Genotypowanie polimorfizmu długości receptora dopełniacza 1 metodą topnienia w wysokiej rozdzielczości: innowacyjne narzędzie do oceny podatności genów choroby Alzheimera

Ogólnym celem tej metody jest genotypowanie polimorfizmów długości receptora dopełniacza 1 w celu oceny podatności na choroby, takie jak choroba Alzheimera, aby lepiej zrozumieć rolę izoform CR1 w patogenezie tych schorzeń. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki, m.in. dotyczące patogenezy choroby Alzheimera. Głównymi zaletami tej techniki są brak konieczności stosowania świeżych próbek krwi oraz fakt, że jest ona prostsza, tańsza i szybsza, a w konsekwencji możliwa do zastosowania w badaniach większych populacji.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy trudności związane z wykonywaniem analiz Western blot, w szczególności w odniesieniu do wymaganego czasu oraz konieczności stosowania świeżych próbek krwi. Do dna probówki o pojemności 1,5 ml pipetujemy 20 µL proteinazy K. Następnie do probówki dodajemy 200 µL próbki.

Do próbki należy dodać 200 µL buforu lizującego. Wymieszać za pomocą pulsacyjnego wstrząsania w vortexie przez 15 sekund. Po wymieszaniu inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 56 °C przez 10 minut.

Krótko odwiruj probówkę 1,5-mililitrową, aby usunąć krople z wewnętrznej strony zakrętki. Następnie dodaj 100 µL etanolu do próbki. Ponownie wymieszaj, stosując pulsacyjne wirowanie w vortexie przez 15 sekund, a następnie krótko odwiruj probówkę w ten sam sposób co wcześniej.

Następnie ostrożnie nanieś mieszaninę na kolumnę membranową znajdującą się w probówce do zbierania o pojemności 2 ml. Zamykając zakrętkę, uważaj, aby nie zamoczyć krawędzi, a następnie wiruj z prędkością 6 000 ×g przez jedną minutę. Przenieś kolumnę membranową do czystej probówki do zbierania o pojemności 2 ml i odrzuć probówkę zawierającą filtrat.

Ostrożnie otwórz kolumnę membranową i dodaj 500 µL buforu płuczącego jeden, nie zwilżając krawędzi. Zamknij zakrętkę i wiruj z prędkością 6 000 ×g przez jedną minutę. Następnie umieść kolumnę membranową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 mL i wyrzuć probówkę zawierającą filtrat.

Po ostrożnym otwarciu kolumny membranowej, dodaj 500 µL buforu płuczącego dwa, uważając, aby nie zmoczyć krawędzi. Zamknij nakrętkę i wiruj z prędkością 20 000 ×g przez trzy minuty. Następnie umieść kolumnę membranową w nowej probówce do zbierania o pojemności 2 mL i ponownie wiruj.

Po wirowaniu przenieś kolumnę membranową do czystej probówki o pojemności 1,5 ml i odrzuć probówkę zbiorczą zawierającą filtrat. Ostrożnie otwórz kolumnę membranową i dodaj 200 µl wody destylowanej. Inkubuj kolumnę w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie wiruj przy 6 000 ×g przez jedną minutę.

Aby przeprowadzić protokół HRM-PCR, najpierw rozcieńczyć próbki DNA w probówkach 1,5 ml wodą do stężenia 10 ng/µL. Następnie rozcieńczyć rozmrożone roztwory starterów w probówkach 1,5 ml wodą do stężenia 6 µM. Rozmrozić roztwory z zestawu HRM-PCR i dokładnie wymieszać za pomocą wortexa, aby zapewnić pełne odzyskanie wszystkich składników.

Przed otwarciem krótko wiruj w mikrowirówce trzy fiolki zawierające mieszaninę enzymatyczną z barwnikiem wiążącym DNA, chlorek magnezu oraz wodę. W probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze pokojowej, wykorzystując powyższe komponenty, przygotuj mieszaninę PCR dla reakcji o objętości 120 µL zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wymieszaj dokładnie za pomocą vortexa.

Kluczowe jest, aby pracować z należytą starannością i dokładnością, zgodnie z zasadami dobrej praktyki w biologii molekularnej. Do każdego dołka białej płytki wielodołkowej należy pipetować 19 µL mieszaniny PCR. Następnie należy dodać 1 µL DNA matrycy o dostosowanym stężeniu, a następnie szczelnie zamknąć białą płytkę wielodołkową folią uszczelniającą.

Wiruj białą płytkę wielodołkową przez jedną minutę przy 1 500 ×g w standardowej wirówce z koszyczkami, wyposażonej w rotor do płytek wielodołkowych z odpowiednimi adapterami. Włóż białą płytkę wielodołkową do urządzenia HRM-PCR. Uruchom program HRM-PCR z warunkami PCR opisanymi w protokole tekstowym.

Po reakcji HRM-PCR przeprowadź analizę HRM w celu określenia polimorfizmu długości CR1, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Krzywe topnienia analizowano przy użyciu oprogramowania po wysokorozdzielczym topnieniu amplikonów z PCR uzyskanych z genomicznego DNA osób z różnymi izoformami CR1. Wyniki w postaci krzywych pozwalają na rozróżnienie badanych osób w zależności od ich allotypowych fenotypów ekspresji CR1.

Jak pokazują dwa tryby prezentacji: znormalizowane i przesunięte krzywe topnienia oraz znormalizowany i przesunięty temperaturowo wykres różnic, profile krzywych są rozłożone zgodnie z grupami CR1 star three, CR1 star one, grupą CR1 star one, CR1 star two, grupą CR1 star one, grupą CR1 star two oraz grupą CR1 star two, CR1 star four. Krzywe te odpowiadają allelom polimorfizmu długości CR1. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak łatwo typować genetycznie polimorfizm długości CR1 na podstawie idealnych krzywych uzyskanych metodą HRM-PCR.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na konieczność posiadania próbek referencyjnych o znanych genotypach długości CR1. Po opanowaniu techniki, w przypadku jej prawidłowego wykonania, procedura ta zajmuje cztery godziny. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby dla każdej próbki DNA zastosować takie samo stężenie.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak stożkowe sekwencjonowanie DNA, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład w celu zidentyfikowania nowego, znanego prywatnego SNP. Po tym opracowaniu technika ta otwiera drogę dla badaczy w dziedzinie genetyki populacyjnej do zbadania presji selekcyjnej patogenów w polimorfizmie długości CR1. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat podatności w patogenezie choroby Alzheimera, może być ona również zastosowana w innych badaniach nad chorobami, takimi jak toczeń rumieniowaty układowy i malaria.