Doppler laserowy: narzędzie do pomiaru mikrokrążenia naczynia krwionośnego wysp trzustkowych in vivo

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie stanu funkcjonalnego wazomotoryki mikrokrążenia wysepek trzustkowych in vivo w celu oceny jej wpływu na powiązane choroby. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie krążenia medycznego, takie jak to, czy wazomotoryka mikrokrążenia wysepek trzustkowych ulega zmianie w stanie patologicznym. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po wykazaniu istnienia funkcjonalnego krążenia w obrębie mechanizmów, które ewoluowały podczas rozwoju cukrzycy.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość oceny stanu funkcjonalnego wazomotoryki mikro naczyniowej tkanek i narządów zarówno w warunkach klinicznych, jak i laboratoryjnych. Metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w choroby związane z wysepkami trzustkowymi. Można ją również zastosować w innych układach, takich jak choroby mikro naczyniowe związane z nerkami i siatkówką oka.

Zastosowania tej techniki obejmują również zrozumienie natury trendów w stanie czynnościowym wazomotoryki naczyniowej mikrokrążenia. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą napotykać trudności ze względu na ogromną ilość danych akademickich dotyczących mikrokrążenia, pozyskanych za pomocą laserowego dopplerowskiego pomiaru przepływu podczas eksperymentów. Należy pamiętać, że demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ wiele czynników może negatywnie wpływać na dokładność gromadzenia danych o mikrokrążeniu.

Protokół ten rozpoczyna się od codziennego wstrzykiwania myszom STZ przez pięć kolejnych dni. Rozpuścić STZ w buforze cytrynianu sodu do stężenia roboczego 5 mg/ml. Następnie wykonać zastrzyki dosytrycznowe za pomocą strzykawki o objętości 1 ml i igły o rozmiarze 25 G.

Myszy muszą być na czczo przez cztery godziny przed wstrzyknięciem, jednak dostęp do wody nie powinien być ograniczony. Myszom z grupy kontrolnej wstrzyknąć taką samą objętość czystego buforu cytrynianowo-sodowego. Po wstrzyknięciach zapewnić myszom dostęp do zwykłej karmy oraz wody z 10% sacharozą.

Po piątym dniu wstrzykiwań STZ zastąpić wodę z 10% sacharozą zwykłą wodą. Dziewięć dni później przeprowadzić pomiar glikemii. Najpierw poddać myszy sześciogodzinnej głodówce, zapewniając im swobodny dostęp do wody.

Następnie pobierz krew z żył ogonowych i użyj standardowego glukometru ręcznego do pomiaru poziomu glukozy we krwi. Myszy z poziomem glukozy we krwi powyżej 200 mg/dL uznaj za cukrzycowe. Przed użyciem aparatury laserowej dopplerowskiej najpierw oczyść powierzchnie optyczne końcówki sondy i złącza sondy miękką, nieścierną ściereczką, a następnie podłącz kabel do portu urządzenia.

Następnie należy zmontować statyw kalibracyjny. Najpierw należy pozwolić, aby przechowywany wzorzec strumienia osiągnął temperaturę pokojową. Zajmuje to około pół godziny.

Następnie delikatnie wstrząśnij wzorcem strumienia przez 10 sekund i pozostaw go na podstawie kalibracyjnej na dwie minuty. Następnie podnieś zacisk tak wysoko, jak to możliwe, i zamocuj w nim sondę. Teraz powoli zanurz sondę we wzorcu strumienia i zabezpiecz ją za pomocą uchwytów do sondy.

Aby kontynuować, przyciemnij światła w pomieszczeniu i naciśnij przycisk kalibracji w aparaturze dopplerowskiej laserowej. Następnie wybierz kanał roboczy, do którego podłączona jest sonda, i uruchom program kalibracyjny. Umieść znieczuloną mysz w pozycji grzbietnej na platformie roboczej i przymocuj ją za pomocą taśmy chirurgicznej.

Następnie należy zdezynfekować skórę brzucha 75% ethanol, przecierając obszar od okolicy szyjnej aż do ogona, a następnie osłonić obwód tego regionu suchym gazikiem z otworem o szerokości 3 cm w centrum. Następnie należy unieść skórę brzucha pęsetą i wykonać wstępne cięcie pionowe wzdłuż linii środkowej brzucha, używając skalpela lub nożyczek do skóry. Następnie należy uchwycić leżący pod nią mięsień pęsetą i przeciąć go, aby dostać się do jamy brzusznej.

Należy unikać uszkodzenia narządów. Aby odsłonić jamę brzuszną, złóż skórę oraz znajdujący się pod nią mięsień w stronę klatki piersiowej, a następnie delikatnie odsłoń trzustkę (część trzonową) i śledzionę, używając pęsety tępym końcem. Następnie w oprogramowaniu sterującym aparaturą do laserowej dopplerometrii utwórz nowy plik pomiarowy, a potem skonfiguruj podłączone monitory.

W zakładce ogólnej (general) ustaw czas trwania monitorowania na bieg swobodny (free run), a w zakładce monitora LDF pozostaw ustawienia fabryczne. Następnie otwórz okno dialogowe konfiguracji wyświetlania i wybierz odpowiednie kanały. Następnie przełącz następujące parametry: źródło danych dla kanału i etykietę, jednostki oraz kolor, a następnie kliknij dalej.

Następnie w oknie dialogowym informacji o pliku wprowadź dane identyfikacyjne obiektu i pomiaru, a następnie przejdź dalej, klikając ponownie przycisk „next”. Konfiguracja została zakończona i pojawi się okno pomiarowe. Teraz ręcznie przesuń elektrodę na odległość mniejszą niż jeden milimetr od trzustki.

Dokładność pomiaru zależy od odległości między sondą a tkanką wysepek trzustkowych. Odczyt przepływu krwi będzie niedokładny, jeśli nie zostanie starannie zachowany odstęp jednego milimetra między tkankami a sondą. Aby rozpocząć rejestrację, kliknij ikonę startu, po czym rozpocznie się zapisywanie danych PU przepływu krwi w naczyniach mikrokrwionośnych.

Wykonuj tę czynność przez pełną minutę, korzystając z przycisków kompresowania i rozwijania wyświetlacza oraz przycisków zwiększania lub zmniejszania wysokości śladów wykresu, aby dostosować wyświetlany efekt podczas rejestracji, a następnie zatrzymaj nagrywanie. Następnie zapisz plik pod odpowiednią nazwą. Teraz ręcznie przesuń sondę, aby uniknąć efektów addytywnych oraz lokalnego wyczerpania zdolności skurczowej i rozkurczowej.

Łącznie należy zebrać dane PU z trzech losowych punktów na trzustce dla każdej myszy. W pewnym momencie eksperymentu należy zmierzyć dane PU z płytki nierefleksyjnej, aby uzyskać baseline’ową wartość kontrolną. Po wykonaniu trzech pomiarów należy użyć szwów 3-0 do zamknięcia warstw mięśni, a następnie szwów 4-0 do zamknięcia warstwy skóry.

Obserwuj teraz mysz w klatce rekonwalescencyjnej, aż będzie gotowa do przeniesienia do czystej klatki domowej. Zazwyczaj stan mikrokrążenia wysepki trzustkowej objawia się okresowymi fazami skurczu i rozkurczu. Całościowe zjawiska hemodynamiczne tworzą wzorzec perfuzji przepływu krwi.

Przy użyciu aparatury do lasernej dopplerometrii zebrano dane PU, aby przedstawić wzorzec rozkładu perfuzji krwi w naczyniach mikrokrążenia u myszy niediabetycznych i cukrzycowych. Wyniki były całkowicie odmienne. Rytm skurczów i rozkurczów wazomotoryki mikrokrążenia wysepek trzustkowych był chaotyczny i nieregularny u myszy z cukrzycą indukowaną STZ, podczas gdy w grupie kontrolnej (myszy niediabetyczne) obserwowano rytmiczne oscylacje.

Następnie, za pomocą profili PU ilościowo określono wazomotorykę. W porównaniu z grupą kontrolną, średnia perfuzja krwi w mikrokrążeniu wysepek trzustkowych była zmniejszona u myszy z cukrzycą indukowaną STZ. U myszy tych odnotowano również istotne zmniejszenie amplitudy i częstotliwości tej wazomotoryki, a także względnej prędkości perfuzji krwi w wysepkach trzustkowych.

Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje 30 minut. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że odległość między sondą a tkanką trzustki nie przekracza jednego milimetra. Niewłaściwa odległość prowadzi do sztucznie zawyżonego lub zaniżonego odczytu przepływu krwi.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak laserowy obraz speckle oraz translokacja tlenu, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, m.in. dotyczące wizualizacji niedokrwienia, oceny przepływu krwi oraz oceny stanu funkcjonalnego ruchomości naczyń mikrokrążenia. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom i klinicystom z zakresu endokrynologii i metabolizmu do badania mechanizmów mikrokrążenia leżących u podstaw chorób związanych z wysepkami trzustkowymi. Należy pamiętać, że praca z urządzeniami laserowymi może być niezwykle niebezpieczna ze względu na ekspozycję na promieniowanie; podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak zachowanie odległości co najmniej 200 millimeter od oka do źródła promieniowania.