Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne uwięzienie obrazowej przejściowości wapnia w męskich neuronach głowy C.Elegans po ekspozycji na feromony. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak zrozumienie regulacji obwodów nerwowych specyficznej dla płci. Główną zaletą tej techniki jest to, że samce C.Elegans mogą być teraz skutecznie obrazowane w mikroprzepływowym urządzeniu pułapkowym.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ ładowanie zwierząt może być na początku trudne, a feromony biogenne nie wywołują przejściowości wapnia u każdego zwierzęcia. Aby rozpocząć montaż zbiorników, przygotuj trzy zestawy rurek, wkładając igłę do jednego końca i metalową rurkę do drugiego. Następnie dla każdego zbiornika weź trójdrogowy zawór luer i podłącz 30-mililitrową strzykawkę z usuniętym tłokiem, trzymililitrową strzykawkę i rurkę.

Napełnić każdy zbiornik odpowiednim buforem, bodźcem podstawowym S lub podstawowym S zawierającym fluorescynę. Następnie usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza zarówno ze zbiornika, jak i z rurki, przesuwając strzykawkę. Teraz napełnij nową trzymililitrową strzykawkę i rurkę S baseal i włóż do portu wylotowego urządzenia mikroprzepływowego.

Delikatnie lekko docisnąć strzykawkę, aż bufor pojawi się na powierzchni otworów wlotowych. Następnie podłącz rurki sterowania przepływem, bufora i zbiornika bodźca do odpowiednich otworów wlotowych, upewniając się, że krople cieczy są obecne zarówno w otworze portu ładowania, jak i w rurce, która ma być podłączona. Teraz delikatnie dociśnij nieco mocniej strzykawkę, aż kropelki pojawią się we wlocie portu ładowania ślimaka, a następnie włóż solidny kołek blokujący do tego portu.

Następnie wyjmij strzykawkę z portu wylotowego i podłącz przewód wylotowy podłączony do domu próżni. Teraz sprawdź, czy w urządzeniu nie ma pęcherzyków w kanałach pływakowych w obrazie wideo z mikroskopu. Kliknij na żywo, aby obserwować obraz na żywo i poczekaj, aż bąbelki naturalnie się rozproszą, zanim przejdziesz dalej.

Następnie włącz fluorescencyjne źródło światła i użyj filtra GFP, aby potwierdzić prawidłową dynamikę przepływu. Uruchom zawór trójfalowy i obserwuj, jak strumień sterowania fluorescencyjnego pojawia się w paszy wideo, gdy zawór jest otwarty. Na początek wybierz jednego robaka na nieobsianą płytkę agarową NGM i pozwól robakowi się odczołgać.

Następnie przełóż płytkę z S basal. Pobrać roztwór zawierający robaka do strzykawki. Teraz w urządzeniu wyłącz podciśnienie, aby zatrzymać przepływ za pomocą wylotowego zaworu luer.

Następnie usuń solidny kołek, który blokuje port ładowania ślimaka. Włóż rurkę zawierającą robaki do portu ładowania. Otwórz wylotowy zawór luer i obserwuj obraz wideo na żywo.

Teraz delikatnie dociśnij strzykawkę, aż pojawi się robak. Odciągnij robaka do tyłu, jeśli najpierw wejdzie w ogon, musi najpierw wejść głową, aby był wystawiony na bodziec. Użytkownik musi odciągnąć robaka do tyłu, zanim ogon całkowicie wejdzie do kanału, w przeciwnym razie wydostanie robaka z kanału jest niezwykle trudne i zwykle wymaga całkowitego przepłukania robaka przez kanał i załadowania nowego robaka.

Teraz, używając nacisku strzykawki, przesuń robaka przez kanał i ustaw głowę robaka tak, aby była wystawiona na przepływ buforowy, ale nie tak daleko w głąb kanału, aby mogła się swobodnie poruszać. U zwierząt niesparaliżowanych spodziewany jest niewielki ruch osiowy lub obrotowy. Chociaż dodanie paralityka do prawie eliminuje ten efekt.

Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo ruchu podczas próby, użyj starszych samców, które są skuteczniej uwięzione, zmniejsz szerokość lub grubość portu ładowania robaków lub zwiększ ilość czasu spędzonego w paralityce. Użyj oprogramowania do wykonywania nagrań z wykorzystaniem wzbudzenia światłem niebieskim. Ustaw ekspozycję na 100 milisekund, otwórz okno akwizycji obrazu, ustaw punkty czasowe na 300 z interwałem na zero, a następnie rozpocznij akwizycję obrazu.

Po pięciu sekundach zastosuj bodziec, zmieniając zawór trójdrogowy sterujący. 10-sekundowa stymulacja jest dobrym punktem wyjścia, a długość bodźca można dostosować w zależności od potrzeb. Po stymulacji przełącz przepływ z powrotem, ponownie naciskając przycisk i kontynuuj nagrywanie, aż 30-sekundowy film zostanie zakończony.

Pozwala to na powrót fluorescencji obozu g do linii podstawowej. Teraz pozwól preparatowi odpocząć przez 30 sekund przed następną próbą. Robaki wyrażające obóz g trzeci w neuronie niewrażliwym, ASH, reagują na jeden molowy glicerol z widocznymi zmianami we fluorescencji w obrębie neuronu ASH, co wskazuje na aktywność neuronalną.

Neuron powinien pozostać w obszarze analizy przez cały film, w przeciwnym razie może wystąpić artefakt ruchowy. Jeśli tak, przesuń obszar analizy dla tych punktów czasowych i scal wartości intensywności, aby utworzyć pojedynczy ślad. Mężczyźni, którzy są stymulowani atrakcyjnym feromonem biogennym askarozydem trzy podczas ekspozycji, mierzono przejściowość wapnia w czterech neuronach CEM.

Od zwierzęcia do zwierzęcia i od neuronu do neuronu, ślady różniły się kształtem, znakiem i wielkością. Dlatego bardzo ważne jest, aby podczas badania reakcji feromonów analizować wiele zwierząt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak załadować samca C elegans do urządzenia mikroprzepływowego i przeanalizować przejściowość wapnia w neuronach głowy.

Ten sam proces można zastosować w przypadku hermafrodytów, aby zidentyfikować specyficzne dla sekundy różnice w odpowiedziach neuronalnych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pół godziny dla pierwszego sfotografowanego zwierzęcia. Po pierwszym nagraniu nowe zwierzę może zostać załadowane na obraz w ciągu około 10 minut.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak optogenetyka, mogą być połączone z tym protokołem, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób regulowane są obwody nerwowe.