Name: Zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę oceny wpływu wysokiego stężenia soli i asymetrii roztworu na stany fazowe błon w modelowych pęcherzykach GUV. Technika mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia badanie właściwości błon komórkowych w warunkach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częścią konsorcjum MaxSynBio, które jest wspólnie finansowane przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych Niemiec oraz Towarzystwo Maxa Plancka.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Skuteczna produkcja GUV w celu obserwacji stanu fazowego w symetrycznych i asymetrycznych warunkach wysokiego zasolenia
Protokoły przedstawione w niniejszej pracy wprowadzają strategię oceny wpływu buforu o wysokim zasoleniu oraz asymetrii roztworów na stan fazowy błony naładowanych GUV w szerokim zakresie składów. Jednym z głównych wyzwań w dążeniu do osiągnięcia tego celu była produkcja naładowanych GUV w buforach o wysokim zasoleniu.
Z powodzeniem otrzymaliśmy GUV w roztworze sacharozy oraz w buforze o wysokim zasoleniu, stosując prostą metodę spontanicznego pęcznienia, która obejmuje etap wstępnej hydratacji osadzonego filmu lipidowego oraz nocny etap końcowej hydratacji w celu wzrostu pęcherzyków. Należy zaznaczyć, że osadzanie lipidów powinno być przeprowadzane na chropowatej płytce z PTFE, aby zapewnić równomierne rozprzestrzenianie się lipidów i uzyskanie pęcherzyków jednowarstwowych. Ponadto niezbędne jest, aby każdy etap przygotowania pęcherzyków odbywał się w temperaturze, w której film lipidowy znajduje się w jednorodnym i płynnym stanie fazowym. W przeciwnym razie populacja pęcherzyków może być polidyspersyjna pod względem składu, co może zafałszować końcową analizę stanu fazowego populacji. Specyficzny protokół spontanicznego pęcznienia GUV prowadzi do powstania agregatu pęcherzyków, co z jednej strony umożliwia jego resuspensję w małych objętościach w celu uzyskania wysoko skoncentrowanych dyspersji pęcherzyków, a z drugiej strony zapewnia asymetryczne warunki roztworu po obu stronach błony, minimalizując jednocześnie rozcieńczenie pęcherzyków8,28. Kluczowe jest, aby podczas rozcieńczania pęcherzyków lub wymiany roztworu zewnętrznego osmolarity wewnątrz i na zewnątrz pozostały dopasowane, ponieważ zmiany morfologiczne spowodowane niedopasowaniem osmolarity mogą indukować lub zapobiegać separacji faz Lo+Ld41 lub, w przypadku warunków hipotonicznych, mogą prowadzić do pękania pęcherzyków.
W tym przypadku próby optymalizacji protokołów elektroformowania w roztworze o wysokim zasoleniu nie doprowadziły do powstania GUV, natomiast pęcznienie wspomagane PVA zaowocowało utworzeniem pęcherzyków wielowarstwowych. Mimo że wymaga to dłuższego czasu przygotowania i skutkuje partiami pęcherzyków o niższej jakości10,17, pomyślna produkcja pęcherzyków naładowanych poprzez pęcznienie spontaniczne wiąże się z dodatkowymi zaletami. Wymaga ona minimalnego nakładu pracy, zapewniając jednocześnie wydajność wystarczającą do statystycznych analiz partii i, w przeciwieństwie do elektroformowania, nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani optymalizacji. Ponadto nie zaobserwowano zanieczyszczeń wynikających z utleniania lipidów42,43. Według literatury nie ma różnic między składem lipidowym pęcherzyków a odpowiadającymi im roztworami stokowymi, z których zostały one wytworzone7,17. Co więcej, tworzenie pęcherzyków na podłożu PTFE nie powoduje wprowadzenia żadnych zanieczyszczeń, w przeciwieństwie do metod pęcznienia wspomaganego żelem, gdzie podłoże może wprowadzać obce cząsteczki23. Elektroformowanie wiąże się z dalszymi wadami związanymi z nadmiernym rozcieńczeniem pęcherzyków podczas tworzenia asymetrycznych warunków roztworu. GUV wytworzone przez elektroformowanie występują zazwyczaj jako dyspersja homogeniczna (w przeciwieństwie do silnie skoncentrowanej zawiesiny pęcherzyków w formie grudki tworzącej się podczas pęcznienia spontanicznego). Jakiekolwiek rozcieńczenie roztworu zewnętrznego spowodowałoby również znaczne zmniejszenie liczby pęcherzyków. Ponadto w toku niniejszej pracy zaobserwowano, że GUV DOPG/eSM/Chol wytworzone przez elektroformowanie w sacharozie stawały się niestabilne po rozcieńczeniu w buforze o wysokim zasoleniu. Fluorescencja z plam lipidowych na szkiełku mikroskopowym wskazywała, że pęcherzyki pękały przed możliwością ich wizualnej inspekcji. Taką niestabilność można przypisać podwyższonemu napięciu błon pęcherzyków przygotowanych metodą elektroformowania w porównaniu do tych otrzymanych w wyniku pęcznienia spontanicznego10.
Choć rozcieńczanie pęcherzyków jest łatwym i szybkim sposobem na stworzenie asymetrycznych warunków roztworu GUV, pozwala ono jedynie na częściową wymianę roztworu zewnętrznego, mimo że w wysokim stopniu (tutaj: 95 %, Rysunek 2), ponieważ po rozcieńczeniu pozostaną śladowe ilości roztworu pęczniejącego. Wybór stopnia wymiany roztworu zewnętrznego jest kompromisem między pobraniem pipetą skupiska pęcherzyków wraz z roztworem pęczniejącym (sekcja 2) a uniknięciem zbyt dużego rozcieńczenia. W związku z tym wprowadziliśmy alternatywne podejście mikrofluidyczne, szczegółowo omówione w innym opracowaniu37, które umożliwia szybką i całkowitą wymianę roztworu zewnętrznego podczas obserwacji stanu fazowego GUV w celu weryfikacji obserwacji stanu fazowego przeprowadzonych dla pęcherzyków rozcieńczonych. Stwierdzono, że obserwacje zmian stanu fazowego przy przejściu z symetrycznych na asymetryczne warunki roztworu są zgodne. Ponadto obie zaprezentowane tutaj metody generowania asymetrycznych warunków roztworu są porównywalnie szybkie (por. Ref.8) i nie wiążą się z żadnym znanym ryzykiem lokalnych zmian składu (por. referencje30,31), zwiększenia napięcia błony (por. referencję32) czy lokalnego nagrzewania (por. referencję33), co ma miejsce w przypadku alternatywnych metod omówionych we Wstępie. Podczas pułapkowania mikrofluidycznego równowaga osmotyczna między wnętrzem a zewnętrzem pęcherzyka jest niezbędna nie tylko w celu uniknięcia wspomnianych wyżej artefaktów stanu fazowego, ale także dlatego, że deflacja spowodowana hipertonicznymi warunkami roztworu może spowodować wysunięcie się uwięzionych GUV spoza filarów po wymianie roztworu zewnętrznego.
Mimo że metodę spontanicznego pęcznienia z powodzeniem zastosowano do hodowli nienaładowanych pęcherzyków z układu DOPC/eSM/Chol, w innych przypadkach brak ładunków może upośledzać pęcznienie GUV ze względu na wynikający z tego brak odpychania między poszczególnymi dwuwarstwami44. Przedłużenie okresu wstępnego pęcznienia lub wprowadzenie objętościowych grup polarnych lipidów może przeciwdziałać temu problemowi45. Ponadto stabilność pęcherzyków po ich rozcieńczeniu w roztworach innych niż ten użyty do pęcznienia może być różna dla różnych składów lipidowych i mediów rozcieńczających, czego w niniejszej pracy nie badaliśmy. Nie zbadaliśmy również możliwości regulowania średnicy GUV za pomocą przedstawionej tutaj metody przygotowania. Prawdopodobnie jednak parametry takie jak skład pęcherzyków i roztwór pęczniejący wpływają na wyniki. Zastosowanie alternatywnych metod46 może przynieść większe pęcherzyki dla lipidów i roztworów użytych w tej pracy, jednak mogą one wiązać się z innymi wadami charakterystycznymi dla danej metody. Opisane powyżej podejście do wytwarzania GUV w symetrycznych i asymetrycznych warunkach wysokiego zasolenia stanowi potencjalne narzędzie do dalszych badań nad pęcherzykami o różnych składach lipidowych, rozproszonymi w różnych mediach. Ponieważ nie zbadaliśmy tych możliwości, przyszłe próby wykażą, w jakim stopniu metody przygotowania i rozcieńczania GUV mogą być stosowane w sposób ogólny.
Obserwacja separacji faz w różnych temperaturach
Istnieją różne konfiguracje eksperymentalne odpowiednie do badania GUV w zmiennych temperaturach. Chociaż układy te nie są zazwyczaj szczegółowo opisywane w literaturze, niniejsza praca przedstawia podstawowy zestaw możliwy do zastosowania w takich badaniach.
Pomiary kontrolne wykazują, że temperatura w tej zaprojektowanej i zbudowanej wewnętrznie komorze jest precyzyjnie kontrolowana przez termostat, a gradienty temperatury wewnątrz komory mieszczą się w granicach eksperymentalnej rozdzielczości temperatury. Zapewniono, że eksperymentalne warunki termiczne są zgodne z odczytem termostatu.
Podczas oceny stanów fazowych GUV w szerokim zakresie temperatur ważne jest, aby obserwowane pęcherzyki były dobrze zrównoważone po zmianie temperatury. Jednym ze sposobów zapewnienia tego jest sprawdzenie występowania histerezy. Jeśli występuje histereza, należy zmniejszyć kroki temperatury i/lub wydłużyć czas równoważenia. Ponieważ kontrola temperatury w niniejszej pracy jest realizowana za pomocą termostatu wodnego, zakres temperatur roboczych jest idealnie ograniczony do 0 - 100 °C. Zakres ten można rozszerzyć, stosując inne ciecze do kontroli temperatury, takie jak olej, lub wykorzystując inne układy, np. element Peltiera. W praktyce temperatura robocza jest również ograniczona przez możliwość kondensacji lub odparowania. Ponadto w temperaturach znacznie odbiegających od temperatury pokojowej bardziej prawdopodobne staje się wystąpienie stacjonarnego gradientu temperatury w całej komorze obserwacyjnej. Co więcej, sprzęt obrazujący może ulec uszkodzeniu w ekstremalnych temperaturach. W typowych zakresach temperatur odpowiednich dla badań pęcherzyków lipidowych (~10 - 50 °C7,9) należy wziąć pod uwagę ryzyko uszkodzenia sprzętu obserwacyjnego, choć zazwyczaj nie jest ono spodziewane.
Artefakty obserwacji domen pęcherzykowych
W szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej istnieje szereg źródeł artefaktów obserwacyjnych. Przede wszystkim należy mieć świadomość, że maksymalna rozdzielczość r obiektu poddanego inspekcji wizualnej w celu określenia stanów fazowych pęcherzyków wyznacza granicę detekcji domen lipidowych zgodnie z równaniem: 
<img alt="Równanie granicy rozdzielczości: r=0.61λ/NA, stosowane w mikroskopii do wyznaczania optycznej zdolności rozdzielczej." src="/files/ftp_upload/56034/56034eq2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
gdzie λ to długość fali emisji, a NA to apertura numeryczna obiektywu. Typowy obiektyw z powiększeniem 40x i NA wynoszącym 0.6, który wykrywa zielone światło emisji o długości około 560 nm, osiągnąłby rozdzielczość optyczną ~0.6 µm. Zatem badania porównujące stany fazowe pęcherzyków wykonanych z konkretnych mieszanin lipidów w różnych warunkach powinny wykorzystywać ten sam obiektyw dla tej samej mieszaniny lipidów.
Kolejnym artefaktem jest powstawanie domen lipidowych w wyniku fotoutleniania lipidów spowodowanego przedłużoną ekspozycją na światło wzbudzenia41. Fotouszkodzenia występują preferencyjnie w nienasyconych węglowodorowych fragmentach lipidów. W rzeczywistości, dla niektórych składów lipidowych, w początkowo jednorodnych pęcherzykach zaobserwowano tutaj tworzenie się takich domen po przedłużonym czasie ekspozycji na światło wzbudzenia (~30 s). Aby przeciwdziałać temu problemowi, światło wzbudzenia było skupione na jednym polu widzenia tylko przez kilka sekund w celu oceny stanu fazowego. Z tego względu DiIC18 był odpowiedni do naszych celów. Inne barwniki mogą być jednak znacznie bardziej wrażliwe i mogą wymagać pracy przy niższych intensywnościach wzbudzenia oraz krótszych czasach ekspozycji na światło wzbudzenia.
Mechaniczne naprężenie ścinające powstające podczas przenoszenia pęcherzyków pipetą może tymczasowo mieszać domeny, zniekształcając tym samym pozorny przebieg przemian fazowych pęcherzyków. W przypadku niektórych partii różne pęcherzyki wykazywały odmienne zachowania fazowe w 0 min i 5 min po przeniesieniu pipetą na szkiełko podstawowe mikroskopu. Wykazano również, że naprężenie ścinające wywołane przepływem cieczy w urządzeniu mikrofluidycznym prowadzi do mieszania domen47. Przed obserwacją pęcherzyki powinny pozostać w spoczynku przez wystarczający czas w celu osiągnięcia stanu równowagi. W niniejszym badaniu pęcherzyki uwięzione w urządzeniu mikrofluidycznym pozostawiono w spoczynku na 1 h po załadowaniu pęcherzyków i wymianie roztworów przed przystąpieniem do obserwacji.
Aby uniknąć niektórych z wyżej wymienionych trudności, a także ograniczeń wynikających z limitu dyfrakcji światła, można zastosować alternatywne metody, takie jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego48 lub techniki mikroskopii superrozdzielczej49.
Podsumowanie i perspektywy
Przedstawiona praca demonstruje zestaw metod pozwalających na analizę wpływu warunków roztworów symetrycznych i asymetrycznych o wysokim zasoleniu na separację faz membran. Wszystkie zaprezentowane metody nadają się do innych zastosowań. Urządzenie mikrofluidyczne stanowi na przykład platformę do badania kinetyki tworzenia się i znikania domen po indukcji asymetrii roztworu. W ten sposób można również zbadać pojawianie się domen w funkcji stężenia soli. Wszystkie metody mogą być ponadto wykorzystane do analizy wpływu na zachowanie fazowe przy użyciu dowolnych innych interesujących roztworów.

Od czasu obserwacji domen o rozmiarach mikronów w oddzielonych fazami ciekły-ciecz gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, GUV były używane jako system modelowy do badania hipotezy tratwy lipidowej1,2,3. Ponieważ obszar ich wolnostojącej dwuwarstwy leży w zasięgu komórek biologicznych, są one odpowiednimi naśladowcami błon plazmatycznych z hipotetycznymi tratwami. Liczne badania nad takimi GUV przeprowadzono z pęcherzykami rozproszonymi w czystej wodzie, sacharozie lub roztworach o niskim zasoleniu4,5,6,7,8. Warunki te nie odzwierciedlają jednak fizjologicznie istotnego narażenia błon biologicznych na środowisko o wysokim zasoleniu i asymetrii roztworu transbłonowego, tak jak ma to miejsce w przypadku komórek.
W tej pracy i w poprzedniej publikacji z naszej grupy9, stany fazowe naładowanych wieloskładnikowych GUV zostały zbadane jako funkcja obecności soli i asymetrii roztworu w poprzek membrany. GUV przygotowano z mieszanin dioleoilofosfatydyloglicerolu (DOPG), sfingomieliny jaj (eSM) i cholesterolu (Chol) w roztworze sacharozy (o osmolarności 210 mOsm/kg) lub buforze o wysokim zasoleniu (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 210 mOsm/kg). Wybór lipidów był uzasadniony danymi uzyskanymi już na schemacie fazowym tej mieszaniny6,8.
W literaturze dostępnych jest wiele metod przygotowania GUVów10,11,12 (zauważ, że tutaj nie będziemy rozważać tych obejmujących transfer lipidów z fazy olejowej do fazy wodnej13,14 ze względu na nieodłączne niebezpieczeństwo pozostałości oleju w membranie, które mogą wpływać na zachowanie fazowe). Przygotowanie GUV w buforze o wysokim zasoleniu wiąże się ze szczególnymi wyzwaniami. W przypadku roztworów o niskiej sile jonowej metoda elektroformacji15,16 przedstawia szybki sposób przygotowania GUV o wysokiej wydajności z niewielkimi wadami10,17. Metoda opiera się na osadzaniu warstwy lipidów na powierzchni przewodzącej (elektrodzie), suszeniu ich i nawilżaniu roztworem wodnym przy jednoczesnym zastosowaniu pola prądu przemiennego. Jednak ta metoda wymaga korekt, jeśli w roztworze wodnym znajduje się sól18,19. Zakłada się, że siłą napędową wzrostu pęcherzyków przez elektroformację jest elektroosmoza16, która jest utrudniona przy wysokich przewodnościach20. W związku z tym pęcznienie elektryczne GUV w roztworach o wysokim zasoleniu nie jest prostym podejściem, ponieważ wymaga optymalizacji pod kątem różnych stężeń soli obecnych w roztworze pęczniejącym. Pęcznienie pęcherzyków wspomagane żelem21,22 to potencjalna alternatywa dla elektroformacji o jeszcze szybszym czasie powstawania. Podejście to opiera się na zwiększonym uwodnieniu filmu lipidowego, gdy jako substrat stosuje się żel (agarozę lub alkohol poliwinylowy (PVA)). Podejścia te wiążą się jednak z ryzykiem zanieczyszczenia membrany w przypadku pęcznienia na bazie agarozy23 i/lub limitów temperatury, jak w przypadku pęcznienia na bazie PVA. Podobnie, niedawno ustanowiono protokół uprawy GUV na podłożu z papieru celulozowego24. Ogólnym problemem tej metody jest brak kontroli nad czystością substratu, a także stosowanie dużych ilości lipidów. W tej pracy przedstawimy i przedstawimy zalety najbardziej tradycyjnej metody przygotowania GUV, a mianowicie metody spontanicznego pęcznienia25,26. Polega ona na wysuszeniu warstwy lipidowej na podłożu lipofobicznym, uwodnieniu jej w atmosferze pary wodnej, a następnie pęcznieniu w pożądanym roztworze pęczniejącym (patrz Rysunek 1 i szczegóły w sekcji Protokół). Metoda ta nie zapewnia kontroli nad rozkładem wielkości pęcherzyków i skutkuje ogólnie mniejszymi pęcherzykami w porównaniu z metodami, w których produkcja jest wspomagana przez pole elektryczne, podłoże polimerowe lub środki mikroprzepływowe. Jednak jakość i rozmiar pęcherzyków jest odpowiedni do badania stanu fazy błonowej, jak opisano tutaj.
Tworzenie asymetrii między roztworami w poprzek błony pęcherzykowej wiąże się również z pewnymi wyzwaniami. Jednym z powszechnie stosowanych podejść jest bezpośrednie rozcieńczenie zawiesiny pęcherzyków w pożądanym roztworze zewnętrznym27,28. Jednak zmniejsza to również gęstość rozmieszczenia pęcherzyków. Inną strategią jest powolna wymiana roztworu zewnętrznego wokół GUV osadzonych na dnie komory przepływowej, która umożliwia dopływ i odpływ roztworu. Aby uniknąć zakłócenia lub nawet utraty pęcherzyków wraz z przepływem, stosuje się niskie natężenia przepływu8, co sprawia, że takie podejście jest nieefektywne czasowo. Co więcej, żadne z tych podejść nie gwarantuje pełnej wymiany rozwiązań zewnętrznych. Oczywistym rozwiązaniem jest unieruchomienie pęcherzyków, aby uniknąć ich utraty podczas zewnętrznej wymiany roztworu. Na przykład, biotynylowane GUV mogą być przywiązane do powierzchni pokrytej streptawidyną29. Jednak takie podejście może prowadzić do różnic w składzie na przylegających, a tym samym nieprzylegających segmentach membrany30,31. Zastosowanie pól magnetycznych lub elektrycznych do wychwytywania pęcherzyków powoduje nałożenie napięcia błony32. Użycie pęsety optycznej do uwięzienia pęcherzyka wymaga dołączenia uchwytu (tj. koralika), podczas gdy użycie napinacza optycznego może wiązać się z miejscowym ogrzewaniem33. Pułapkowanie GUV można również osiągnąć poprzez hodowanie ich na drutach platynowych bez końcowego odłączania34. W ten sposób powstają pęcherzyki, które nie są izolowane i które są zwykle połączone z drutami lub innymi pęcherzykami za pomocą cienkich rurek lipidowych (pęt).
Prezentowana praca podkreśla strategie przezwyciężania wyżej wymienionych ograniczeń. W pierwszej kolejności przedstawiamy szczegółowy opis metody spontanicznego pęcznienia dostosowanej i zoptymalizowanej do produkcji GUV w o wysokim zasoleniu. Następnie wprowadzamy dwa podejścia do efektywnego tworzenia asymetrycznych warunków roztworu poprzez proste rozcieńczenie lub wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego. Ponieważ naszym celem jest analiza stanu fazy membranowej GUV w różnych warunkach roztworu, kolejne sekcje opisują kryteria udanej analizy statystycznej i przedstawiają wskazówki, jak uniknąć błędnej kategoryzacji.
Analizy były wykonywane w warunkach izotermicznych, jak również w różnych temperaturach. Podczas gdy kontrola temperatury jest powszechnie stosowana, szczegóły dotyczące eksperymentalnych komór kontroli temperatury są rzadko opisywane. Tutaj prezentowana jest wbudowana przez nas konfiguracja do obserwacji GUV w różnych warunkach temperaturowych.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), sól sodowa</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475C</td><td>, w skrócie DOPG w tekście</td></tr><tr><td>sfingomielina jaj kurzych</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td>w skrócie eSM</td></tr><tr><td>cholesterol (wełna owcza, > 98 %)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td> w <td>skrócie Chol</td></tr><tr><td>Nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny</td><td>Sondy molekularne</td><td>D-282</td><td>w skrócie DiIC18</td></tr><tr><td>Chloroform, klasa HPLC (&ge; 99,8 %)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (> 99,8%)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (37%)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris (&ge; 99,9%)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza (&ge; 99,5 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolka gwintowana 45x27 mm, 15 mL</td><td>Kimble</td><td></td><td>Soda płaskie dno, biała zakrętka</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Mettler Toledo</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>Osmometr</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat030</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer D1</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 40x, 0.6 NA</td><td>Zeiss</td><td>LD Achroplan</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 40x, 0.75 BRAK Obiektyw</td><td>Leica</td><td>506174</td><td></td></tr><tr><td>63x, 0.9 NA</td> Szkiełko mikroskopowe <td>Leica</td><td>506148</td><td></td></tr>, <tr><td>56x26 mm, 0.17 &plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, 22x22 mm, 0.17 &plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; aser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M"Bremix</td> <td>Elastyczne strzykawki do pakowania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 5 mL, 10 mL</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro; m filtr strzykawkowy</td><td>GVS Ameryka Północna</td><td>Cameo 25AS, 1213723</td><td>Octan, sterylny</td></tr></tbody></table>

zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

Oddzielone fazowo gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) wykazujące współistniejące domeny uporządkowane cieczą i nieuporządkowane cieczą są powszechnym narzędziem biofizycznym do badania hipotezy tratwy lipidowej. Liczne badania zaniedbują jednak wpływ warunków fizjologicznych roztworu. W związku z tym w niniejszej pracy przedstawiono wpływ asymetrii o wysokim zasoleniu i roztworów transbłonowych na separację fazy ciecz-ciecz w naładowanych GUV wyhodowanych z dioleylfosfatydyloglicerolu, sfingomieliny jaj i cholesterolu. Efekty badano w warunkach izotermicznych i zmiennych temperaturach.
Opisujemy sprzęt i strategie eksperymentalne mające zastosowanie do monitorowania stabilności współistniejących domen cieczy w naładowanych pęcherzykach w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu o wysokim zasoleniu. Obejmuje to podejście polegające na przygotowaniu naładowanych wieloskładnikowych GUV w buforze o wysokim zasoleniu w wysokich temperaturach. Protokół zakłada możliwość przeprowadzenia częściowej wymiany roztworu zewnętrznego poprzez prosty etap rozcieńczania przy jednoczesnej minimalizacji rozcieńczenia pęcherzyków. Przedstawiono alternatywne podejście wykorzystujące urządzenie mikroprzepływowe, które pozwala na pełną wymianę roztworu zewnętrznego. Badano również wpływ roztworu na separację faz w różnych temperaturach. W tym celu przedstawiamy podstawowy projekt i użyteczność wbudowanej we własnym zakresie studzienki kontroli temperatury. Ponadto zastanawiamy się nad oceną stanu fazowego GUV, pułapkami z nim związanymi i sposobami ich obejścia.

Eksperymenty na oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) często zaniedbują fizjologiczne warunki roztworu. W pracy przedstawiono podejścia do badania wpływu buforu o wysokim zasoleniu na separację faz ciecz-ciecz w naładowanych wieloskładnikowych GUV w funkcji asymetrii i temperatury roztworu transmembranowego.

Zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ilościowa ocena wpływu środowisk o wysokim zasoleniu oraz asymetrii roztworów transbłonowych, występujących w warunkach fizjologicznych, na stany fazowe błony. Roztwory wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe znacznie się od siebie różnią. Nasze metody pomagają zrozumieć wpływ asymetrii roztworów na właściwości błony oraz zachowanie fazowe.Główną zaletą naszego podejścia jest możliwość przygotowania pęcherzyków w fizjologicznych warunkach buforowych oraz możliwość wykorzystania urządzenia mikrofluidycznego do wytworzenia asymetrycznych warunków buforowych. Aby rozpocząć procedurę, należy zmatowić jedną stronę płytki PTFE drobnym papierem ściernym. Płytkę, 15 mililitrową szklaną fiolkę oraz szczelny szklany pojemnik należy umyć komercyjnym detergentem do naczyń, etanolem i chloroformem.Użyj szklanej strzykawki o pojemności 25 µL, aby nanieść od 10 do 15 µL roztworu zapasu lipidów w chloroformie na szorstką stronę czystej i suchej płytki PTFE. Rozprowadź zapas lipidów igłą strzykawki, aby utworzyć jednorodną warstwę lipidową. Za pomocą pęsety przenieś płytkę do fiolki o pojemności 15 mL.Ogrzewaj płytkę w temperaturze 60 °C i susz w eksyكاتهrze przez dwie godziny, aby odparować rozpuszczalnik. Następnie wlej do szklanego pojemnika wodę dejonizowaną do wysokości około jednego centymetra. Umieść fiolkę z płytką w pojemniku, upewniając się, że stoi stabilnie i pionowo, a następnie szczelnie zamknij pojemnik.Pozostawć dwuwarstwę lipidową do wstępnego pęcznienia w temperaturze 60 °C przez cztery godziny. Następnie wyjmij fiolkę z pojemnika. Pobierz 5 mL roztworu pęczniejącego do plastikowej strzykawki i przymocuj filtr 0,45 µm do końcówki strzykawki.Dodaj przefiltrowany roztwór pęcznienia do fiolki, aby nawodnić film lipidowy. Zakręć fiolkę i zabezpiecz ją plastikową folią parafinową. Przechowuj fiolkę w temperaturze 60 degrees Celsius przez noc, aby uzyskać agregat GUV.Schłodzić pęcherzyki do temperatury pokojowej w ciągu godziny od zdjęcia z cieplniczki. Odciąć końcówkę plastikowej końcówki do mikropipety o pojemności 200 µL w taki sposób, aby agregat GUV można było wciągnąć do środka. Za pomocą przyciętej końcówki pipety przenieść agregat oraz 50 µL roztworu pęczniejącego do czystej, suchej fiolki o pojemności 2 mL.Do fiolki należy dodać 950 µL świeżego roztworu pęczniejącego lub roztworu izotonicznego, aby uzyskać odpowiednio symetryczne lub asymetryczne warunki roztworu. Mieszaninę należy pipetować w górę i w dół, a następnie delikatnie kilka razy odwrócić fiolkę, aby resuspender GUV. Aby rozpocząć ocenę, należy nanieść alikwot zawiesiny GUV do izolatora silikonowego na szkiełku przedmiotowym mikroskopu.Zamknij komorę za pomocą szkiełka nakrywkowego. Pozostaw próbkę na pięć minut w celu ponownej równowagi. Następnie umieść preparat na stole mikroskopu fluorescencyjnego i wykonaj zdjęcia co najmniej 30 GUV z każdej partii.Przeanalizuj obrazy, aby określić stany fazowe GUV widocznych na zdjęciach. GUV w jednofazowym stanie ciekłym będą sferyczne i gładkie, z etykietą fluorescencyjną homogenicznie rozłożoną w całej błonie. GUV w dwufazowym stanie ciekłym uporządkowanym i nieuporządkowanym będą sferyczne, z etykietą fluorescencyjną podzieloną na domeny o gładkich granicach w obrębie błony.Należy zweryfikować, czy domeny swobodnie dyfundują na powierzchniach pęcherzyków i mogą koalescować. GUV w dwufazowym lub trójfazowym stanie fazy stałej i ciekłej będą zaokrąglone z pewnymi kanciastymi granicami. Domeny ciekłe na stałym tle nie powinny wykazywać dyfuzji, natomiast domeny stałe powinny swobodnie dyfundować na ciekłym tle.Po zidentyfikowaniu stanu fazowego każdego obrazu GUV należy określić dominujący stan fazowy dla całej partii. Należy powtórzyć ten proces na niezależnych próbkach, jeśli dominujący stan fazowy stanowi niewielką większość. Przed użyciem urządzenia mikroprzepływowego należy przygotować co najmniej pięć mililitrów roztworów pęczniejących: sacharozy oraz soli.Każdy roztwór przefiltruj przez filtr o wielkości porów 0,45 µm. Następnie odetnij końcówki plastikowych końcówek do pipet o pojemności 200 µl i umieść jedną końcówkę w każdym kanale urządzenia. Do zbiornika urządzenia dodaj 100 µl świeżego, przefiltrowanego roztworu pęczniejącego tego samego typu, którego użyto do przygotowania GUVs.Dodaj 5 µL roztworu pęczniejącego do każdej końcówki pipety. Wirowarkuj urządzenie przy 900 ×g przez 10 minut, aby wypełnić kanały urządzenia. Następnie napełnij jednofamilowy szklany strzykawkę tym samym przefiltrowanym roztworem pęczniejącym.Podłącz odcinek rurki do strzykawki. Przeciśnij roztwór pęczniejący przez rurkę, aż tłok zostanie całkowicie dociśnięty, a rurka zostanie wypełniona roztworem. Następnie podłącz rurkę do kanału wylotowego i zamocuj strzykawkę w pompie strzykawkowej.Następnie podłącz jednostkę kontroli ciśnienia do wlotów kanału mikroprzepływowego. Upewnij się, że zawory są zamknięte, a następnie ustaw ciśnienie na trzy bary. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na stole przedmiotowym odwróconego mikroskopu konfokalnego.Za pomocą pipety usunąć roztwór pęczniejący z rezerwuaru urządzenia, aż pozostanie w nim jedynie 25 do 50 µL roztworu. Do rezerwuaru dodać 150 µL zawiesiny GUV i wymieszać ją, delikatnie pipetując. Uruchomić pompę strzykawkową w trybie wycofywania z prędkością 10 µL na minutę przez 20 minut lub do momentu, gdy zajętych zostanie ponad 90% pułapek w urządzeniu.Następnie otwórz zawory jednostki sterowania ciśnieniem, aby zamknąć zawory pierścieniowe w urządzeniu mikrofluidycznym. Zatrzymaj pompę strzykawkową i odstaw urządzenie na jedną godzinę przed wykonaniem obrazowania konfokalnego GUV w urządzeniu. Następnie za pomocą pipety usuń zawiesinę GUV z rezerwuaru, pozostawiając jedynie od 25 do 50 µl.Do zbiornika należy dodać 150 µL drugiego rodzaju przefiltrowanego roztworu pęczniejącego i delikatnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety. Proces ten należy powtórzyć co najmniej pięć razy, aby całkowicie wymienić roztwór w zbiorniku. Następnie należy uruchomić pompę strzykawkową w trybie pobierania z prędkością 10 µL/min przez 10 minut, aby wymienić roztwór w mikrokanałach.Następnie zmniejszyć szybkość przepływu do 1 µL/min. Zamknąć zawory jednostki kontroli ciśnienia na dwie sekundy, a następnie otworzyć zawory i zatrzymać pompę strzykawkową. Pozostawić urządzenie na jedną godzinę przed wykonaniem obrazowania konfokalnego.Aby rozpocząć przygotowanie komory kontroli temperatury, najpierw przymocuj złączki do rurek z barbami do aluminiowego zespołu przepływu ciepła z okienkami z szkiełek nakrywkowych o grubości dwóch milimetrów. Przymocuj gumową przekładkę do jednego ze szkiełek nakrywkowych, aby utworzyć komorę obserwacyjną. Wprowadź 100 µL zawiesiny GUV do komory obserwacyjnej i uszczelnij komorę szkiełkiem nakrywkowym.Powoli odwróć zespół. Podłącz komorę aluminiową do zewnętrznej łaźni wodnej. Zamocuj zespół na stoliku mikroskopu.Ustaw zewnętrzną łaźnię wodną na najniższą pożądaną temperaturę i pozwól systemowi osiągnąć równowagę przez 10 do 15 minut. Pozyskaj obrazy GUV i określ stany fazowe w różnych temperaturach. GUV przygotowano z różnych proporcji DOPG, sfingomieliny jajecznej i cholesterolu w symetrycznych roztworach sacharozy lub soli.Dominujące stany fazowe określono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie wybrane składy przeniesiono do warunków asymetrycznych poprzez rozcieńczenie, aby ocenić wpływ efektywnych warunków roztworu na zachowanie fazowe. W celu dalszego zbadania zachowania fazowego GUV w roztworach asymetrycznych, GUV zostały uwięzione w urządzeniu mikrofluidycznym, co umożliwiło całkowitą wymianę roztworu zewnętrznego.Uwięzione GUV-y oceniono za pomocą mikroskopii konfokalnej przed i po wymianie płynu. Monitorowano frakcję GUV-ów jednorodnych w stosunku do GUV-ów z rozdziałem faz w zakresie określonych temperatur, aby ocenić wpływ temperatury na zachowanie fazowe GUV-ów. W danych zaobserwowano wzorzec sigmoidalny, który następnie dopasowano do modelu Boltzmanna.Temperaturę, przy której frakcja GUV z separacją faz wynosiła 0.5, wyznaczono z dopasowanej krzywej. Choć metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o zachowaniu fazowym błony, jej zastosowania mogą obejmować również inne eksperymenty, takie jak badanie oddziaływań między błonami a biomolekułami w warunkach fizjologicznych.

phase-behavior-charged-vesicles-under-symmetric-asymmetric-solution

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przekształcanie funkcjonalnych białek błonowych w gigantyczne liposomy o określonym składzie jest potężnym podejściem w połączeniu z elektrofizjologią patch-clamp. Jednak konwencjonalna produkcja gigantycznych liposomów może być niezgodna ze stabilnością białka.  Opisujemy protokoły wytwarzania gigantycznych liposomów z czystych lipidów lub małych liposomów zawierających kanały jonowe.

Preparat liposomów olbrzymich do obrazowania i elektrofizjologii patch-clamp

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Prezentujemy technikę bezdotykowej mikromanipulacji pęcherzykami, wykorzystując zlokalizowane gradienty jonów wapnia. Mikroiniekcja roztworu jonów wapnia w pobliżu gigantycznego pęcherzyka lipidowego jest wykorzystywana do przebudowy błony lipidowej, w wyniku czego powstają wypukłości rurki błonowe.

Przebudowa błony gigantycznych pęcherzyków w odpowiedzi na zlokalizowane gradienty jonów wapnia

Tutaj prezentujemy protokół do badania molekularnego mechanizmu translokacji protonów przez błony lipidowe pojedynczych liposomów, używając cytochromu bo3 jako przykładu. Łącząc elektrochemię i mikroskopię fluorescencyjną, zmiany pH w świetle pojedynczych pęcherzyków, zawierających jeden lub wiele enzymów, mogą być wykrywane i analizowane indywidualnie.

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Celem protokołu jest wiarygodny pomiar właściwości mechanicznych membrany gigantycznych pęcherzyków za pomocą aspiracji mikropipet.

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Poznaj metodę oceny wpływu wysokiego stężenia soli i asymetrii roztworu na stany fazowe błon w modelowych pęcherzykach GUV. Technika mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia badanie właściwości błon komórkowych w warunkach fizjologicznych.

Zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów