Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny model terapii elektrowstrząsowej w ciężkiej depresji. ECS globalnie stymuluje aktywność hipokampa, prowadząc do synaptogenezy i plastyczności synaptycznej. W tym miejscu opisujemy metody indukcji ECS u szczurów i subkomórkowego frakcjonowania ich hipokampów w celu zbadania zmian w białkach synaptycznych wywołanych napadami.

Ogólnym celem elektrokonwekcyjnej indukcji napadów padaczkowych i późniejszego frakcjonowania hipokampa na małą skalę jest wywołanie globalnej aktywności napadowej w mózgu szczura oraz zbadanie wywołanych aktywnością napadową zmian białek w postsynaptycznej gęstości hipokampa. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w procesie neuronalnym filmu, takie jak to, które białka snaptic są regulowane w określonych regionach mózgu po napadzie i czy taka regulacja może przyczyniać się do neuroplastyczności. Główną zaletą tego protokołu elektrokonwulsyjnej indukcji napadów jest to, że możemy w żywy sposób wywołać lo-balowe złagodzenie aktywności mózgu bez śmierci neuronów.

Procedurę zademonstruję ja i Han Gil Jeong z laboratorium dr Hee Jung Chunga. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść samca szczura w czystej, pustej klatce z pokrywką. Pozwól szczurowi przyzwyczaić się przez 30 minut, a następnie ustaw generator impulsów na indukcję ECS.

Przygotuj generator impulsów, naciskając przycisk resetowania i upewnij się, że przycisk gotowości się świeci. Upewnij się, że klipsy na uszy nie są przymocowane do generatora impulsów. Następnie naciśnij przycisk wstrząsu przez kilka sekund, a następnie podłącz klipsy na uszy do generatora impulsów.

Na tym etapie zwilż klipsy do uszu sterylną solą fizjologiczną i upewnij się, że są nasycone. Następnie zwilż uszy szczura sterylną solą fizjologiczną, owijając je gazą nasączoną solą fizjologiczną. Gdy będą mokre, usuń gazę.

Przymocuj klipsy do uszu po jednym klipsie na ucho i umieść je poza główną opaską chrząstki. Naciśnij przycisk wstrząsu przez kilka sekund i obserwuj napad. W przypadku pozoru, bez kontroli napadów, traktuj szczura identycznie, ale nie dostarczaj prądu.

Gdy zaczyna się klonus, odłącz klipsy uszne i zapisuj zachowanie napadowe zgodnie ze zmienioną skalą Racine'a od jednego do pięciu. Obejmuje to odchów z klonusem czteroramiennym na etapie czwartym oraz odchów i upadek z klonusem czteroramiennym na etapie piątym. Napad powinien trwać około 10 sekund.

Zapisz czas trwania napadu za pomocą timera. Po zakończeniu napadu należy zwrócić szczura do jego klatki domowej. Monitoruj szczura przez kolejne pięć minut, aby upewnić się, że wyzdrowieje po napadach.

Trzymaj go pojedynczo w klatce i zwróć klatkę do sali pooperacyjnej. W tej procedurze umieść dwa hipokampy jednego szczura na naczyniu do hodowli tkankowej o grubości 30 mil i zmiel je na małe kawałki za pomocą nożyczek. Następnie przenieś zmielone hipokampy do ręcznego homogenizatora szklanego i dodaj jeden mililitr lodowatego buforu do homogenizacji na zimno.

Następnie włóż okrągły pecil do szklanego homogenizatora. Gdy szklany homogenizator znajduje się na lodzie, delikatnie i równomiernie przesuwaj pecyl w górę i w dół, 10 do 15 razy przez jedną minutę, aż znikną małe kawałki tkanki hipokampa. Następnie przenieść homognotę do probówki mikrowirówkowej o średnicy 1,7 milimetra za pomocą pipety o średnicy jednego milimetra i odwirować homogenotę przy 800 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby oddzielić supernatant pojądrowy od osadu zawierającego nierozpuszczalną tkankę i jądra.

Następnie przenieś 50 mikrolitrów i 950 mikrolitrów frakcji S1 do dwóch oddzielnych nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,7 mililitra i przechowuj te probówki na lodzie. Zachowaj również granulat frakcji P1 na lodzie. Następnie odwirować frakcję S1 o pojemności 950 mikrolitrów przez 10 minut w temperaturze 13 800 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby oddzielić supernatant wzbogacony cytozolowymi białkami rozpuszczalnymi i osad wzbogacony białkami związanymi z błoną, w tym białkami synaptosomalnymi.

Przenieś frakcję S2 do nowej mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra i przechowuj ją na lodzie. Następnie ponownie zawiesić granulki frakcji P2 w 498 mikrolitrach lodowatej oczyszczonej wody. Dodaj dwa mikrolitry jednego heeps molowych, aby uzyskać końcowe stężenie czterech heeps milimolowych.

Zawiesinę inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem przez 30 minut. Po 30 minutach zawiesinę frakcji P2 należy przechowywać na lodzie. Na tym etapie odwirować frakcję P2 przez 20 minut w temperaturze 25 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby oddzielić lizowany supernatant i zlizowany osad

Przenieś frakcję LS2 do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 mililitra i przechowuj ją na lodzie. Następnie ponownie zawieś granulat LP1 w 250 mikrolitrach w 50 milimolowych heepach, zmieszany z 250 mikrolitrami jednego procenta detergentu i 1 X PBS. Zawiesinę inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając przez 15 minut.

Następnie odwirować zawieszony osad LP1 przez 3 godziny w temperaturze 25 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby oddzielić supernatant frakcji innej niż PSD od osadu frakcji frakcji PSD. Usunąć supernatant do 1,7 mililitrowej probówki wirówkowej i ponownie zawiesić osad PSD w 100 mikrolitrach 50 milimolowych heepów. Na tym rysunku reprezentatywne western blot pokazują ekspresję białka podjednostki receptywnej NMDA GluN2B, receptora ampa, GluA2 i STEP 61 we frakcjach S2, P2 i PSD z hipokampów szczurów pozorowanych, bez napadów i szczurów, które otrzymały ostry ECS.

Cytoplazmatyczne rozpuszczalne białko alfa-tubulina jest wzbogacone we frakcję S2. Synaptofizyna jest białkiem pęcherzyków presynaptycznych i jest wzbogacona we wstępną frakcję błonową P2, ale nie we frakcję PSD, podczas gdy PSD-95 jest wzbogacona zarówno we frakcje P2, jak i PSD. Pokazano tutaj oznaczanie ilościowe GluN2B i GluA2 we frakcjach P2 i PSD po trzech i 24 godzinach po ostrym ECS.

Ekspresja GluN2B i GluA2 we frakcji P2 została znormalizowana do alfa-tubuliny we frakcji S2. W ekspresji GluN2B i GluA2 we frakcji PSD, normalizował się do PSD 95 we frakcji PSD. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu do sześciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Po tej procedurze można przeprowadzić auto-masę, taką jak masa, spektrometria, na podstawie mieszanki białek, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, jakie inne białka synaptyczne są zmieniane przez ECS. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami neurologicznymi do zbadania mechanizmu leżącego u podstaw dysfunkcji synaps w celu działania praworządów, trans-genowych motorów chorób neurologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować ECS u prawników, przeprowadzać homogenizację i frakcjonowanie PSD z hipokampów oraz badać zmiany w białkach synaptycznych po ECS.