Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta
31 lipca 2017
Ten protokół został opracowany do ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i ImageJ.
Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowa identyfikacja składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i obrazu J. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrośrodowiska guza, takie jak to, jak te składniki wyglądają w próbkach pacjentów i jak możemy określić fizjologicznie istotne proporcje komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona prosta do analizy w próbkach pobranych od pacjentów. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku wyjaśnienia niedostatecznie scharakteryzowanego, złożonego mikrośrodowiska guza glejaka.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ czas rozwoju chromogennego musi być ściśle monitorowany, aby zapobiec nadmiernemu rozwojowi i nasyceniu tkanki. Rozpocznij protokół od wykonania prania określonych w dołączonym protokole tekstowym. Rozcieńczyć roztwór demaskujący antygen o wysokim pH na bazie tris i wodę destylowaną zgodnie z zaleceniami producenta.
Przejdź do pobierania antygenu za pośrednictwem ciepła, dodając rozcieńczony roztwór demaskujący do nieszczelnego naczynia nadającego się do kuchenki mikrofalowej. Umieść szkiełka w naczyniu. Następnie umieść szkiełka naczyniowe w kuchence mikrofalowej.
Następnie gotuj naczynie przez 20 minut na dużej mocy. Monitorować poziom cieczy pod kątem parowania i w razie potrzeby napełnić naczynie wodą destylowaną. Pozostawić próbki do ostygnięcia w roztworze przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Obrysować próbkę tkanki środkiem hydrofobowym, aby zminimalizować objętość odczynników niezbędnych do pokrycia próbki. Następnie wlej wystarczającą ilość roztworu przepuszczalnego, od 100 do 200 mikrolitrów, aby pokryć próbkę tkanki. Usunąć i wyrzucić roztwór, a następnie ponownie przykryć próbkę tkanki roztworem przepuszczalnym.
Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym przez jedną godzinę. Następnie inkubować próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym. Następnego dnia wykryj przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą odczynnika polimerowego peroksydazy chrzanowej odpowiadającego głównemu przeciwciału zwierzęcia gospodarza.
Wlej roztwór przepuszczalny w ilości wystarczającej do pokrycia próbki tkanki i inkubuj próbkę przez pięć minut. Usunąć i wyrzucić roztwór, a następnie przykryć próbkę tkanki roztworem do przepuszczalności jeszcze raz na pięć minut. Inkubować szkiełka w 0,3% nadtlenku wodoru i IX TBS przez 15 minut.
Rozwijać próbki za pomocą peroksydazy, diaminobenzydyny lub substratu do wcierania przez dwie do 10 minut, aż do uzyskania pożądanej intensywności barwienia. Przeciwbarwić próbki w celu identyfikacji jąder komórkowych, na przykład hematoksyliną, postępując zgodnie z protokołem producenta. Odwodnić próbki 100% etanolem i ksylenem.
Na koniec zamontuj próbki na stałe za pomocą nośników montażowych. Dwa obszary zainteresowania w naszych resekcjach guza, guz pierwotny luzem i sąsiednie regiony, składające się głównie ze zdrowej tkanki z rozproszonymi atakującymi komórkami rakowymi, zostały zidentyfikowane przez współpracującego neuropatologa na próbkach pacjentów barwionych hematoksyliną i eozyną. Immunohistochemia chromogenna zidentyfikowała dodatnie barwienie astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów w każdej próbce pacjenta.
Przeprowadziliśmy barwienie bez przeciwciał pierwszorzędowych w celu kontroli ujemnej. Producent zalecił dalsze rozcieńczenia przed ustaleniem rozcieńczenia od jednego do 200 ze względu na optymalne pozytywne barwienie ciała komórki i procesu z minimalizacją tła dla przeciwciała anty ALDH 1l1. Korzystając z obrazu J, określono ilościowo procentowe pokrycie barwienia oligodendrocytów OSP-1 dodatnim, aby ostatecznie porównać różnice w naszych regionach zainteresowania.
Po zastosowaniu odpowiedniego progu do obrazu można zmierzyć procentowe pokrycie od progu i porównać je dla wielu pacjentów. Pięć sąsiadujących i masywnych regionów próbek pacjentów z glejakiem lub GBM, wraz ze zdrową tkanką mózgową, porównano pod kątem specyficznego dla oligodendrocytów pokrycia białka jeden lub OSP1. Po opanowaniu techniki barwienia można ją wykonać w ciągu czterech godzin pierwszego dnia i dwóch godzin drugiego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym monitorowaniu intensywności barwienia i nawilżenia tkanek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę ilościowej identyfikacji komponentów mikrośrodowiska guza w wycinkach chirurgicznych pobranych od pacjentów z glejakolwem wielopostaciowym, z wykorzystaniem chromogennej immunohistochemii oraz programu ImageJ. Technika ta ma na celu dostarczenie informacji na temat złożonego mikrośrodowiska guza w glejakolwiomie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Onkologia
- Histologia
Wprowadzenie
- Glioblastoma to wysoce agresywny nowotwór mózgu.
- Mikrośrodowisko guza odgrywa kluczową rolę w jego progresji.
- Zrozumienie składu tego środowiska jest niezbędne do opracowania terapii celowanych.
- Chromogenna immunohistochemia umożliwia szczególną wizualizację składników tkanki.
Cel badania
- Aby ilościowo ocenić mikrośrodowisko nowotworu w próbkach glejaka wielopostaciowego.
- Aby określić fizjologicznie istotne proporcje różnych typów komórek.
- Aby zapewnić prostą metodę analizy próbek pacjentów.
Zastosowane metody
- Chromogenna immunohistochemia do barwienia tkanek.
- Oprogramowanie ImageJ do analizy ilościowej.
- Protokoły przemywania i odsłaniania antygenów zgodnie z zaleceniami producenta.
- Staranne monitorowanie czasu trwania procesu utleniania chromogenu.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja różnych komponentów mikrośrodowiska guza.
- Opracowanie metod określania proporcji komórek w próbkach glejaka wielopostaciowego.
- Wnioski dotyczące złożoności mikrośrodowiska glejaka wielopostaciowego.
- Wykazanie możliwości zastosowania metody w próbkach pobranych od pacjentów.
Wnioski
- Niniejszy protokół zapewnia niezawodną metodę badania mikrośrodowisk glejaków wielopostaciowych.
- Pomaga on w zrozumieniu interakcji w obrębie mikrośrodowiska guza.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu usprawnienia strategii leczenia glejaków wielopostaciowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza mikrośrodowiska guza w próbkach glejaka wielopostaciowego pochodzących od pacjentów umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów terapeutycznych w komórkach glejowych podczas poszukiwania leków w neuroonkologii. Dzięki dostarczaniu powtarzalnych, specyficznych dla regionu pomiarów astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów, metoda ta wspiera walidację celów oraz przesiew fenotypowy w systemach istotnych dla przebiegu choroby. Zwiększa ona pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez powiązanie składu mikrośrodowiska z odpowiedzią terapeutyczną i mechanizmami oporności.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju bioprzemysłu farmaceutycznego
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie fenotypów komórek glejowych i ich stanów funkcjonalnych w heterogenicznych obszarach guza.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe odczyty oparte na obrazowaniu w celu oceny stopnia zaangażowania celu oraz modulacji mikrośrodowiska.
- Wartość prognostyczna: Wspiera dobór celów zgodnych z biomarkerami poprzez korelację liczności gleju z gradientami patologicznymi w próbkach pacjentów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Ustanawia standaryzowane protokoły immunohistochemiczne kompatybilne z potokami obrazowania i analizy wysokoprzepustowej.
- Wynik ilościowy: Dostarcza wskaźniki procentowego pokrycia za pomocą programu ImageJ, które umożliwiają porównania między próbkami i między regionami.
- Powtarzalność: Określa krytyczne kontrole czasu wywoływania chromogenicznego w celu zapewnienia specyficzności sygnału i zminimalizowania szumów tła.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Wykorzystanie rzeczywistych próbek z resekcji pacjentów w celu zachowania wierności patofizjologicznej w badaniach walidacji celu.
- Ciągłość translacyjna: Powiązanie wyników badań podstawowych z modelami przedklinicznymi poprzez zdefiniowanie ilościowych punktów odniesienia dla składu komórek glejowych.
- Minimalizacja ryzyka: Redukcja niepewności związanej z biologicznym ryzykiem w terapiach celowanych w glej poprzez charakterystykę kontekstu mikrośrodowiskowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po optymalizację wiodących związków, w szczególności w programach neuroonkologicznych skoncentrowanych na modulacji mikrośrodowiska.
- Biologia odkrywcza: Wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie przestrzennego i ilościowego profilowania populacji glejowych w tkankach ludzkich.
- Przesiewanie: Generuje zestandaryzowane, mierzalne wzorce barwienia, które mogą być wykorzystane do oceny wpływu związków na skład mikrośrodowiska.
- Analityka: Zapewnia pomiary procentowego pokrycia w oparciu o wartości progowe, co pozwala na statystyczne porównanie różnych warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera strategie biomarkerowe poprzez powiązanie gęstości komórek glejowych z histopatologicznymi obszarami zainteresowania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia przenaszalny schemat pracy IHC/ImageJ, który można zastosować w modelach glejaków oraz innych nowotworów OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność w wyborze celu dzięki ilościowej, rozdzielczej przestrzennie analizie komórek glejowych w próbkach pacjentów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność poprzez zestandaryzowane protokoły odzyskiwania antygenu, blokowania oraz czasu przejawiania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w zakresie interakcji w mikrośrodowisku celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapeutyków modulujących glej z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dane dotyczące zaangażowania mikrośrodowiskowego.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunohistochemii i przygotowania próbek neuropatologicznych.
- Zależne od zoptymalizowanego czasu wywoływania chromogennego w celu uniknięcia nasycenia sygnału.
- Wymaga zastosowania ustandaryzowanych protokołów progowania w programie ImageJ dla zapewnienia spójnej kwantyfikacji.
- Wymaga dostępu do próbek z resekcji glejaków wielopostaciowych pochodzących od pacjentów z zaznaczonymi obszarami zainteresowania.
- Ograniczone przez heterogeniczność tkanek oraz konieczność przeprowadzania analiz specyficznych dla danego regionu, aby uniknąć sygnałów zakłócających.
