Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta
31 lipca 2017
Ten protokół został opracowany do ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i ImageJ.
Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowa identyfikacja składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i obrazu J. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrośrodowiska guza, takie jak to, jak te składniki wyglądają w próbkach pacjentów i jak możemy określić fizjologicznie istotne proporcje komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona prosta do analizy w próbkach pobranych od pacjentów. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku wyjaśnienia niedostatecznie scharakteryzowanego, złożonego mikrośrodowiska guza glejaka.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ czas rozwoju chromogennego musi być ściśle monitorowany, aby zapobiec nadmiernemu rozwojowi i nasyceniu tkanki. Rozpocznij protokół od wykonania prania określonych w dołączonym protokole tekstowym. Rozcieńczyć roztwór demaskujący antygen o wysokim pH na bazie tris i wodę destylowaną zgodnie z zaleceniami producenta.
Przejdź do pobierania antygenu za pośrednictwem ciepła, dodając rozcieńczony roztwór demaskujący do nieszczelnego naczynia nadającego się do kuchenki mikrofalowej. Umieść szkiełka w naczyniu. Następnie umieść szkiełka naczyniowe w kuchence mikrofalowej.
Następnie gotuj naczynie przez 20 minut na dużej mocy. Monitorować poziom cieczy pod kątem parowania i w razie potrzeby napełnić naczynie wodą destylowaną. Pozostawić próbki do ostygnięcia w roztworze przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Obrysować próbkę tkanki środkiem hydrofobowym, aby zminimalizować objętość odczynników niezbędnych do pokrycia próbki. Następnie wlej wystarczającą ilość roztworu przepuszczalnego, od 100 do 200 mikrolitrów, aby pokryć próbkę tkanki. Usunąć i wyrzucić roztwór, a następnie ponownie przykryć próbkę tkanki roztworem przepuszczalnym.
Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym przez jedną godzinę. Następnie inkubować próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym. Następnego dnia wykryj przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą odczynnika polimerowego peroksydazy chrzanowej odpowiadającego głównemu przeciwciału zwierzęcia gospodarza.
Wlej roztwór przepuszczalny w ilości wystarczającej do pokrycia próbki tkanki i inkubuj próbkę przez pięć minut. Usunąć i wyrzucić roztwór, a następnie przykryć próbkę tkanki roztworem do przepuszczalności jeszcze raz na pięć minut. Inkubować szkiełka w 0,3% nadtlenku wodoru i IX TBS przez 15 minut.
Rozwijać próbki za pomocą peroksydazy, diaminobenzydyny lub substratu do wcierania przez dwie do 10 minut, aż do uzyskania pożądanej intensywności barwienia. Przeciwbarwić próbki w celu identyfikacji jąder komórkowych, na przykład hematoksyliną, postępując zgodnie z protokołem producenta. Odwodnić próbki 100% etanolem i ksylenem.
Na koniec zamontuj próbki na stałe za pomocą nośników montażowych. Dwa obszary zainteresowania w naszych resekcjach guza, guz pierwotny luzem i sąsiednie regiony, składające się głównie ze zdrowej tkanki z rozproszonymi atakującymi komórkami rakowymi, zostały zidentyfikowane przez współpracującego neuropatologa na próbkach pacjentów barwionych hematoksyliną i eozyną. Immunohistochemia chromogenna zidentyfikowała dodatnie barwienie astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów w każdej próbce pacjenta.
Przeprowadziliśmy barwienie bez przeciwciał pierwszorzędowych w celu kontroli ujemnej. Producent zalecił dalsze rozcieńczenia przed ustaleniem rozcieńczenia od jednego do 200 ze względu na optymalne pozytywne barwienie ciała komórki i procesu z minimalizacją tła dla przeciwciała anty ALDH 1l1. Korzystając z obrazu J, określono ilościowo procentowe pokrycie barwienia oligodendrocytów OSP-1 dodatnim, aby ostatecznie porównać różnice w naszych regionach zainteresowania.
Po zastosowaniu odpowiedniego progu do obrazu można zmierzyć procentowe pokrycie od progu i porównać je dla wielu pacjentów. Pięć sąsiadujących i masywnych regionów próbek pacjentów z glejakiem lub GBM, wraz ze zdrową tkanką mózgową, porównano pod kątem specyficznego dla oligodendrocytów pokrycia białka jeden lub OSP1. Po opanowaniu techniki barwienia można ją wykonać w ciągu czterech godzin pierwszego dnia i dwóch godzin drugiego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym monitorowaniu intensywności barwienia i nawilżenia tkanek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu chromogennej immunohistologii i programu ImageJ. Technika ta ma na celu zapewnienie wglądu w złożone mikrośrodowisko guza glejakowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Onkologia
- Histologia
Tło
- Glioblastoma jest wysoce agresywnym guzem mózgu.
- Mikrosrodowisko guza odgrywa kluczową rolę w progresji guza.
- Zrozumienie składu tego środowiska jest niezbędne do opracowania ukierunkowanych terapii.
- Chromogenna immunohistologia pozwala na szczegółową wizualizację składników tkanki.
Cel badania
- Ilościowa ocena mikrośrodowiska guza w próbkach glejaka.
- Określenie fizjologicznie istotnych proporcji różnych typów komórek.
- Dostarczenie prostej metody analizy próbek pacjentów.
Stosowane metody
- Chromogenna immunohistologia do barwienia tkanek.
- Oprogramowanie ImageJ do analizy ilościowej.
- Protokoły płukania i odsłonięcia antygenów zgodnie z zaleceniami producenta.
- Dokładne monitorowanie czasu rozwoju chromogenu.
Główne wyniki
- Sukcesywne identyfikowanie różnych składników mikrośrodowiska guza.
- Ustanowienie metod określania proporcji komórek w próbkach glejaka.
- Wgląd w złożoność mikrośrodowiska glejaka.
- Wykazanie przydatności metody dla próbek pacjentów.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę badania mikrośrodowisk glejaka.
- Pomaga w zrozumieniu interakcji w mikrośrodowisku guza.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach, aby ulepszyć strategie leczenia glejaka.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of the tumor microenvironment in patient-derived glioblastoma samples enables mechanistic de-risking of glial cell targets in neuro-oncology drug discovery. By providing reproducible, region-specific measurements of astrocytes, microglia, and oligodendrocytes, this method supports target validation and phenotypic screening in disease-relevant systems. It enhances predictive confidence in preclinical models by linking microenvironment composition to therapeutic response and resistance mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial cell phenotypes and their functional states within heterogeneous tumor regions.
- Operational Value: Provides quantitative, image-based readouts for assessing target engagement and microenvironment modulation.
- Predictive Value: Supports biomarker-aligned target selection by correlating glial abundance with pathological gradients in patient samples.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized immunohistochemistry protocols compatible with high-throughput imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Delivers percent coverage metrics via ImageJ that enable inter-sample and inter-region comparisons.
- Reproducibility: Defines critical timing controls for chromogenic development to ensure signal specificity and minimize background noise.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses actual patient resection samples to maintain pathophysiological fidelity in target validation studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical models by defining quantitative benchmarks for glial cell composition.
- Risk Mitigation: Reduces biological de-risking uncertainty in glial-targeted therapies by characterizing microenvironmental context.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for neuro-oncology programs focused on microenvironment modulation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by enabling spatial and quantitative profiling of glial populations in human tissue.
- Screening: Generates standardized, quantifiable staining patterns that can be used to evaluate compound effects on microenvironmental composition.
- Analytics: Provides threshold-based percent coverage measurements that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by linking glial cell densities to histopathological regions of interest.
- Enterprise Reuse: Establishes a transferable IHC/ImageJ workflow applicable across glioma and other CNS tumor models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence through quantitative, spatially resolved glial cell analysis in patient samples.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized antigen retrieval, blocking, and development timing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing ambiguity in target microenvironment interactions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of glial-modulating therapeutics based on microenvironmental engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry and neuropathological sample handling.
- Dependent on optimized chromogenic development timing to avoid signal saturation.
- Necessitates standardized ImageJ thresholding protocols for consistent quantification.
- Requires access to patient-derived glioblastoma resection samples with annotated regions of interest.
- Limited by tissue heterogeneity and the need for region-specific analysis to avoid confounding signals.
