Oparta na filtracji metoda przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji chromatyny

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest umożliwienie przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych, które można następnie wykorzystać do badań immunoprecypitacji chromatyny. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mięśni i okołodoby, takie jak badania genomiczne z wykorzystaniem tkanek i komórek mięśniowych w kontekście okołodobowym lub innym wrażliwym na czas kontekście. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona natychmiastowe sieciowanie próbek, a procedura oparta na filtracji może być niezawodnie przeprowadzona w celu wyizolowania wysokiej jakości jąder przy minimalnym zanieczyszczeniu miofibrylami.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w mięśnie szkieletowe, może być również stosowana do innych układów, takich jak serce i mięśnie gładkie. Zważyć i zmielić mięśnie szkieletowe kończyn tylnych wyizolowane od około 20-tygodniowych czarnych myszy C57 sześciu samców w lodowatym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami, jak opisano wcześniej. Umieść zmieloną tkankę mięśni szkieletowych w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów zawierającej 10 mililitrów PBS na lodzie.

Następnie odwirować próbkę w temperaturze 300 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant PBS przez aspirację. Oszacuj objętość osadu w każdej 50-mililitrowej probówce za pomocą probówek referencyjnych z jednym, dwoma, trzema i czterema mililitrami wody.

Dodać siedem objętości lodowatego 1% formaldehydu i PBS i homogenizować próbki na lodzie za pomocą homogenizatora tkankowego z sondą. Następnie usieciuj próbkę, inkubując ją w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ugasić reakcję sieciowania poprzez dodanie jednej glicyny molowej do końcowego stężenia 0,125 mola, a następnie inkubację przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu próbki w temperaturze 3 000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usunąć supernatant przez aspirację. Wypłucz osad, ponownie zawieszając go w 10 mililitrach lodowatego buforu zasadowego zawierającego świeżo dodane inhibitory proteazy. Ponownie odwirować próbkę i ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację.

Następnie ponownie zawiesić osad w sześciu mililitrach buforu do lizy zawierającego świeżo dodane inhibitory proteazy. Przenieść próbkę do wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce o pojemności 15 mililitrów i inkubować przez 10 minut na lodzie. Odbić każdą próbkę homogenizować na lodzie 15 powolnymi pociągnięciami za pomocą luźnego tłuczka, a następnie 15 uderzeń ciasnym tłuczkiem, aby uwolnić jądra.

Następujące etapy filtracji są kluczem do izolacji jąder wysokiej jakości. Przefiltrować homogenat przez sitko do komórek i przepłukać czterema mililitrami buforu do lizy. Następnie odwirować próbki o masie 1 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ponownie zawiesić pastylkę w pięciu mililitrach lodowatego bufora bazowego i odbić 10 razy ciasnym tłuczkiem, aby uwolnić jądra. Następnie przefiltrować zawiesinę przez sitko komórkowe i przepłukać probówkę dwoma mililitrami buforu bazowego i ponownie przefiltrować. Powtórzyć filtrację za pomocą sitek komórkowych o stopniowo zmniejszającej się wielkości porów.

Na koniec odwirować w temperaturze 1 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu zasadowego przed ponownym odwirowaniem. Odrzucić supernatant i przechowywać osad w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Rozmrozić próbki w 500 mikrolitrach buforu do lizy SDS i ponownie zawiesić za pomocą delikatnego pipetowania. Przenieść zawiesinę DNA jąder do szklanej fiolki z lodem. Wybór odpowiedniej platformy i warunków sonikacji ma kluczowe znaczenie dla przygotowania chromatyny z izolowanych jąder.

Uruchom sonikację ze skoncentrowanymi impulsami ultradźwiękowej energii akustycznej z przetwornika w kształcie dysku, korzystając z ustawień opisanych w protokole tekstowym. Przenieś sonikowaną chromatynę do 1,5 mililitrowej probówki. Następnie odwirować przy 12 000 g przez 15 minut i przenieść supernatant do nowej probówki.

Następnie przenieś 50 mikrolitrów sonikowanej próbki do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra w celu odwrotnego sieciowania przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Pobieranie próbek DNA opisano w następnym rozdziale. Po ocenie sonikacji i kwantyfikacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym, podwielokrotnić rozmrożoną chromatynę do około 100 do 120 mikrogramów na probówkę.

Następnie rozcieńczyć chromatynę od 1 do 10 buforem immunoprecypitacyjnym. Następnie dodaj 40 mikrolitrów 50% zawiesiny wstępnie zablokowanego białka HE, agarozy lub kulek IgY BSA i inkubuj na rotatorze przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu próbki w temperaturze 1 000 g przez 10 minut, ostrożnie przenieść supernatant do nowych probówek.

Następnie dodaj przeciwciała w ilości jednego mikrograma przeciwciała na 25 do 100 mikrogramów DNA chromatyny. Obracaj delikatnie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza i około 15 obr./min. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wstępnie zablokowanego białka BSA, HE, agarozy lub kulek IgY i wymieszaj.

Obracaj zawiesinę ściegu w chłodni przez dwie godziny. Następnie umyj kulki buforem RIPA, a następnie buforem o wysokiej zawartości soli, buforem chlorku litu i Tris EDTA, jak opisano w protokole tekstowym. Po przemyciu wymyj DNA z kulek, najpierw odwirowując je w ilości 1 000 g przez jedną minutę i ostrożnie usuwając supernatant.

Ponownie zawiesić kulki za pomocą 50 mikrolitrów buforu elucyjnego. Następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Po inkubacji odwirować przy 12 000 g przez pięć minut.

Usunąć supernatant i dodać kolejne 50 mikrolitrów buforu elucyjnego przed ponownym odwirowaniem w ilości 12 000 g przez pięć minut. Ostateczna objętość elucji wyniesie 100 mikrolitrów. Aby odwrócić sieciowanie i przeprowadzić elucję DNA, najpierw inkubuj elucjowaną chromatynę przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj jeden mikrolitr RNazy A przed inkubacją przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie inkubować z ośmioma mikrolitrami po 10 miligramów na mililitr proteazy K przez 30 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Zbierz DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR o objętości elucji 50 mikrolitrów zgodnie z protokołem producenta.

Na koniec przeanalizuj profile za pomocą QPCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej. Filtracja sekwencyjna skutecznie usunęła resztki tkanek. Reprezentatywne obrazy próbek po filtracji początkowej i po filtracji seryjnej są pokazane tutaj dla porównania.

Postępujące rozdrabnianie chromatyny przez 10 cykli sonikacji ujawnia się poprzez prowadzenie żelu agarozowego. 10 cykli sonikacji z strawioną chromatyną dało DNA o długości około 500 par zasad. Tutaj pokazano reprezentatywne wyniki QPCR dla samców B jeden chIP z próbkami mięśni szkieletowych myszy pobranymi w ZT6 i ZT18.

Analiza elementów lokalizacji Dbp w genie Dbp wykazała, że zgodnie z poprzednimi wynikami piki wiązania znajdują się około ZT6. Po opanowaniu, przygotowanie jąder można wykonać w ciągu pięciu do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać metod opartych na filtracji do oczyszczania wysokiej jakości jąder i DNA chromatyny z usieciowanej tkanki mięśniowej.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu próbek na lodzie lub w chłodni i zachowaniu podwielokrotności próbek do kontroli mikroskopowej przed i po etapach filtracji. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mięśniami i genomiką do zbadania okołodobowej lub wrażliwej na czas dynamiki interakcji chromatyna-białko w różnych tkankach mięśniowych. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie chIP, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak poszukiwanie wzorców wiązania czynników transkrypcyjnych w tkankach mięśniowych.