Name: Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj metodę ilościowej immunohistochemii chromogenowej do analizy mikrośrodowiska glejaka wielopostaciowego w tkankach pacjenta z wykorzystaniem ImageJ. Technika ta umożliwia określenie fizjologicznie istotnych proporcji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują doktorom Fahadowi Bafakihowi i Jimowi Mandellowi za pobranie i identyfikację próbek od pacjentów, Garrettowi F. Beeghly'emu za pomoc w immunohistochemii, a także Biorepository and Tissue Research Facility, Cardiovascular Research Center Histology Core oraz Biomolecular Analysis Facility na University of Virginia za pomoc w pozyskiwaniu próbek, immunohistochemii i obrazowaniu.

Ten protokół identyfikuje składniki komórkowe w próbkach zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, co jest typowe dla próbek pacjentów klinicznych przechowywanych w banku. Osadzanie parafiny pozwala na najlepsze utrzymanie morfologii komórek i tkanek, a także ma lepszą trwałość skrawków. Dostęp do próbek wykorzystanych do tej analizy uzyskano za pośrednictwem University of Virginia Biorepository and Tissue Research Facility. Próbki pacjentów zostały wybrane przez neuropatologa na podstawie ostatecznej diagnozy glejaka (gwiaździaka, IV stopień wg WHO), który przeszedł resekcje guza na Uniwersytecie Wirginii w latach 2010-2013 i zostały pozbawione identyfikacji przed tą analizą11.
1. Deparafinizacja i ponowne nawodnienie próbki FFPE
UWAGA: Ta część protokołu jest specyficzna dla próbek FFPE. Podczas gdy próbki zatopione w parafinie mogą być bardziej przydatne do tej analizy ze względu na zachowanie morfologii komórek i tkanek, analizę tę można również przeprowadzić w przypadku zamrożonych skrawków. W przypadku stosowania zamrożonych skrawków tę część można pominąć i przejść bezpośrednio do immunohistochemii chromogennej.
<ol>
	<li>Wykonaj następujące prania przez 5 minut każde: Ksylen, Ksylen, 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 95% etanol, 70% etanol, woda dejonizowana, woda dejonizowana</li>
</ol>
2. Pobieranie antygenu
UWAGA: Ta część protokołu jest niezbędna do przerwania mostków metylenowych powstałych podczas utrwalania formaliny w próbkach FFPE i odsłonięcia miejsc antygenowych do wiązania przeciwciał.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć roztwór demaskujący antygen o wysokim pH na bazie Tris zgodnie z zaleceniem producenta w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Wykonaj pobieranie antygenu za pośrednictwem ciepła za pomocą kuchenki mikrofalowej. Inne formy odzyskiwania za pośrednictwem ciepła (takie jak szybkowar, parowar do warzyw lub wrząca woda) również wystarczą.
	<ol>
		<li>Dodać rozcieńczony roztwór demaskujący do nieszczelnego naczynia nadającego się do kuchenki mikrofalowej. Umieść szkiełka w naczyniu. Umieść szkiełka w kuchence mikrofalowej.</li>
		<li>Gotować przez 20 minut na dużej mocy. Monitoruj poziom cieczy pod kątem parowania i w razie potrzeby uzupełniaj wodą destylowaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostawić próbki do ostygnięcia w roztworze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Immunohistochemia chromogenna
<ol>
	<li>Obrysuj próbkę tkanki pisakiem hydrofobowym, aby zminimalizować objętość odczynników niezbędnych do pokrycia próbki. 
	UWAGA: Upewnij się, że próbki tkanek są nawodnione i nie pozwól im wyschnąć, ponieważ wpłynie to na skuteczność barwienia.</li>
	<li>Odpipetować wystarczającą ilość roztworu do przepuszczalności (sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS) + 0,01% Triton-X), aby pokryć próbkę tkanki (zwykle około 100 - 200 μl).</li>
	<li>Usuń i wyrzuć roztwór, a następnie powtórz krok 3.2.</li>
	<li>Próbki inkubować w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym (2,5% surowica końska + roztwór permeabilizacyjny).</li>
	<li>Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym. 
	UWAGA: Wszystkie użyte tutaj przeciwciała pierwszorzędowe są rozcieńczane w stosunku 1:200, ale optymalne rozcieńczenia można określić za pomocą seryjnych rozcieńczeń, zaczynając od zalecenia producenta. Szczegółowe informacje na temat przeciwciał stosowanych w tym protokole zostały wcześniej opublikowane11.</li>
	<li>Wykryć przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą odczynnika polimerowego peroksydazy chrzanowej odpowiadającego głównemu przeciwciału u zwierzęcia gospodarza, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Odpipetować wystarczającą ilość roztworu do przepuszczalności, aby pokryć próbkę tkanki i inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń i wyrzuć roztwór, a następnie powtórz krok 3.7.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w 0,3% H2O2 w 1x TBS przez 15 min.</li>
	<li>Opracowywać próbki z substratem peroksydazy diaminobenzydyny (DAB) przez 2 - 10 minut, aż do uzyskania pożądanej intensywności barwienia.</li>
	<li>Próbki barwienia przeciwstawnego w celu identyfikacji jąder komórkowych, takich jak hematoksylina, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Odwodnić próbki 100% etanolem i ksylenem.</li>
	<li>Zamontuj próbki na stałe za pomocą nośników montażowych.</li>
</ol>
4. Identyfikacja regionów zainteresowania
<ol>
	<li>Preparaty obrazowe w mikroskopii jasnego pola zdolne do wykonywania obrazów o wysokiej rozdzielczości. 
	UWAGA: Używaj komponentów komórkowych do obrazowania w rozdzielczości co najmniej 20x.</li>
	<li>Przesuń kamerę do określonych obszarów zainteresowania w próbkach tkanek.</li>
	<li>Zapisywanie obrazów jako plików TIFF w celu oceny ilościowej.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Otwórz obrazy w ImageJ, aby określić ilościowo procentowe pokrycie.</li>
	<li>Użyj wtyczki Threshold Colour, aby usunąć fioletowy kolor z jąder barwionych hematoksyliną.</li>
	<li>Konwertuj obraz na 8-bitowy.</li>
	<li>Dodaj próg bez ciemnego tła.</li>
	<li>Przetwarzaj obraz przy użyciu jednego z 17 wstępnie załadowanych filtrów progowych ImageJ (tj. MaxEntropy), tak aby tylko fragmenty barwione DAB były uwzględniane w progu. 
	UWAGA: Wybierz optymalny, wstępnie załadowany filtr progowy, który minimalizuje uwzględnianie barwienia tła. Może to zależeć od jakości barwienia i swoistości przeciwciała. Stosować ten sam próg dla wszystkich kontrprób technicznych w każdej próbce pacjenta.</li>
	<li>Zastosuj próg.</li>
	<li>Zmierz procentową powierzchnię obrazu z progiem.</li>
	<li>Średni procent pokrycia obszaru dla wielu regionów w każdej próbie.</li>
</ol>

<ol><li>Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+glioma+growth%3A+a+guerilla+war%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Diffuse glioma growth: a guerilla war.</a> Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).</li>
<li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+the+terminator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li>
<li>Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+Irradiation+Promotes+Migration+and+Invasiveness+of+Glioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells.</a> Cancer Res. 61 (6), (2001).</li>
<li>Tuettenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrence+pattern+in+glioblastoma+multiforme+patients+treated+with+anti-angiogenic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).</li>
<li>Munson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-invasive+adjuvant+therapy+with+imipramine+blue+enhances+chemotherapeutic+efficacy+against+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma.</a> Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36(2012).</li>
<li>Correia, A. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+is+a+dominant+force+in+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist.+Updat%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance.</a> Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).</li>
<li>Rubin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Only+in+congenial+soil%3A+the+microenvironment+in+brain+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis.</a> Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).</li>
<li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+glioma+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li>
<li>Le, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+astrocytes+by+glioma+cells+to+facilitate+invasiveness%3A+a+mechanism+involving+matrix+metalloproteinase-2+and+the+urokinase-type+plasminogen+activator-plasmin+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade.</a> J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+microglia%2Fmacrophages+enhance+the+invasion+of+glioma+stem-like+cells+via+TGF-%CE%B21+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway.</a> J. Immunol. 189, 444-453 (2012).</li>
<li>Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Cellular+Microenvironment+of+Glioblastoma+to+Develop+Predictive+Statistical+Models+of+Overall+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Image+Analysis+of+Cellular+Heterogeneity+in+Breast+Tumors+Complements+Genomic+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling.</a> Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).</li>
<li>Yi, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Obstructive+Intimal+Lesions+and+Their+Cellular+Phenotypes+in+Chronic+Pulmonary+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).</li>
<li>Turcan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH1+mutation+is+sufficient+to+establish+the+glioma+hypermethylator+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype.</a> Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).</li>
<li>Songtao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH+mutations+predict+longer+survival+and+response+to+temozolomide+in+secondary+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma.</a> Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).</li>
<li>Shinojima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Value+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Patients+with+Glioblastoma+Multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme.</a> Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).</li>
<li>Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+high-grade+gliomas%3A+where+do+we+stand%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?</a> Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).</li>
<li>Badie, B., Schartner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+glioma+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in glioma biology.</a> Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).</li>
<li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li>
<li>Alves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cells%3A+A+heterogeneous+and+fatal+tumor+interacting+with+the+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma.</a> Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+and+macrophages+in+glioma+maintenance+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression.</a> Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li>
<li>Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+astrocytes+in+the+progression+of+brain+cancer%3A+complicating+the+picture+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment.</a> Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).</li>
<li>Rath, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Enhance+the+Invasion+Potential+of+Glioblastoma+Stem-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells.</a> PLoS One. 8 (1), e54752(2013).</li>
</ol>

Proponowana przez nas metoda to ilościowe podejście do analizy próbek histologicznych barwionych przy użyciu tradycyjnej immunohistochemii chromogennej. Obecna metodologia tego typu analizy obejmuje podobne protokoły barwienia, po których następuje klasyfikacja przez niezależnych patologów. Metoda ta okazała się niezawodna, jednak w przypadku wielu zastosowań wymagane jest bardziej precyzyjne zrozumienie składu komórkowego, takie jak lepsze zrozumienie heterogeniczności związanej z nowotworami i dokładna rekapitulacja gu...

Glejak wielopostaciowy (GBM), najczęstszy i najbardziej złośliwy nowotwór mózgu, charakteryzuje się wysoce rozproszoną inwazją od pierwotnej masy guza do otaczającego zdrowego miąższu mózgu1,2. Ta rozproszona inwazja sprawia, że guz jest szczególnie trudny do pełnej resekcji, a atakujące komórki rakowe, które pozostają po terapii, są najczęstszą przyczyną nieuniknionego nawrotu2,3,4. Wcześniej stwierdziliśmy, że hamowanie inwazji komórek glejaka rozlanego jest korzystne terapeutycznie5, jednak niewiele wiadomo o złożonych mechanizmach przyczyniających się do inwazji GBM. Mikrośrodowisko guza, czyli tkanka otaczająca nowotwór, jest zaangażowana w progresję nowotworów w wielu nowotworach6,7. W szczególności mikrośrodowisko guza glejaka jest stosunkowo słabo scharakteryzowane i jest wyjątkowo złożone, składa się z wielu komórek glejowych, takich jak astrocyty, mikroglej i oligodendrocyty, a także macierzy zewnątrzkomórkowej, czynników rozpuszczalnych i czynników biofizycznych. Eksperymentalnie wykazano, że astrocyty i mikroglej zwiększają progresję i inwazję glejaka8,9,10, ale skład wszystkich komórek glejowych w rodzimym mikrośrodowisku ludzkiego mózgu jest nieznany.
Wcześniej pokazaliśmy, że komponenty mikrośrodowiskowe mogą przewidywać przeżycie pacjenta, analizując ilościowo komponenty komórkowe mikrośrodowiska glejaka i włączając nasze analizy do modelu proporcjonalnego ryzyka11. W tym miejscu opisujemy metodę analizy ilościowej służącą do identyfikacji populacji komórek glejowych w masie guza i sąsiednich regionach resekcji guza od pacjentów z glejakiem. Użyliśmy immunohistochemii chromogennej do identyfikacji populacji komórek glejowych i ImageJ do analizy procentowego pokrycia barwienia dla każdej populacji glejowej. Ocena procentowego pokrycia tworzy prosty pomiar do określania różnic morfologicznych komórek, szczególnie tych dotkniętych interakcjami z komórkami nowotworowymi. Wcześniejsze badania nad ilościowym określaniem barwienia histopatologicznego wykorzystują standardowe barwienie, takie jak hematoksylina i eozyna12 lub Masson's trichrome13, które nie wykorzystują specyficzności barwienia immunohistochemicznego opartego na przeciwciałach. Nasza metoda została opracowana w celu bezpośredniego ilościowego określenia populacji glejowych w resekcjach guza u pacjentów z glejakiem, które zamierzamy wykorzystać do wyjaśnienia złożonego mikrośrodowiska glejaka.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór demaskujący antygen o wysokim pH</td><td>Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Surowica</td><td></td><td></td><td></td>dla koni</tr><tr><td>Anti-ALDH1L1&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Iba1&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Białko specyficzne dla anty-oligodendrocytów1&nbsp;</td><td>ABCAM&nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS anti-goat</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universal (anty-myszy/królika)</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT Podłoże DAB</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik hematoksylinowy</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik montażowy Histochoice</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>Research Products International</td><td>195506</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Wraz z rosnącym zainteresowaniem mikrośrodowiskiem guza, postanowiliśmy opracować metodę szczegółowego określania składników mikrośrodowiska w próbkach pobranych od pacjentów glejaka, najbardziej śmiertelnego i inwazyjnego raka mózgu. Metody ilościowe są nie tylko korzystne dla dokładnego opisu chorych tkanek, ale mogą również potencjalnie przyczynić się do dokładniejszego prognozowania, diagnozowania i opracowywania systemów inżynierii tkankowej i zamienników. W glejaku komórki glejowe, takie jak mikroglej i astrocyty, zostały niezależnie skorelowane ze złym rokowaniem na podstawie oceny patologów. Jednak stan tych komórek i innych składników komórek glejowych nie został dobrze opisany ilościowo. Może to być trudne ze względu na duże procesy, które znaczą te komórki glejowe. Ponadto większość analiz histologicznych koncentruje się na całej próbce tkanki lub tylko w obrębie większości guza, w przeciwieństwie do wyznaczania kwantyfikacji na podstawie regionów w wysoce niejednorodnej tkance. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i ilościowej analizy populacji komórek glejowych w masie guza i sąsiednich regionach resekcji guza od pacjentów z glejakiem. Użyliśmy immunohistochemii chromogennej do identyfikacji populacji komórek glejowych w resekcjach guza u pacjentów oraz ImageJ do analizy procentowego pokrycia barwienia dla każdej populacji glejowej. Dzięki tym technikom jesteśmy w stanie lepiej opisać komórki glejowe we wszystkich regionach mikrośrodowiska guza glejaka.

Do niniejszej analizy wybrano dwa obszary zainteresowania w obrębie wyciętych guzów – główną masę guza oraz obszary przyległe, składające się głównie z tkanki zdrowej z rozproszonymi naciekami komórek nowotworowych (Rycina 1A, 1B), które zostały zidentyfikowane przez współpracujących neuropatologów na próbkach pacjentów barwionych hematoksyliną i eozyną. W każdej próbce pacjenta zidentyfikowano pozytywne barwienie astrocytów (<strong class="x...

Ten protokół został opracowany do ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i ImageJ.

Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ilościowa identyfikacja składników mikrośrodowiska guza w wycinkach resekcyjnych glioblastynomy pacjentów z wykorzystaniem chromogennej immunohistochemii oraz programu Image J. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mikrośrodowiska guza, takie jak wygląd tych składników w próbkach pacjentów oraz sposób określania fizjologicznie istotnych proporcji komórek. Główną zaletą tej techniki jest prostota analizy próbek pobranych od pacjentów. Zastosowanie tej metody przyczynia się do wyjaśnienia słabo scharakteryzowanego, złożonego mikrośrodowiska guza glioblastynomy.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ czas trwania rozwoju chromogenicznego musi być ściśle monitorowany, aby zapobiec nadmiernemu utlenieniu i nasyceniu tkanki. Rozpocznij protokół od wykonania etapów płukania określonych w towarzyszącym protokole tekstowym. Rozcieńcz roztwór do odsłaniania antygenów o wysokim pH na bazie TRIS oraz wodę destylowaną zgodnie z zaleceniami producenta.Przejdź do etapu termicznej odmaskowania antygenów, dodając rozcieńczony roztwór do odmaskowywania do niezamkniętego naczynia przystosowanego do kuchenek mikrofalowych. Umieść preparaty w naczyniu. Następnie włóż naczynie z preparatami do kuchenki mikrofalowej.Następnie gotuj zawartość naczynia przez 20 minut przy wysokiej mocy. Monitoruj poziom cieczy pod kątem odparowania i w razie potrzeby uzupełniaj naczynie wodą destylowaną. Pozostaw próbki do ochłodzenia w roztworze przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Obrysuj próbkę tkanki materiałem hydrofobowym, aby zminimalizować objętość odczynników niezbędną do pokrycia próbki. Następnie nanieś pipetą odpowiednią ilość roztworu do permeabilizacji, od 100 do 200 µL, aby pokryć próbkę tkanki. Usuń i wylej roztwór, a następnie ponownie pokryj próbkę tkanki roztworem do permeabilizacji.Inkubować próbki w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym przez jedną godzinę. Następnie inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym. Następnego dnia wykryć przeciwciała pierwszorzędowe, używając odczynnika polimerowego z peroksydazą chrzanową odpowiadającego gatunkowi zwierzęcia, w którym wytworzono przeciwciało pierwszorzędowe.Dodać za pomocą pipety odpowiednią ilość roztworu permeabilizującego, aby przykryć próbkę tkanki, i inkubować próbkę przez pięć minut. Usunąć i wylać roztwór, a następnie ponownie przykryć próbkę tkanki roztworem permeabilizującym na pięć minut. Inkubować preparaty w 0,3% nadtlenku wodoru w IX TBS przez 15 minut.Wywoływać próbki przy użyciu substratu peroksydazy diaminobenzydyny (DAB) przez okres od 2 do 10 minut, aż do uzyskania pożądanej intensywności barwienia. Próbki poddać barwieniu kontrastowemu w celu zidentyfikowania jąder komórkowych, na przykład hematoksyliną zgodnie z protokołem producenta. Odwodnić próbki w 100% etanolu i ksylenie.Na koniec trwale zamocuj preparaty za pomocą medium montażowego. Dwa obszary zainteresowania w obrębie wyciętych guzów – główną masę guza (Bulk) oraz obszary sąsiednie (Adjacent), składające się głównie z tkanki zdrowej z rozproszonymi naciekami komórek nowotworowych, zostały zidentyfikowane przez współpracującego neuropatologa na próbkach pacjentów barwionych hematoksyliną i eozyną. Chromogenna immunohistochemia wykazała pozytywne barwienie astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów w każdej próbce pacjenta.W celu uzyskania kontroli negatywnej przeprowadziliśmy barwienie bez zastosowania przeciwciała pierwszorzędowego. Producent zalecał przeprowadzenie dodatkowych rozcieńczeń przed wyborem rozcieńczenia 1:200, które zapewniło optymalne barwienie pozytywne ciał i wypustek komórkowych przy jednoczesnym zminimalizowaniu tła dla przeciwciała anty-ALDH 1l1. Za pomocą programu Image J określono procentowy stopień pokrycia barwienia oligodendrocytów pozytywnych na OSP-1, aby ostatecznie porównać różnice w analizowanych obszarach zainteresowania.Po zastosowaniu odpowiedniego progu do obrazu można zmierzyć i porównać procentowy stopień pokrycia wynikający z tego progu dla wielu pacjentów. Porównano pięć sąsiednich i zbiorczych obszarów próbek glejaka wielopostaciowego (GBM) oraz zdrową tkankę mózgową pod kątem procentowego pokrycia białkiem specyficznym dla oligodendrocytów 1 (OSP1). Po opanowaniu metody, technika barwienia może zostać wykonana w cztery godziny pierwszego dnia i dwie godziny drugiego dnia, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uważnie monitorować intensywność barwienia tkanek oraz ich nawodnienie.

quantitative-immunohistochemistry-cellular-microenvironment-patient

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Núñez, F. J., et al. Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na zatopionych w parafinie kulturach neurosfery glejaka 3D. J. Vis. Exp. (2019). Ten film przedstawia immunohistochemiczną technikę znakowania biomarkerów nowotworowych w neurosferach guza mózgu zanurzonych w parafinie. Skrawki neurosfery poddawane są usuwaniu parafiny i nawadnianiu, a następnie leczeniu w celu odsłonięcia miejsc biomarkerów. Następnie stosuje się przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe w...

Barwienie immunohistochemiczne biomarkerów w skrawkach neurosfery guza mózgu

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Dysregulacja proteomiczna odgrywa ważną rolę w rozprzestrzenianiu się glejaków naciekających dynacyjnie, ale kilka istotnych białek pozostaje niezidentyfikowanych. Cyfrowe przetwarzanie przestrzenne (DSP) oferuje wydajne, wysokoprzepustowe podejście do charakteryzowania zróżnicowanej ekspresji białek kandydujących, które mogą przyczyniać się do inwazji i migracji glejaków naciekających.

Cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Protokół ten skutecznie przygotował wystarczającą ilość wysokiej jakości tkanki neowaskularnej z próbek glejaka za pomocą mikrodyssekcji laserowej do ilościowej analizy proteomicznej angiogenezy guza, przezwyciężając ograniczenia badań tradycyjnie koncentrujących się głównie na czynnikach angiogennych oraz dostarczając szeroko zakrojonego profilu proteomicznego angiogenezy glejaka.

Przygotowanie tkanek neowaskularnych z tkanek glejaka ludzkiego do ilościowej analizy proteomiki angiogenezy guza

Poznaj metodę ilościowej immunohistochemii chromogenowej do analizy mikrośrodowiska glejaka wielopostaciowego w tkankach pacjenta z wykorzystaniem ImageJ. Technika ta umożliwia określenie fizjologicznie istotnych proporcji komórek.

Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta

Przeglądaj więcej filmów