Zachowanie fazowe naładowanych pęcherzyków w symetrycznych i asymetrycznych warunkach roztworu monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
24 października 2017
Eksperymenty na oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) często zaniedbują fizjologiczne warunki roztworu. W pracy przedstawiono podejścia do badania wpływu buforu o wysokim zasoleniu na separację faz ciecz-ciecz w naładowanych wieloskładnikowych GUV w funkcji asymetrii i temperatury roztworu transmembranowego.
Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowa ocena wpływu środowisk o wysokim zasoleniu i asymetrii roztworu transbłonowego występujących w warunkach fizjologicznych na stany fazy błonowej. Rozwiązania wewnątrz komórki i na zewnątrz komórek są bardzo różne. Nasze metody pomagają zrozumieć wpływ asymetrii roztworu na właściwości membrany i zachowanie fazowe.
Główną zaletą naszego podejścia jest to, że pęcherzyki mogą być przygotowywane w fizjologicznych warunkach buforowych, a urządzenie mikroprzepływowe może być używane do tworzenia asymetrycznych warunków buforowych. Aby rozpocząć procedurę, zszorstkuj jedną stronę płytki PTFE drobnym papierem ściernym. Umyj płytkę, szklaną fiolkę o pojemności 15 mililitrów i zamykany szklany pojemnik z dostępnym w handlu detergentem do mycia naczyń, etanolem i chloroformem.
Użyj szklanej strzykawki o pojemności 25 mikrolitrów, aby nanieść od 10 do 15 mikrolitrów lipidów w chloroformie na szorstką stronę czystej, suchej płytki PTFE. Rozprowadzić materiał lipidowy za pomocą igły strzykawki, aby utworzyć jednolity film lipidowy. Użyj pęsety, aby przenieść płytkę do 15-mililitrowej fiolki.
Podgrzej płytkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza i susz przez dwie godziny, aby odparować rozpuszczalnik. Następnie dodaj wodę dejonizowaną do szklanego pojemnika na wysokość około jednego centymetra. Umieścić fiolkę z tabliczką w pojemniku, upewniając się, że pozostaje stabilna i pionowa, a następnie zamknąć pojemnik.
Pozwól dwuwarstwie lipidowej pęcznieć w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Następnie wyjąć fiolkę z pojemnika. Pobrać pięć mililitrów roztworu pęczniejącego do plastikowej strzykawki i przymocować filtr 0,45 mikrometra do końcówki strzykawki.
Dodać przefiltrowany roztwór pęczniejący do fiolki, aby nawodnić film lipidowy. Nakrętkę należy zamknąć fiolkę i zamknąć fiolkę folią parafinową z tworzywa sztucznego. Przechowywać fiolkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc, aby uzyskać agregat GUV.
Schłodzić pęcherzyki do temperatury pokojowej w ciągu godziny od zdjęcia z ognia. Odetnij koniec plastikowej końcówki do mikropipet o pojemności 200 mikrolitrów, aby agregat GUV mógł zostać wciągnięty do końcówki. Za pomocą przyciętej końcówki pipety przenieś kruszywo i 50 mikrolitrów roztworu pęczniejącego do czystej, suchej fiolki o pojemności dwóch mililitrów.
Dodać do fiolki 950 mikrolitrów świeżego roztworu pęczniejącego lub roztworu izotonicznego, aby uzyskać odpowiednio symetryczne lub asymetryczne warunki roztworu. Odpipetować mieszaninę w górę i w dół, a następnie delikatnie odwrócić fiolkę kilka razy, aby ponownie zawiesić GUV. Aby rozpocząć ocenę, należy umieścić podwielokrotność zawiesiny GUV w silikonowym izolatorze w szkiełku mikroskopowym.
Uszczelnij komorę szkiełkiem nakrywkowym. Pozostawić próbkę do ponownego wyrównania przez pięć minut. Następnie umieść szkiełko na stoliku na próbkę mikroskopu fluorescencyjnego i uzyskaj obrazy co najmniej 30 GUV na partię.
Sprawdź obrazy, aby określić stany fazowe GUV obrazu. GUV w stanie pojedynczej fazy ciekłej będą kuliste i gładkie, z fluorescencyjną etykietą równomiernie rozmieszczoną w całej membranie. GUV w stanie dwufazowym uporządkowanym i nieuporządkowanym będzie sferyczny z etykietą fluorescencyjną podzieloną na domeny o gładkich granicach w membranie.
Sprawdź, czy domeny mogą swobodnie dyfundować na powierzchni pęcherzyków i mogą się łączyć. GUV w dwufazowym lub trójfazowym stanie stałej fazy ciekłej zostaną zaokrąglone z pewnymi granicami kątowymi. Domeny płynne na jednolitym tle nie powinny wykazywać dyfuzji, ale domeny stałe powinny swobodnie dyfundować na płynnym tle.
Po zidentyfikowaniu stanu fazowego każdego obrazu GUV określ dominujący stan fazowy dla partii. Powtórz proces z niezależnymi próbkami, jeśli dominujący stan fazowy to niewielka większość. Przed użyciem urządzenia mikroprzepływowego przygotuj co najmniej pięć mililitrów sacharozy i roztworów pęczniejących sacharozy i soli.
Przefiltruj każdy roztwór przez filtr o wielkości 0,45 mikrometra. Następnie przytnij końce plastikowych końcówek do pipet o pojemności 200 mikrolitrów i umieść końcówkę pipety w każdym kanale urządzenia. Dodaj do zbiornika urządzenia 100 mikrolitrów świeżego, przefiltrowanego roztworu pęczniejącego tego samego typu, którego użyto do przygotowania GUV.
Dodać pięć mikrolitrów roztworu pęczniejącego do każdej końcówki pipety. Odwirować urządzenie pod ciśnieniem 900 razy G przez 10 minut, aby napełnić kanały urządzenia. Następnie napełnij szklaną strzykawkę o pojemności jednego mililitra tym samym przefiltrowanym roztworem pęczniejącym.
Podłączyć rurkę do strzykawki. Przepchnąć roztwór pęczniejący przez rurkę, aż tłok zostanie całkowicie wciśnięty, a rurka zostanie wypełniona roztworem. Następnie podłączyć rurkę do kanału wylotowego i zamontować strzykawkę na pompie strzykawkowej.
Następnie podłącz jednostkę sterującą ciśnieniem do wlotów kanałów mikroprzepływowych. Upewnij się, że zawory są zamknięte, a następnie ustaw ciśnienie na trzy bary. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku próbki odwróconego mikroskopu konfokalnego.
Za pomocą pipety usuń pęczniejący roztwór ze zbiornika urządzenia, aż pozostanie tylko 25 do 50 mikrolitrów roztworu. Dodać 150 mikrolitrów zawiesiny GUV do zbiornika i wymieszać zawiesinę, delikatnie pipetując. Uruchom pompę strzykawkową w trybie pobierania z prędkością 10 mikrolitrów na minutę przez 20 minut lub do momentu, gdy ponad 90% pułapek urządzenia zostanie zajętych.
Następnie otwórz zawory jednostki sterującej ciśnieniem, aby zamknąć zawory pierścieniowe w urządzeniu mikroprzepływowym. Zatrzymaj pompę strzykawkową i pozostaw urządzenie na godzinę przed uzyskaniem obrazów konfokalnych GUV w urządzeniu. Następnie za pomocą pipety usuń zawiesinę GUV ze zbiornika, aby pozostawić tylko 25 do 50 mikrolitrów.
Dodać do zbiornika 150 mikrolitrów innego rodzaju przefiltrowanego roztworu pęczniejącego i delikatnie pipetować mieszaninę w górę iw dół. Powtórz ten proces co najmniej pięć razy, aby całkowicie zastąpić roztwór w zbiorniku. Uruchomić pompę strzykawkową w trybie pobierania z prędkością 10 mikrolitrów na minutę przez 10 minut, aby zastąpić roztwór w mikrokanałach.
Następnie zmniejsz natężenie przepływu do jednego mikrolitra na minutę. Zamknij zawory jednostki sterującej ciśnieniem na dwie sekundy, a następnie otwórz zawory i zatrzymaj pompę strzykawkową. Pozostaw urządzenie na godzinę przed zarejestrowaniem obrazów konfokalnych.
Aby rozpocząć przygotowywanie komory kontroli temperatury, najpierw przymocuj złączki z rurką kolczastą do aluminiowego zespołu przepływu ciepła z oknami nakrywkowymi o grubości dwóch milimetrów. Przymocuj gumową przekładkę do jednego z szkiełek nakrywkowych, aby utworzyć komorę obserwacyjną. Załadować 100 mikrolitrów zawiesiny GUV do komory obserwacyjnej i uszczelnić komorę szkiełkiem nakrywkowym.
Powoli odwróć zespół. Podłącz aluminiową komorę do zewnętrznej łaźni wodnej. Zamontuj zespół na stoliku na próbki mikroskopu.
Ustaw zewnętrzną łaźnię wodną na najniższą żądaną temperaturę i pozwól systemowi osiągnąć równowagę przez 10 do 15 minut. Zdobądź obrazy GUV i określ stany fazowe w różnych temperaturach. GUV przygotowano z różnych proporcji DOPG i sfingomieliny jaj oraz cholesterolu w symetrycznych roztworach sacharozy lub soli.
Ich dominujące stany fazowe wyznaczono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Wybrane kompozycje przeniesiono następnie do warunków asymetrycznych przez rozcieńczenie, aby ocenić efektywne warunki roztworu w odniesieniu do zachowania fazy. W celu dalszego zbadania zachowania fazowego GUV w roztworach asymetrycznych, GUV zostały uwięzione w urządzeniu mikroprzepływowym, aby umożliwić pełną wymianę roztworu zewnętrznego.
Uwięzione GUV oceniano za pomocą mikroskopii konfokalnej przed i po wymianie płynów. Frakcja jednorodnych lub oddzielonych fazowo GUV była monitorowana w zakresie temperatur w celu oceny efektywnej temperatury w zachowaniu fazowym GUV. W danych zaobserwowano wzorzec sigmoidalny, który następnie dopasowano do modelu Boltzmanna.
Temperaturę, w której frakcja GUV oddzielonych fazowo wynosiła 0,5, wyznaczono na podstawie dopasowanej krzywej. Chociaż metody te mogą zapewnić wgląd w zachowanie fazy błonowej, aplikacje mogą być również wykorzystywane do innych eksperymentów, takich jak badanie interakcji między błonami w biomolekułach w warunkach fizjologicznych.
Przegląd
Niniejsze badanie śledzi wpływ warunków buforowych o wysokiej słoności na separację faza-faza w wielkocząsteczkowych ujednorodnionych wezykulach otoczkowych (GUV) o wielu składnikach. Badania podkreślają znaczenie asymetrii roztworu przezbłonowego i temperatury w zrozumieniu właściwości błon.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biologia błon
Tło
- Wielkocząsteczkowe ujednorodnione wezykuły (GUV) są modelami do badania dynamiki błon.
- Warunki fizjologiczne często różnią się znacznie od ustawień eksperymentalnych.
- Zrozumienie zachowania fazowego w błonach jest kluczowe dla wnikliwych obserwacji procesów komórkowych.
- Środowiska o wysokiej słoności mogą zmieniać właściwości i stany fazowe błon.
Cel badania
- Ilościowa ocena wpływu wysokiej słoności i asymetrii roztworu przezbłonowego na stany fazowe błony.
- Opracowanie metod przygotowywania GUV w warunkach buforowych fizjologicznych.
- Zbadanie wpływu asymetrii roztworu na właściwości błony i zachowanie fazowe.
Stosowane metody
- Przygotowanie warstw lipidowych na płytkach PTFE, następnie nawodnienie w celu utworzenia GUV.
- Zastosowanie urządzeń mikrofluidycznych do stworzenia asymetrycznych warunków buforowych.
- Mikroskopia fluorescencyjna do oceny stanów fazowych GUV.
- Ilościowa analiza stanów fazowych na podstawie dystrybucji fluorescencji.
Główne wyniki
- GUV wykazują charakterystyczne stany fazowe w zależności od warunków roztworu.
- Zachowanie fazowe jest wpłynięte zarówno przez słoność, jak i asymetrię przezbłonową.
- Opracowanie metod pozwala na kontrolowane eksperymenty w warunkach fizjologicznych.
- Wyniki dostarczają wnikliwych obserwacji dotyczących dynamiki błon istotnych dla środowisk komórkowych.
Wnioski
- Badanie podkreśla znaczenie warunków fizjologicznych w badaniach nad błonami.
- Zrozumienie separacji faz w GUV może pomóc w badaniach nad błonami komórkowymi.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach do badania złożonych systemów biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding membrane phase behavior under physiological solution conditions is critical for de-risking target validation in membrane-associated drug discovery. This protocol enables assessment of how high-salinity and transmembrane asymmetry influence lipid domain stability, providing predictive confidence in early-stage mechanistic studies. By modeling physiologically relevant membrane environments, the approach supports translational continuity from discovery to preclinical evaluation of compounds targeting membrane proteins or lipid-dependent pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how solution conditions modulate lipid raft formation, informing hypotheses about membrane protein localization and signaling complex assembly.
- Operational Value: Enables controlled testing of transmembrane asymmetry effects, reducing false positives in target engagement assays conducted under non-physiological buffer conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates phase-separated GUVs as reproducible models for evaluating compound partitioning into liquid-ordered or liquid-disordered domains.
- Operational Value: Standardizes vesicle preparation under symmetric or asymmetric high-salinity conditions, improving assay robustness for fluorescence-based membrane interaction screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro phase behavior to physiological relevance, supporting risk-adjusted advancement of leads whose activity depends on membrane microenvironment.
- Operational Value: Provides a scalable method to assess temperature-dependent phase transitions, enabling correlation with preclinical efficacy or toxicity signals under varying physiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where membrane target validation requires mechanistic de-risking of lipid-dependent mechanisms, particularly for targets implicated in lipid raft-mediated signaling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding how solution asymmetry influences domain formation and protein recruitment to specific lipid phases.
- Screening: Delivers assay-ready GUV populations with quantifiable phase states, enabling reliable comparison of compound effects across solution conditions.
- Analytics: Produces fluorescence-based domain partitioning metrics that help teams compare compound behavior in ordered versus disordered membrane phases.
- Translational Research: Connects GUV phase stability to physiological temperature and salinity ranges, informing preclinical model selection for membrane-targeted interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for evaluating membrane microenvironment effects across multiple projects, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by revealing how ionic strength and gradient conditions alter membrane material properties relevant to drug binding.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized GUV formation and solution exchange protocols, minimizing variability in membrane-based assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying compounds whose activity is sensitive to physiological solution conditions, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of membrane-associated targets based on validated phase behavior under realistic extracellular and intracellular milieus.
Implementation Considerations
- Expertise in lipid film hydration, vesicle formation, and fluorescence microscopy interpretation is required to ensure accurate phase state assessment.
- Access to microfluidic systems and temperature-controlled chambers is necessary for implementing asymmetric solution conditions and thermal variation studies.
- Standardization across teams depends on consistent lipid composition, vesicle size selection, and imaging parameters to maintain comparability of phase state data.
- Adaptation to other model systems (e.g., different lipid mixes or protein-reconstituted vesicles) should consider potential alterations in phase transition temperatures and domain stability.
- Practical limitations include the need for careful avoidance of vesicle dilution during solution exchange and potential photobleaching during prolonged fluorescence imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Giant Unilamellar Vescicle (GUV) Preparation
3:02
Phase State Assessment with Fluorescence Microscopy
4:33
GUV Observation and Imaging with a Microfluidic Device
7:35
GUV Observations at Varying Temperatures
8:29
Results: GUV Phase Behavior
9:42
Conclusion
