Przeszczep pierwotnych komórek rozrodczych w celu przeskoku opartego na CRISPR/Cas9 w Xenopus
1 lutego 2018
Geny niezbędne do przetrwania stanowią techniczne przeszkody w tworzeniu linii mutantów. Skakanie pozwala uniknąć śmiertelności, łącząc edycję genomu z przeszczepem pierwotnych komórek rozrodczych w celu stworzenia zwierząt typu dzikiego z mutacjami linii zarodkowej. Leapfrogging pozwala również na efektywne generowanie homozygotycznych mutantów zerowych w pokoleniu F1. Tutaj pokazany jest etap przeszczepu.
Ogólnym celem techniki leapfrogging jest ułatwienie tworzenia linii mutantów dla genów niezbędnych do embriogenezy. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w genetyce rozwojowej i innych dziedzinach. Główną zaletą tej techniki jest możliwość otrzymania mutantów w genach niezbędnych już w pokoleniu F1.
Aby rozpocząć tę procedurę, przeprowadź mikroiniekcję kompleksów Cas9-sgRNA do embrionów Xenopus w stadium jednej komórki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Gdy embriony osiągną wiek 4,5 godziny po zapłodnieniu, w wczesnym stadium blastuli dziewiątym, wyjmij je z inkubatora ustawionego na 25 stopni Celsius, aby umożliwić dalszy rozwój w temperaturze pokojowej. Aby rozpocząć transplantację w piątej godzinie po zapłodnieniu, użyj pipety Pasteura do przeniesienia jednego nieiniekowanego embrionu do 60 milimetrowej szalki agarozowej z wgłębieniami, która będzie służyć jako biorca przeszczepu.
Przenieś również jeden embrion donora PGC do szalki. Używając pęsety, ręcznie usuń osłonki żółtkowe z każdego embrionu. Następnie obróć oba embriony tak, aby ich bieguny wegetatywne były widoczne i dostępne do przeprowadzenia zabiegu.
Następnie, stabilizując embrion biorcy za pomocą pętli z włosa, wprowadź ostrą końcówkę noża z włosa brwiowego do bieguna wegetatywnego, tuż pod powierzchnię. Szybkimi, wznoszącymi ruchami tnącymi wykonaj cztery płytkie nacięcia w kształcie kwadratu, wewnątrz strefy, w której utworzą się przyszłe komórki butelkowate wyznaczające blastopor.
Uwolnić eksplant tkanki wegetatywnej z zarodka biorcy, wykonując jedno lub więcej poziomych cięć w głębokim regionie wegetatywnym. Następnie, działając szybko, powtórzyć tę procedurę na zarodku dawcy PGC, aby przygotować fragment tkanki wegetatywnej o podobnej wielkości do transplantacji. Po usunięciu tkanki zawierającej PGC z zarodka dawcy, użyć noża z włosa brwiowego oraz pętli z włosa, aby umieścić eksplant w otworze utworzonym w zarodku biorcy.
Używając trzonka nożyka do brwi, trzymanego równolegle do powierzchni przeszczepu, delikatnie dociśnij przeszczep do otworu w powierzchni wegetatywnej embrionu biorcy. Używając pętli do włosów, delikatnie przesuń tułów embrionu dawcy po powierzchni agarozy do dołka. Upewnij się, że otwarta rana tułowia jest skierowana w stronę cieczy.
Przesuń embrion biorcę do sąsiedniej dołki i upewnij się, że przeszczepiona tkanka bieguna wegetatywnego jest skierowana w stronę objętości cieczy. Powtórz transplantację PGC z dodatkowymi embrionami, aby stworzyć więcej par dawca-biorca, aż embriony osiągną w przybliżeniu wczesny etap gastruli 10, przenosząc embriony do pustych dołków w miarę wykonywania przeszczepów. Po zagojeniu się przeszczepów, zazwyczaj od 30 do 45 minut po transplantacji, użyj pipety Pasteura, aby bardzo delikatnie przenieść embriony z wgłębień do poszczególnych dołków w 24-dołkowej płytce pokrytej agarozą.
Obrócić embriony tak, aby biegun wegetatywny był skierowany do góry, w stronę głównego roztworu. Umieścić zwłoki dawców i biorców przeszczepów w sąsiednich dołkach, aby ułatwić śledzenie par embrionów, i zapisać te informacje. Następnie przenieść płytkę 24-dołkową z embrionami do inkubatora w temperaturze 25 °C na noc.
Następnego dnia przenieś każdego biorcę przeszczepu, znajdującego się obecnie we wczesnym stadium pąka ogonowego, do oddzielnej dołki nowej, powleczonej agarozą płytki sześciodołkowej. Hoduj embriony poddane metodzie leapfrogging i przeprowadź analizę DNA dawcy uzyskanego z ciał embrionów zgodnie z protokołem tekstowym. Ponieważ metoda leapfrogging pozwala na uzyskanie zwierząt, u których następuje efektywne zastąpienie linii zarodkowej allelami mutantów, fenotypy mutantów można uzyskać już w pokoleniu F1.
Jak przedstawiono w tej tabeli, Blitz i wsp. zgłosili, że większość zwierząt F0 z celowaniem w locus tyrozynazy, która jest niezbędna do pigmentacji melanocytów i siatkówki, wykazuje 100% transmisji linii zarodkowej mutantów pochodzących od dawcy, co zmierzono poprzez krzyżowanie wsteczne ze zwierzętami albinosami tyr minus. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić transplantację pierwotnych komórek rozrodczych Xenopus.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Technika „leapfrogging” umożliwia tworzenie linii mutantów dla genów niezbędnych w embriogenezie. Metoda ta pozwala na uzyskanie homozygotycznych mutantów null w pokoleniu F1, co pozwala przezwyciężyć problemy związane z mutacjami letalnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka rozwojowa
- Inżynieria genetyczna
- Embriologia
Wprowadzenie
- Geny niezbędne są kluczowe dla przetrwania i stanowią wyzwanie przy tworzeniu linii mutantów.
- Tradycyjne metody mogą nie sprawdzić się w przypadku genów wymaganych podczas wczesnego rozwoju.
- Metoda leapfrogging łączy edycję genomu z transplantacją komórek linii zarodkowej.
- Technika ta umożliwia badanie genów niezbędnych bez wywoływania letalności.
Cel badania
- Zaprezentowanie techniki leapfrogging w celu generowania linii mutantów.
- Przedstawienie metody badania genów niezbędnych w procesach rozwojowych.
- Usprawnienie procesu wydajnego tworzenia homozygotycznych mutantów null.
Zastosowane metody
- Mikroiniekcja kompleksów Cas9-sgRNA do zarodków Xenopus.
- Transplantacja komórek linii zarodkowej z wstrzykniętych zarodków do zarodków biorców.
- Monitorowanie rozwoju zarodków na różnych etapach.
- Zastosowanie szalek agarozowych do przeszczepiania zarodków.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie zwierząt typu dzikiego z mutacjami w linii zarodkowej.
- Efektywna produkcja homozygotycznych mutantów null w generacji F1.
- Demonstracja etapu transplantacji w procesie leapfrogging.
- Walidacja skuteczności metody w przewyciężaniu letalności.
Wnioski
- Leapfrogging jest obiecującą techniką badania genów niezbędnych.
- Metoda ta pozwala badaczom ominąć letalność mutacji genów niezbędnych.
- Dalsze zastosowania tej techniki mogą usprawnić badania w zakresie genetyki rozwoju.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda „leapfrogging” poprzez transplantację pierwotnych komórek zarodkowych przyspiesza generowanie linii mutantów indukowanych CRISPR/Cas9 u Xenopus, bezpośrednio eliminując wąskie gardła w genomice funkcjonalnej genów niezbędnych do przeżycia. Podejście to umożliwia szybką analizę fenotypową w pokoleniu F1, co sprzyja wcześniejszej walidacji celów oraz redukcji ryzyka mechanistycznego w procesach badawczych nad rozwojem i genetyką. Metoda ta zwiększa elastyczność portfolio badawczego, umożliwiając efektywne badanie genów, które wcześniej były niedostępne ze względu na letalność embrionalną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę genów niezbędnych do przeżycia poprzez ominięcie letalności zarodkowej.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki bezpośredniej analizie fenotypowej pokolenia F1.
- Ułatwia szybką weryfikację hipotez dotyczących funkcji genów w szlakach rozwojowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów w badaniach we wczesnej fazie.
Przesiew i opracowanie metody analitycznej
- Zapewnia zwalidowane linie zarodkowe mutantów do późniejszego przesiewu fenotypowego.
- Standaryzuje tła genetyczne w celu opracowania powtarzalnych testów.
- Umożliwia skalowalną produkcję mutantów homozygotycznych lub złożonych heterozygotycznych.
- Wspiera rzetelną ocenę funkcji genów w systemach kontrolowanych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z badaniami nad funkcjami genów istotnymi dla chorób w modelach kręgowców.
- Umożliwia przejście od odkryć genetycznych do przedklinicznej walidacji fenotypu.
- Zmniejsza ryzyko w badaniach translacyjnych poprzez wczesne wyjaśnienie niezbędności genów.
- Wspiera analizę genów efektu matczynego, rozszerzając wiedzę translacyjną.
Integracja potoków przetwarzania i przepływu pracy
Metoda ta integruje etapy wczesnego odkrywania i identyfikacji związków wiodących, umożliwiając bezpośrednie przejście od mutagenezy CRISPR/Cas9 do walidacji fenotypowej w ramach jednego pokolenia.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza testowanie hipotez zerowych i wyjaśnianie szlaków dla genów niezbędnych.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, genetycznie zdefiniowane embriony do dalszych analiz.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty transmisji w linii zarodkowej oraz odczyty fenotypowe do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną dla genów o efektach rozwojowych lub matczynych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku schemat postępowania dla szybkiej generacji linii mutantów dla różnych genów docelowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w badaniach nad funkcją genów.
- Wartość operacyjna: Usprawnia generowanie mutantów, standaryzuje procesy i zwiększa powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań oraz ogranicza ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka, umożliwiając wczesną walidację funkcjonalną genów niezbędnych.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikroiniekcji, manipulacjach embrionalnych oraz edycji CRISPR/Cas9.
- Wymagane jest specjalistyczne instrumentarium do manipulacji zarodkami i ich transplantacji.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i integralności danych.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Wydajność zależy od precyzyjnego czasu i sposobu obchodzenia się z materiałem podczas etapów transplantacji.
