Name: Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę wywoływania napadów elektrowstrząsowych u szczurów i frakcjonowania hipokampu w celu badania zmian w białkach postsynaptycznych. Ta technika pozwala analizować plastyczność synaptyczną i mechanizmy neurobiologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Ericowi C. Boltonowi za umożliwienie nam użycia jego wirówki do frakcjonowania oraz dr Grahamowi H. Dieringowi z laboratorium dr Richarda L. Huganira na Uniwersytecie John's Hopkins za dostarczenie nam protokołu frakcjonowania PSD na małą skalę.

Wszystkie procedury eksperymentalne, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych na Uniwersytecie Illinois w Urbana-Champaign.
1. Utrzymanie kolonii szczurów
<ol>
	<li>Hoduj szczury Sprague-Dawley (patrz tabela materiałów) i utrzymuj je w standardowych warunkach z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność i dostępem ad libitum do pożywienia i wody.</li>
	<li>Odsadz młode szczura od piersi w 28. dniu po urodzeniu (P) i trzymaj je w grupach po 2-4 samce lub samice z miotu.</li>
	<li>Oznacz ogony samców szczurów nietoksycznym, trwałym czarnym markerem w celu identyfikacji.</li>
	<li>Waż samce szczurów 3 razy w tygodniu i zapisuj ich masę ciała.</li>
</ol>
2. Przygotowanie maszyny ECS
<ol>
	<li>O godzinie 7:30 należy zdezynfekować ławkę w pomieszczeniu do przygotowywania zwierząt i umieścić na niej maszynę ECS (generator impulsów).</li>
	<li>Umieść pojedynczego samca szczura o wadze 200 - 250 g w czystej, pustej klatce z pokrywką. Powtórz tę czynność dla wszystkich samców szczurów, które mają być leczone indukcją ECS. Pozwól szczurom przyzwyczaić się przez 30 minut.</li>
	<li>Podczas gdy szczury przyzwyczajają się w swoich klatkach, ustaw generator impulsów do indukcji ECS na częstotliwość 100 impulsów/s, szerokość impulsu 0,5 ms, czas trwania wstrząsu 0,5 s i prąd 55 mA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Przygotuj generator impulsów, naciskając przycisk "RESET" i upewniając się, że przycisk "READY" świeci. Upewnij się, że klipsy na uszy nie są przymocowane do generatora impulsów, a następnie naciśnij przycisk "SHOCK" przez kilka sekund. 
	UWAGA: W tym momencie generator impulsów jest gotowy do indukcji ECS.</li>
	<li>Podłącz klipsy na uszy do generatora impulsów.</li>
</ol>
3. Indukcja ostrego ECS
UWAGA: Zobacz Rysunek 1B, górny panel.
<ol>
	<li>Zwilż klipsy do uszu sterylną solą fizjologiczną i upewnij się, że są nasycone.</li>
	<li>Zwilż uszy szczura sterylną solą fizjologiczną, owijając je gazą nasączoną solą fizjologiczną. Gdy będą mokre, usuń gazę.</li>
	<li>Przymocuj jeden klips na ucho, umieść poza głównym pasmem chrząstki.</li>
	<li>Potwierdź na maszynie ECS, że ustanowiona została prawdziwa pętla; jeśli nie, na maszynie pojawi się komunikat o błędzie lub odczyt liczby "1".</li>
	<li>Noś grubą, niemetalową rękawicę. Trzymając szczura delikatnie w dłoni w rękawiczce, naciśnij przycisk "SHOCK" przez kilka sekund i powoli zwolnij uchwyt szczura, aby obserwować napad. W przypadku pozorowanej kontroli "bez napadu" (NS) należy obchodzić się ze szczurem identycznie, ale nie dostarczać prądu.</li>
	<li>Odłącz klipsy uszne, gdy zaczyna się klonus i zapisuj zachowanie napadowe zgodnie ze zmienioną skalą Racine'a22, która obejmuje "ruchy ust i twarzy" (etap 1), "głową" (etap 2), "klonus kończyn przednich" (etap 3), "wychowywanie z klonusem kończyn przednich" (etap 4) oraz "podnoszenie i upadanie z klonusem kończyn przednich" (etap 5). Napad powinien trwać około 10 sekund; Zapisz czas trwania napadu za pomocą timera.</li>
	<li>Po zakończeniu napadu należy zwrócić szczura do jego klatki domowej. Monitoruj szczura przez kolejne 5 minut, aby upewnić się, że szczur wyzdrowieje po napadach. Trzymaj go pojedynczo w klatce i zwróć klatkę do sali pooperacyjnej.</li>
	<li>Powtórz indukcję ECS na następnym szczurze.</li>
	<li>Monitoruj szczury przez pozostałą część dnia i co najmniej raz rano i raz po południu następnego dnia, aż zostaną poddane eutanazji do eksperymentów. 
	UWAGA: Metoda indukcji ECS może prowadzić do objawów klinicznych jako przypadkowego działania niepożądanego, które wymaga uwagi. Na przykład protokół indukcji ECS może wywołać napady trwające dłużej niż 15 s i powodować niepotrzebny stres u szczurów. W takim przypadku należy przerwać napad za pomocą diazepamu (10 mg/kg, i.p.) lub pentobarbitalu (25 - 30 mg/kg, i.p.). Jeśli u szczurów rozwinie się niewydolność oddechowa lub poważne nieprawidłowości behawioralne po ustaniu napadów, należy je poddać eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla, a następnie ścinanie głowy.</li>
</ol>
4. Indukcja przewlekłego ECS
UWAGA: Zobacz Rysunek 1B, dolny panel.
<ol>
	<li>Wywoływać jeden ECS dziennie o tej samej porze rano, jak opisano w krokach 1 - 3 powyżej, przez siedem kolejnych dni.</li>
	<li>Monitoruj szczury dwa razy dziennie po powrocie do klatek domowych.</li>
</ol>
5. Homogenizacja i frakcjonowanie hipokampów szczurów
UWAGA: Zobacz Rysunek 2.
<ol>
	<li>Przygotować świeży bufor homogenizacyjny (roztwór A), który zawiera 320 mM sacharozy, 5 mM pirofosforanu sodu, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7,4, 200 nM kwasu okadainowego i inhibitory proteazy. Przefiltruj i wysterylizuj bufor za pomocą filtrów o wielkości porów 0,22 μm do filtracji próżniowej i umieść go na lodzie.</li>
	<li>W określonym momencie po ostrym ECS lub przewlekłym ECS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1), poddaj szczura eutanazji przez wdychanie CO2 przez 5 - 10 minut, a następnie ścięcie głowy za pomocą gilotyny.</li>
	<li>Usuń mózg i rozłóż hipokampy na metalową płytkę umieszczoną na lodzie, jak opisano wcześniej23,24.</li>
	<li>Umieść dwa hipokampy jednego szczura na 30-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej i zmiel je na małe kawałki za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Przenieść rozdrobnione hipokampy do ręcznego homogenizatora szklanego za pomocą pipety o pojemności 1 ml i dodać 1 ml lodowatego buforu homogenizacyjnego (roztwór A, krok 5.1). Włóż okrągły tłuczek do szklanego homogenizatora. Gdy szklany homogenizator znajduje się na lodzie, delikatnie i równomiernie przesuwaj tłuczek w górę i w dół 10 - 15 razy przez 1 minutę, aż znikną małe kawałki tkanki hipokampa.</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml i odwirować homogenat przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia supernatantu pojądrowego (frakcja S1) od osadu zawierającego nierozpuszczalną tkankę i jądra (frakcja P1). Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś 50 μl i 950 μl frakcji S1 do dwóch oddzielnych, nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml i przechowuj je na lodzie. Zachowaj granulat frakcji P1 na lodzie.</li>
	<li>Odwirować frakcję S1 (950 μl) przez 10 minut w temperaturze 13 800 x g i 4 °C w celu oddzielenia supernatantu (frakcji S2), wzbogaconego białkami rozpuszczalnymi w cytozolu, i osadu (frakcja P2), wzbogaconego białkami związanymi z błoną, w tym białkami synaptosomalnymi. Przenieś frakcję S2 do nowej mikrowirówki o pojemności 1,7 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przechowuj ją na lodzie.</li>
	<li>Zawiesić osad (frakcja P2) w 498 μl lodowato oczyszczonej wody za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Dodać 2 μl 1 M HEPES (pH 7,4) za pomocą pipety 20 μL, aby uzyskać końcowe stężenie 4 mM HEPES (pH 7,4). Inkubować w temperaturze 4 °C z mieszaniem przez 30 minut. Zawieszoną frakcję P2 należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Określ stężenie białka we frakcjach S1, S2 i P2 za pomocą testu BCA. Dodać 50 mM HEPES (pH 7,4) do każdej frakcji, aby osiągnąć stężenie 1 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia lub przetworzyć frakcję P2 w celu wyizolowania PSD.</li>
</ol>
6. Izolacja PSD z frakcji surowego białka błonowego (P2)
<ol>
	<li>Odwirować frakcję P2 (500 μl) przez 20 minut w temperaturze 25 000 x g i 4 °C w celu oddzielenia lizowanego supernatantu (frakcja LS2) i lizowanego osadu (frakcja LP1). Przenieś frakcję LS2 do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przechowuj ją na lodzie.</li>
	<li>Zawiesić osad LP1 w 250 μl 50 mM HEPES (pH 7,4) zmieszanym z 250 μl 1% detergentu w 1x buforze PBS za pomocą pipety 1 ml. Inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem przez 15 min.</li>
	<li>Odwirować zawieszony osad LP1 przez 3 godziny w temperaturze 25 000 x g i temperaturze 4 °C, aby oddzielić supernatant (frakcja inna niż PSD) od osadu (frakcja PSD). Usunąć supernatant do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml i ponownie zawiesić osad PSD w 100 μl 50 mM HEPES (pH 7,4) za pomocą pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Określ stężenie białka we frakcjach LS2, innych niż PSD i PSD za pomocą testu BCA. Dodać 50 mM HEPES (pH 7,4) do każdej frakcji, aby osiągnąć stężenie 1 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Wszystkie roztwory użyte w krokach 5 - 6 (tj. roztwór A, bufor HEPES i bufor PBS) powinny być wykonane z oczyszczonej wody wolnej od zanieczyszczeń i cząstek jonowych i organicznych.</li>
</ol>
7. Western Blotting (zachodnia plama)
<ol>
	<li>Rozmrozić każdą frakcję białkową na lodzie. Przenieść 12 μl każdej frakcji (S2, P2 i PSD w 1 mg/ml) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml za pomocą pipety o pojemności 20 μl.</li>
	<li>Dodać 3 μl 5-krotnego buforu do próbek SDS i inkubować w temperaturze 75 °C przez 30 minut w łaźni wodnej. Schłodzić próbkę do temperatury pokojowej (RT).</li>
	<li>Załaduj 10 μl próbki białka do każdej studzienki z 15-dołkowym żelem do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o nachyleniu 4-20% za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Uruchomić żel w aparacie SDS-PAGE i przy napięciu 80-100 V w buforze roboczym (25 mM Tris, 190 mM glicyny i 0,1% SDS; pH 8,3). 
	UWAGA: Każdy żel powinien zawierać próbki białek od szczurów NS i szczurów ECS w różnych punktach czasowych po ostrym lub przewlekłym ECS.</li>
	<li>Przenieść białka z żelu SDS-PAGE do membrany z polifluorku winylu (PVDF) w aparacie transferowym pod napięciem 25 - 30 V (60 mA) przez 9 - 12 godzin w buforze transferowym (25 mM Tris, 190 mM glicyny i 20% metanolu; pH 8,3).</li>
	<li>Usunąć membranę PVDF z aparatu transferowego i umyć ją w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) przez 5 minut na wielofunkcyjnym rotatorze w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zablokować błonę w 5% mleku i 0,1% Tween-20 w TBS przez 1 godzinę. Inkubować ją w przeciwciałach pierwszorzędowych (Tabela 1) w buforze płuczącym (1% mleka i 0,1% Tween-20 w TBS) przez noc na wielofunkcyjnym rotatorze w temperaturze 4 °C (patrz Tabela materiałów dla rozcieńczeń).</li>
	<li>Przemyć membranę 4 razy przez 10 minut każdy w buforze do przemywania się, a następnie inkubować ją z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) w buforze płuczącym przez 1 godzinę na wielozadaniowym rotatorze w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płukać membranę 4 razy po 10 minut w buforze do mycia, a następnie TBS przez 5 minut.</li>
	<li>Inkubować membranę ze wzmocnionym substratem chemifluorescencyjnym przez 1 minutę i wystawić ją na działanie filmu rentgenowskiego. Wywołaj naświetloną folię za pomocą procesora filmowego.</li>
</ol>
8. Kwantyfikacja Western Blot
<ol>
	<li>Przeskanuj Western blot jako plik TIFF i zapisz ten plik na komputerze.</li>
	<li>Otwórz plik Western blot w programie ImageJ jako obraz w skali szarości, w sekcji "Plik", "Otwórz obraz", strzałka w prawo "skala szarości".</li>
	<li>Wybierz narzędzie do zaznaczania prostokątnego z paska narzędzi ImageJ i narysuj prostokąt, który pokrywa pojedynczy pasmo Western blot interesującego Cię białka.</li>
	<li>W sekcji "Analizuj" naciśnij "Zmierz", aby uzyskać obszar i średnią gęstość wybranego pasma.</li>
	<li>Przenieś prostokąt do obszaru tła bez zmiany jego rozmiaru i kształtu. Powtórz krok 8.4 dla obszaru i średniej gęstości tła.</li>
	<li>Odejmij średnią wartość gęstości prążka tła od gęstości pasma Western blot, uzyskując gęstość pasma odjętą od tła białka będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Powtórz kroki od 8.2 do 8.6 dla wszystkich interesujących nas pasm Western blot.</li>
	<li>Podziel gęstość prążkową odjętego tła białka będącego przedmiotem zainteresowania przez gęstość prążka odjętą od tła produktu genu porządkowego, takiego jak α-tubulina; ten krok daje znormalizowaną wartość białka będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu opisujemy metodę indukcji ECS u szczurów, która wywołuje globalną stymulację aktywności neuronalnej w ich hipokampach. ECS jest zwierzęcym modelem terapii elektrowstrząsowej, która jest klinicznie stosowana w leczeniu opornych na leki zaburzeń depresyjnych u ludzi 1,2,3. Pomimo stosowania terapii elektrowstrząsowej w leczeniu ciężkiej depresji, dokładny mechanizm leżący u podstaw depresji pozostaje niejasny. Poniew...

Terapia elektrowstrząsowa była stosowana w leczeniu pacjentów z poważnymi zaburzeniami depresyjnymi, w tym ciężką depresją lekooporną, depresją dwubiegunową, chorobami Parkinsona i schizofrenią1,2. W tej terapii napad jest generowany przez bodziec elektryczny dostarczany do głowy znieczulonych pacjentów za pośrednictwem elektrod naczaszkowych1,2,3. Powtarzające się podawanie ECS było klinicznie korzystne w przypadku lekoopornych zaburzeń depresyjnych1,2,3. Jednak dokładny mechanizm leżący u podstaw długoterminowej skuteczności działania przeciwdepresyjnego u ludzi pozostaje nieuchwytny. ECS jest zwierzęcym modelem terapii elektrowstrząsowej i jest szeroko stosowany do badania jej mechanizmu terapeutycznego. U gryzoni zarówno ostre ECS, jak i przewlekłe leczenie ECS promują neurogenezę dorosłych w hipokampach i reorganizują sieć neuronową4,5, co prawdopodobnie przyczyni się do poprawy elastyczności poznawczej. Co więcej, globalne zwiększenie aktywności mózgu przez ECS zmienia obfitość transkryptów, takich jak czynnik neurotropowy pochodzenia mózgowego6, oraz wiele białek, w tym metabotropowy receptor glutaminianu 17 i podjednostki receptora glutaminianu typu N-metylo-D-asparaginianu (NMDA)7. Zmiany te pośredniczą w długotrwałej modyfikacji liczby, struktury i siły synaps w hipokampie7,8,9.
W modelach ECS stymulacja elektryczna jest dostarczana gryzoniom za pomocą stereotaktycznie wszczepionych elektrod, elektrod rogówkowych lub elektrod usznych, co wywołuje uogólnione napady toniczno-kloniczne10,11. Stereotaktyczne wszczepienie elektrod wiąże się z operacją mózgu i wymaga znacznego czasu na poprawę umiejętności chirurgicznych eksperymentatora w celu zminimalizowania obrażeń. Mniej inwazyjne elektrody rogówki mogą powodować ścieranie i suchość rogówki oraz wymagać znieczulenia. Stosowanie elektrod z klipsem do uszu omija te ograniczenia, ponieważ można je stosować u gryzoni bez operacji lub znieczulenia i powodować minimalne obrażenia. Rzeczywiście, odkryliśmy, że prąd dostarczany do obudzonych szczurów za pośrednictwem elektrod z klipsem do uszu niezawodnie indukuje napady toniczno-kloniczne w stadium 4-5 i zmienia białka synaptyczne w ich hipokampie10.
Aby zbadać indukowaną przez ECS obfitość białek synaptycznych w określonych regionach mózgu gryzoni, ważne jest, aby wybrać metody eksperymentalne, które są najbardziej odpowiednie do ich wykrywania i kwantyfikacji. Subkomórkowe frakcjonowanie mózgu pozwala na surową izolację rozpuszczalnych białek cytozolowych; białka błonowe; białka związane z organellami; a nawet białka w specjalnych strukturach subkomórkowych, takich jak PSD12,13,14. PSD to gęsta i dobrze zorganizowana domena subkomórkowa w neuronach, w której białka synaptyczne są silnie skoncentrowane na błonie postsynaptycznej i w jej pobliżu12,13,15. Izolacja PSD jest przydatna do badania białek synaptycznych wzbogaconych w PSD, ponieważ dynamiczne zmiany w obfitości i funkcji postsynaptycznych receptorów glutaminianu, białek rusztowania i białek transdukcji sygnału w PSD12,15,16,17 są skorelowane z plastycznością synaptyczną i synaptopatią obserwowaną w kilku zaburzeniach neurologicznych17,18. Poprzednia metoda frakcjonowania subkomórkowego stosowana do oczyszczania PSD polegała na izolacji frakcji nierozpuszczalnej w detergentach z surowej frakcji błonowej mózgu poprzez różnicowe wirowanie gradientów sacharozy14,19. Głównym wyzwaniem związanym z tą tradycyjną metodą jest to, że wymaga ona dużej ilości mózgów gryzoni14,19. Przygotowanie 10 - 20 gryzoni do wyizolowania frakcji PSD na zabieg wymaga znacznych nakładów kosztów i czasu i nie jest praktycznie wykonalne, jeśli istnieje wiele zabiegów.
Aby sprostać temu wyzwaniu, dostosowaliśmy prostszą metodę, która bezpośrednio izoluje frakcję PSD, bez wirowania w gradiacji sacharozy20,21, i zmieniliśmy ją tak, aby miała zastosowanie do izolacji PSD z hipokampa pojedynczego mózgu szczura. Nasza metoda frakcjonowania PSD na małą skalę pozwala uzyskać około 30 - 50 μg białek PSD z 2 hipokampów, co wystarcza do wykorzystania w kilku testach biochemicznych, w tym immunoprecypitacji i Western blot. Western blot pokazuje sukces naszej metody izolowania PSD, ujawniając wzbogacenie białka o gęstości postsynaptycznej 95 (PSD-95) i wykluczenie markera presynaptycznego synaptofizyny i rozpuszczalnego białka cytoplazmatycznego α-tubuliny. Nasze metody indukcji ECS i frakcjonowania PSD na małą skalę można łatwo dostosować do innych regionów mózgu gryzoni i zapewniają stosunkowo prosty i niezawodny sposób oceny wpływu ECS na ekspresję białek PSD.

<table><tbody><tr><td>Spargue-Dawley rat</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>ECS dostarcza</td></tr><tr><td>generator impulsów</td><td>Ugo Bsile, Comerio, Włochy</td><td>57800</td><td>ECS dostarcza</td></tr><tr><td>system oczyszczania wody MilliQ</td><td>EMD Millipore</td><td>Z00Q0VWW</td><td>Frakcjonowanie subkomórkowe dostarcza</td></tr><tr><td>sacharozę</td><td>Em science</td><td>SX 1075-3</td><td>Materiały do</td></tr> <tr><td>frakcjonowania subkomórkowegoNa4O7P2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368</td><td>Frakcjonowanie subkomórkowe dostarcza</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>Materiały do frakcjonowania subkomórkowego</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td><td>Frakcjonowanie subkomórkowe dostarcza</td></tr><tr><td>Kwas okadaikowy</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>Materiały do frakcjonowania subkomórkowego</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td>Frakcjonowanie subkomórkowe</td></tr><tr><td>dostarcza NaVO3</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>Frakcjonowanie subkomórkowe</td></tr><tr><td>EMD Millipore Sterito Sterylne próżniowe filtry butelkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS05RE</td><td>Subcellular Fractionation dostarcza</td></tr><tr><td>nożyczki do irysa</td><td>WPI (World Precision Instrumenty)</td><td>500216-G</td><td>Materiały do frakcjonowania subkomórkowego</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 30 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Materiały do frakcjonowania subkomórkowego</td></tr><tr><td>Homogenizator szklany i tłuczek teflonowy</td><td>VWR</td><td>89026-384</td><td>Frakcjonowanie subkomórkowe dostarcza</td></tr><tr><td>probówkę do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Frakcjonowanie subkomórkowe dostarcza</td></tr><tr><td>wirówkę Sorvall Legend XT/XF&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>Materiały do frakcjonowania subkomórkowego</td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek Pierce BCA A, 500 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>#23228</td><td>Western blot Odczynnik</td></tr> do <tr><td>oznaczania białek Pierce BCA B, 25 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>#1859078</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>SDS-żel poliakrylamidowy (SDS-PAGE)</td><td>BIO-RAD</td><td></td>#4561086S <td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Bieganie Bufor</td><td>Wykonany w laboratorium</td><td></td><td>Western blot supplies.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pionowe ogniwo elektroforetyczne Mini-PROTEAN Tetra do żeli Mini-Prefabrykat, 4-żelowe</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>membranę z polifluorku winylu (PVDF)&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>Bufor transferowy</td><td>Wykonane w laboratorium</td><td></td><td>Western blot supplies.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>metanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergent do izolacji PSD</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Module&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703935</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>beztłuszczowe mleko instant w proszku</td><td>Świetna wartość</td><td></td><td>Western blot Wielofunkcyjny</td></tr><tr><td>rotator&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model-2314</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>film autoradiograficzny Hyblot CL</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>E3018 (1001365)</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>dostarcza Ulepszony substrat chemifluorescencyjny&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>procesor foliowy Konica SRX-101A</td><td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>Western blot dostarcza</td></tr><tr><td>Nazwa przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Cell Signaling</td><td>#2507</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała = 1:500 - 1,000, czas = 9 - 12 h, Temperatura reakcji = 4 &deg; C, Gatunek gospodarza = Sygnalizacja</td></tr><tr><td>komórkowa</td> <td>synaptofizyny</td> królika<td>#4329</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała = 1:500 - 1,000, czas = 9 - 12 godzin, Temperatura reakcji = 4 &deg; C, Gatunek gospodarza =</td></tr><tr><td>alfa-tubulina</td> królika <td>Santacruz</td><td>SC-5286</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała = 1:500 - 1,000, czas = 9 - 12 godzin, Temperatura reakcji = 4 &deg; C, Gatunek gospodarza = Mysz</td></tr><tr><td>GluN2B</td><td>Neuromab</td><td>75-097</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała = 1:500 - 1,000, czas = 9 - 12 godzin, Temperatura reakcji = 4 &deg; C, Gatunek gospodarza = Mysz</td></tr><tr><td>GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała = 1:500 - 1,000, czas = 9 - 12 godzin, Temperatura reakcji = 4 &deg; C, Gatunek gospodarza = Królik</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td><td>Rozcieńczenie przeciwciał = 1:200 - 500, czas = 9 - 12 h, Temperatura reakcji = 4 &deg; C, Gatunek gospodarza = Mysz</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>715-035-150</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała = 1:2,000-5,000, czas = 1 h, Temperatura reakcji = RT, Gatunek gospodarza = Osioł</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>711-035-152</td><td>Rozcieńczenie przeciwciał = 1:2,000-5,000, czas = 1 h, Temperatura reakcji = RT, Gatunek gospodarza = Osioł</td></tr></tbody></table>

napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny zwierzęcy model terapii elektrowstrząsowej, najskuteczniejszej metody leczenia ciężkiej depresji. ECS indukuje uogólnione napady toniczno-kloniczne z niską śmiertelnością i śmiercią neuronów i jest szeroko stosowanym modelem do badań przesiewowych leków przeciwpadaczkowych. W tym miejscu opisujemy metodę indukcji ECS, w której krótki prąd o natężeniu 55 mA jest dostarczany przez 0,5 s do samców szczurów o wadze 200 - 250 g za pomocą elektrod z klipsem uszy. Taka obustronna stymulacja powodowała napady kloniczne w stadium 4 - 5, które trwały około 10 s. Po ustaniu ostrego lub przewlekłego ECS większość szczurów wyzdrowiała, stając się behawioralnie nie do odróżnienia od szczurów pozorowanych "bez napadów". Ponieważ ECS globalnie zwiększa aktywność mózgu, został również wykorzystany do badania zależnych od aktywności zmian białek synaptycznych i ich wpływu na siłę synaps przy użyciu wielu metod. W szczególności subkomórkowe frakcjonowanie gęstości postsynaptycznej (PSD) w połączeniu z Western blotting pozwala na ilościowe określenie obfitości białek synaptycznych w tej wyspecjalizowanej strukturze synaptycznej. W przeciwieństwie do poprzedniej metody frakcjonowania, która wymaga dużej ilości mózgów gryzoni, opisujemy tutaj metodę frakcjonowania na małą skalę w celu wyizolowania PSD z hipokampa pojedynczego szczura, bez wirowania w gradiencie sacharozy. Za pomocą tej metody pokazujemy, że wyizolowana frakcja PSD zawiera postsynaptyczne białka błonowe, w tym PSD95, GluN2B i GluA2. Marker presynaptyczny synaptofizyna i rozpuszczalne białko cytoplazmatyczne α-tubulina zostały wykluczone z frakcji PSD, wykazując udaną izolację PSD. Co więcej, przewlekły ECS zmniejszył ekspresję GluN2B w PSD, co wskazuje, że nasza metoda frakcjonowania PSD na małą skalę może być zastosowana do wykrywania zmian w białkach PSD w hipokampie u pojedynczego szczura po leczeniu genetycznym, farmakologicznym lub mechanicznym.

Stosując szczegółową procedurę przedstawioną w niniejszym opracowaniu, pojedynczy wstrząs elektryczny (55 mA, 100 impulsów/s przez 0,5 s) podany za pomocą elektrod klipsowych do uszu wywołał jednorazowe drgawki toniczno-kloniczne stopnia 4-5 u szczurów (Rysunek 1A-B). Łącznie 8 szczurów poddano ostrej indukcji ECS, w wyniku której wystąpiły drgawki toniczno-kloniczne stopnia 4-5. Drgawki trwały około 10 s, a wszystkie szczury powróciły do sta...

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny model terapii elektrowstrząsowej w ciężkiej depresji. ECS globalnie stymuluje aktywność hipokampa, prowadząc do synaptogenezy i plastyczności synaptycznej. W tym miejscu opisujemy metody indukcji ECS u szczurów i subkomórkowego frakcjonowania ich hipokampów w celu zbadania zmian w białkach synaptycznych wywołanych napadami.

Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

Ogólnym celem indukcji drgawek elektrowstrząsowych i następnego frakcjonowania hipokampa w małej skali jest wywołanie globalnej aktywności drgawkowej w mózgu szczura oraz zbadanie zmian w białkach gęstości postsynaptycznej hipokampa indukowanych przez tę aktywność. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące procesów neuronalnych, takie jak to, które białka synaptyczne są regulowane w konkretnych obszarach mózgu podczas drgawek oraz czy taka regulacja może przyczyniać się do neuroplastyczności. Główną zaletą tego protokołu indukcji drgawek elektrowstrząsowych jest możliwość wywołania globalnej aktywacji aktywności mózgu gryzonia bez powodowania śmierci neuronów.Procedurę zaprezentuję ja oraz Han Gil Jeong z laboratorium dr Hee Jung Chung. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść samca szczura w czystej, pustej klatce z pokrywą. Pozostaw szczura na 30 minut w celu habituacji, a następnie ustaw generator impulsów do indukcji ECS.Przygotuj generator impulsów, naciskając przycisk resetowania, i upewnij się, że przycisk gotowości jest podświetlony. Upewnij się, że klipsy nauszne nie są podłączone do generatora impulsów. Następnie naciśnij przycisk wstrząsu na kilka sekund, a potem podłącz klipsy nauszne do generatora impulsów.W tym kroku należy zwilżyć klipsy do uszu sterylnym roztworem soli fizjologicznej i upewnić się, że są one nasycone. Następnie należy zwilżyć uszy szczura sterylną solą fizjologiczną, owijając je gazą nasączoną tym roztworem. Po ich zwilżeniu należy usunąć gazę.Przymocuj klipsy do uszu, używając jednego klipsa na ucho, i umieść je za głównym pasmem chrząstki. Naciśnij przycisk wstrząsu na kilka sekund i obserwuj napad. W przypadku grupy pozorowanej (sham), bez kontroli napadów, potraktuj szczura w identyczny sposób, ale nie podawaj prądu.W momencie wystąpienia klonusów odłącz klipsy uszne i zarejestruj przebieg napadu zgodnie z przejrzywistą skalą Racine’a od jednego do pięciu. Stopień czwarty obejmuje wznoszenie się na tylnych łapach z klonusami czterech kończyn, a stopień piąty wznoszenie się i upadek z klonusami czterech kończyn. Napad powinien trwać około 10 sekund.Czas trwania napadu należy zarejestrować za pomocą stopera. Po ustąpieniu napadu szczura należy umieścić z powrotem w klatce domowej. Następnie należy monitorować szczura przez kolejne pięć minut, aby upewnić się, że doszło do całkowitego ustąpienia objawów napadowych.Zwierzę należy trzymać pojedynczo w klatce, a następnie przenieść klatkę z powrotem do pomieszczenia rekonwalescencyjnego. W tej procedurze dwa hipokampy od jednego szczura umieszcza się na szalce hodowlanej o średnicy 30 mm i sieka na małe kawałki za pomocą nożyczek. Następnie posiekane hipokampy przenosi się do ręcznego homogenizatora szklanego i dodaje 1 mL schłodzonego buforu do homogenizacji.Następnie wprowadź okrągły tłok do homogenizatora szklanego. Gdy homogenizator szklany znajduje się w lodzie, delikatnie i miarowo przesuwaj tłok w górę i w dół od 10 do 15 razy przez jedną minutę, aż małe fragmenty tkanki hipokampa znikną. Następnie przenieś homogenat do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml za pomocą pipety 1 ml i odwiruj homogenat z prędkością 800 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby oddzielić nadsącz ponuklearny od osadu zawierającego nierozpuszczalną tkankę i jądra komórkowe.Następnie przenieś 50 µL i 950 µL frakcji S1 do dwóch osobnych, nowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml i przechowuj je w lodzie. Zachowaj również osad frakcji P1 w lodzie. Następnie odwiruj 950 µL frakcji S1 przez 10 minut przy 13 800 ×g i w temperaturze 4 °C, aby oddzielić nadsącz wzbogacony w rozpuszczalne białka cytozolowe oraz osad wzbogacony w białka związane z błoną, w tym białka synaptosomalne.Przenieś frakcję S2 do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mililitra i przechowuj ją w lodzie. Następnie resuspenduj osad frakcji P2 w 498 mikrolitrach lodowatej wody oczyszczonej. Dodaj dwa mikrolitry heeps o stężeniu jednego mola, aby uzyskać stężenie końcowe czterech milimoli heeps.Inkubować zawiesinę w temperaturze 4 °C z mieszaniem przez 30 minut. Po 30 minutach przechowywać resuspensowaną frakcję P2 w lodzie. Na tym etapie odwirować frakcję P2 przez 20 minut przy 25 000 ×g i 4 °C, aby oddzielić lizowany nadsącz od lizowanego osadu.Przenieś frakcję LS2 do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1.7 milliliter i przechowuj ją w lodzie. Następnie resuspenduj osad LP1 w 250 microliters 50 millimolar heeps, zmieszanych z 250 microliters jednego procentowego detergentu oraz 1 X PBS. Inkubuj zawiesinę w temperaturze four degrees Celsius przy łagodnym mieszaniu przez 15 minut.Następnie odwiruj zawiesinę osadu LP1 przez 3 godziny przy 25 000 ×g i temperaturze 4°C, aby oddzielić nadsącz frakcji nie-PSD od osadu frakcji PSD. Przenieś nadsącz do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml i zawieś osad PSD w 100 µL 50 mM HEPES. Na tej rycinie reprezentatywne analizy western blot pokazują ekspresję białka podjednostki receptora NMDA GluN2B, receptora AMPA GluA2 oraz STEP61 w frakcjach S2, P2 i PSD z hipokampów szczurów z grupy sham, grupy bez napadów oraz szczurów, które otrzymały ostre ECS.Cytoplazmatyczne białko rozpuszczalne alfa-tubulina jest wzbogacone w frakcji S2. Synaptofizyna jest białkiem pęcherzyków presynaptycznych i jest wzbogacona w surowej frakcji błoniastej P2, ale nie we frakcji PSD, podczas gdy PSD-95 jest wzbogacone zarówno w frakcji P2, jak i PSD. Przedstawiono tutaj ilościowe oznaczenie GluN2B i GluA2 w frakcjach P2 i PSD w trzech i 24 godzinach po ostrym ECS.Ekspresję GluN2B i GluA2 we frakcji P2 znormalizowano do poziomu alfa-Tubuliny we frakcji S2. W przypadku ekspresji GluN2B i GluA2 we frakcji PSD, znormalizowano ją do poziomu PSD 95 we frakcji PSD. Po opanowaniu tej techniki, prawidłowe wykonanie procedury zajmuje od pięciu do sześciu godzin.Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać analizy spektrometrii masowej oparte na mieszaninach białek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jakie inne białka synaptyczne ulegają zmianom pod wpływem ECS. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie chorób neurologicznych do zbadania podstawowych mechanizmów dysfunkcji synaptycznej w modelach gryzoni i transgenicznych modelach chorób neurologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak indukować ECS u gryzoni, przeprowadzać homogenizację i frakcjonowanie PSD z hipokampów oraz jak badać zmiany białek synaptycznych po ECS.

electroconvulsive-seizures-rats-fractionation-their-hippocampi-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje elektroencefalograficzny (EEG) zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką. Szczur z elektrodami wszczepionymi w brzuszny hipokamp podłącza się do systemu rejestracji EEG i umieszcza w komorze z pleksi. Szczur może się swobodnie poruszać, podczas gdy aktywność mózgu jest rejestrowana w celu monitorowania występowania napadów.

Elektroencefalograficzny zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką

Źródło: Soukupová, M., et al. Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia ocenę poziomu zewnątrzkomórkowego neuroprzekaźnika pobudzającego u szczurów z przewlekłą indukcją padaczki. Po wszczepieniu sondy do mikrodializy do mózgu i potwierdzeniu braku napadów za pomocą elektroencefalografii (EEG), pobiera się płyn zewnątrzkomórkowy w celu oceny podwyższonego poziomu neuroprzekaźników u szczurów z...

Ocena poziomu neuroprzekaźników pobudzających u szczurów z przewlekłą padaczką

Źródło: Jang, S., et al, Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje indukcję ostrego napadu elektrowstrząsowego (ECS) w modelu szczurzym w celu zbadania neuroplastyczności wywołanej napadem. Naukowcy stosują stymulację elektryczną za pomocą elektrod z klipsem do ucha, wywołując nadpobudliwość neuronów i klonus. Model ten pomaga badać plastyczność synaptyczną,...

Wywoływanie ostrego napadu elektrowstrząsowego w modelu szczurzym

Ten film przedstawia procedury przygotowania, rejestracji i analizy źródeł wysokorozdzielczego EEG u szczurów poddanych sedacji ze szczególnym przedklinicznym modelem padaczki ogniskowej w warunkach nieinwazyjnych.

Obrazowanie źródła mózgu w przedklinicznych szczurzych modelach padaczki ogniskowej przy użyciu zapisów EEG o wysokiej rozdzielczości

Ten szczegółowy protokół opisuje umieszczanie elektrod stymulacji przezczaszkowej na kości skroniowej w celu zbadania krótko- i długoterminowych efektów przezczaszkowej stymulacji elektrycznej u swobodnie poruszających się szczurów.

Przewlekła przezczaszkowa stymulacja elektryczna i zapis wewnątrzkorowy u szczurów

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.

Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich

Tutaj opisujemy metodę mikrodializy in vivo do analizy uwalniania asparaginianu i glutaminianu w brzusznym hipokampie u szczurów z padaczką i bez padaczki, w połączeniu z zapisami EEG. Zewnątrzkomórkowe stężenia asparaginianu i glutaminianu mogą być skorelowane z różnymi fazami choroby.

Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów

Wyzwaniem badań nad padaczką jest opracowanie nowych metod leczenia dla pacjentów, u których klasyczna terapia jest niewystarczająca. Korzystając z nowego protokołu - za pomocą wszczepialnego systemu dostarczania leków - jesteśmy w stanie kontrolować napady padaczkowe u znieczulonych myszy poprzez elektroforetyczne dostarczanie GABA do ogniska padaczkowego.

Elektroforetyczne dostarczanie kwasu γ-aminomasłowego (GABA) do ogniska padaczkowego zapobiega napadom padaczkowym u myszy

Prezentowany protokół opisuje transport i przygotowanie wyciętej ludzkiej tkanki hipokampa, której ostatecznym celem jest wykorzystanie ważnych wycinków mózgu jako narzędzia do oceny przedklinicznej potencjalnych substancji przeciwpadaczkowych.

Przygotowanie ostrych wycinków ludzkiego hipokampa do zapisów elektrofizjologicznych

Ten raport opisuje metody generowania modelu padaczki skroniowej na podstawie elektrycznego rozpalenia transgenicznych myszy VGAT-Cre. Rozpalone myszy VGAT-Cre mogą być przydatne w określaniu, co powoduje padaczkę i w badaniach przesiewowych nowych terapii.

Przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy VGAT-Cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej

Poznaj metodę wywoływania napadów elektrowstrząsowych u szczurów i frakcjonowania hipokampu w celu badania zmian w białkach postsynaptycznych. Ta technika pozwala analizować plastyczność synaptyczną i mechanizmy neurobiologiczne.

Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej (Wideo) | JoVE Journal

Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

Przeglądaj więcej filmów