześciu probówek i natychmiast wlej do nich dziewięć mililitrów lizatu protoplastów.

Wymieszać kulki z lizatem, pipetując, aż zawiesina stanie się brązowa i jednorodna. Inkubuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę z delikatnym obracaniem. Po inkubacji umieść probówki z powrotem w stojaku magnetycznym na trzy minuty.

Gdy wszystkie kulki zostaną uchwycone z boku probówek, zbierz supernatant zawierający lizat protoplastów do sześciu nowych dwumililitrowych okrągłodennych mikroprobówek wirówek. Następnie dodaj 1,5 mililitra lodowatego buforu do płukania po jednym do każdej probówki zawierającej kulki i ponownie zawieś kulki przez pipetowanie. Po delikatnym obracaniu przez minutę umieść rurki z powrotem w stojaku magnetycznym na trzy minuty.

Wyrzucić supernatant i powtórzyć ten etap płukania jeden raz. Używając 1,5 mililitra lodowatego buforu do mycia dwa, powtórz tę samą procedurę prania dwa razy. Jeśli mRNP zostały skutecznie wyizolowane z lizatu protoplastów, w próbce CL powinna być widoczna aureola wokół granulki kulki.

Na koniec powtórz procedurę mycia raz z 1,5 mililitra lodowatego buforu o niskiej zawartości soli. Po umyciu dodać 500 mikrolitrów buforu elucyjnego do każdej probówki i delikatnie ponownie zawiesić kulki przez pipetowanie. Inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby uwolnić RNA z ogonem poli-A.

Delikatnie ponownie zawiesić kulki przez jednokrotne pipetowanie i umieścić probówki z powrotem w stojaku magnetycznym w temperaturze czterech stopni Celsjusza na pięć minut. Przenieś i połącz eluenty ze wszystkich sześciu probówek do 15-mililitrowej rurki o stożkowym dnie umieszczonej na lodzie. Pozwoli to uzyskać około trzech milimetrów eluentu.

Jakość i ilość RNA można natychmiast określić za pomocą spektrofotometru. Przygotować kulki oligo-d(T) do ponownego użycia, przemłukując je dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego buforu elucyjnego. Następnie umyj je jednym mililitrem lodowatego buforu wiążącego do lizy, aby dostosować stężenie soli z powrotem do 500 milimolów.

Użyj tych umytych kulek oligo-d(T), aby powtórzyć procedury wiązania, mycia i elucji przez dodatkowe dwie rundy. Spowoduje to zubożenie ogoniastego RNA poli-A z lizatu protoplastów i uzyskanie łącznie dziewięciu milimetrów eluentu na każdą próbkę. Koraliki mogą być przechowywane i używane do innego eksperymentu maksymalnie trzy razy.

Aby przetestować RNA pod kątem jakości, należy strawić białka usieciowane promieniami UV roztworem proteinazy K zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie oczyść RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, aby usunąć wszelkie pozostałości zanieczyszczeń. Po oczyszczeniu próbki są gotowe do badania jakości RNA za pomocą qRT-PCR.

Rozpocznij od potraktowania ośmiu mililitrów każdej próbki 100 jednostkami koktajlu RNAzy zawierającego RNAzę A i RNAzę T1. Po krótkim wirowaniu inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby skoncentrować białka wiążące mRNA lub mRBP, należy przefiltrować próbki za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących. Każda próbka da 75 mikrolitrów z dwoma mikrogramami białka.

W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby uruchomić żel ze strony SDS, wymieszaj 25 mikrolitrów każdej skoncentrowanej próbki z 15 mikrolitrami barwnika o 2-krotnym obciążeniu i podgrzej próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Załaduj próbki do markera białkowego na żel stronicowy SDS z pięcioprocentowym żelem układającym w stos i dwunastoprocentowym żelem rozdzielczym.

Następnie umyj żel dwukrotnie ultraczystą wodą przez pięć minut na pranie. Użyj dostępnego w handlu zestawu do barwienia srebra, aby zabarwić żel. Jeśli użyto wystarczającej liczby początkowych protoplastów, prążki białkowe pojawią się w ciągu pięciu minut.

Aby dalej testować mRBP, oczyść peptydy z drugiego żelu stronicowego 1D, jak wyjaśniono w protokole tekstowym. Te oczyszczone peptydy można teraz analizować za pomocą nanochromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, spektrometrii mas oraz proteomiki jakościowej i ilościowej. Po wychwyceniu kulek oligo-d(T), qRT-PCR wykazał istotnie wyższe poziomy referencyjnego mRNA poliubikwityny 10 w porównaniu z 18S rRNA.

Ponieważ kulki oligo-d (T) wiążą się tylko z RNA z ogonem poli-A, sugeruje to, że mRNA są wzbogacone w eluent. Wychwytywanie mRBP przez kulki oligo-d (T) jest dalej oceniane za pomocą srebrzystego żelu na strony SDS. Żel wykazuje znacznie większą ilość białka w próbce CL usieciowanej promieniami UV w porównaniu z próbką nieusieciowaną bez CL.

Czas trwania naświetlania promieniami UV może mieć wpływ na skuteczność sieciowania. Ten zabarwiony srebrem żel do strzyżenia kart charakterystyki potwierdza, że jedna lub trzy minuty naświetlania promieniami UV to optymalne warunki, przy najsilniejszych intensywnościach pasma. Łącznie 325 białek zidentyfikowano za pomocą ilościowej analizy proteomicznej.

225 z tych białek było poniżej poziomu istotności ze względu na niską obfitość peptydów obecnych w każdym białku, przy dużej zmienności intensywności peptydów. Ponieważ jednak wszystkie z nich zostały jakościowo wykryte tylko w próbkach CL, wszystkie uznano za wyniki pozytywne. Te 325 białek zostało dalej sklasyfikowanych w trzech kategoriach: białka rybosomalne, główne RBP i kandydujące RBP.

Kandydujące RBP nie mają konwencjonalnych domen wiążących RNA, a większość ich ról nie została zwalidowana, co sugeruje możliwe nowe funkcje w regulacji RNA. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się szlakami regulacji molekularnej u roślin do zbadania całego genomu proteomu związanego z informacyjnym RNA w komórkach i tkankach dwuliściennych i jednoliściennych.