Genotypowanie polimorfizmu długości receptora dopełniacza 1 metodą topnienia w wysokiej rozdzielczości: innowacyjne narzędzie do oceny podatności genów choroby Alzheimera

Ogólnym celem tej metody jest genotyp polimorfizmów długości receptora dopełniacza 1 do wykorzystania w ocenie podatności na choroby, takie jak choroba Alzheimera, aby lepiej zrozumieć rolę izoform CR1 w patogenezie choroby. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak patogeneza choroby Alzheimera. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga świeżych próbek krwi i jest łatwiejsza, tańsza, szybsza, a zatem ma zastosowanie w większych populacjach.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę z wyzwań związanych z wykonywaniem Western blot w odniesieniu do niezbędnego czasu i potrzeby pobierania świeżych próbek krwi. Odpipetować 20 mikrolitrów proteinazy K na dno 1,5-mililitrowej probówki. Następnie dodaj 200 mikrolitrów próbki do probówki.

Dodać 200 mikrolitrów buforu do lizy do próbki. Mieszaj przez pulsacyjne wirowanie przez 15 sekund. Po wymieszaniu inkubować w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez 10 minut w łaźni wodnej.

Krótko odwiruj 1,5-mililitrową probówkę, aby usunąć krople z wnętrza pokrywki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów etanolu do próbki. Wymieszaj ponownie, pulsując, wirując przez 15 sekund, a następnie krótko odwiruj probówkę, jak poprzednio.

Następnie ostrożnie nałóż mieszaninę na kolumnę membranową w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Nie zwilżając obręczy, zamknij nakrętkę i odwiruj przy 6 000 razy G przez jedną minutę. Umieść kolumnę membranową w czystej dwumililitrowej probówce zbiorczej i wyrzuć probówkę zawierającą filtrat.

Ostrożnie otwórz kolumnę membranową i dodaj 500 mikrolitrów bufora myjącego bez zwilżania obręczy. Zamknąć nakrętkę i odwirować w temperaturze 6 000 razy G przez jedną minutę. Następnie umieść kolumnę membranową w czystej dwumililitrowej probówce zbiorczej i wyrzuć probówkę zawierającą filtrat.

Po dokładnym otwarciu kolumny membranowej dodać 500 mikrolitrów drugiego buforu do płukania bez zwilżania obręczy. Zamknij nakrętkę i odwiruj przy 20 000 razy G przez trzy minuty. Następnie umieść kolumnę membranową w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej i ponownie odwiruj.

Po odwirowaniu umieścić kolumnę membranową w czystej probówce o pojemności 1,5 mililitra i wyrzucić probówkę zbiorczą zawierającą filtrat. Ostrożnie otwórz kolumnę membranową i dodaj 200 mikrolitrów wody destylowanej. Inkubować kolumnę w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie odwirować w temperaturze 6 000 razy G przez jedną minutę.

Aby wykonać protokół HRM-PCR, najpierw rozcieńczyć próbki DNA w 1,5-mililitrowych probówkach wodą do stężenia 10 nanogramów na mikrolitr. Następnie rozcieńczyć rozmrożone roztwory podkładu w 1,5-mililitrowych probówkach wodą do tego samego stężenia sześciu mikromolowych. Rozmrozić roztwory zestawu HRM-PCR i ostrożnie wymieszać przez wirowanie, aby zapewnić odzyskanie całej zawartości.

Przed ich otwarciem krótko zakręć trzema fiolkami zawierającymi mieszaninę enzymatyczną z barwnikiem wiążącym DNA, chlorkiem magnezu i wodą. W 1,5-mililitrowej probówce o temperaturze pokojowej użyj składników do przygotowania mieszanki PCR do 120-mikrolitrowej reakcji, jak opisano w protokole tekstowym. Dokładnie wymieszaj, wirując.

Bardzo ważne jest, aby pracować z uwagą i zastosowaniem zgodnie z dobrymi praktykami biologii molekularnej. Odpipetować 19 mikrolitrów PCR wymieszać z każdym dołkiem białej płytki wielodołkowej. Dodać jeden mikrolitr matrycy DNA o dostosowanym stężeniu, a następnie uszczelnić białą płytkę wielodołkową folią uszczelniającą.

Odwirować białą płytkę wielodołkową przez jedną minutę w temperaturze 1 500 razy G w standardowej wirówce z odchylanym wiadrem zawierającej wirnik do płytek wielodołkowych z odpowiednimi adapterami. Załaduj białą płytkę wielodołkową do instrumentu HRM-PCR. Uruchom program HRM-PCR z warunkami PCR znalezionymi w protokole tekstowym.

Po reakcji HRM-PCR należy przeprowadzić analizę HRM w celu wyznaczenia polimorfizmu długości CR1 zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Krzywe fuzji zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania po stopieniu w wysokiej rozdzielczości amplikonów pochodzących z PCR z genomowego DNA osób z różnymi izoformami CR1. Rezultatami są krzywe, które dyskryminują badanych według ich allotypowych fenotypów ekspresji CR1.

Jak pokazują dwa tryby prezentacji, znormalizowane i przesunięte krzywe topnienia oraz znormalizowany i przesunięty temperaturowo wykres różnicowy, profile krzywych są rozłożone zgodnie z gwiazdą CR1 trzy, gwiazdą CR1 jedną grupą, gwiazdą CR1 gwiazdą jeden, gwiazdą CR1 grupą dwójką, gwiazdą CR1 grupą jedną i gwiazdą CR1 gwiazdą drugą, Grupa gwiazdek CR1 cztery. Krzywe te odpowiadają allelom polimorfizmu długości CR1. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo genotypować polimorfizm długości CR1 zgodnie z idealnymi krzywymi uzyskanymi przez HRM-PCR.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu potrzeby próbek referencyjnych o znanych już genotypach długości CR1. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby używać tego samego stężenia dla każdej próbki DNA.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak stożkowe sekwencjonowanie DNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak znalezienie nowego znanego prywatnego SNP. Po tym rozwoju technika ta toruje drogę badaniom w dziedzinie genetyki populacyjnej do zbadania selektywnej presji patogenów w polimorfizmie długości CR1. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat podatności na patogenezę choroby Alzheimera, może być również stosowana do innych badań nad chorobami, takimi jak toczeń rumieniowaty układowy i malaria.