Name: Oparta na filtracji metoda przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji chromatyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Naucz się izolować wysokiej jakości jądra z usieciowanych mięśni szkieletowych myszy metodą filtracyjną bez ultrawirówki. Przygotowanie chromatyny do immunoprecypitacji ułatwia badania genomiki mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Karyn Esser, Nobuya Koike i Noheon Park za pomocne rady. Praca ta była częściowo wspierana przez NIH/NIGMS (R01GM114424) dla S.-H.Y. oraz Fundację Roberta A. Welcha (AU-1731) i NIH/NIA (R01AG045828) dla Z.C.

Opieka nad zwierzętami została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), a procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez University of Texas Health Science Center w Houston.
1. Izolacja jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych
<ol>
	<li>Zważyć i zmielić mięśnie szkieletowe kończyn tylnych, wyizolowane od około 20-tygodniowych samców myszy C57BL/6, w lodowato zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), jak opisano szczegółowo wcześniej22. 
	UWAGA: Z jednej myszy zwykle pozyskujemy 1,0 - 1,5 g mięśni szkieletowych.
	<ol>
		<li>Umieść zmieloną tkankę mięśni szkieletowych w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml PBS na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant PBS przez aspirację.</li>
	<li>Oszacuj objętość osadu w każdej probówce o pojemności 50 ml za pomocą probówek referencyjnych z 1, 2, 3 i 4 ml wody.</li>
	<li>Dodać 7 objętości lodowatego 1% formaldehydu do PBS i homogenizować próbki na lodzie za pomocą homogenizatora tkankowego z sondą (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Opcjonalnie: Procedurę homogenizacji można przeprowadzić w chłodni.</li>
	<li>Próbkę należy usieciować przez inkubację w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Ugasić reakcję sieciowania przez dodanie 1 M glicyny do końcowego stężenia 0,125 M i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant przez aspirację.</li>
	<li>Przepłukać 10 ml lodowatego buforu bazowego (10 mM HEPES-KOH o pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT) zawierającego świeżo dodane inhibitory proteazy (0,2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 10 μg/ml leupeptyny). Odwirować przy 3 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację.</li>
	<li>Zawiesić osad w 6 ml buforu do lizy (10 mM HEPES-KOH o pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) zawierającym świeżo dodane inhibitory proteazy (0,2 mM PMSF i 10 μg/ml leupeptyny).</li>
	<li>Przenieść próbkę do wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml i inkubować przez 10 minut na lodzie. Odbić każdą próbkę homogenizować na lodzie 15 powolnymi pociągnięciami za pomocą luźnego tłuczka, a następnie 15 uderzeń ciasnym tłuczkiem, aby uwolnić jądra.</li>
	<li>Przefiltrować homogenat (6 ml) przez sitko do komórek (wielkość porów: 100 μm) i przepłukać 4 ml buforu do lizy. Odwirować próbki o masie 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić w 5 ml lodowatego buforu zasadowego i odbić 10 razy ciasnym tłuczkiem w celu uwolnienia jąder.
	<ol>
		<li>Usunąć podwielokrotność 20 μl do pomiaru stężenia DNA za pomocą spektrofotometru (OD260/OD280) i obserwacji mikroskopowej z błękitem trypanowym, jeśli to konieczne (patrz poniżej) (patrz poniżej) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę przez sitko komórkowe (wielkość porów: 70 μm), przepłukać probówkę i ponownie przefiltrować za pomocą 2 ml buforu zasadowego, jak powyżej.</li>
	<li>Powtórzyć filtrację jak w kroku 1.13 z sitkami do komórek o stopniowo zmniejszanej wielkości porów (40 μm, 30 μm, 20 μm i 10 μm). 
	UWAGA: W sumie w krokach 1.12-1.14 zastosowano sitka o 6 rozmiarach porów.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 1 000 g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze zasadowym o pojemności 500 μl.</li>
	<li>Zmierz stężenie DNA jak wyżej. 
	UWAGA: Około 200 μg nukleinowego DNA uzyskano z połączenia obu tylnych kończyn od jednego zwierzęcia. Opcjonalnie zachowaj 20 μl do obserwacji mikroskopowej z barwieniem błękitem trypanowym (stężenie podstawowe 0,4%, rozcieńczenie 1:5); jądra będą barwione na niebiesko (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 1 000 g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i odrzucić supernatant. Przechowywać granulki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Sonikacja
<ol>
	<li>Próbki należy rozmrozić w 500 μl buforu do lizy SDS i ponownie zawiesić za pomocą delikatnego pipetowania.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę DNA jąder do szklanej fiolki z lodem.</li>
	<li>Uruchom sonikację ze skoncentrowanymi impulsami ultradźwiękowej energii akustycznej z przetwornika w kształcie talerza. Szczegółowe informacje na temat wyposażenia znajdują się w tabeli materiałów. Użyj następującego ustawienia: liczba cykli na serię: 200; intensywność: 5; cykl pracy: 20; temperatura 4 - 6 °C; 30 s wł. 
	UWAGA: Przykład oceny skuteczności sonikacji jest pokazany na Rysunek 2.</li>
	<li>Przenieś sonikowaną chromatynę do probówki o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy 12 000 x g przez 15 minut i przenieść supernatant do nowej probówki. Przenieść 50 μl próbek poddanych sonikacji (~ 7 - 10 μg/próbkę mięśniową) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml w celu odwrotnego sieciowania przez noc w temperaturze 65 °C. Pozostałe próbki zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Ocena sonikacji i kwantyfikacji
<ol>
	<li>Dodać 1,0 μl RNazy A (500 U/ml RNazy A: 20 000 U/ml RNazy T1) do zapisanych 50 μl sonikowanych próbek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 8 μl proteazy K (10 mg/ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Zbierz DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA.
	<ol>
		<li>Dodać 5 objętości buforu wiążącego, nałożyć go na wirującą kolumnę i odwirować przy 4 000 x g, 10 min.</li>
		<li>Nałożyć przepust na tę samą kolumnę i ponownie odwirować.</li>
		<li>Przemyć buforem myjącym dwa razy po 13 000 x g, 1 min.</li>
		<li>Ponownie odwirować przy 13 000 x g, 1 minutę w celu wysuszenia kolumny.</li>
		<li>Dodać 50 μlH2Oi odwirować przy 13 000 x g, 1 minutę w celu wymycia DNA.</li>
		<li>Nałożyć przepust na tę samą kolumnę i ponownie odwirować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określić ilościowo ilość DNA za pomocą spektrofotometru (OD260/OD280). Uruchom próbki na żelach o stężeniu 0,8%, aby ocenić wielkość i ilość (1 μg) produktów poddanych sonikacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Średnia wydajność chromatyny wynosi około ~ 20%.</li>
</ol>
4. ChIP
<ol>
	<li>Uprzednio zapisaną chromatynę rozmrozić w temperaturze -80 °C i podwielokrotnić chromatynę do ilości ~ 100 - 120 μg na probówkę. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 buforem do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) (20mM Tris-HCl (pH 7,4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM PMSF, 1x koktajl inhibitorów proteazy (), 0,1% Na-deoksycholan (w/v), 1% Triton X-100).
	<ol>
		<li>Jeśli w każdej grupie jest wiele próbek, połącz równe ilości DNA chromatyny do końcowej ilości ~ 100 - 120 μg / próbkę. Zaoszczędź 10% jako dane wejściowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 40 μl (50% v/v zawiesiny w buforze RIPA) wstępnie zablokowanego (~ 2 h, 4 °C) białka A/G agarozy (przeciwciało inne niż kurze) lub kulek IgY (przeciwciało kurze) i inkubować na rotatorze przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować przy 1 000 x g, 10 minut i ostrożnie przenieść supernatant do nowych probówek.</li>
	<li>Dodaj przeciwciała o stężeniu 1 μg przeciwciała na ~ 25 - 100 μg DNA chromatyny.</li>
	<li>Obracać delikatnie w temperaturze 4 °C przez noc z prędkością około 15 obr./min.</li>
	<li>Dodać 10 μl wstępnie zablokowanego (~2 h, 4 °C) białka A/G agarozy (przeciwciało inne niż kurze) lub kulek IgY (przeciwciało kurze) i obracać w chłodni przez 2 godziny.</li>
	<li>Umyj koraliki w następujący sposób. Przemyć 1 ml buforu RIPA przez 3 minuty dwukrotnie, przemyć 1 ml buforu o wysokiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100) przez 3 minuty dwa razy, przemyć 1 ml buforu LiCl (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Na-deoksycholanu, 0,5% NP40) przez 3 minuty dwukrotnie.
	<ol>
		<li>Przemyć 1 ml buforu Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) przez 3 minuty raz. Następnie eluuj DNA za pomocą buforu elucyjnego (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA i 0,5% SDS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować przy 1 000 g przez 1 minutę i ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić kulkę z 50 μl buforu elucyjnego.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Wirować przy 12 000 g przez 5 min.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki, dodać kolejne 50 μl i ponownie odwirować przy 12 000 g przez 5 minut. Ostateczna objętość elucji wyniesie 100 μl.</li>
	<li>Odwrotne sieciowanie i elucja DNA.
	<ol>
		<li>Inkubować eluowaną chromatynę przez noc w temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Dodać 1,0 μl RNazy A i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 8 μl proteazy K (10 mg/ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 55 °C.</li>
		<li>Pobrać DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR z objętością elucji wynoszącą 50 μl zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj profile za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej25,26. 
	UWAGA: Sekwencje starterów są wymienione w Rysunek 3 Legenda. Dane są przedstawione jako średnia ± SEM (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>

<ol><li>Bouzakri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-based+gene+silencing+reveals+specialized+roles+of+IRS-1%2FAkt2+and+IRS-2%2FAkt1+in+glucose+and+lipid+metabolism+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle.</a> Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).</li>
<li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).</li>
<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meter+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li>
<li>Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+circadian+signaling+networks+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets.</a> Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).</li>
<li>Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms%2C+the+molecular+clock%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle.</a> J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).</li>
<li>Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+the+circadian+and+sleep+cycles+to+protect+against+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35(2015).</li>
<li>Harfmann, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+loss+of+Bmal1+leads+to+disrupted+tissue+glucose+metabolism+and+systemic+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis.</a> Skelet Muscle. 6, 12(2016).</li>
<li>Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscles%2C+exercise+and+obesity%3A+skeletal+muscle+as+a+secretory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ.</a> Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Jackson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+histone+organization+in+the+nucleosome+using+formaldehyde+as+a+reversible+cross-linking+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent.</a> Cell. 15 (3), 945-954 (1978).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Takahashi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+RNA-seq+methods+to+study+circadian+control+of+transcription+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals.</a> Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).</li>
<li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein%3ADNA+associations+in+a+chromatin+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19 (3), 425-433 (1999).</li>
<li>Chen, Z., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+promoter+elements+and+TAFs+contribute+to+the+diversity+of+transcriptional+activation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates.</a> Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).</li>
<li>Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+PER+repression+mechanisms+in+the+Drosophila+circadian+clock%3A+from+on-DNA+to+off-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA.</a> Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).</li>
<li>Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+regulates+Period2+expression+and+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">p53 regulates Period2 expression and the circadian clock.</a> Nat Commun. 4, 2444(2013).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Koike, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+and+chromatin+landscape+of+the+core+circadian+clock+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals.</a> Science. 338 (6105), 349-354 (2012).</li>
<li>Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPping+away+at+the+Drosophila+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">ChIPping away at the Drosophila clock.</a> Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).</li>
<li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. , (2016).</li>
<li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).</li>
<li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+skeletal+muscle+satellite+cells+and+myofibers+for+use+in+chromatin+immunoprecipitation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays.</a> Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).</li>
<li>Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nuclei+and+preparation+of+nuclear+envelopes+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle.</a> Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).</li>
<li>Hahn, C. G., Covault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+transcriptionally+active+nuclei+from+striated+muscle+using+Percoll+density+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients.</a> Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).</li>
<li>Jeong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+attenuation+of+proteasomal+and+autophagic+BMAL1+degradation+in+Clock+Delta19%2F%2B+mice+contributes+to+improved+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis.</a> Scientific reports. 5, 12801(2015).</li>
<li>Nohara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonia-lowering+activities+and+carbamoyl+phosphate+synthetase+1+%28Cps1%29+induction+mechanism+of+a+natural+flavonoid%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid.</a> Nutrition & metabolism. 12, 23(2015).</li>
<li>Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+integrates+the+transcriptional+response+of+the+hepatocyte+to+fasting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting.</a> Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li>
<li>Kondratov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMAL1-dependent+circadian+oscillation+of+nuclear+CLOCK%3A+posttranslational+events+induced+by+dimerization+of+transcriptional+activators+of+the+mammalian+clock+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system.</a> Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).</li>
<li>Ripperger, J. A., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+CLOCK-BMAL1+binding+to+multiple+E-box+motifs+drives+circadian+Dbp+transcription+and+chromatin+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions.</a> Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).</li>
<li>Laplante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEPTOR+cell-autonomously+promotes+adipogenesis%2C+and+its+expression+is+associated+with+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity.</a> Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).</li>
<li>Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+regulator+PGC-1alpha+directly+controls+the+expression+of+the+hypothalamic+neuropeptide+oxytocin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin.</a> J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy solidną metodę, w której do wyizolowania jąder wysokiej jakości wykorzystano usieciowane tkanki mięśni szkieletowych. Przeprowadzono sekwencyjną filtrację, aby skutecznie oddzielić jądra od gruzu, a ultradźwiękowa energia akustyczna z przetwornika w kształcie talerza ścięła chromatynę do analizy ChIP. Wyniki wykazały specyficzne dla czasu okołodobowego wiązanie BMAL1 z docelowymi promotorami.
ChIP można wykorzystać do uchwycenia w czasie rzeczywistym zajętości białek w ...

Mięśnie szkieletowe odgrywają ważną rolę w fizjologii i zachowaniu. Wielojądrowe włókno mięśniowe składa się z miofibryli, w których aktyna i miozyna tworzą jednostki funkcjonalne zwane sarkomerami, które generują siłę skurczu. Mięśnie szkieletowe są również największym narządem metabolicznym w organizmie, odpowiadającym za >80% poposiłkowego spożycia glukozy i regulującym odpowiedź insulinową oraz homeostazę metaboliczną1,2. Fizjologia i metabolizm mięśni są ściśle regulowane przez zegar okołodobowy, wewnętrzny zegar biologiczny3,4,5,6. Na przykład, specyficzna dla mięśni szkieletowych delecja Bmal1, jednego z podstawowych składników zegara okołodobowego, spowodowała insulinooporność i zmniejszony wychwyt glukozy w mięśniach szkieletowych, a u zwierząt stwierdzono, że u zwierząt rozwija się cukrzyca typu 27. Ponadto mięśnie szkieletowe są coraz bardziej doceniane jako narząd dokrewny8, wydzielający miokiny w celu regulacji ogólnoustrojowego metabolizmu i fizjologii. Aby w pełni zrozumieć te funkcje regulacyjne w mięśniach szkieletowych, wymagane są badania mechanistyczne.
ChIP to potężne podejście do wyznaczania rekrutacji promotorów białek wiążących DNA. ChIP został początkowo opracowany w celu identyfikacji organizacji nukleosomów na chromatynie DNA9,10. Od tego czasu opisano różne metody sieciowania białek i chromatyny DNA przy użyciu formaldehydu, siarczanu dimetylu lub promieniowania ultrafioletowego (UV)11,12. Najczęściej stosowanym sposobem sieciowania formaldehydu jest zachowujące strukturę chromatyny i interakcje DNA-białko9,13,14. Usieciowana chromatyna jest rozdrabniana przez sonikację i immunoprecypitowana przeciwciałem przeciwko konkretnemu białku wiążącemu DNA będącemu przedmiotem zainteresowania15,16. W ostatnich latach opracowano sekwencjonowanie ChIP (ChIP-seq), metodę łączącą ChIP z NGS, do badania wiązania czynnika transkrypcyjnego w całym genomie17, a w niektórych przypadkach do monitorowania dynamicznych zmian w czasie 18,19,20. Na przykład, okołodobowe badania ChIP-seq ujawniły wysoce zaaranżowaną sekwencję genomowego wiązania składników zegara okołodobowego i markerów histonowych, która napędza czasowo precyzyjną ekspresję genów w całym ~ 24-godzinnym cyklu okołodobowym18.
Większość dostępnych protokołów ChIP jest przeznaczona dla tkanek miękkich (np. wątroba, mózg, itp.), a bardzo niewiele zostało opublikowanych dla tkanek twardych, w tym mięśni szkieletowych. Homogenizacja bogatych w błonnik mięśni szkieletowych i wyizolowanie wysokiej jakości jąder jest technicznie trudne21, szczególnie w przypadku eksperymentów ChIP, które wymagają sieciowania. W niedawnym badaniu ChIP mięśni22, komórki satelitarne oddzielono od włókien mięśniowych, a jądra przygotowano z obu typów komórek poprzez długotrwałą procedurę obejmującą trawienie tkanek. Cały proces trwał około trzech godzin, zanim przeprowadzono sieciowanie formaldehydu na izolowanych jądrach. Chociaż procedura ta pozwoliła uniknąć sieciowania włókien mięśniowych, co sprawia, że tkanka mięśniowa jest jeszcze bardziej oporna na wydajną homogenizację i była w stanie wytworzyć wysokiej jakości jądra, znaczne opóźnienie od pobrania tkanki do sieciowania jąder wiąże się z ryzykiem zmienionej interakcji DNA-białko. W przeciwieństwie do tego, większość badań wykonywała sieciowanie natychmiast po eksperymentalnym leczeniu lub pobraniu tkanek w celu zachowania wiązania DNA-białko w czasie rzeczywistym12. Drugą wadą izolacji jąder przed sieciowaniem jest to, że wyklucza ona zastosowania wrażliwe na czas, takie jak pobieranie próbek w rytmie okołodobowym, które zwykle odbywa się w odstępach 3-4 godzin. Bez sieciowania jąder izolacja musi przebiegać natychmiast po rozbiorze, podczas gdy próbki usieciowane mogą być przetwarzane razem po zakończeniu całego przebiegu czasowego, zapewniając w ten sposób większą spójność eksperymentalną.
Inne protokoły izolacji jąder z nieusieciowanych mięśni szkieletowych również zostały zgłoszone. W dwóch badaniach opisano zastosowanie ultrawirowania gradientowego w celu oddzielenia jąder od pozostałych miofibryli i resztek komórkowych23,24. Podczas gdy ultrawirowanie sacharozy lub gradientu koloidalnego jest skuteczne w przypadku nieusieciowanych tkanek mięśniowych, nasze eksperymenty wykazały, że po usieciowaniu ultrawirowanie gradientowe nie oddzieliło jąder od szczątków komórkowych na gradiencie.
Dlatego opracowaliśmy procedurę izolowania jąder wysokiej jakości za pomocą usieciowanych tkanek mięśni szkieletowych myszy. Zamiast ultrawirowania gradientowego opracowaliśmy metodę filtracji szeregowej, aby skutecznie oddzielać jądra od zanieczyszczeń. Po ultradźwiękach próbki chromatyny zostały z powodzeniem zastosowane do badań ChIP, które wykazały okołodobowy wzorzec wiązania białka BMAL1 z docelowymi promotorami. Nasza metoda może mieć szerokie zastosowanie w różnych badaniach mechanistycznych tkanek mięśniowych.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde roztwór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak Przeciwciało</td><td></td><td></td> <td>anty-BMAL1Generowany u kurczaka (Cocalico Biologicals) przeciwko antygenowi aa 318 - 579, a IgY został oczyszczony powinowactwem przy użyciu tego samego antygenu.</td></tr><tr><td>Żywica strącająca kurczaka IgY</td><td>GenScript</td><td>L00405</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KINEMATICA&nbsp; Homogenizator stołowy Polytron PT2100</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-178</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Młynek do tkanek</td><td>Whearton</td><td>357544</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Sitka do komórek 100 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek Falcon 70 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek Falcon 40 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>pluriSitko 30 & mikro; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>filtr siatkowy pluriStrainer 20 & mikro; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>filtr siatkowy pluriStrainer 10 &micro; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50010-03</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S2 Skoncentrowany ultrasonograf</td><td>Covaris</td><td>Model S2</td><td></td></tr><tr><td>Labquake&nbsp;</td><td>Kamera mikroskopowa CCD Thermo Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Leica Microsystems</td><td>DFC3000 G</td><td></td></tr><tr><td>zestaw odczynników</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Zestaw do ekstrakcji</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wszystkie składniki bufora są opisane w protokole. Każdy komponent został zakupiony w firmie Sigma Aldrich</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oparta na filtracji metoda przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji chromatyny

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) to skuteczna metoda określania wiązania białek z DNA chromatyny. Mięśnie szkieletowe bogate w błonnik stanowiły jednak wyzwanie dla ChIP ze względu na trudności techniczne w izolowaniu jąder wysokiej jakości przy minimalnym zanieczyszczeniu miofibryli. Poprzednie protokoły próbowały oczyścić jądra przed sieciowaniem, co wiązało się z ryzykiem zmienionej interakcji DNA-białko podczas przedłużonego procesu przygotowania jąder. W obecnym protokole najpierw usieciowaliśmy tkankę mięśni szkieletowych pobraną od myszy, a następnie tkanki zostały zmielone i poddane sonikacji. Ponieważ stwierdziliśmy, że ultrawirowanie nie było w stanie oddzielić jąder od miofibryli za pomocą usieciowanej tkanki mięśniowej, opracowaliśmy procedurę filtracji sekwencyjnej w celu uzyskania wysokiej jakości jąder pozbawionych znacznego zanieczyszczenia miofibrylami. Następnie przygotowaliśmy chromatynę za pomocą ultradźwięków, a testy ChIP z przeciwciałem anty-BMAL1 ujawniły silny okołodobowy wzór wiązania BMAL1 z docelowymi promotorami genów. Ten protokół filtracji stanowi łatwą do zastosowania metodę izolowania wysokiej jakości jąder z usieciowanej tkanki mięśni szkieletowych, umożliwiając spójne przetwarzanie próbek do badań okołodobowych i innych wrażliwych na czas badań. W połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS), nasza metoda może być stosowana w różnych badaniach mechanistycznych i genomicznych koncentrujących się na funkcji mięśni szkieletowych.

W niniejszym badaniu przeprowadzono sieciowanie formaldehydem bezpośrednio po pobraniu tkanki, aby zachować rzeczywiste interakcje DNA-białko. Stwierdzono jednak, że sacharoza lub gradient koloidalny, powszechnie stosowane do izolacji jąder komórkowych23,24, nie były skuteczne w oddzielaniu jąder od miofibryl (dane nie zostały przedstawione). Przyczyną może być fakt, że sieciowanie nadało jądrom i miofibrylom zbliżoną gęstość. Opr...

Prezentujemy protokół oparty na filtracji do izolowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych myszy, w którym usunęliśmy potrzebę ultrawirowania, dzięki czemu jest to łatwe do zastosowania. Pokazujemy, że chromatyna przygotowana z jąder nadaje się do badań immunoprecypitacji chromatyny i prawdopodobnego sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny.

Oparta na filtracji metoda przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji chromatyny

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest umożliwienie przygotowania wysokiej jakości jąder komórkowych z sieciowanego mięśnia szkieletowego, które mogą być następnie wykorzystane w badaniach immunoprecypitacji chromatyny. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań mięśni i rytmów okołodobowych, takie jak badania genomiczne z wykorzystaniem tkanek i komórek mięśniowych w kontekście okołodobowym lub innym kontekście zależnym od czasu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona natychmiastowe sieciowanie próbek, a procedura oparta na filtracji pozwala na niezawodną izolację wysokiej jakości jąder przy minimalnym zanieczyszczeniu miofibrylami.Choć metoda ta pozwala na analizę mięśni szkieletowych, można ją zastosować również w innych układach, takich jak mięśnie sercowe i gładkie. Odważone i posiekane mięśnie szkieletowe kończyn tylnych, wyizolowane z samców myszy C57 black six w wieku około 20 tygodni, należy umieścić w lodowatym roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, zgodnie z wcześniejszym opisem. Posiekaną tkankę mięśni szkieletowych należy umieścić w probówce stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml PBS, utrzymując ją na lodzie.Następnie odwiruj próbkę z siłą 300 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Ostrożnie usuń nadsącz z PBS poprzez aspirację. Oszacuj objętość osadu w każdej probówce o pojemności 50 ml, korzystając z probówek referencyjnych zawierających 1, 2, 3 i 4 ml wody.Dodać siedem objętości lodowatego 1% formaldehydu oraz PBS i homogenizować próbki na lodzie za pomocą homogenizatora tkankowego z głowicą. Następnie przeprowadzić sieciowanie próbki poprzez inkubację w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przerwać reakcję sieciowania poprzez dodanie glicyny 1 M do stężenia końcowego 0,125 M, a następnie inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po odwirowaniu próbki z prędkością 3 000 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usuń nadosad przez aspirację. Przepłucz osad, resuspendując go w 10 mililitrach lodowatego buforu bazowego z dodanymi świeżo inhibitorami proteaz. Ponownie odwiruj próbkę i ostrożnie usuń nadosad przez aspirację.Następnie resuspendować osad w sześciu mililitrach buforu do lizy zawierającego świeżo dodane inhibitory proteaz. Przenieść próbkę do schłodzonego wcześniej homogenizatora Dounce o pojemności 15 mililitrów i inkubować przez 10 minut na lodzie. Homogenizować każdą próbkę metodą Dounce na lodzie, wykonując 15 powolnych ruchów luźnym tłokiem, a następnie 15 ruchów tłokiem dopasowanym, aby uwolnić jądra komórkowe.Następujące etapy filtracji są kluczowe dla izolacji wysokiej jakości jąder komórkowych. Przefiltruj homogenat przez sito do komórek i wypłucz czterema mililitrami buforu lizującego. Następnie odwiruj próbki z prędkością 1 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Resuspenduj osad w pięciu mililitrach lodowatego buforu podstawowego i homogenizuj 10 razy za pomocą homogenizatora Dounce z dopasowanym tłokiem, aby uwolnić jądra komórkowe. Następnie przefiltruj zawiesinę przez sitko do komórek, przepłucz probówkę dwoma mililitrami buforu podstawowego i przefiltruj ponownie. Powtórz filtrację, stosując sitka do komórek o stopniowo zmniejszanej wielkości porów.Na koniec odwiruj próbkę przy 1 000 $\times$g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Odlej supernatant i resuspenduj osad w 500 $\mu$L buforu podstawowego, a następnie ponownie odwiruj. Usuń supernatant i przechowuj osad w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Rozmrozić próbki w 500 µL buforu lizującego SDS i resuspender za pomocą delikatnego pipetowania. Przenieść zawiesinę DNA jąder do szklanej fiolki umieszczonej na lodzie. Wybór odpowiedniej platformy oraz warunków sonikacji jest krytyczny dla przygotowania chromatyny z izolowanych jąder.Przeprowadź sonikację, stosując skupione impulsy ultradźwiękowej energii akustycznej z przetwornika dyskowego, zgodnie z ustawieniami opisanymi w protokole tekstowym. Przenieś sonikowaną chromatynę do probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie wiruj z prędkością 12 000 ×g przez 15 minut i przenieś supernatant do nowej probówki.Następnie przenieś 50 µL sonikowanej próbki do nowej probówki 1,5 ml w celu przeprowadzenia odwrotnego sieciowania przez noc w temperaturze 65 °C. Sposób odzyskiwania próbek DNA opisano w następnej sekcji. Po ocenie sonikacji i ilościowym oznaczeniu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, podziel rozmrożoną chromatinę na aلیکwoty o masie około 100 do 120 µg na probówkę.Następnie rozcieńczyć chromatin w stosunku 1:10 buforem do immunoprecypitacji. Dalej, dodać 40 µL 50% zawiesiny białka BSA zablokowanego na agarozie protein HE lub kulek IgY i inkubować na rotatorze przez trzy godziny w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu próbki przy 1 000 ×g przez 10 minut, ostrożnie przenieść nadfiltr do nowych probówek.Następnie należy dodać przeciwciała w ilości 1 µg przeciwciała na 25 do 100 µg chromatynowego DNA. Próbkę należy delikatnie rotować przez noc w temperaturze 4 °C przy prędkości około 15 rpm. Następnie dodaje się 10 µL białka BSA pre-blocked protein HE agarose lub kulek IgY i wymieszać.Inkubować zawiesinę kulek w pomieszczeniu chłodniczym przez dwie godziny, stale obracając próbkę. Następnie przemyć kuleczki buforem RIPA, a potem buforem wysokosolnym, buforem chlorku litu oraz Tris EDTA, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Po przemyciu eluować DNA z kuleczek, najpierw wirowując próbkę z prędkością 1 000 ×g przez jedną minutę i ostrożnie usuwając nadsącz.Resuspendować kuleczki w 50 µL buforu elucyjnego. Następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 65 °C. Po inkubacji wirować przy 12 000 ×g przez pięć minut.Usunąć supernatant i dodać kolejne 50 µL buforu elucyjnego, a następnie ponownie odwirować przy 12 000 ×g przez pięć minut. Końcowa objętość elucji wyniesie 100 µL. Aby odwrócić sieciowanie i przeprowadzić elucję DNA, w pierwszej kolejności inkubować eluowaną chromatynę przez noc w temperaturze 65 °C.Następnie dodaj 1 µL RNazy A przed inkubacją przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie inkubuj z 8 µL proteazy K o stężeniu 10 mg/mL przez 30 minut w temperaturze 55 °C. Wyizoluj DNA, używając zestawu do oczyszczania PCR z objętością elucji 50 µL zgodnie z protokołem producenta.Na koniec przeanalizowano profile za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym, zgodnie z wcześniej opisanym protokołem. Filtracja sekwencyjna skutecznie usunęła zanieczyszczenia tkankowe. W celu porównania przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy próbek po filtracji wstępnej oraz po filtracji seryjnej.Postępowa fragmentacja chromatyny w wyniku 10 cykli sonikacji została wykazana poprzez elektroforezę na żelu agarozowym. 10 cykli sonikacji trawionej chromatyny doprowadziło do uzyskania DNA o długości około 500 par zasad. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki QPCR dla B males one chIP z próbek mięśnia szkieletowego myszy pobranych w ZT6 i ZT18.Analiza elementów lokalizacji Dbp w genie Dbp wykazała, zgodnie z poprzednimi wynikami, obecność pików wiązania około godziny ZT6. Po opanowaniu techniki przygotowanie jąder komórkowych może zająć od pięciu do sześciu godzin, jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat wykorzystania metod opartych na filtracji do oczyszczania wysokiej jakości jąder komórkowych oraz DNA chromatyny z usieciowanej tkanki mięśniowej.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymywaniu próbek na lodzie lub w pomieszczeniu chłodniczym oraz o zachowaniu alikwotów próbek do kontroli mikroskopowej przed i po etapach filtracji. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny mięśni i genomiki do eksploracji dynamiki interakcji chromatyna-białko w zależności od rytmu okołodobowego lub czasu w różnych tkankach mięśniowych. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie chIP, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. w celu poszukiwania wzorców wiązania czynników transkrypcyjnych w tkankach mięśniowych.

a-filtration-based-method-preparing-high-quality-nuclei-from-cross

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych. <br...

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ten protokół opisuje procedurę generowania i oczyszczania dzikich i zmutowanych wersji ludzkiego kompleksu przebudowującego chromatynę INO80. Oznakowane epitopami wersje podjednostek INO80 ulegają stabilnej ekspresji w komórkach HEK293, a kompletne kompleksy i kompleksy pozbawione określonych zestawów podjednostek są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa immunologicznego.

Wytwarzanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelujących chromatynę INO80

Przedstawiono nowy protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłej myszy, przystosowany do badania regulacji genów we włóknach mięśniowych przez immunoprecypitację chromatyny.

Ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Biologia międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) jest w dużej mierze niezbadana ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu identyfikacji składu komórkowego tego unikalnego magazynu tłuszczu.

Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

Naucz się izolować wysokiej jakości jądra z usieciowanych mięśni szkieletowych myszy metodą filtracyjną bez ultrawirówki. Przygotowanie chromatyny do immunoprecypitacji ułatwia badania genomiki mięśni.

Oparta na filtracji metoda przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji chromatyny (Wideo) | JoVE Journal

Oparta na filtracji metoda przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji chromatyny

Przeglądaj więcej filmów